CN112022837A - 一种纳米递送体系及其制备方法和应用 - Google Patents

一种纳米递送体系及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种纳米递送体系及其制备方法和应用，所述纳米递送体系包括纳米药物载体和负载在纳米药物载体内的OXA和PKI‑587。本发明的H‑PDA NPs具有较大的比表面积和中空结构，因此具有更高的装载效率，可以长期和持续释放OXA和PKI‑587，并且它们的释放率保持在稳定水平，避免了早期的突发释放并保持暴露于细胞的药物在固定的比率，有利于药物的持续性作用。本发明基于H‑PDA NPs的OXA和PKI‑587的联合疗法可通过调节上下游信号通路和同时抑制DNA修复酶的活性来降低化学抗性，从而显著放大PKI‑587诱导的HCC细胞对OXA的药物反应，取得强大的抗肿瘤功效，这对于未来的临床应用具有重要意义。

Description

一种纳米递送体系及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种纳米递送体系及其制备方法和应用。
背景技术
肝细胞癌(HCC)是中国人最常罹患和最易致死的主要癌症，根据国家癌症中心发布的全国最新癌症报告(2019年版)，肝癌发病率位列恶性肿瘤第四位，死亡率则高居恶性肿瘤第二位，目前国内新发肝癌病例和死亡病例均占世界的一半以上。肝癌早期症状不明显，60％以上的患者确诊时已是中晚期了，往往失去了手术治疗的最佳机会。到目前为止，传统的治疗方法主要是手术切除、放疗和化疗。手术切除被认为是治疗HCC的最佳方法，但肿瘤细胞易于转移并侵袭其他组织，具有较高的复发风险。此外，已证明放疗和化学疗法会杀死辐射范围内的所有细胞，包括正常细胞，这些细胞选择性差且副作用严重，并降低了患者的生活质量。因此，探索治疗肝癌的有效方法非常迫切，已引起研究人员的广泛关注。
目前，分子靶向治疗成为了近年来肝癌综合治疗的重要方法之一。奥沙利铂(OXA)作为第三代基于铂(II)的药物，由于其活性谱广和临床不良副作用少而受到广泛关注。OXA可以通过在DNA链上的两个侧边鸟嘌呤之间形成链内连接，直接诱导癌细胞DNA的铂损伤，从而抑制肿瘤的进展。不幸的是，最近的证据发现，以OXA为基础的长期化疗可诱导肿瘤的自我保护机制的激活，例如磷酸肌醇3-激酶(PI3K)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路的异常激活和磷酸化蛋白激酶B(pPKB)，从而刺激HCC细胞增殖和迁移，并抑制细胞凋亡以拮抗OXA的有效性，这被称为耐药性。因此，基于OXA的化学疗法最初取得成功所带来的希望很快被随后的研究所扑灭，该研究表明肿瘤在持续进行OXA给药的同时会产生耐药性，从而抵消了化学疗法产生的功效并导致肿瘤复发，严重影响了其长期疗效。
解决由单药化疗引起的耐药性问题的一种有效方法是联合化疗或多化学疗法，即同时使用两种或多种化学治疗药物。与单一化疗相比，联合化疗调节不同多个信号通路可以同时产生协同，加成或增强的治疗效果，从而避免单一药物功效的后续失败，从而提高抗肿瘤的功效。而且先前研究中阐明的优化比例的多种药物联合治疗确实比单药化疗对具有耐药性的肿瘤细胞具有更好的抑瘤效果。毫无疑问，联合化疗成为克服长期化疗后发生的耐药性的新范例，这不仅导致越来越复杂的联合方案的紧急性，而且导致了增加剂量强度的不同方法的发展，例如以更短的间隔或更高的剂量给药。在引入联合化疗后的近50年中，联合化疗取得的成就基本上处于平稳状态。值得注意的是，肿瘤细胞最终仍然对联合化疗产生抗药性，这与单药化疗中观察到的事实相似。因此，迫切需要通过设计与基因组学或蛋白质组学相结合的合理方案以使联合治疗的功效最大化并降低全身性副作用来优化联合化疗。本课题组研究发现，PKI-587成为一种高效的双重PI3K/mTOR抑制剂，可以使PI3K/mTOR信号通路失活。这种药物可能为联合化疗提供最大的化疗疗效。
纳米药物递送系统的发展为改善抗肿瘤药物的缺陷提供了新的策略。与传统疗法相比，该系统具有更高的溶解度，化学稳定性和生物利用度，有效的靶向性，更长的周期时间和低毒性。然而，临床试验的结果表明，传统的聚合物纳米载体可能无法在病理变化中实现药物的程序性释放，从而导致细胞的多重耐药性和功效降低。同时，由于简单的物理包封，抗癌药物在全身循环中很容易从载体中漏出，从而导致严重的副作用。此外，由于较差的水溶性，疏水性药物在纳米制剂中的包封率非常低，这也严重限制了其应用。
发明内容
针对现有技术的上述不足，本发明的目的是提供一种纳米递送体系及其制备方法和应用，解决现有化疗药物易产生耐药性以及组合药物药代动力学不同步，造成治疗效果不佳的问题。
为了解决上述技术问题，本发明采用了如下的技术方案：一种纳米药物载体，所述载体为空心PDA纳米壳，首先制备的SiO2 NPs呈球形，直径约为323nm，PDA涂层后，观察到明显的PDA-SiO2双层结构，PDA层为灰色，均匀地涂在SiO2表面，总粒径约433nm，再通过蚀刻溶液去除内部SiO2之后，即获得所述空心PDA纳米壳(H-PDA)，且所述空心PDA纳米壳的粒径为420～450nm，厚度为50～60nm。
与先前报道的固体PDANPs相比，所本发明制备的H-PDANPs具有较大的比表面积和中空结构，因此具有更高的装载效率。此外，H-PDA的高负载效率可以在减少注射剂量的同时确保功效，从而减少全身性副作用。
本发明的另外一个目的在于提供了一种纳米递送体系，包括所述的纳米药物载体和负载在纳米药物载体内的OXA和PKI-587。
