CN115813885A

CN115813885A - 一种ros响应的靶向性抗氧化纳米药物、其制备方法及其应用

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Publication number: CN115813885A
Application number: CN202210280345.1A
Authority: CN
Inventors: 王烨颖; 王依婷; 闫志强; 刘秧; 王镜; 孙磊; 周子钰; 俞磊
Original assignee: East China Normal University
Current assignee: East China Normal University
Priority date: 2022-03-22
Filing date: 2022-03-22
Publication date: 2023-03-21

Abstract

本发明公开了一种活性氧（ROS）响应的靶向性抗氧化纳米药物精氨酸/聚多巴胺/聚乙二醇/pPB多肽纳米复合粒子，是以实心二氧化硅为核，聚多巴胺为外壳，用氢氟酸进行刻蚀得到中空的聚多巴胺HPDA，接着在外壳表面进行PEG改性，然后再修饰可以有效靶向肝星状细胞（HSCs）的pPB多肽，最后包载精氨酸L‑Arg。本发明还提供了所述纳米复合粒子的制备方法和应用，以及在抗氧化性能、抗炎症、抗纤维化和改善并发症门脉高压中的应用，可清除病变部位ROS，主动靶向肝星状细胞，并发挥持久的抗氧化性能，从而减少氧化应激和逆转肝硬化。本发明还提出了为深入研究肝硬化的机制奠定工具基础，为从根源上逆转肝硬化及其并发症的应用以及全新研究策略，具有良好临床指导意义。

Description

一种ROS响应的靶向性抗氧化纳米药物、其制备方法及其应用

技术领域

本发明属于抗氧化应激药物载体技术领域，涉及一种ROS响应的靶向性抗氧化纳米药物、其制备方法及其应用。

背景技术

肝脏作为人体最大的代谢和排毒器官，由于现代人不良生活方式的急剧增加，据统计全世界每年有超过200万人死于肝脏疾病，其中一半死于肝硬化。肝硬化是由多种慢性肝病引起的动态肝损伤病变，包括肝细胞变性、坏死、肝脏炎症反应、肝实质被纤维化组织取代，正常肝小叶结构破坏和肝功能受损等。可由不同致病因素，如病毒、酒精、肥胖、自身免疫性疾病、毒物损伤等引起，其发病率高、病程长且预后差，且肝硬化患者正在逐年升高，已经成为全球公共卫生组织关注的主要问题之一。代偿性肝硬化可以多年无症状，而75％～95％的肝硬化患者一旦进入失代偿期，5年内就会死亡。同时随着病变进展，肝血窦内的血流转运障碍成为肝硬化患者最为常见的并发症之一，即门脉高压。临床研究表明肝硬化及其并发症的病变过程是缓慢且可以逆转的，但其逆转的相关机制尚未可知且由于肝硬化机制复杂，临床上还没有可以有效地逆转或者进行靶向治疗的抗肝硬化的药物出现。因此，探究肝硬化发展的病理机制，在其发展过程中消除致病因素加以有效的治疗防止其进一步发展成为不可逆病变，是当前急需解决的科学难题。

肝硬化是一个病理复杂的动态发展过程，不是单一的疾病状态。早期是引起肝脏炎症反应，当致病因素反复刺激肝细胞会导致静息状态的肝星状细胞被激活，ECM的合成与降解平衡被打破从而导致ECM大量沉积和增生，发生肝纤维化，随着ECM形成的瘢痕组织替代肝实质细胞，炎症反应和肝纤维化的互相协同作用进一步发展成为肝硬化，由此可见，治疗肝硬化可以从肝脏炎症和肝纤维化两个方面入手。在这个发展过程中，ROS介导的氧化应激和HSC细胞的活化是两个至关重要的因素。氧化应激是有氧呼吸产生的ROS与抗氧化系统之间的平衡被破坏而产生过量的自由基，可使细胞坏死或凋亡，从而导致组织损伤。机体在肝硬化过程中氧化应激水平呈高表达，一方面，ROS通过激活NF-κB信号通路上调多种促炎因子的表达，其继续作用于肝脏产生更多的ROS，形成一种恶性循环。另一方面，氧化应激攻击促纤维化因子TGF-β1通路导致HSC细胞的激活，活化的HSC细胞进一步分化成肌成纤维细胞，增加大量胶原蛋白的表达。由此氧化应激水平的升高既可直接促进肝纤维化发展，又可与氧化应激继发的炎症相互作用，协同加重肝硬化进程。因此，肝硬化中有效的ROS清除以缓解氧化应激水平可能会从根源上有效逆转肝损伤进程。而传统的抗氧化剂是非特异性减少ROS积累，存在疗效低和毒副作用大等问题。此外，肝硬化发生时，大量ECM沉积，使Disse腔增厚，压迫肝血窦使其收缩，肝内血流阻力增加，导致门静脉高压。纳米药物由于得天独厚的尺寸优势很容易被肝脏网状内皮系统所截留，因此对肝脏疾病的治疗具有先天的优越性而被考虑。因此开发一种既能具有高肝脏靶向能力和全身毒性低的清除ROS用于治疗肝硬化，又能缓解门脉高压的纳米药物具有很大的挑战性。

