CN115808529A

CN115808529A - 一种蛋白质pars2在制备诊断酒精性心肌病的试剂中的应用及试剂盒

Info

Publication number: CN115808529A
Application number: CN202211485638.XA
Authority: CN
Inventors: 贾栋; 曹阳; 齐帮若
Original assignee: Harbin Medical University
Current assignee: Harbin Medical University
Priority date: 2022-11-24
Filing date: 2022-11-24
Publication date: 2023-03-17
Anticipated expiration: 2042-11-24
Also published as: CN115808529B

Abstract

一种蛋白质PARS2在制备诊断酒精性心肌病的试剂中的应用及试剂盒，所述诊断试剂盒包括酶标板，人源蛋白质PARS2，标准血清，酶标试剂，酶底物溶液，封闭液，样品稀释液，洗涤液和终止液。本发明提供一种灵敏、安全、可靠，易操作的商品化试剂盒，能够定性测定人血清中抗蛋白质PARS2的IgM抗体的水平，有助于辅助早期酒精性心肌病的诊断；提供的生物标志物PARS2特异性为90％敏感性为93％，具有高特异性和高灵敏度的特点。

Description

一种蛋白质PARS2在制备诊断酒精性心肌病的试剂中的应用及试剂盒

技术领域

本发明属于生物科学领域，特别涉及一种诊断试剂盒及PARS2在制备酒精性心肌病早期诊断试剂中的应用。

背景技术

酒精性心肌病(Alcoholic cardiomyopathy，ACM)是指因长期大量饮酒所致的以心脏扩大、心律失常和充血性心力衰竭为特征的一类继发性心肌病变。随着人民生活水平提高，饮酒人数增加，ACM发病率呈逐年上升趋势。据统计ACM占所有心脏疾病的3.8％，而几乎一半扩张型心肌病患者都是由酒精摄入引起的(Piano MR，Clinical Characteristicsand Pathophysiology，2002，121:1638-1650)。终末期ACM患者会出现心功能下降的各种临床症状，同时累及脑、神经系统、肝脏，骨骼肌等靶器官出现相应症状，最终导致病人死亡。据报道3年ACM患者病死率高达40％，4年病死率接近50％(李为民，Chinese Journal ofPractical Internal Medicine，2012)。因而ACM已成为世界各国所日益关注的公共健康问题。为了降低死亡率，提高ACM的治疗效果，关键是ACM的早期发现、早期诊断、早期治疗，然而关于ACM的诊断方法是及其有限的，目前ACM被欧洲心脏病学会和由美国心脏协会归为扩张型心肌病(DCM)(Elliott P，Eur Heart，2008；29:270-276)。因此ACM的诊断通常是在患有DCM的患者中排除的，这部分DCM患者没有确定的病因并且有长期的严重酒精滥用史(至少5年内每天超过80g)(Fauchier L,Eur Heart，2000；21:306-314)。但是具体多少酒精以及多长时间的应用会导致ACM是有争议的。因此，关于ACM，目前尚无特异性诊断方法及标准。从长远角度来看，为了实现对ACM的早期高灵敏性，高特异性的诊断，急需在分子水平上寻找到更敏感、更特异的ACM的生物标志物。

理想的ACM标志物应符合以下几个条件：(1)敏感性高；(2)特异性高；(3)标志物能够和其他心脏疾病区分开来；(4)半衰期短，有效治疗后浓度能够很快的下降，能够较快的反应治疗效果；(5)存在于体液，特别是血液中，易于检测。目前还没有符合上述条件的ACM生物标志物开发出来用于诊断ACM，为了实现对ACM的早期高灵敏性，高特异性的诊断，急需在分子水平上寻找。

蛋白PARS2(prolyl-tRNA synthetase 2)脯氨酸-tRNA连接酶，含有475个氨基酸，主要分布在线粒体中。以往的研究注意到，PARS2与阿尔卑斯综合征，一种进行性的神经变性疾病，其呈现在婴儿期或幼儿期，其特征在于脑灰质的弥漫性变性有相关性，最近的研究显示PARS2中的突变会导致肾功能疾病和心机病变(Sofou K,Molecular genetic genomicmedicine.2015；Jan,3(1):59-68)