如图1所示，该纳米递送体系可以通过同时抑制PI3K/mTOR信号通路活化和HCC细胞中DNA修复酶的活性来调节下游效应分子，从而阻抑HCC细胞增殖、迁移、周期进程和促进HCC细胞DNA双链断裂、凋亡，进而重新激活HCC细胞对化疗药物的敏感性。此外，我们采用的纳米包载材料H-PDA因具有较大的比表面积和中空结构而具有更高的装载效率。
这样，H-PDANPs可以长期和持续释放OXA和PKI-587，并且它们的释放率保持在稳定水平，避免了早期的突发释放并保持暴露于细胞的药物在固定的比率，有利于药物的持续性作用。
作为优选的，所述OXA和PKI-587的摩尔比约为15～25:1。这样，空心PDA纳米壳中负载的OXA和PKI-587在上述配比关系下协同作用，可以发挥极大的抑制HCC细胞活力的作用。
本发明的另一个目的在于提供一种上述纳米递送体系的制备方法，包括以下步骤：
1)将H2O、无水乙醇与氨混合，并剧烈搅拌，然后在保持剧烈搅拌的同时滴加TEOS进行反应，充分反应后，得到的乳白色溶液，然后离心收集沉淀物，再经洗涤、干燥后，得白色固体颗粒SiO2 NPs；
2)将步骤1)得到的白色固体颗粒SiO2NPs用Tris缓冲溶液洗涤并重悬，得到均匀溶液，然后加入多巴胺盐酸盐，在室温下搅拌反应，得到深灰色溶液，再将其离心、洗涤得到黑色沉淀PDA-SiO2NPs；
3)将步骤2)得到的黑色沉淀PDA-SiO2与刻蚀溶液混合，然后将混合物在室温下剧烈搅拌，反应结束后，将离心收集的沉淀物重复洗涤，直到上清液透明，再除去上清液用水悬浮沉淀物，即得到所述纳米药物载体H-PDA溶液；
4)将溶于PBS的OXA和溶于DMSO的PKI-587缓慢加入到步骤3)得到的H-PDA溶液中得到混合溶液，使混合溶液中OXA的浓度为1.5mg/mL～2.5mg/mL，PKI-587的浓度为0.2mg/mL～0.4mg/mL，H-PDA的浓度为1.5mg/mL～2.5mg/mL，再将上述混合物在黑暗中搅拌12～24h后，离心去除过量的OXA和PKI-587，即得到所述纳米递送体系O/P-HPNPs。
作为优选的，步骤1)中所述H2O、无水乙醇、氨与TEOS的体积比为16～24:4～6:0.8～1.2:0.96～1.44。
作为优选的，步骤2)中所述SiO2NPs与多巴胺盐酸盐的质量比为1:2～3。
作为优选的，步骤3)中所述PDA-SiO2与刻蚀溶液的质量体积比为2.8～4.2mg:0.8～1.2mL。
作为优选的，步骤4)中所述药物OXA、PKI-587与H-PDA的摩尔比为15～20:1:15～20。
本发明的另一个目的在于提供上述纳米递送体系在制备治疗肝细胞癌药物中的应用。
本发明的另一个目的在于提供上述纳米递送体系在提高肝细胞对化疗药物的敏感性方面的应用。
相比现有技术，本发明具有如下有益效果：
1、本发明的纳米药物载体具有大比表面积和中空纳米壳结构，显著提高了其装载效率，可有效地封装药物，在减少注射剂量的同时确保功效，从而减少全身性副作用。且具有高生物相容性、增强的通透性和保留能力(EPR)，能够实现在病灶组织的药物富集，而且有利于药物在病灶组织的有效渗透，提高药物输运效率。
2、本发明的纳米递送体系为OXA和PKI-587共装载中空聚多巴胺纳米颗粒(H-PDANPs)，基于H-PDANPs的内腔赋予其出色的载药能力，可有效地封装OXA和PKI-587。此外，利用H-PDA固有的高生物相容性和增强的通透性和保留能力(EPR)，载药递送系统(O/P-HP)可以将OXA和PKI-587有效地同时递送给HCC细胞，不仅能够实现在肝组织的药物富集，而且有利于药物OXA和PKI-587在肿瘤组织的有效渗透，而不会不必要地泄漏血液循环中的药物，达到同步的药代动力学并减少全身性副作用。因此本发明的纳米递送体系具有缓释、减毒和靶向作用。
3、本发明的纳米递送体系是将联合治疗和H-PDANPs的整合，其中O/P-HP的HCC细胞杀伤作用要强于游离药物与OXA或PKI-587的结合。此外，与仅使用基于NPs的OXA的单一疗法相比，基于H-PDANPs的OXA和PKI-587的联合疗法可通过调节上下游信号通路和同时抑制DNA修复酶的活性来降低化学抗性，从而显著放大PKI-587诱导的HCC细胞对OXA的药物反应，取得强大的抗肿瘤功效。从而有效解决游离药物的药代动力学不同步问题。该纳米递送体系可以提供新颖的联合治疗策略，具有对耐药性HCC治疗的互补功效。为基于不同靶点的蛋白和化疗药物共同递送提供了广阔的前景，这对于未来的临床应用具有重要意义。本发明的纳米递送体系制备方法简单易行，适宜大规模连续生产。
附图说明
图1为本发明纳米递送体系的制备过程、作用机制及效应的示意图。
图2为本发明制备纳米颗粒的透射电子显微镜图，A是SiO2，B是PDA-SiO2和C是H-PDA，比例尺：500nm。
图3为本发明制备的纳米颗粒的Zeta电位图。
图4为本发明制备的纳米颗粒的流体力学尺寸图。
图5为本发明制备的纳米递送体系的药物释放行为；A是在228nm的检测波长下通过HPLC评估的OXA的标准曲线，B是通过UV-可见分光光度计在310nm的波长下测量的PKI-587的标准曲线，C是OXA和PKI-587从H-PDANPs的药物释放行为。
图6为本发明制备的纳米递送体系对耐OXA的HepG2细胞增殖活力的影响图；A为不同药物处理对耐OXA的HepG2细胞的细胞毒性，B为不同药物处理耐OXA的HepG2细胞后菌落形成的代表性图像，C为蛋白质印迹法和半定量分析耐OXA的HepG2细胞处理24h后调节细胞增殖的效应分子的蛋白表达水平图；半定量数据分别表示为p-eIF4EBP1/elF4EBP1和p-S6K1/p70S6K。数据是平均值±SD，n＝3。**P<0.01，***P<0.001，下同。