中国专利申请CN202010284494.6，提供了氨硼烷/中空介孔聚多巴胺/聚乙二醇纳米复合粒子，该纳米复合粒子的化学式为AB@HMPDA-PEG，是以实心二氧化硅为核，介孔聚多巴胺为外壳，用氢氟酸进行刻蚀得到中空介孔聚多巴胺HMPDA，在外壳表面进行PEG改性，然后通过氢键作用力包载氨硼烷AB小分子前药。此专利主要利用中空聚多巴胺的结构作为载药系统，使用氨硼烷作为气体前药，在酸性环境下释放氢气，用于治疗肿瘤疾病，但是并没有提及能够治疗肝硬化及其并发症，也没有其他现有技术公开能够治疗肝硬化及其并发症的药物载体。

综上，目前急需一种能够进行集清除ROS、靶向运输、药物负载和改善病变部位门脉高压于一体，实现低毒高效的逆转肝硬化及其并发症的抗氧化应激药物载体。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种合成条件温和，反应简便，原料来源广泛便捷，尺寸孔径可控，氧化应激微环境响应效应优异，具有靶向性，生物相容性好的精氨酸/聚多巴胺/聚乙二醇/pPB多肽纳米复合粒子。

本发明从PDA的抗氧化性能以及NO可以舒张血管的角度入手，寻找到了一种全新的纳米复合粒子，实现逆转肝硬化，抑制门脉高压发展，具有很好的临床转化意义。

本发明提供了一种ROS响应的靶向性抗氧化纳米药物，其为一种精氨酸/聚多巴胺/聚乙二醇/pPB多肽纳米复合粒子，该纳米复合粒子的化学式为L-Arg@HPDA-PEG-pPB(称作L@HPp)。进一步地，是以实心二氧化硅为核，聚多巴胺为外壳，用氢氟酸进行刻蚀得到中空的聚多巴胺HPDA，在表面进行PEG改性，然后再修饰pPB多肽，最后包载精氨酸L-Arg而形成的L@HPp多肽纳米复合粒子。

优选地，所述纳米复合粒子的载药量为35-42％；优选地，为38.9±0.07％。

优选地，所述纳米复合粒子的直径为100-150nm；优选地，为126nm。

本发明还提出了ROS响应的靶向性抗氧化纳米药物的制备方法，所述方法包括以下步骤：

1)以正硅酸四乙酯为原料，在碱性环境中通过水解反应，制备单分散的致密的实心二氧化硅(dSiO₂)纳米颗粒；

2)弱碱环境下，在步骤1)制得的dSiO₂纳米颗粒表面通过氧化自聚反应，包裹一层厚厚的聚多巴胺，制得dSiO₂@PDA纳米粒子；

3)将步骤2)制得的dSiO₂@PDA纳米粒子通过氢氟酸进行刻蚀，构造具有中空结构的聚多巴胺(HPDA)纳米颗粒；

4)将步骤3)制得的HPDA纳米颗粒的表面进行PEG改性，制得HPDA-PEG复合纳米粒子；

5)步骤4)制得的HPDA-PEG复合纳米粒子进行pPB多肽修饰，制得HPp复合纳米粒子；

6)步骤5)制得的HPp复合纳米粒子包载气体前药精氨酸(L-Arg)搅拌、离心洗涤，然后分散于去离子水中，即制得L@HPp复合纳米粒子。

进一步地，所述步骤1)中，水解反应的工艺步骤为：氨水作为催化剂，乙醇作溶剂，水作为介质混合，在20-40℃下搅拌5-20分钟，再滴入一定量的正硅酸四乙酯进行水解聚合反应，20-40℃水浴搅拌0.8-3小时，后经离心醇洗和水洗，将最终产物分散在水中，然后真空干燥箱进行干燥得到实心的单分散dSiO₂颗粒；

