CN115791729A - 一种基于比率型荧光探针定量检测血清中acp的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于比率型荧光探针定量检测血清中ACP的方法,(1)以碳化钛(Ti3C2)MXene粉末为前驱体,加入氮源,通过溶剂热法合成了发射蓝色荧光的氮掺杂Ti3C2MXene量子点(N‑Ti3C2MQDs);(2)将邻苯二胺(OPD)与Ce4+混合反应,生成发射黄色荧光的2,3‑二氨基吩嗪(DAP),并将其与合成的发射蓝色荧光的N‑Ti3C2MQDs混合。由于内滤效应,DAP猝灭蓝色量子点的荧光,形成黄色荧光较强、蓝色荧光较弱的比率型荧光探针;(3)ACP催化水解L‑抗坏血酸‑2‑磷酸(AA2P)生成的抗坏血酸(AA),可以将Ce4+还原为Ce3+,从而使产生的DAP减少,黄色荧光减弱,被猝灭的蓝色量子点的荧光恢复。借此可以根据蓝色和黄色荧光强度的比值定量检测ACP浓度。该方法灵敏度高、选择性好、检测简便。
Description
技术领域
本发明属纳米材料、荧光传感技术和生物分析检测领域,具体涉及基于量子点的比率荧光传感平台定量测定血清中酸性磷酸酶(ACP)的方法。
背景技术
酸性磷酸酶(Acid phosphatase,ACP)是一种广泛存在于人体体液和组织中的水解酶,能够将磷酸酯底物去磷酸化。血清ACP浓度异常多与前列腺癌、戈谢病、血栓性静脉炎、甲状旁腺功能亢进、多发性骨髓瘤等多种疾病的病理生理过程有关。其中,前列腺癌是目前全球男性发病率排第二位、死亡率排第五位的恶性肿瘤。但是,对ACP浓度异常的早期发现和适当治疗则有可能帮助根除该病。因此,开发灵敏度高、选择性好的ACP检测方法,对疾病的早期诊断和治疗具有重要的临床意义。
目前用于检测ACP的方法主要有色谱法和电化学法等,但是这些方法都需要复杂的操作和昂贵的仪器,因此难以普及。由于荧光方法灵敏度高,选择性好,简单且信号易读,最近对于检测ACP浓度的荧光方法的探索已经取得了较大的进步。如利用碳点、石墨烯量子点、铜纳米簇作为信号探针建立的荧光方法。但是这些方法大多基于单个荧光信号变化,非常容易受到外界条件的干扰。因此,利用在同一激发波长下可以输出两个荧光信号的特性,建立的比率型荧光探针,可以克服上述缺点,改善探针的检测性能。另外,比率荧光探针能够展现荧光颜色的变化,这有利于现场检测与诊断,具有重要的意义。
二维过渡金属碳/氮化物MXene是二维纳米材料中最年轻的成员之一,它独特的理化性质使其近年来在能源存储与转换、传感器、多功能聚合物复合材料等多个领域受到广泛关注。MXene量子点是由二维MXene衍生而来的一种新兴的零维纳米材料。将MXenes优异的亲水性和生物相容性与量子点的化学稳定性和卓越的光致发光特性相结合,MXene量子点已成为环境监测、食品分析和生物医学检测等领域极具前景的分析工具。基于MXene量子点建立的比率荧光探针具有较高的稳定性和灵敏度,可实现更精确、有效的检测。据我们所知,目前还没有基于MXene量子点的比率荧光探针用于ACP的检测。
发明内容
针对现有技术的问题,本发明的目的在于提供一种用于定量检测血清中ACP的比率型荧光探针的制备方法,基于量子点的比率荧光传感平台,具有灵敏度高、选择性好、检测简便的优点,大大减少了来自探针浓度,光源,仪器效率和测量条件的干扰。
为了实现上述发明目的,本发明采用的技术方案为:
一种基于比率型荧光探针定量检测血清中ACP的方法,所述方法包括以下步骤:
(1)合成发射蓝色荧光的N-Ti3C2 MQDs;
在某个特殊的实施例中,所述N-Ti3C2 MQDs的制备方法为:
将Ti3C2 MXene粉末溶于DMF中,在N2条件下超声30分钟后,加入二乙烯三胺(DETA)并滴加NH3·H2O调节pH。将混合溶液密封在聚四氟乙烯内衬反应釜中,150℃反应8h,冷却至室温后,将得到的黑色悬浮液离心、过滤后得到N-Ti3C2 MQDs溶液,其发射波长范围在400-490nm。