图7为本发明制备的纳米递送体系对耐OXA的HepG2细胞迁移能力的影响图；A为Transwell实验中显示各组耐OXA的HepG2细胞迁移能力的代表性图片，B为划痕愈合实验中显示各组耐OXA的HepG2细胞迁移能力的代表性图片，C为蛋白质印迹分析和半定量分析显示了耐OXA的HepG2细胞在处理24h后MMP2和MMP9蛋白的表达水平。
图8为本发明制备的纳米递送体系对耐OXA的HepG2细胞DNA断裂点形成的影响图；A为间接免疫荧光试验中显示各组耐OXA的HepG2细胞中γ-H2AX灶和RAD51灶形成的代表图，B为蛋白质印迹分析和半定量分析揭示了不同组处理24h后，耐OXA的HepG2细胞细胞中γ-H2AX，p-BRCA1和RAD51蛋白的表达水平。
图9为本发明制备的纳米递送体系对耐OXA的HepG2细胞周期进程的影响图；A为通过流式细胞术确定的不同组处理24小时后的耐OXA的HepG2细胞的细胞周期分布，B为蛋白质印迹分析和半定量分析显示不同组处理24小时后耐OXA的HepG2细胞中P53，CHK1和p-Rb蛋白的表达水平。
图10为本发明制备的纳米递送体系对耐OXA的HepG2细胞凋亡的影响图；A为流式细胞术检测不同组处理24h后耐OXA的HepG2细胞的线粒体膜电位，B为AO/EB染色试验中显示不同组处理24h后耐OXA的HepG2细胞死亡状态的代表性图片，C为蛋白质印迹法和半定量分析确定在不同组处理24后耐OXA的HepG2细胞Bax，Bcl-2，c-Caspase3，Caspase3，c-PARP和PARP蛋白的表达水平。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细的描述，但本发明并不局限于此。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和原料，如无特殊说明，均可以从商业途径获得和/或根据已知的方法制备获得。
实施例1纳米递送体系(O/P-HPNPs)的制备
如图1所示，按照stober方法合成了SiO2 NPs，然后将多巴胺在SiO2 NPs的表面自聚合形成聚多巴胺(PDA)涂层，称为PDA-SiO2。为了高度提高所制备药物载体的负载能力，通过用HF蚀刻溶液蚀刻PDA-SiO2 NPs的内部SiO2组分来构建中空结构，从而获得中空PDA纳米颗粒(H-PDANPs)，再通过避光搅拌将OXA和PKI-587负载到纳米药物载体的空腔内，得到纳米递送体系(O/P-HPNPs)具体包括以下步骤：
1)SiO2 NPs的制备：在圆底烧瓶中将H2O(16.2mL)和乙醇(94.2mL)与氨(4.54mL)混合，并剧烈搅拌10min，然后在保持剧烈搅拌的同时滴加TEOS(5.4mL)进行反应，并继续搅拌5h得到的乳白色溶液，然后以9000rpm的转速离心10min，并将收集的沉淀物用水洗涤3次，在真空烘箱中干燥过夜，得到白色固体颗粒SiO2 NPs。
2)PDA-SiO2NPs的制备：将SiO2 NPs(175mg)用pH8.5 Tris缓冲溶液(10mmol/L)洗涤两次，并用Tris缓冲溶液重悬，使最终体积为90mL，然后缓慢加入500mg的多巴胺盐酸盐，在室温下搅拌24小时得到深灰色溶液，经离心(9000rpm，10min)分离收集、洗涤沉淀物，得到黑色沉淀PDA-SiO2NPs。
3)取175mg获得的PDA-SiO2 NPs与50mL的刻蚀溶液(7.5mLHF：15g氟化铵：25mL蒸馏水)混合，然后将混合物在室温下剧烈搅拌24h，然后离心(10000rpm，30分钟)以收集黑色沉淀物。将离心收集的沉淀物重复洗涤多次，直到上清液透明，再除去上清液用水悬浮沉淀物，即得到所述纳米药物载体H-PDA溶液。
4)将OXA溶解在PBS中得到OXA溶液，将PKI-587溶解在DMSO中得到PKI-587溶液，然后将这两种溶液缓慢加入到步骤3)得到的H-PDA溶液中，使混合溶液中OXA的浓度为2mg/mL，PKI-587的浓度为0.3mg/mL，H-PDA的浓度为2mg/mL，再将上述混合物在黑暗中搅拌24h后，离心(10000rpm，30分钟)去除过量的OXA和PKI-587，即得到所述纳米递送体系O/P-HPNPs。
实施例2理化性质表征
1、通过透射电子显微镜(TEM，JEM-2010HR，JEOL)观察本发明制备的纳米颗粒SiO2、PDA-SiO2和H-PDA的形貌，结果如图2所示。
从图中可以看出，制备的SiO2 NPs呈球形，直径约为323nm(图2A)。PDA涂层后，观察到明显的PDA-SiO2双层结构，PDA层为灰色，均匀地涂在SiO2表面，总粒径约433nm，表明PDA在SiO2表面上的成功涂覆和均匀涂层(图2B)。之后，在通过蚀刻溶液去除内部SiO2之后，获得了空心PDA纳米壳(H-PDA)(图2C)，单纯纳米壳的厚度约为55nm。
2、通过Malvern Zetasizer(NanoZS，Malvern)分析了所制备NP的zeta电位和动态光散射(DLS)尺寸分布，结果如图3和图4所示。
从图3中可以看出，H-PDA的流体力学尺寸约为454nm，高于SiO2的流体力学尺寸(342nm)，这与TEM图像中显示的结果一致。此外，发现制备的H-PDANPs经历了明显的电荷反转，从最初的-59.4mV SiO2变为最终的8.48mV(图4)。这些结果都证明了成功制备具有稳定且均匀的直径约433nm的空心壳结构的H-PDA。
3、通过高效液相色谱法(HPLC，Agilent 1200)定量检测OXA的负载量，检测波长为228nm，并使用UV-vis分光光度计确定波长为的PKI-587的负载量，检测波长为310nm。
OXAor PKI-587的负载能力使用以下公式计算：
Figure BDA0002681058200000081