其中，所述的氨水、乙醇、水与正硅酸四乙酯的体积比为1.5-1.6：35-40：5：1.5-2.5。优选地，体积比为1.57：37：5：1.6。

进一步地，所述步骤2)中，氧化自聚反应的工艺步骤为：配置pH＝8.5的Tris缓冲液，在弱碱环境下加入上述的分散在去离子水中的dSiO₂纳米颗粒，置于反应容器中，再将多巴胺DA溶于水，并迅速加入上述混合液中，在室温下搅拌7-20小时即可包裹上一层厚厚的聚多巴胺，后经水洗、离心和静置，即制得dSiO₂@PDA纳米粒子；

其中，所述的Tris缓冲液的体积、分散在去离子水中的dSiO₂纳米颗粒的体积与多巴胺的重量比为30mL:4-8mL:130-200mg。优选体积重量比为30mL:5mL:150mg。

进一步地，所述步骤3)中，氢氟酸蚀刻构造具有中空结构的工艺步骤为：取上述的分散在去离子水中的单分散的dSiO₂@PDA纳米粒子，里面加入水和乙醇中，置于超声中进行搅拌，再加入20％氢氟酸，放置10-18小时，离心水洗三次，分散在水中，即制得中空结构的HPDA复合纳米粒子；

其中，所述的分散在去离子水中的单分散的dSiO₂@PDA纳米粒子、水、乙醇与20％氢氟酸的体积比为4-10：10-30：10-25：5-10。优选体积比为10：15：15：6。

进一步地，所述步骤4)中，PEG改性的工艺步骤为：将上述得到的HPDA复合纳米粒子分散在去离子水中，用稀的氢氧化钠溶液调节pH至12，加入NH₂-PEG-COOH，室温搅拌20-30小时，离心水洗，分散在水中，即制得HPDA-PEG复合纳米粒子；

其中，所述的NH₂-PEG-COOH在去离子水中的质量浓度为40-60mg/mL。优选地，质量浓度为60mg/mL。

进一步地，所述步骤5)中，pPB多肽修饰的工艺步骤为：将上述得到的HPDA-PEG复合纳米粒子分散在去离子水中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC，在室温下搅拌20-50分钟；然后加入pPB溶液并保持搅拌，搅拌30-40小时后，通过透析48小时获得HPp复合纳米粒子；

其中，所述的分散在去离子水中的HPDA-PEG纳米粒子、EDC与pPB的体积质量比为：2-5mL：3.5-10mg：0.2mg。优选体积质量比为4mL：5mg：0.2mg。

进一步地，所述步骤6)中，具体工艺步骤为：称取精氨酸溶解在HPp复合纳米粒子中，在室温下搅拌24-36小时，后经离心水洗，即制得L@HPp复合纳米粒子；

其中，所述的精氨酸与HPp复合纳米粒子的质量比为100-500：5-20。优选质量比为200：10。

本发明还提供了所述的ROS响应的靶向性抗氧化纳米药物作为抗氧化剂或药物载体的应用、在制备用于气体前药的负载和靶向递送药物中的应用、在制备用于病变部位的微环境响应性可控释放药物中的应用、在制备用于改善肝硬化病变部位的门脉高压环境的药物中的应用、和/或在制备用于治疗肝硬化及其并发症的药物中的应用。本发明的精氨酸/聚多巴胺/聚乙二醇/pPB多肽纳米复合粒子能够用于抗氧化、抗炎症、抗纤维化和改善并发症门脉高压中的应用，可清除病变部位ROS，主动靶向肝星状细胞，并发挥持久的抗氧化性能，从而减少氧化应激和逆转肝硬化。同时，释放的L-Arg在过氧化氢过多的肝脏病变微环境中有效产生NO，引起血管扩张，进一步缓解门静脉高压。为深入研究肝硬化的机制奠定工具基础，为从根源上逆转肝硬化及其并发症提供全新的研究策略，具有良好的临床指导意义。

本发明与申请人早期申请的专利CN202010284494.6的技术方案相比，提供了一种新的发明构思。两者不同之处在于：(1)药物递送载体的设计不同。本发明不仅考虑了利于载药的中空结构，还设计了靶向功能，可以让纳米递送系统更好地到达病变部位，以发挥治疗作用。(2)同为中空聚多巴胺，但应用功能完全不同。现有专利是利用中空聚多巴胺的结构做了单纯的载药系统。而本发明是巧妙使用了中空聚多巴胺富含抗氧化基团的机构，发挥其本身的生物活性，进行抗氧化应用。(3)负载的气体前药不同。现有专利使用氨硼烷作为气体前药，在酸性环境下释放氢气。而本发明负载了精氨酸，可以利用肝脏病变部位微环境响应性释放一氧化氮，达到舒张血管的作用。(4)应用的疾病模型不同。现有专利治疗肿瘤疾病。本发明是是治疗肝硬化及其并发症疾病。