(2)将不同浓度的ACP标准曲线溶液与底物AA2P于15℃-55℃孵育后,底物AA2P在ACP的催化下产生AA;
(3)向步骤(2)所得体系中加入Ce4+,AA将Ce4+还原为Ce3+;再加入OPD继续反应,OPD被Ce4+氧化生成黄色荧光产物DAP,而Ce3+无法将OPD氧化生成DAP;
(4)向步骤(3)所得体系中加入步骤(1)所得N-Ti3C2 MQDs,步骤(3)所得体系中的DAP与N-Ti3C2 MQDs发生内滤效应,从而使得N-Ti3C2 MQDs的荧光被猝灭,形成蓝色荧光较弱黄色荧光较强的比率型荧光探针;
(5)标准曲线溶液中ACP浓度越大,产生的AA越多,更多Ce4+被还原,从而使得DAP生成减少,黄色荧光减弱,被猝灭的N-Ti3C2 MQDs蓝色荧光恢复,形成蓝色荧光较强黄色荧光较弱的比率型荧光探针;
(6)根据N-Ti3C2 MQDs与DAP两者荧光强度的比值对ACP的浓度绘制标准曲线;
(7)将待测血清按步骤(2)~(4)操作,根据标准曲线,完成对待测血清中ACP的定量检测。
进一步的,步骤(1)中合成的N-Ti3C2 MQDs发射波长范围为400-490nm。
进一步的,步骤(2)中,不同浓度的ACP标准曲线溶液与AA2P的共孵育时间为10-60min。
进一步的,步骤(2)中,底物AA2P浓度为0.01-0.25mM。
进一步的,步骤(2)中,底物AA2P浓度为0.05-0.25mM;随着浓度的增加,荧光强度的比值先增加后维持不变,在荧光强度的比值基本保持恒定时,检测更佳,因此最佳底物AA2P浓度为0.05-0.25mM。
进一步的,步骤(3)中,Ce4+浓度为0.1-1.2mM;
进一步的,步骤(3)中,OPD浓度为0.05-1.2mM;
进一步的,步骤(3)中,OPD浓度为0.2-1.2mM;随着浓度的增加,荧光强度的比值先减后维持不变,在荧光强度的比值基本保持恒定时,检测更佳,因此最佳OPD浓度为0.2-1.2mM。
进一步的,步骤(4)中,N-Ti3C2 MQDs在步骤(3)所得体系浓度为0.1-0.5mg/mL。
进一步的,步骤(6)中,根据N-Ti3C2 MQDs和荧光产物DAP在450nm及560nm处的荧光强度的比值对不同浓度ACP标准曲线溶液绘制标准曲线。
进一步的,步骤(7)所述将待测血清按步骤(2)~(4)操作具体为:
将待测血清与底物AA2P于15℃-55℃孵育后,底物AA2P在ACP的催化下产生AA;
向上述体系中加入Ce4+,AA将Ce4+还原为Ce3+;再加入OPD继续反应,OPD被Ce4+氧化生成黄色荧光产物DAP,而Ce3+无法将OPD氧化生成DAP;
向上述体系中加入步骤(1)所得N-Ti3C2 MQDs,Ce4+被AA还原,产生的黄光荧光产物DAP减少,形成蓝色荧光较强黄色荧光较弱的比率型荧光探针;
根据待测血清N-Ti3C2 MQDs与DAP两者荧光强度的比值(即蓝色荧光与黄色荧光比值)与标准曲线对应,完成对待测血清中ACP的定量检测。
本发明定量检测血清中ACP的原理是:
首先,Ce4+具有很强的类氧化酶活性,可直接氧化OPD生成黄色荧光产物DAP。DAP的吸收光谱与N-Ti3C2 MQDs的发射光谱有明显的重叠,利用内滤效应可以有效地猝灭N-Ti3C2MQDs的荧光。而ACP催化底物AA2P水解得到的产物AA可将Ce4+还原为Ce3+,抑制OPD的氧化。因此,当存在ACP时,可抑制黄色荧光产物DAP生成,黄色荧光降低,与N-Ti3C2 MQDs的内滤效应减弱,N-Ti3C2 MQDs蓝色荧光逐渐恢复。因此通过建立ACP的浓度与探针的蓝色荧光和黄色荧光强度的比值之间的相关性可以将此探针应用于ACP的检测。