目前，未见有将PARS2蛋白质(基因ID:25973)作为酒精性心肌病生物标志物的报导。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种诊断试剂盒，以解决现有技术对酒精性心肌病诊断不能实现早期高灵敏性、高特异性的技术性问题。

本发明的第二目的在于提供一种PARS2(基因ID:25973)在制备酒精性心肌病早期诊断试剂中的应用，以解决现有技术不能实现对酒精性心肌病的早期高灵敏性、高特异性诊断的技术性问题。

本发明的一种人源蛋白质PARS2的应用，所述的人源蛋白质PARS2在制备诊断酒精性心肌病的试剂中的应用。

进一步地，所述的人源蛋白质PARS2在制备测定血清中抗所述人源蛋白质PARS2的IgM抗体的浓度的试剂。

进一步地，所述的试剂盒包括酶标板、人源蛋白质PARS2、标准血清、酶标试剂、酶底物溶液、封闭液、样品稀释液、洗涤液和终止液。

进一步地，所述人源蛋白质PARS2是从酿酒酵母中过量表达、亲和纯化得到，浓度为10μg/mL。

进一步地，所述标准血清由标准血清A和标准血清B组成，所述标准血清A为稀释于样品稀释液中的健康人血清；所述标准血清B为稀释于样品稀释液中的PARS2抗体为阳性的血清；所述的PARS2抗体浓度为100U/mL。

进一步地，所述酶标试剂是浓度为0.1-1μg/mL的偶联HRP的抗人IgM二抗。

进一步地，所述酶底物溶液为TMB溶液，所述TMB溶液由显色剂A和显色剂B组成；其中，1000mL显色剂A溶液中含有醋酸钠27.2g、柠檬酸3.2g和30％双氧水0.6mL；1000mL显色剂B溶液中含有TMB 700mg、DMSO 40mL和柠檬酸·H₂O 10.2g。

进一步地，所述封闭液为1000mL溶液中含5g BSA、8g NaCl、0.2g KH₂PO₄、2.9gNa₂HPO₄·12H₂O和0.2g KCl；所述样品稀释液为1000mL溶液中含8g NaCl、0.2g KH₂PO₄、2.9gNa2HPO4·12H₂O和0.2g KCl；所述洗涤液为1000mL溶液中含8g NaCl、0.2g KH₂PO₄、2.9gNa₂HPO₄·12H₂O、0.2g KCl和0.5mL Tween-20；所述终止液为2mol/L H₂SO₄溶液。

进一步地，所述试剂盒中的试剂均加入防腐剂。

进一步地，用人源蛋白质PARS2包被酶标板，向包被有人源蛋白质PARS2的酶标板孔中加入待测血清，再与酶标试剂结合，形成人源蛋白质PARS2-抗体-酶标二抗复合物，经过洗涤后加底物TMB显色，TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色，测定血清中抗人源蛋白质PARS2值，若抗人源蛋白质PARS2值≤1.5，则判定为健康，若2.7>抗人源蛋白质PARS2值≥2，则判定为高危；若抗人源蛋白质PARS2值>2.7，则判定为酒精性心肌病。

本发明在前期研究中利用人蛋白质组芯片高通量、快速分析的优势，分析了酒精性心肌病人相关血清120份(酒精性心肌病人40份、DCM患者20份、健康人血清60份)，在较短时间内比较了酒精性心肌病人、DCM患者和健康人样品中的不同，给出了候选血清生物标志物，以期早期诊断和有效治疗ACM。

与现有技术相比，本发明有以下优点：

1、提供一种灵敏、安全、可靠、易操作的商品化试剂盒，定性测定人血清中抗蛋白质PARS2的IgM抗体的水平，有助于辅助早期诊断酒精性心肌病；

2、提供的血清标志物PARS2的特异性为90％，敏感性为93％，具有高特异性和高敏感性的特点。

附图说明

图1为银染鉴定PARS2的表达浓度、纯化状况的示意图；

图中：1表示标准BSA溶液浓度为5μg/mL；2表示标准BSA溶液浓度为10μg/mL；3表示标准BSA溶液浓度为25μg/mL；4表示标准BSA溶液浓度为50μg/mL；5表示标准BSA溶液浓度为100μg/mL；6表示经琼脂糖亲和介质(谷胱甘肽)分离纯化后的PARS2蛋白质样品(含GST标签)；7表示蛋白质分子量marker，从大到小分子量分别是：130KD，95KD，72KD，55KD；