本发明具有如下技术效果：

1)本发明制备得到的L@HPp纳米复合粒子所需原材料来源广泛且成本低，反应条件温和，合成工艺简便且结构巧妙，大大缩短了纳米载体的制备周期。制备得到的L@HPp纳米复合粒子的粒径是100-150nm，一方面是因为制备得到的纳米复合物的优良粒径，另一方面是L@HPp纳米复合粒子的zeta电位是-32.2mV，因此则该分散体系稳定性高，可以满足体内的体液环境，且在冰箱4℃可以长久保存，储存方便。

2)采用本发明方法制备得到的L@HPp纳米复合粒子成分新颖，PDA具有抗氧化性，可以清除活性氧等有害自由基，为氧化应激相关疾病提供新思路。从本发明的具体实施方式的检测结果可以看出：

本发明的L@HPp纳米复合粒子成分具有生物可降解性，生物相容性好，进入动物体之后无毒，可进一步向临床转化，作为药物是安全可靠的。

本发明的L@HPp纳米复合粒子结构新颖，具有肝星状细胞靶向性，可以在纳米药物进入动物体之后很好地靶向到病变部位，降低清除率，提高治疗效果。

本发明的L@HPp纳米复合粒子能够降低病变部位的氧化应激水平，清除ROS，抑制炎症，降低细胞死亡，逆转肝损伤。

本发明的L@HPp纳米复合粒子可以有效抗肝纤维化，通过天狼星红(SR)和Masson染色得以证实，显示出了很好的缓解肝损伤的效果，进一步病变部位逆转肝硬化进程。

本发明的L@HPp纳米复合粒子负载L-Arg，可以在肝损伤部位过表达的过氧化氢浓度下转化成NO，起到舒张血管的作用，有效缓解肝硬化的并发症门脉高压，为临床治疗提供新思路。相比现有技术达到了更好的效果，并且这些优良的效果均被具体实施方式的实施例1所证实。

3)本发明涉及抗氧化应激药物载体技术，提出了用于治疗肝硬化及其并发症的加载选择性靶向的纳米复合粒子及其制备方法与应用，所述纳米复合粒子L@HPp可清除病变部位ROS，主动靶向肝星状细胞，并发挥持久的抗氧化性能，从而减少氧化应激和逆转肝硬化。同时，释放的L-Arg在过氧化氢过多的肝脏病变微环境中有效产生NO，引起血管扩张，进一步缓解门静脉高压。为深入研究肝硬化的机制奠定工具基础，为从根源上逆转肝硬化及其并发症提供全新的研究策略，具有良好的临床指导意义。

附图说明

图1为本发明实施例1中dSiO₂、dSiO₂@PDA、HPDA纳米粒子的TEM图谱和SEM图谱，其中，a、b、c分别为dSiO₂、dSiO₂@PDA、HPDA纳米粒子的TEM图谱，d为HPDA纳米粒子的SEM图谱。

图2为本发明实施例1中的dSiO₂、dSiO₂@PDA、HPDA、HPDA-PEG、HPp和L@HPp复合纳米粒子的zeta电位图。

图3为本发明实施例1中的不同HPDA复合纳米粒子浓度下的总抗氧化能力(T-AOC)。

图4为本发明实施例1中的不同浓度的HPp或L@HPp复合纳米粒子与HSC细胞共同孵育后的细胞存活率。

图5为本发明实施例1中在肝硬化模型小鼠中分别静脉注射DiR-L@HP和DiR-L@HPp后监测分布的体内荧光图像。

图6为本发明实施例1中在肝硬化模型小鼠中，最后一次给药后检测氧化应激水平和肝切片的H&E和Tunel染色图像。箭头表示细胞坏死、小叶内和门静脉周围炎症以及胶原纤维增生的部位。

图7为本发明实施例1中在肝硬化模型小鼠中，最后一次给药后天狼星红(SR)和Masson染色的肝组织学图像。

图8为本发明实施例1中在肝硬化模型小鼠中，血清血栓素B₂(TXB₂)水平表达情况。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。