首先确定HPLC和UV-vis光谱的标准曲线(图5A和图5B)，然后评估了本发明制备的纳米递送体系对OXA和PKI-587的负载能力。载有OXA的H-PDA(O-HP)和载有PKI-587的H-PDA(P-HP)作为对照组。经计算得出，O-HP中OXA的载药效率为32.5％，而O/P-HP中OXA和PKI-587的载药率分别为49.6％和7.0％。不出所料，与先前报道的固体PDANPs相比，H-PDA纳米壳显著提高了其装载效率，这主要归因于所制备的H-PDANPs的大比表面积和中空结构。H-PDA的高负载效率可以在减少注射剂量的同时确保功效，从而减少全身性副作用。
为了评估OXA和PKI-587从H-PDA的释放动力学，将5mL新鲜制备的O/P-HPNPs(500μg/mL)溶液置于离心管中并在振荡器中以100rpm/min的速度摇动。在每个预定时间点收集1mL释放介质，然后重新加入1mL新鲜PBS。分别通过HPLC和UV-vis分光光度计检测OXA和PKI-587的释放量。
从图5C可以看出，H-PDANPs可以长期和持续释放OXA和PKI-587，并且它们的释放率保持在稳定水平，避免了早期的突发释放并保持暴露于细胞的药物在固定的比率。
实施例3纳米递送体系可以更有效地抑制耐药细胞的增殖
1、细胞毒性试验
取生长状态良好的HR细胞(耐奥沙利铂的HepG2细胞)悬液，接种于96孔板，使最终密度为5×103细胞/孔。在细胞培养箱(37℃，5％CO2)中培养过夜后，弃去原培养液，并分别用含有OXA(2μM)，OXA+PKI-587(2μM OXA和0.1μM PKI-587)，H-PDA(Blank NPs 2μM)，O-HP(OXANPs含2μM OXA)和O/P-HP(OXA+PKI-587NPs含2μM OXA和0.1μM PKI-587)的新鲜培养基培养预定的时间，每组设置5个平行试验，除去培养基并用PBS洗涤细胞两次，然后向孔中添加10μL MTT溶液(5mg/mL，含0.5％MTT)。温育4小时后，将每个孔的上清液替换为150μL二甲基亚砜(DMSO)，随后将板在振荡器上低速摇动10分钟，以完全溶解晶体。同时，将未经任何治疗和仅接受药物治疗的组分别设为空白和对照组。用酶标仪(ELx800，Bio-Tek，Winooski，VT，USA)在490nm处测量每个孔的吸光度，并根据下式计算细胞活力：细胞活力(％)＝(实验孔的OD值-空白孔的OD值)/(对照孔的OD值-空白孔的OD值)×100％
由图6A可以看出，O/P-HP组在48小时内的细胞存活率不超过20％(17.63％)，显著低于其它组，表明O/P-HPNPs对HR细胞的杀伤作用更好。而且，有载体和无载体的联合治疗分别比单独有NP和无NP的OXA治疗具有更好的治疗效果，这暗示了联合治疗产生的合成杀伤力。此外，值得注意的是，尽管用游离的OXA和PKI-587进行处理，HR细胞在48小时内的存活率接近42.30％，远高于相同浓度的OXA和PKI-587的O/P-HP组。据推测，这归因于O/P-HP纳米药物的细胞内药物传递特性，从而最大限度地提高了封装的OXA和PKI-587的功效。
2、菌落形成试验
取生长状态良好的HR细胞(耐奥沙利铂的HepG2细胞)悬液，使最终密度为每孔1,000个细胞。在细胞培养箱(5％CO2，37℃)中培养过夜后，弃去旧培养基，分别用含有OXA(2μM)，OXA+PKI-587(含2μM OXA和0.1μM PKI-587)，H-PDA(Blank NPs 2μM)，O-HP(OXA NPs含2μM OXA)和O/P-HP(OXA+PKI-587NPs含2μM OXA和0.1μM PKI-587)的新鲜培养基孵育24小时，再替换为不含药物的新鲜培养基，并进行孵育，直到可以在平板上看到菌落为止。接下来，除去上清液后，将细胞依次用PBS洗涤两次，用5mL的4％多聚甲醛固定15分钟，并用结晶紫染料染色30分钟。随后，使用倒置荧光显微镜拍摄图像，并根据以下公式计算克隆形成率：克隆形成率(％)＝(克隆数/接种细胞数)×100％。
图6B中进一步证实了，本发明制备的纳米递送体系的联合疗法对HR细胞具有更高的联合杀伤力，该结果也与细胞毒性结果一致。
3、调节细胞增殖的效应分子的Western印迹分析试验
取生长状态良好的HR细胞悬液，接种于96孔板，使细胞密度均调整至2×107细胞/孔，然后在细胞培养箱(37℃，5％CO2)中培养24小时后，弃去原培养液，然后分别用含OXA(2μM)，OXA+PKI-587(含2μM OXA和0.1μM PKI-587)，H-PDA(Blank NPs 2μM)，O-HP(OXA NPs含2μM OXA)和O/P-HP(OXA+PKI-587NPs含2μM OXA和0.1μM PKI-587)的新鲜培养液培养细胞24小时，进行分组干预，每组设置5个平行试验。待处理时间结束后，通过胰蛋白酶消化并离心收集处理过的细胞，然后用强RIPA裂解物以及与蛋白酶抑制剂混合的溶液裂解。随后，使用BCA-200蛋白测定试剂盒确定裂解液中的蛋白质浓度。用10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶分离目标蛋白(p-eIF4EBP1，eIF4EBP1，p-S6K1和p70S6K)，然后将其转移到PVDF膜上。在室温下用5％脱脂奶密封膜1小时后，将膜与一抗在4℃下孵育过夜。然后将膜用TBST洗涤3次，并在室温下于含有二抗(1：4000稀释度)的TBST缓冲溶液中孵育1小时，然后通过TCL方法对其进行进一步显影。最后，通过凝胶成像系统对膜成像，并将结果与控制信号的百分比进行比较，以纠正印记之间的差异。
如图6C所示，在O/P-HP组中，p-eIF4EBP1，eIF4EBP1，p-S6K1和p70S6K的表达受到高度抑制，明显低于其它组，表明载药递送系统(O/P-HP)可通过调节p-eIF4EBP1和p-S6K1蛋白的表达来有效抑制细胞增殖。