有益效果:本发明利用ACP水解底物AA2P产生的AA可抑制Ce4+氧化OPD生成黄色荧光产物DAP过程,从而抑制DAP与N-Ti3C2 MQDs之间的荧光内滤效应,建立了一种用于ACP定量检测的比率荧光探针。与传统的单信号检测方法相比,具有灵敏度高、选择性好、检测简便的优点,并且可以减少来自探针浓度,光源,仪器效率和测量条件的干扰,可以直接应用于血清中ACP的检测。整个检测过程环保、安全、方便。
本发明所述MQDs是指:MXene量子点。
本发明所述ACP是指:酸性磷酸酶。
本发明所述AA2P是指:L-抗坏血酸-2-磷酸。
本发明所述AA是指:抗坏血酸。
本发明所述OPD是指:邻苯二胺。
本发明所述DAP是指:2,3-二氨基吩嗪。
附图说明
图1A是实施例1制备得到的N-Ti3C2 MQDs的透射电子显微镜图;
图1B是实施例1制备得到的N-Ti3C2 MQDs的紫外吸收以及荧光发射图谱;
图2A是底物AA2P与ACP的反应时间优化图;
图2B是底物AA2P的浓度优化图;
图3A是Ce4+反应时间优化图;
图3B是OPD浓度优化图;
图4A是加入不同浓度ACP后溶液荧光强度的变化图;
图4B是ACP浓度与荧光强度比值的线性相关图;
具体实施方式
以下结合实施例来进一步解释本发明,但实施例并不对本发明做任何形式的限定。
Ti3C2 MXene粉末(南京先丰材料科技有限公司);酸性磷酸酶(ACP)、L-抗坏血酸-2-磷酸(AA2P)、四水硫酸铈(Ce(SO4)2·4H2O)(阿拉丁试剂有限公司);二乙烯三胺(DETA)、邻苯二胺(OPD)(国药集团化学试剂有限公司)。
实施例1发射蓝色荧光的N-Ti3C2 MQDs QDs的合成
步骤如下:
将30mg Ti3C2 MXene粉末溶于15mL DMF中,在N2条件下超声30分钟后,加入DETA。通过滴加NH3·H2O调节pH至9。将混合溶液转入聚四氟乙烯内衬反应釜中,150℃加热8h,冷却至室温后,将得到的黑色悬浮液于12000rpm离心30min,上清液用0.22μm滤膜过滤后得到N-Ti3C2 MQDs溶液。其透射电镜图如图1A所示,MQDs粒径约为5.5nm。紫外吸收和荧光发射图谱如图1B所示,在200nm到400nm处有紫外吸收,N-Ti3C2 MQDs荧光发射波长在400-490nm,且发射波长随激发波长的变化而改变。
实施例2考察底物与酶反应的时间对目标物响应的影响实验,步骤如下:
(1)将10μL浓度为3.0U/L的ACP水溶液与10μL浓度为0.2mM的AA2P水溶液于37℃孵育5-60min(5min、10min、20min、30min、40min、50min、60min)后,底物AA2P在ACP的催化下产生AA;
(2)向步骤(1)所得体系中加入10μL浓度为0.6mM的Ce4+水溶液于37℃孵育20min,再加入10μL浓度为0.5mM的OPD水溶液继续反应,生成黄色荧光产物DAP;
(3)向步骤(2)所得体系加入实施例1制备的N-Ti3C2 MQDs,使N-Ti3C2MQDs浓度为0.15mg/mL,测定450nm及560nm处的荧光强度。考察底物与酶反应的时间对目标物响应的影响,结果如图2A所示,随着反应时间的增加,荧光强度的比值逐渐增大然后趋于稳定。
实施例3考察底物AA2P浓度对目标物响应的影响实验,步骤如下:
(1)将10μL的浓度为3.0U/L的ACP水溶液与10μL AA2P水溶液(0.005-0.25mM范围内的0.005mM、0.02mM、0.05mM、0.075mM、0.125mM、0.15mM、0.20mM、0.25mM)于37℃孵育40min后,底物AA2P在ACP的催化下产生AA;
(2)向步骤(1)所得体系中加入10μL浓度为0.6mM的Ce4+水溶液于37℃孵育20min,再加入10μL浓度为0.5mM的OPD水溶液继续反应,生成黄色荧光产物DAP;
(3)向步骤(2)所得体系加入实施例1制备的N-Ti3C2 MQDs,使N-Ti3C2MQDs浓度为0.15mg/mL,测定450nm及560nm处的荧光强度。考察Ce4+的反应时间对目标物响应的影响,结果如图2B所示,随着反应时间的增加,荧光强度的比值逐渐增大然后趋于稳定。