正硅酸四乙酯(TEOS)、多巴胺(DA)、氢氧化钠(NaOH)、氢氧化铵(NH₃H₂O)、氢氟酸(HF)、DiR'[DiIC18(7)]、分子量为2000的氨基-聚乙二醇-羧基(NH₂-PEG-COOH)、硫代乙酰胺(TAA)、四氯化碳(CCl₄)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)、L-精氨酸(L-Arg)和Cy5.5-COOH均来自上海麦克林生化科技有限公司。武汉谷歌生物技术有限公司提供磷酸盐缓冲液(PBS)和(RPMI)1640培养基。使用Milli-Q水净化系统(MerkMillipore)获得去离子水。所有抗体均购自武汉Servicebio有限公司。

实施例1

本发明的精氨酸/聚多巴胺/聚乙二醇/pPB多肽纳米复合粒子(L@HPp)，该复合结构纳米粒子是以实心二氧化硅为核，聚多巴胺为外壳，用氢氟酸进行刻蚀得到中空的聚多巴胺HPDA，在表面进行PEG改性，然后再修饰pPB多肽，最后包载精氨酸L-Arg而形成。

(1)该精氨酸/聚多巴胺/聚乙二醇/pPB多肽纳米复合粒子的制备方法，具体包括以下步骤：

(1-1)实心二氧化硅dSiO₂纳米粒的制备：在一个单口瓶中，按正硅酸四乙酯和水的反应过程的计量，加入3.14mL氨水，74mL乙醇和10mL水混合，在30℃下搅拌5分钟，再滴入3.2mL正硅酸四乙酯进行水解聚合反应，30℃水浴再搅拌1小时，后经离心醇洗2次，水洗1次，将最终产物分散在水中，然后真空干燥箱进行干燥得到实心的单分散dSiO₂颗粒；

(1-2)纳米颗粒dSiO₂@PDA的制备：配置pH＝8.5的Tris缓冲液30mL，在弱碱环境下加入上述的5mL分散在去离子水中的dSiO₂纳米颗粒置于反应容器中，再将150mg多巴胺(DA)溶于2mL的水，并迅速加入上述混合液中，在室温下搅拌9小时即可包裹上一层厚厚的聚多巴胺，后经去离子水洗3次，离心、静置，即制得dSiO₂@PDA纳米粒子；

(1-3)纳米颗粒HPDA的制备：取上述的分散在去离子水中10mL的单分散的dSiO₂@PDA纳米粒子，里面加入15mL水和15mL乙醇中，置于超声中进行搅拌，再加入6mL 20％的氢氟酸，放置10小时，然后离心水洗三次，分散在水中，即制得中空结构的HPDA复合纳米粒子；

(1-4)HPDA-PEG复合结构纳米颗粒的制备：将上述得到的HPDA复合纳米粒子分散在去离子水中，用稀的氢氧化钠溶液调节pH至12，加入250μL的NH₂-PEG-COOH(60mg/mL)，室温搅拌24小时，离心水洗三次，再分散在水中，即制得HPDA-PEG复合纳米粒子；

(1-5)纳米复合粒子HPp的制备：称取5mgEDC溶解在4mL的HPDA-PEG复合纳米粒子中，在室温下搅拌20分钟。然后加入pPB溶液(1mg/mL，0.2mL)并保持搅拌，搅拌36小时后，通过透析48小时获得HPp复合纳米粒子。

(1-6)纳米复合粒子L@HPp的制备：称取200mg精氨酸溶解在10mL HPp复合纳米粒子(1mg/mL)中，在室温下搅拌36h，后经离心水洗重复多次，即制得L@HPp复合纳米粒子，保存于4℃下备用。

(2)本发明实施例1制备的复合纳米颗粒粒径大小：其TEM和SEM分别见图1，可以看出HPDA复合纳米粒子粒径约为136nm，这种粒径尺寸对于肝脏部位的摄取是有利的，对于细胞实验和体内治疗肿瘤均是非常合适的。

(3)本发明实施例1制备的复合纳米粒子的zeta电位：dSiO₂、dSiO₂@PDA、HPDA、HPDA-PEG、HPp和L@HPp复合纳米粒子通过马尔文动态光散射仪检测出的zeta电位见图2，可以看出L@HPp复合纳米粒子的zeta电位是-32.2mV，因此则该分散体系稳定性高，可以满足体内的体液环境，且在冰箱4℃可以长久保存，储存方便。