实施例4纳米递送体系可以更有效地抑制耐药细胞的迁移
1、Tanswell分析
取生长状态良好的HR细胞悬液，Transwell的上室中，使细胞密度均调整至5×104/孔，并在5％CO2、37℃的培养箱中培养24小时，弃去原培养液，然后将上室中的培养基分别替换为包含OXA(2μM)，OXA+PKI-587(含2μM OXA和0.1μM PKI-587)，H-PDA(Blank NPs 2μM)，O-HP(OXANPs含2μM OXA)和O/P-HP(OXA+PKI-587NPs含2μM OXA和0.1μM PKI-587)的含药培养基，同时将600μL无血清培养基添加到Transwell的下室中，然后再共同孵育24小时。每组设置5个平行试验。取出transwell小室以除去孔中的培养基。剩余的细胞用PBS轻轻洗涤两次，并用甲醇固定30分钟，然后用0.1％的结晶紫染色20分钟。观察染色的细胞并在400倍显微镜下计数。
如图7A所示，在transwell分析中，经过不同处理后，OXA+PKI-587NPs组的迁移细胞数少于其他组，这表明O/P-HP纳米药物对HR细胞的迁移发挥了最强的抑制作用。
2、划痕愈合实验
取生长状态良好密度为1.2×106/mL的HR细胞悬液接种在12孔板上，然后在37℃的湿润培养箱(5％CO2)中培养24小时，弃去原培养液，然后分别加入含有OXA(2μM)，OXA+PKI-587(含2μM OXA和0.1μM PKI-587)，H-PDA(BlankNPs 2μM)，O-HP(OXANPs含2μM OXA)和O/P-HP(OXA+PKI-587NPs含2μM OXA和0.1μM PKI-587)的新鲜培养基。每组设置5个平行试验。通过使用20μL无菌移液器吸头每个孔的底部进行划痕。以预定的间隔时间(0和48小时)，通过倒置光学显微镜对孔中细胞之间的间隙进行成像。
如图7B所示，在划痕愈合实验中，经过不同处理后，OXA+PKI-587NPs组的伤口愈合率最低，这表明O/P-HP纳米药物对HR细胞的迁移发挥了较强的抑制作用。
3、与迁移相关的基因的Western印迹分析试验
取生长状态良好的HR细胞悬液，接种于96孔板，使细胞密度均调整至2×107细胞/孔，然后在细胞培养箱(37℃，5％CO2)中培养24小时后，弃去原培养液，然后分别用含OXA(2μM)，OXA+PKI-587(含2μM OXA和0.1μM PKI-587)，H-PDA(Blank NPs 2μM)，O-HP(OXA NPs含2μM OXA)和O/P-HP(OXA+PKI-587NPs含2μM OXA和0.1μM PKI-587)的新鲜培养液培养细胞24小时，进行分组干预，每组设置5个平行试验。待处理时间结束后，通过胰蛋白酶消化并离心收集处理过的细胞，然后用强RIPA裂解物以及与蛋白酶抑制剂混合的溶液裂解。随后，使用BCA-200蛋白测定试剂盒确定裂解液中的蛋白质浓度。用10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶分离目标蛋白(包括基质金属蛋白酶2(MMP2)和基质金属蛋白酶9(MMP9))，然后将其转移到PVDF膜上。在室温下用5％脱脂奶密封膜1小时后，将膜与一抗在4℃下孵育过夜。然后将膜用TBST洗涤3次，并在室温下于含有二抗(1：4000稀释度)的TBST缓冲溶液中孵育1小时，然后通过TCL方法对其进行进一步显影。最后，通过凝胶成像系统对膜成像，并将结果与控制信号的百分比进行比较，以纠正印记之间的差异，β-肌动蛋白用作对照。
如图7C所示，与其他组相比，在OXA+PKI-587NPs暴露下，在肿瘤转移和侵袭中起重要作用的MMP2和MMP9的表达被高度抑制，这与transwell和划痕愈合实验测定的结果一致。这些结果表明，基于H-PDA的纳米药物(O/P-HP)可以通过下调MMP2和MMP9的表达水平来更有效地抑制耐药细胞的迁移。
实施例5纳米递送体系增强了HR细胞对OXA的化学敏感性
在受到外部物理和化学因素刺激的DNA双链断裂过程中，γ-H2AX通过H2AX上的139-丝氨酸被ATM和ATR磷酸化的磷脂酰肌醇3-激酶磷酸化而形成。因此，γ-H2AX被广泛用作生物标记，以清楚地反映DNA损伤和修复的程度。同时，作为E3泛素蛋白连接酶，p-BRCA1特异性介导“Lys-6”连接的聚泛素链的形成，该链通过促进细胞对DNA损伤的反应而在DNA修复中起着至关重要的作用。RAD51，一种拥有339个氨基酸的蛋白质，通过与ssDNA结合蛋白RPA，BRCA2，PALB2和RAD52相互作用，在双链断裂修复过程中的DNA同源重组中也起着重要作用。
1、间接免疫荧光共定位试验
将500μL密度为5×105/mL的HR细胞悬液接种到装有细胞爬片的24孔板的孔中，并在培养箱中孵育过夜，弃去原培养液，分别用含有OXA(2μM)，OXA+PKI-587(含2μM OXA和0.1μM PKI-587)，H-PDA(BlankNPs 2μM)，O-HP(OXANPs含2μM OXA)和O/P-HP(OXA+PKI-587NPs含2μM OXA和0.1μM PKI-587)的新鲜培养基孵育24小时，将细胞用PBS洗涤两次，然后用4％多聚甲醛固定5分钟。将固定的细胞依次与0.3％TritonX-100在室温下孵育20分钟，与非免疫血清(5％BSA)在室温下孵育1h，与特异性一抗(γ-H2AX稀释度为1：100，RAD51稀释度为1：500和p-DNAPKcs(S2056)稀释度为1：1000)在4℃过夜放置，与荧光素标记的二抗(稀释度为1：100的绵羊抗小鼠Cy3-IgG，稀释度为1：1000的羊抗兔