实施例4考察Ce4+反应时间对目标物响应的影响实验,步骤如下:
(1)将10μL的浓度为3.0U/L的ACP水溶液与10μL浓度为0.2mM的AA2P水溶液于37℃孵育40min后,底物AA2P在ACP的催化下产生AA;
(2)向步骤(1)所得体系中加入10μL浓度为0.6mM的Ce4+水溶液于37℃孵育5-40min(5min、10min、15min、20min、25min、30min、40min),再加入10μL浓度为0.5mM的OPD水溶液继续反应,生成黄色荧光产物DAP;
(3)向步骤(2)所得体系加入实施例1制备的N-Ti3C2 MQDs,使N-Ti3C2MQDs浓度为0.15mg/mL,测定450nm及560nm处的荧光强度。考察底物AA2P的浓度对目标物响应的影响,结果如图3A所示,随着反应时间的增加,荧光强度的比值逐渐增大然后趋于稳定。
实施例5考察OPD浓度对目标物响应的影响实验,步骤如下:
(1)将10μL的浓度为3.0U/L的ACP水溶液与10μL浓度为0.2mM的AA2P水溶液于37℃孵育40min后,底物AA2P在ACP的催化下产生AA;
(2)向步骤(1)所得体系中加入10μL浓度为0.6mM的Ce4+水溶液于37℃孵育20min,再加入OPD(0.05-1.2mM范围内的0.05mM、0.10mM、0.20mM、0.30mM、0.50mM、0.80mM、1.0mM、1.2mM)继续反应,生成黄色荧光产物DAP;
(3)向步骤(2)所得体系加入实施例1制备的N-Ti3C2 MQDs,使N-Ti3C2MQDs浓度为0.15mg/mL,测定450nm及560nm处的荧光强度。考察OPD浓度对目标物响应的影响,结果如图3B所示,随着反应时间的增加,荧光强度的比值逐渐减小然后趋于稳定。
实施例6对ACP的定量检测,步骤如下:
(1)将不同浓度的ACP(0.15-7.5U/L)与10μL浓度为0.2mM的AA2P水溶液于37℃孵育40min,底物AA2P在ACP的催化下产生AA;
(2)向步骤(1)所得体系中加入10μL浓度为0.6mM的Ce4+水溶液于37℃孵育20min后,再加入10μL浓度为0.5mM的OPD水溶液继续反应,生成黄色荧光产物DAP;
(3)向步骤(2)所得体系加入实施例1制备的N-Ti3C2 MQDs,使N-Ti3C2MQDs浓度为0.15mg/mL,测定探针的蓝色荧光与黄色荧光的强度的比值,所得荧光图如图4A所示,随着ACP浓度的增加(0.15-7.5U/L),比率荧光探针的蓝色荧光逐渐增强,黄色荧光逐渐减弱。荧光强度的比值与ACP浓度的相关性如图4B所示,随着ACP浓度的增大,比率荧光探针的蓝色荧光与黄色荧光比值逐渐增大,在0.15-3.75U/L范围内,ACP的浓度与比率荧光探针的蓝色荧光与黄色荧光比值呈线性相关,线性回归方程为y=0.5133x+0.5263,相关系数R2=0.9946,检测限为0.02U/L。
实施例7实际血清样品中ACP的检测,步骤如下:
(1)将用Tris-HCl缓冲溶液稀释200倍的血清样品作为基质;
(2)向(1)的基质中加入不同浓度的ACP标准溶液(0、0.30、1.00、3.00U/L),与10μL浓度为0.2mM的AA2P水溶液于37℃孵育40min;
(3)向步骤(2)所得体系加入10μL浓度为0.6mM的Ce4+水溶液于37℃孵育20min后,再加入10μL浓度为0.5mM的OPD水溶液继续反应;
(4)向步骤(3)所得体系加入实施例1制备的N-Ti3C2 MQDs,使N-Ti3C2MQDs浓度为0.15mg/mL,测定探针的蓝色荧光(450nm)与黄色荧光(560nm)的强度,根据标准曲线计算得到血清中ACP的含量,其回收率结果如表1所示。
表1是实施例7中血清样品检测的回收率结果,如表所示,回收率均在90%到106%之间,说明复杂基质对ACP的检测不产生明显干扰,该方法具有良好的选择性,可以用于实际样品的测定。