(4)本发明实施例1制备的HPDA复合纳米粒子的总抗氧化能力(T-AOC)：使用TOC测定试剂盒(Solarbio Life Science，Beijing)用于分析HPDA复合纳米粒子的T-AOC。分析原理是在酸性环境下，HPDA能还原Fe³⁺-三吡啶三嗪(Fe³⁺-TPTZ)生成蓝色的Fe²⁺-TPTZ。根据制造商提供的方案进行T-AOC的测量。最后，HPDA的T-AOC通过593nm处的吸光度来定量。所有的测量重复三次，结果见图3。结果表明，HPDA的总抗氧化能力显示出了显著的浓度依赖性自由基清除能力。正如预期的那样，当HPDA浓度为100μg/mL时，HPDA清除了82.2％的活性氧类物质。表明HPDA纳米粒子具有良好的清除活性物种的能力。

(5)本发明实施例1制备的复合纳米粒子的细胞毒性测试：将HSC细胞以5×10⁴/孔的密度接种到96孔板中，并与不同浓度(0、12.5、25、50、100、200μg/mL)的HPp和L@HPp复合纳米粒子一起孵育24小时。然后，通过标准细胞计数试剂盒-8(CCK-8)测定法测定细胞活力，结果见图4。结果表明，HSCs分别与HPp和L@HPp复合纳米粒子孵育后，CCK-8检测未观察到明显的细胞毒性，表明其具有良好的生物相容性。

(6)本发明实施例1制备的L@HPp复合纳米粒子的体内靶向性测试：从中国科学院上海实验动物中心得到饲养了6-8周的雄性Balb/c小鼠。通过腹腔注射100mg/kg剂量的硫代乙酰胺，每周三次一共注射7周以诱导肝硬化。为了验证体内靶向性，将纳米颗粒(L@HP和L@HPp)与DiR一起孵育24小时，以制备载有DiR的纳米颗粒(DiR-L@HP，DiR-L@HPp),并离心除去游离的DiR。接下来，采用尾静脉注射给肝硬化Balb/c小鼠注射100μL装载有DiR的纳米颗粒(DiR-L@HP和DiR-L@HPp)，剂量为10mg/kg。在注射后1、2、3、5、7、10、14天，使用CRiMaestroTM小动物成像系统(EX-RRO，USA)捕捉荧光信号的变化，结果见图5。结果表明，在注射后24小时，两组小鼠在注射后24小时在肝脏中显示出强烈的荧光强度，L@HPp组的荧光比L@HP组强，表明L@HPp比L@HP更多地被肝组织保留。然后，L@HP组的荧光强度开始逐渐降低，一周后几乎消失。相比之下，L@HPp组的荧光强度在注射后3天仍然显著，并且在2周内几乎消失，并且L@HPp组的荧光强度比L@HP组的高得多。表明L@HPp在体内的靶向性优良，可进一步有效提高体内疗效。

(7)本发明实施例1制备的L@HPp复合纳米粒子的体内抗炎测试：通过腹腔注射诱导一批肝硬化小鼠。除对照组外，将肝硬化小鼠随机分为4组(PBS、HPp、L@HP、L@HPp)，使得体重差异最小，为每组肝硬化小鼠静脉注射纳米颗粒(10mg/kg体重，共4次，每周1次)。最后一次给药后48小时取出小鼠新鲜肝脏，用4％多聚甲醛固定，梯度脱水，石蜡包埋，制成3微米切片备用。以二氢乙锭(DHE)为探针，进行ROS染色。根据标准方案进行苏木精-伊红(H&E)和Tunel染色以检测肝组织的组织病理学检查和凋亡。结果见图6。结果表明，肝硬化小鼠表现出高ROS水平。HPp能显著降低肝脏ROS水平，且L@HPp的作用优于L@HP组，这与L@HPp的主动靶向作用有关。肝组织的H&E组织学分析显示PBS组的肝组织显示广泛的细胞肿胀、肝窦狭窄、明显的炎性细胞浸润、胶原纤维增生和大量中央静脉周围的静脉充血。相比之下，在对照组中，肝细胞和肝小叶显示出清晰结构、正常形态和规则排列。未见炎性浸润和纤维组织增生。治疗后，HPp组小鼠的炎症和纤维化明显减轻，而HPp组小鼠的情况也明显改善。肝脏的Tunel染色显示了PBS组中肝细胞的凋亡，而在HPp和L@HPp组中显著减轻。结果证明L@HPp具有良好的抗炎作用。

(8)本发明实施例1制备的L@HPp复合纳米粒子的体内抗纤维化测试：通过腹腔注射诱导一批肝硬化小鼠。除对照组外，将肝硬化小鼠随机分为4组(PBS、HPp、L@HP、L@HPp)，为每组肝硬化小鼠静脉注射纳米颗粒(10mg/kg体重，共4次，每周1次)。最后一次给药后48小时取出小鼠新鲜肝脏，制成3微米切片备用。根据标准操作规程进行SR和Masson染色评价胶原沉积。结果见图7。结果表明，肝硬化小鼠显示出大规模的胶原蛋白沉积，HPp、L@HP和L@HPp组肝组织胶原沉积明显受到抑制，L@HPp组胶原沉积最低。结果证明L@HPp具有良好的抗纤维化作用。