Figure BDA0002681058200000121
偶联二抗488)在黑暗中孵育1小时。用PBS(pH7.4)清洗后，将细胞核用Hoechst33258染色15分钟。荧光图像通过荧光显微镜获得。
如图8A所示，当暴露于OXA时，HR细胞显示出比对照组更多的γ-H2AX焦点，表明DNA铂金直接损伤HR细胞。然而，当OXA和OXA NPs组中的DNA断裂时，RAD51焦点的形成显著增加，表明HR细胞固有的DNA自修复能力。与单独用OXA处理的组相比，在联合组中，尤其是在OXA+PKI-587NPs组中，γ-H2AX焦点的数量显著增加，几乎没有检测到形成的RAD51焦点。这可能归因于H-PDA NPs的细胞内递送，实现了更多的OXA和PKI-587被递送至HR细胞并作用于DNA分子。
2、蛋白质印迹分析试验
取生长状态良好的HR细胞悬液，接种于96孔板，使细胞密度均调整至2×107细胞/孔，然后在细胞培养箱(37℃，5％CO2)中培养24小时后，弃去原培养液，然后分别用含OXA(2μM)，OXA+PKI-587(含2μM OXA和0.1μM PKI-587)，H-PDA(Blank NPs 2μM)，O-HP(OXA NPs含2μM OXA)和O/P-HP(OXA+PKI-587NPs含2μM OXA和0.1μM PKI-587)的新鲜培养液培养细胞24小时，进行分组干预，每组设置5个平行试验。待处理时间结束后，通过胰蛋白酶消化并离心收集处理过的细胞，然后用强RIPA裂解物以及与蛋白酶抑制剂混合的溶液裂解。随后，使用BCA-200蛋白测定试剂盒确定裂解液中的蛋白质浓度。用10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶分离目标蛋白(γ-H2AX，RAD51和p-BRCA1)，然后将其转移到PVDF膜上。在室温下用5％脱脂奶密封膜1小时后，将膜与一抗在4℃下孵育过夜。然后将膜用TBST洗涤3次，并在室温下于含有二抗(1：4000稀释度)的TBST缓冲溶液中孵育1小时，然后通过TCL方法对其进行进一步显影。最后，通过凝胶成像系统对膜成像，并将结果与控制信号的百分比进行比较，以纠正印记之间的差异。
图8B是γ-H2AX，RAD51和p-BRCA1的表达水平图，从图中可以看出，与其它组相比，O/P-HP NPs有效抑制HR细胞中p-BRCA1和RAD51的表达，并上调γ-H2AX的表达水平(P<0.001)，表明所制备的O/P-HP纳米药物不仅可以在DNA上诱导强烈的铂损伤，而且可以抑制耐药细胞的DNA修复，从而最大程度地发挥OXA诱导的化学治疗作用。简而言之，PKI-587可以有效地抑制导致OXA功效减弱的DNA修复，从而放大了OXA诱导的DNA断裂点形成对HR细胞的损害。此外，由于与细胞内DNA分子的接触增强，因此利用H-PDA NP的封装和递送，OXA和PKI-587可以显示出更好的功效。
实施例6纳米递送体系诱导了G0/G1期耐药细胞的细胞周期停滞
1、细胞周期分析
据报道，对细胞DNA的破坏将导致细胞周期的相位分布发生变化。通常，处于S期晚期的细胞对外部物理和化学干扰表现出较强的抵抗力，而G0/G1末期细胞和G2/M期细胞对它们相对敏感。为探讨O/P-HP对细胞周期分布的影响，通过PI染色后经流式细胞术检测了不同处理后的HR细胞的细胞周期。
将细胞接种到24孔板的孔中，然后在细胞培养箱(5％CO2，37℃)中孵育过夜。去旧培养基后，分别用含有OXA(2μM)，OXA+PKI-587(含2μM OXA和0.1μM PKI-587)，H-PDA(BlankNPs 2μM)，O-HP(OXANPs含2μM OXA)和O/P-HP(OXA+PKI-587NPs含2μM OXA和0.1μM PKI-587)的新鲜培养基孵育24小时。除去上清液后，将细胞用PBS洗涤3次，然后通过用胰蛋白酶消化并离心(800g，5min)收集细胞。将细胞用250μL预冷PBS重悬，并将750μL预冷无水乙醇缓慢加入制备的细胞悬液中，然后在4℃固定2h。通过离心(1000g，5min)再次收集细胞，用预冷的PBS洗涤3次。然后加入100μLRnaseA溶液(100μg/mL)和400μL碘化丙啶染色溶液(50μg/mL)，在4℃下染色30分钟。通过流式细胞仪在488nm的激发波长下检测红色荧光和光散射。使用ModFit分析软件来分析细胞DNA含量和光散射。
在图9A中发现，与对照组和空白NP相比，OXA和OXA NPs组中的HR细胞大部分分布在S期，分别占64.51％和72.56％。相反，在用OXA+PKI-587处理时，S期细胞的比例显著降低至34.69％，并且在G0/G1期中检测到更多的细胞(64.50％)，并且在OXA+PKI-587NPs组中发现了更好的疗效，其中S期和G0/G1期细胞的比例分别为19.13％和77.70％，这表明掺入PKI-587可以有效地使已经对OXA不敏感的HR细胞重新敏感。
2、与细胞周期相关效应分子的蛋白质印迹分析
DNA分子的损伤还与CHK1和P53的表达水平有关，进而调节细胞周期的分布。另一个重要的蛋白质分子p-Rb也可以将细胞从G0/G1期转变为S期。因此，使用蛋白质印迹法定性和半定量地确定p-Rb，P53和CHK1的表达。
如图9B所示，与其他组相比，OXA+PKI-587NPs组显示出最低的p-Rb，P53和CHK1表达水平，表明O/P-HP纳米药物可以有效地转化OXA诱导的S期HR细胞进入G0/G1期，导致HR细胞对OXA的敏感性增加。这些结果表明，在反复受到OXA的作用后，HR细胞倾向于分布在对化疗有抗性的S期中，从而增强HR细胞对OXA的抗性，而PKI-587与OXA结合可以重新分布细胞周期阶段，将细胞周期阶段转变为对OXA敏感的G0/G1阶段相同，并通过抑制CHK1，P53和p-Rb的表达来限制向S阶段的转变。这可能是PKI-587增强HCC细胞对OXA化疗敏感性的机制之一。