图2为Western-Blotting鉴定PARS2的表达、纯化状况的示意图；

图中：1表示经琼脂糖亲和介质(谷胱甘肽)(国家生化工程技术研究中心)分离纯化后的PARS2蛋白质样品(含GST标签)；2表示蛋白质分子量marker，从大到小分子量分别是：130KD，95KD，72KD，55KD；

图3为健康人、高危、酒精性心肌病患者血清中抗蛋白质PARS2的IgM抗体的浓度变化曲线图，注：图中的数值是健康人、高危、酒精性心肌病患者各500份血清样本中的抗PARS2的IgM浓度的相对水平。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面将详细叙述本发明所揭示内容的精神，任何所属技术领域技术人员在了解本发明内容的实施例后，当可由本发明内容所教示的技术，加以改变及修饰，其并不脱离本发明内容的精神与范围。

本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，但并不作为对本发明的限定。

实施例

1、表达、纯化及鉴定PARS2：

人源蛋白质PARS2是由基因工程改造过的酿酒酵母(获取自国家生化工程技术研究中心)利用半乳糖诱导过量表达后，经琼脂糖亲和介质(谷胱甘肽)分离纯化而得到，对其进行银染定量和Western-Blotting鉴定的结果分别如图1和图2所示。

2、血清样品的准备：

全血标本于室温放置2小时后于2000g离心5分钟左右，取上清即可立即检测；或进行分装，并将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。解冻后的样品应再次离心，然后检测。所检测样品中不能含有NaN₃，因为NaN₃抑制辣根过氧化物酶的(HRP)活性。

3、ELISA法中各种缓冲液及试剂的配制方法：

(1)包被缓冲液

(2)样品稀释液

(3)洗涤液

(4)封闭液

(5)酶底物溶液：显色剂A和显色剂B

(6)终止液：

4、ELISA法测定血清中PARS2的IgM抗体的浓度，以辅助早期诊断酒精性心肌病：具体操作步骤如下：

(1)包被：将纯化的人源PARS2蛋白溶液用包被缓冲液稀释至1μg/mL，加入到96孔酶标板中，每孔100μL，4℃过夜；洗涤液洗板3次，甩干。

(2)封闭：加入封闭液200μL，室温孵育2小时；洗涤液洗板3次，甩干。

(3)标准品与样品的稀释与加样：将标准品与待测血清样品1:100用样品缓冲液稀释至100μL，加入到各自的抗原测定孔板中。注意不要有气泡，将样品加于梅标板孔底部，轻轻晃动混匀，酶标板上加覆膜。标准品及待检测样品临用前15分钟内配制，用完丢弃，下次检测使用新鲜配制的标准品。

(4)温育：酶标板置于37℃反应120分钟，甩净孔中液体，不用洗涤。

(5)加酶：每孔加HRP标记的anti-Human IgM抗体100μL，37℃反应60分钟。甩净孔中液体，同上洗板5次拍干。

(6)显色：拍干后各孔先滴加显色剂A 50μL，再加入显色剂B 50μL，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟。

(7)终止：依序每孔加终止液50μL，终止反应。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。底物反应时间到后应尽快加入终止液。

(8)结果判定：

a.用酶联仪在450nm波长依次测量各孔的光密度(OD值)。

单位值(U/mL)＝(A450<样品>-A450<标准血清A>)/(A450<标准血清B>-A450<标准血清>)