(9)本发明实施例1制备的L@HPp复合纳米粒子缓解门脉高压：通过腹腔注射诱导一批肝硬化小鼠。除对照组外，将肝硬化小鼠随机分为4组(PBS、HPp、L@HP、L@HPp)，使得体重差异最小，为每组肝硬化小鼠静脉注射纳米颗粒(10mg/kg体重，共4次，每周1次)。最后一次给药后48小时，取小鼠血清，按照试剂盒制造商的方案分别用血栓素B₂ ELISA试剂盒测定TXB₂水平。结果见图8。结果表明，与PBS相比，HPDA轻微降低肝脏TXB₂含量(*，P<0.05)，这归因于肝纤维化的有效改善可以降低门静脉压力。然而，L@HPp可以显著减少肝脏中TXB₂的产生，几乎接近正常小鼠的水平。这些结果表明L@HPp能很好地减轻肝硬化小鼠的门静脉高压。

实施例2

本实施例的精氨酸/聚多巴胺/聚乙二醇/pPB多肽纳米复合粒子制备方法与本发明实施例1基本相同，不同之处在于：

步骤(1-1)中，正硅酸四乙酯TEOS加入量为3mL。

步骤(1-2)中，分散在去离子水中的dSiO₂纳米颗粒的加入量为8mL；多巴胺DA的加入量为200mg。

步骤(1-3)中，分散在去离子水中的单分散的dSiO₂@PDA纳米粒子的加入量为7mL、水的加入量为30mL，乙醇的加入量为25mL，20％氢氟酸的加入量为10mL。

步骤(1-4)中，NH₂-PEG-COOH在去离子水中的质量浓度为50mg/mL，NH₂-PEG-COOH加入量为200μL。

步骤(1-5)中，EDC的加入量为10mg，HPDA-PEG复合纳米粒子为5mL。

步骤(1-6)中，精氨酸的加入量为0.5g，HPp复合纳米粒子为20mL。

本实施例2所得精氨酸/聚多巴胺/聚乙二醇/pPB多肽纳米复合粒子的检测结果和性能与本发明实施例1基本相同。

实施例3

步骤(1-1)中，正硅酸四乙酯TEOS加入量为4.5mL。

步骤(1-2)中，分散在去离子水中的dSiO₂纳米颗粒的加入量为4mL；多巴胺DA的加入量为130mg。

步骤(1-3)中，分散在去离子水中的单分散的dSiO₂@PDA纳米粒子的加入量为4mL、水的加入量为10mL，乙醇的加入量为10mL，20％氢氟酸的加入量为5mL。

步骤(1-4)中，NH₂-PEG-COOH在去离子水中的质量浓度为40mg/mL，NH₂-PEG-COOH加入量为150μL。

步骤(1-5)中，EDC的加入量为3.5mg，HPDA-PEG复合纳米粒子为2mL。

步骤(1-6)中，精氨酸的加入量为0.1g，HPp复合纳米粒子为5mL。

本实施例3所得精氨酸/聚多巴胺/聚乙二醇/pPB多肽纳米复合粒子的检测结果和性能与本发明实施例1基本相同。

本实施例制得的精氨酸/聚多巴胺/聚乙二醇/pPB多肽纳米复合粒子可用作药物载体、靶向剂、抗炎、抗纤维化，缓解门脉高压。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种ROS响应的靶向性抗氧化纳米药物，其特征在于，所述的药物为精氨酸/聚多巴胺/聚乙二醇/pPB多肽纳米复合粒子，所述多肽纳米复合粒子的化学式为L-Arg@HPDA-PEG-pPB，是以实心二氧化硅为核，聚多巴胺为外壳，用氢氟酸进行刻蚀得到中空的聚多巴胺HPDA，在表面进行PEG改性，然后再修饰pPB多肽，最后包载精氨酸L-Arg而形成。

2.根据权利要求1所述的ROS响应的靶向性抗氧化纳米药物，其特征在于，所述精氨酸/聚多巴胺/聚乙二醇/pPB多肽纳米复合粒子的粒径是100-150 nm。

3.如权利要求1或2所述的ROS响应的靶向性抗氧化纳米药物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）以正硅酸四乙酯为原料，在碱性环境中通过水解反应，制备单分散的致密的实心二氧化硅dSiO₂纳米颗粒；