实施例7纳米递送体系可以更有效地诱导耐药细胞凋亡
1、线粒体膜电位(ΔΨm)测量
PI3K/AKT/mTOR信号通路和DNA损伤修复通路(NHEJ和HR)的异常激活也可以刺激HCC细胞的抗凋亡作用，从而减弱化疗的效果。由于在细胞凋亡的早期阶段通常伴随着发生线粒体跨膜电位的破坏，因此，我们用JC-1染色后通过流式细胞术测量膜电位的变化来评估细胞凋亡的程度。
将500μL细胞悬浮液接种在24孔板上，密度为5×105/mL。在含有5％CO2的37℃细胞培养箱中孵育12小时后，将细胞与含有OXA(2μM)，PKI-587(0.1μM)，H-PDA(2μM)，O-HP(含2μM OXA)和O/P-HP(含2μM OXA和0.1μM PKI-587)的新鲜培养基一起孵育24小时。消化并离心(400g，5分钟)后，收集细胞并用0.5mL JC-1工作溶液(8μg/mL)重悬，并在培养箱中孵育30分钟。然后将细胞用缓冲溶液洗涤两次，并再次用500μL缓冲溶液重悬，以进行进一步的流式分析。对于流式细胞术，通过FL2通道检测包含红色JC-1聚集体的活细胞的线粒体，而通过FL1(FITC)通道检测包含绿色JC-1单体的凋亡或死细胞。
如图10A所示，OXA，OXA NP，OXA+PKI-587和OXA+PKI-587NP组均对HR细胞表现出明显的凋亡作用，而对照组和空白NP组的凋亡细胞却微不足道。特别是，OXA+PKI-587NPs对HR细胞表现出最强的凋亡作用，其中检测到的凋亡细胞为42.16％，远高于OXA+PKI-587组诱导的凋亡作用(27.46％)。
2、AO/EB染色
预先将AO溶液和EB溶液按1：1的比例混合来制备工作溶液。将细胞接种到细胞数为2×105的24孔板孔中，然后在37℃的培养箱(5％CO2)中培养12小时。然后将细胞与含有OXA(2μM)，OXA-PKI-587(0.1μM)，H-PDA(2μM)，O-HP(含2μM OXA)和O/P-HP(含2μM OXA和0.1μM PKI-587)的培养基一起孵育24小时。除去上清液后，将细胞用PBS洗涤两次，然后添加500μL含10μL制备的工作溶液的PBS缓冲液。在室温下培养2-5分钟后，观察染色的细胞，计数并在倒置荧光显微镜下成像。
在AO/EB分析中发现了类似的趋势，其中早期凋亡细胞的核染色质染色为绿色浓缩物或珠子，晚期凋亡细胞的核染色质染色为橙色浓缩物或珠子(图10B)。具体而言，与对照组和空白NPs组中观察到的少量凋亡细胞相比，所有其他组均可诱导HR细胞明显的凋亡，特别是发挥最强凋亡作用的OXA+PKI-587NPs组。
3、与细胞凋亡的效应分子的蛋白质印迹分析
DNA损伤还反馈到可调节肿瘤细胞凋亡的线粒体凋亡途径中，因此我们评估了HR细胞中线粒体凋亡途径相关蛋白分子的表达水平，包括Bcl-2家族促凋亡因子Bax和抗凋亡因子Bcl-2。另外，我们还评估了负责细胞凋亡的效应分子如c-Caspase3/Caspase3和c-PARP/PARP的表达水平。
在图10C中发现，与其他组相比，OXA+PKI-587组中促凋亡因子Bax的表达水平显著上调，而抗凋亡因子Bcl-2被抑制。此外，c-Caspase3和c-PARP效应分子也被高度表达，表明O/P-HP NP具有优异的促凋亡作用。所有以上结果表明，O/P-HP NPs通过上调促凋亡因子Bax和负责凋亡的效应分子以及同时下调抗凋亡因子Bcl-2来表现出优异的凋亡作用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不以本发明为限制，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种纳米药物载体，其特征在于，所述载体为空心PDA纳米壳，将PDA均匀地涂在球形SiO2NPs表面，得到PDA-SiO2双层结构，在通过蚀刻溶液去除内部SiO2之后，即获得所述空心PDA纳米壳，且所述空心PDA纳米壳的粒径为420～450nm，厚度为50～60nm。
2.一种纳米递送体系，其特征在于，包括权利要求1所述的纳米药物载体和负载在纳米药物载体内的OXA和PKI-587。
3.根据权利要求2所述纳米递送体系，其特征在于，所述OXA和PKI-587的摩尔比约为15～25:1。
4.一种如权利要求2或3所述纳米递送体系的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将H2O、无水乙醇与氨混合，并剧烈搅拌，然后在保持剧烈搅拌的同时滴加TEOS进行反应，充分反应后，得到的乳白色溶液，然后离心收集沉淀物，再经洗涤、干燥后，得白色固体颗粒SiO2 NPs；
2)将步骤1)得到的白色固体颗粒SiO2NPs用Tris缓冲溶液洗涤并重悬，得到均匀溶液，然后加入多巴胺盐酸盐，在室温下搅拌反应，得到深灰色溶液，再将其离心、洗涤得到黑色沉淀PDA-SiO2NPs；
3)将步骤2)得到的黑色沉淀PDA-SiO2与刻蚀溶液混合，然后将混合物在室温下剧烈搅拌，反应结束后，将离心收集的沉淀物重复洗涤，直到上清液透明，再除去上清液用水悬浮沉淀物，即得到所述纳米药物载体H-PDA溶液；
4)将溶于PBS的OXA和溶于DMSO的PKI-587缓慢加入到步骤3)得到的H-PDA溶液中得到混合溶液，使混合溶液中OXA的浓度为1.5mg/mL～2.5mg/mL，PKI-587的浓度为0.2mg/mL～0.4mg/mL，H-PDA的浓度为1.5mg/mL～2.5mg/mL，再将上述混合物在黑暗中搅拌12～24h后，离心去除过量的OXA和PKI-587，即得到所述纳米递送体系O/P-HPNPs。