表1
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种基于比率型荧光探针定量检测血清中ACP的方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:
(1)合成发射蓝色荧光的N-Ti3C2 MQDs;
(2)将不同浓度的ACP标准曲线溶液与底物AA2P于15℃-55℃孵育后,底物AA2P在ACP的催化下产生AA;
(3)向步骤(2)所得体系中加入Ce4+,AA将Ce4+还原为Ce3+;再加入OPD继续反应,OPD被Ce4 +氧化生成黄色荧光产物DAP,而Ce3+无法将OPD氧化生成DAP;
(4)向步骤(3)所得体系中加入步骤(1)所得N-Ti3C2 MQDs,步骤(3)所得体系中的DAP与N-Ti3C2 MQDs发生内滤效应,从而使得N-Ti3C2 MQDs的荧光被猝灭,形成蓝色荧光较弱黄色荧光较强的比率型荧光探针;
(5)标准曲线溶液中ACP浓度越大,产生的AA越多,更多Ce4+被还原,从而使得DAP生成减少,黄色荧光减弱,被猝灭的N-Ti3C2 MQDs蓝色荧光恢复;
(6)根据N-Ti3C2 MQDs与DAP两者荧光强度的比值对ACP的浓度绘制标准曲线;
(7)将待测血清按步骤(2)~(4)操作,根据标准曲线,完成对待测血清中ACP的定量检测。
2.根据权利要求1所述基于比率型荧光探针定量检测血清中ACP的方法,其特征在于,步骤(1)中合成的N-Ti3C2 MQDs发射波长范围为400-490nm。
3.根据权利要求1所述基于比率型荧光探针定量检测血清中ACP的方法,其特征在于,步骤(2)中,不同浓度的ACP标准曲线溶液与AA2P的共孵育时间为10-60min。
4.根据权利要求1所述基于比率型荧光探针定量检测血清中ACP的方法,其特征在于,步骤(2)中,底物AA2P浓度为0.01-0.25mM。
5.根据权利要求1所述基于比率型荧光探针定量检测血清中ACP的方法,其特征在于,步骤(2)中,底物AA2P浓度为0.05-0.25mM。
6.据权利要求1所述基于比率型荧光探针定量检测血清中ACP的方法,其特征在于,步骤(3)中,Ce4+的浓度为0.1-1.2mM。
7.根据权利要求1所述基于比率型荧光探针定量检测血清中ACP的方法,其特征在于,步骤(3)中,OPD浓度为0.05-1.2mM。
8.据权利要求1所述基于比率型荧光探针定量检测血清中ACP的方法,其特征在于,步骤(3)中,OPD浓度为0.2-1.2mM。
9.根据权利要求1所述基于比率型荧光探针定量检测血清中ACP的方法,其特征在于,步骤(4)的步骤(3)所得体系中,N-Ti3C2 MQDs浓度为0.1-0.5mg/mL。
10.根据权利要求1所述基于比率型荧光探针定量检测血清中ACP的方法,其特征在于,步骤(6)中,根据N-Ti3C2 MQDs和荧光产物DAP在450nm及560nm处的荧光强度的比值对不同浓度ACP标准曲线溶液绘制标准曲线。
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WO2001040755A2 (en) * | 1999-12-01 | 2001-06-07 | U.S. Army Medical Research And Materiel Command | A novel and practical serological assay for the clinical diagnosis of leishmaniasis |
CN109266332A (zh) * | 2018-09-20 | 2019-01-25 | 南京医科大学 | 一种用于定量检测血液中AChE和BChE的比率型荧光探针的制备方法 |
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