2）弱碱环境下，在步骤1）制得的dSiO₂纳米颗粒表面通过氧化自聚反应，包裹一层聚多巴胺，制得dSiO₂@PDA纳米粒子；

3）将步骤2）制得的dSiO₂@PDA纳米粒子通过氢氟酸进行刻蚀，构造具有中空结构的聚多巴胺HPDA纳米颗粒；

4）将步骤3）制得的HPDA纳米颗粒的表面进行PEG改性，制得HPDA-PEG复合纳米粒子；

5）步骤4）制得的HPDA-PEG复合纳米粒子修饰pPB多肽，制得HPDA-PEG-pPB（HPp）复合纳米粒子；

6）步骤5）制得的HPDA-PEG-pPB复合纳米粒子包载精氨酸（L-Arg）搅拌、离心洗涤，然后分散于去离子水中，即制得L@HPp复合纳米粒子。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1）中，水解反应的工艺步骤为：氨水作为催化剂，乙醇作溶剂，水作为介质混合，在20-40℃下搅拌5-20分钟，再滴入一定量的正硅酸四乙酯进行反应，20-40℃水浴搅拌0.8-3小时，后经离心醇洗和水洗，将最终产物分散在水中，然后真空干燥箱进行干燥得到实心的单分散dSiO₂颗粒；其中，所述的氨水、乙醇、水与正硅酸四乙酯的体积比为1.5-1.6：35-40：5：1.5-2.5。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2）中，氧化自聚反应的工艺步骤为：配置pH=8.5的Tris缓冲液，在弱碱环境下加入上述的分散在去离子水中的dSiO₂纳米颗粒，置于反应容器中，再将多巴胺DA溶于水，并迅速加入上述混合液中，在室温下搅拌7-20小时即可包裹上一层厚厚的聚多巴胺，后经水洗、离心和静置，即制得dSiO₂@PDA纳米粒子；其中，所述的Tris缓冲液的体积、分散在去离子水中的dSiO₂纳米颗粒的体积与多巴胺的重量比为30 mL:4-8 mL:130-200 mg。

6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3）中，氢氟酸蚀刻构造具有中空结构的工艺步骤为：取上述的分散在去离子水中的单分散的dSiO₂@PDA纳米粒子，里面加入水和乙醇中，置于超声中进行搅拌，再加入20%氢氟酸，放置10-18小时，离心水洗三次，分散在水中，即制得中空结构的HPDA复合纳米粒子；其中，所述的分散在去离子水中的单分散的dSiO₂@PDA纳米粒子、水、乙醇与20%氢氟酸的体积比为4-10：10-30：10-25：5-10。

7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤4）中，PEG改性的工艺步骤为：将上述得到的HPDA复合纳米粒子分散在去离子水中，用稀的氢氧化钠溶液调节pH至12，加入NH₂-PEG-COOH，室温搅拌20-30小时，离心水洗，分散在水中，即制得HPDA-PEG复合纳米粒子；其中，所述的NH₂-PEG-COOH在去离子水中的质量浓度为40-60 mg/mL。

8.根据权利要求3所述的精氨酸/聚多巴胺/聚乙二醇/pPB多肽纳米复合粒子的制备方法，其特征在于，所述步骤5）中，pPB多肽修饰的工艺步骤为：将上述得到的HPDA-PEG复合纳米粒子分散在去离子水中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC，在室温下搅拌20-50分钟；然后加入pPB溶液并保持搅拌，搅拌30-40小时后，通过透析48小时获得HPp复合纳米粒子；其中，所述的分散在去离子水中的HPDA-PEG纳米粒子、EDC与pPB的体积质量比为：2-5mL：3.5-10mg：0.2mg。

9.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤6）中，具体工艺步骤为：称取精氨酸溶解在HPp复合纳米粒子中，在室温下搅拌24-36 h，后经离心水洗，即制得L@HPp复合纳米粒子；其中，所述的精氨酸与HPp复合纳米粒子的质量比为100-500：5-20。

10.如权利要求1或2所述的ROS响应的靶向性抗氧化纳米药物作为抗氧化剂或药物载体的应用、在制备用于气体前药的负载和靶向递送药物中的应用、在制备用于病变部位的微环境响应性可控释放药物中的应用、在制备用于改善肝硬化病变部位的门脉高压环境的药物中的应用、和/或在制备用于治疗肝硬化及其并发症的药物中的应用。