*A450是450nm处吸光度的缩写。

*目前PARS2抗体尚无国际通行的参考标准，因此本检测结果校准时采用了相对单位。

b.血清中抗PARS2值的判定

c.质量控制

每个检测结果必须符合以下标准：

标准血清A的A450：≤0.100

标准血清B的A450：≥0.700

如不符合上述标准，则结果视为无效，必须重新检测。

d.检验结果的解释

对60例健康人血清、40例酒精性心肌病患者血清、20例高危患者血清的ROC分析，确立了以上参考值。

特异性和敏感性检测：采用500份临床确诊的酒精性心肌病患者血清、500份具有饮酒史并且有相似症状，但是临床检测还没有完全满足酒精性心肌病指标的高危人群血清及500份健康人群血清，共计1500份血清进行特异性和敏感性检测(如图3)。本发明的诊断试剂盒辅助早期诊断酒精性心肌病的特异性为90％，敏感性为93％，均大大高于现有技术中酒精性心肌病的诊断指标。(酒精性心肌病的诊断尚无特异性的方法和标准。通常有大量饮酒史(纯乙醇量125ml/d，即啤酒4瓶或白酒150克)，持续10年以上；或每日摄入150克酒精5年以上；或每日饮酒精80克以上超过1年时间，出现与扩张性心肌病相似的症状和体征，并能排除其他心脏病，即应考虑酒精性心肌病。)

本发明还提供人蛋白质PARS2在制备酒精性心肌病早期诊断试剂中的新用途。以上公开的仅为本申请的几个具体实施例，但本申请并非局限于此，任何本领域的技术人员能思之的变化，都应落在本申请的保护范围内。

Claims

1.一种人源蛋白质PARS2的应用，其特征在于所述的人源蛋白质PARS2在制备诊断酒精性心肌病的试剂中的应用。

2.根据权利要求1所述的一种人源蛋白质PARS2的应用，其特征在于所述的人源蛋白质PARS2在制备测定血清中抗所述人源蛋白质PARS2的IgM抗体的浓度的试剂。

3.如权利要求1或2所述的一种人源蛋白质PARS2的试剂盒，其特征在于所述的试剂盒包括酶标板、人源蛋白质PARS2、标准血清、酶标试剂、酶底物溶液、封闭液、样品稀释液、洗涤液和终止液。

4.根据权利要求3所述的一种人源蛋白质PARS2的试剂盒，其特征在于所述人源蛋白质PARS2是从酿酒酵母中过量表达、亲和纯化得到，浓度为10μg/mL。

5.根据权利要求3所述的一种人源蛋白质PARS2的试剂盒，其特征在于所述标准血清由标准血清A和标准血清B组成，所述标准血清A为稀释于样品稀释液中的健康人血清；所述标准血清B为稀释于样品稀释液中的PARS2抗体为阳性的血清；所述的PARS2抗体浓度为100U/mL。

6.根据权利要求3所述的一种人源蛋白质PARS2的试剂盒，其特征在于所述酶标试剂是浓度为0.1-1μg/mL的偶联HRP的抗人IgM二抗。

7.根据权利要求3所述的一种人源蛋白质PARS2的试剂盒，其特征在于所述酶底物溶液为TMB溶液，所述TMB溶液由显色剂A和显色剂B组成；其中，1000mL显色剂A溶液中含有醋酸钠27.2g、柠檬酸3.2g和30％双氧水0.6mL；1000mL显色剂B溶液中含有TMB 700mg、DMSO40mL和柠檬酸·H₂O 10.2g。

8.根据权利要求3所述的一种人源蛋白质PARS2的试剂盒，其特征在于所述封闭液为1000mL溶液中含5g BSA、8g NaCl、0.2g KH₂PO₄、2.9g Na₂HPO₄·12H₂O和0.2g KCl；所述样品稀释液为1000mL溶液中含8g NaCl、0.2g KH₂PO₄、2.9g Na2HPO4·12H₂O和0.2g KCl；所述洗涤液为1000mL溶液中含8g NaCl、0.2g KH₂PO₄、2.9g Na₂HPO₄·12H₂O、0.2g KCl和0.5mLTween-20；所述终止液为2mol/L H₂SO₄溶液。

9.根据权利要求3所述的一种人源蛋白质PARS2的试剂盒，其特征在于所述试剂盒中的试剂均加入防腐剂。

10.如权利要求3所述的一种人源蛋白质PARS2的试剂盒使用方法，其特征在于用人源蛋白质PARS2包被酶标板，向包被有人源蛋白质PARS2的酶标板孔中加入待测血清，再与酶标试剂结合，形成人源蛋白质PARS2-抗体-酶标二抗复合物，经过洗涤后加底物TMB显色，TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色，测定血清中抗人源蛋白质PARS2值，若抗人源蛋白质PARS2值≤1.5，则判定为健康，若2.7>抗人源蛋白质PARS2值≥2，则判定为高危；若抗人源蛋白质PARS2值>2.7，则判定为酒精性心肌病。