5.根据权利要求4所述纳米递送体系的制备方法，其特征在于，步骤1)中所述H2O、无水乙醇、氨与TEOS的体积比为16～24:4～6:0.8～1.2:0.96～1.44。
6.根据权利要求4所述纳米递送体系的制备方法，其特征在于，步骤2)中所述SiO2 NPs与多巴胺盐酸盐的质量比为1:2～3。
7.根据权利要求4所述纳米递送体系的制备方法，其特征在于，步骤3)中所述PDA-SiO2与刻蚀溶液的质量体积比为2.8～4.2mg:0.8～1.2mL。
8.根据权利要求4所述纳米递送体系的制备方法，其特征在于，步骤4)中所述药物OXA、PKI-587与H-PDA的摩尔比为15～20:1:15～20。
9.权利要求2～3任一项所述纳米递送体系或如权利要求4～8任一项方法制备的纳米递送体系在制备治疗肝细胞癌药物中的应用。
10.权利要求2～3任一项所述纳米递送体系或如权利要求4～8任一项方法制备的纳米递送体系在提高肝细胞对化疗药物的敏感性方面的应用。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114392248A (zh) * 2020-12-31 2022-04-26 淮阴工学院 载花青素纳米粒的制备方法
CN115813885A (zh) * 2022-03-22 2023-03-21 华东师范大学 一种ros响应的靶向性抗氧化纳米药物、其制备方法及其应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20140193489A1 (en) * 2013-01-07 2014-07-10 Bar-Ilan University Dopamine Nanocapsules and Uses Thereof
CN106139144A (zh) * 2016-06-27 2016-11-23 华中科技大学同济医学院附属协和医院 一种具有协同抗肿瘤特性的透明质酸修饰的金‑碳纳米球及其制备方法与应用
CN106620702A (zh) * 2017-02-14 2017-05-10 扬州大学 一种金/氮掺杂的空心碳纳米球核壳材料的制备方法
CN108837161A (zh) * 2018-08-24 2018-11-20 东华大学 一种聚多巴胺包裹的金核/中空硅壳纳米材料及其制备和应用
CN110496113A (zh) * 2019-07-23 2019-11-26 中国科学院长春应用化学研究所 一种含青蒿素类药物的纳米复合材料及其制备方法与应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20140193489A1 (en) * 2013-01-07 2014-07-10 Bar-Ilan University Dopamine Nanocapsules and Uses Thereof
CN106139144A (zh) * 2016-06-27 2016-11-23 华中科技大学同济医学院附属协和医院 一种具有协同抗肿瘤特性的透明质酸修饰的金‑碳纳米球及其制备方法与应用
CN106620702A (zh) * 2017-02-14 2017-05-10 扬州大学 一种金/氮掺杂的空心碳纳米球核壳材料的制备方法
CN108837161A (zh) * 2018-08-24 2018-11-20 东华大学 一种聚多巴胺包裹的金核/中空硅壳纳米材料及其制备和应用
CN110496113A (zh) * 2019-07-23 2019-11-26 中国科学院长春应用化学研究所 一种含青蒿素类药物的纳米复合材料及其制备方法与应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
YINCI ZHANG ET AL.: "PKI-587 enhances chemosensitivity of oxaliplatin in hepatocellular carcinoma through suppressing DNA damage repair pathway (NHEJ and HR) and PI3K/AKT/mTOR pathway", 《AM J TRANSL RES》 *
ZHANG YINCI ET AL.: "Oxaliplatin and Gedatolisib (PKI-587) Co-Loaded Hollow Polydopamine Nano-Shells with Simultaneous Upstream and Downstream Action to Re-Sensitize Drugs-Resistant Hepatocellular Carcinoma to Chemotherapy", 《JOURNAL OF BIOMEDICAL NANOTECHNOLOGY》 *
宋冰等: "基于聚多巴胺药物载体的制备及其性能研究", 《广州化工》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114392248A (zh) * 2020-12-31 2022-04-26 淮阴工学院 载花青素纳米粒的制备方法
CN114392248B (zh) * 2020-12-31 2023-06-30 淮阴工学院 载花青素纳米粒的制备方法
CN115813885A (zh) * 2022-03-22 2023-03-21 华东师范大学 一种ros响应的靶向性抗氧化纳米药物、其制备方法及其应用

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