CN115785202A

CN115785202A - 一种胶原三肽透明质酸化合物、制备方法及其应用

Info

Publication number: CN115785202A
Application number: CN202211742718.9A
Authority: CN
Inventors: 周广静; 葛剑
Original assignee: Suzhou Happy Scarlet Ball Biotechnology Co ltd
Current assignee: Suzhou Happy Scarlet Ball Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-12-30
Filing date: 2022-12-30
Publication date: 2023-03-14

Abstract

本发明提供一种胶原三肽透明质酸化合物，其结构式为HA‑Gly‑Pro‑Hyp，其中，HA为透明质酸，Gly为甘氨酸，Pro为脯氨酸，Hyp为羟脯氨酸。所述胶原三肽透明质酸化合物具有较好的透皮能力，皮肤吸收效率高，促进透明质酸的二次合成。

Description

一种胶原三肽透明质酸化合物、制备方法及其应用

技术领域

一种胶原三肽透明质酸化合物、制备方法及其应用，属于胶原三肽应用技术领域。

背景技术

胶原三肽(collagen tripeptide,CTP)由3个氨基酸组成的多肽，胶原三肽的化学式为Gly-X-Y，其中X通常是脯氨酸(Pro)，Y通常是羟脯氨酸(Hyp)，Pro和Hyp都是环状氨基酸。胶原三肽不仅具有较高的弹性和抗拉强度，还能够抵抗部分蛋白酶的降解，是具有无抗原性、低过敏性和易吸收等多种生物功能的最小的生物活性单元。现有学者研究，通过口服给药CTP在实验组采用丙酮诱导ICR小鼠的皮肤干燥模型中，体内透明质酸的含量升高，这一成果也表明CTP有促进肌肤活力恢复的效果。以暴露于紫外线(UVB)的无毛小鼠为模型，口服CTP14周，结果发现皮肤弹性增加，透明质酸的含量升高，证实CTP有作为抗光老化剂的潜力和恢复皮肤活性的能力。这些研究结果都直接或者间接证实了透明质酸与CTP之间存在着某种特定的联系。

现有技术中关于透明质酸和胶原三肽的使用方法多是配制成为混合物的形式，而很少出现化合物的形式。研究表明，在含有透明质酸和三肽组合物的体系中溶液/凝胶受热后，其粘度会急剧降低，致使其产品的吸收效率和作用效果降低。有学者分析原因认为：透明质酸分子为聚阴离子化合物，氨基酸的氨基可以与透明质酸分子的羧基通过离子键进行连接，这一过程也将透明质酸分子在溶液中原来有序的分子排列秩序打破，造成体系的不稳定。正是这一因素影响了透明质酸和三肽类产品复配使用的效果。

发明内容

本发明提供了一种胶原三肽透明质酸化合物、制备方法及其应用，可以有效解决上述问题

本发明是这样实现的：

一种胶原三肽透明质酸化合物，其结构式为HA-Gly-Pro-Hyp，其中，HA为透明质酸，Gly为甘氨酸，Pro为脯氨酸，Hyp为羟脯氨酸。

一种上述的胶原三肽透明质酸化合物的制备方法，包括以下步骤：

S1，将透明质酸和四丁基氢氧化铵混合，反应得到透明质酸的TBA盐；

S2，将透明质酸的TBA盐与L-甘氨酸乙酯盐酸盐混合反应，再加入4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐(DMT-MM)反应，在碱性环境下水解，得透明质酸-甘氨酸(HA-Gly)；

S3，将透明质酸-甘氨酸(HA-Gly)置于二氯甲烷中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDCI)、N，N-二异丙基乙胺(DIEA)充分搅拌反应，加入FMOC-L-Pro-L-Hyp-OH和1-羟基苯并三唑(HOBT)，搅拌反应，洗涤干燥后，将产物置于乙醇胺的二氯甲烷溶液中，室温搅拌，过滤，洗涤，干燥后，制得透明质酸-甘氨酸-L-脯氨酸-L-羟脯氨酸(HA-Gly-L-Pro-L-Hyp)；

S4，将透明质酸-甘氨酸-L-脯氨酸-L-羟脯氨酸(HA-Gly-L-Pro-L-Hyp)置于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDCI)、N，N-二异丙基乙胺(DIEA)充分搅拌，加入DNB和1-羟基苯并三唑(HOBT)，搅拌反应，洗涤干燥后，制得透明质酸-甘氨酸-脯氨酸-羟脯氨酸(HA-Gly-Pro-Hyp)。

作为进一步改进的，步骤S1之前还需对透明质酸进行脱盐。

作为进一步改进的，在步骤S1中，所述透明质酸的浓度为10-20mg/mL，所述四丁基氢氧化铵(TBA-OH)的浓度为35-45％(w/v)，所述透明质酸溶液、四丁基氢氧化铵(TBA-OH)溶液的体积比为1：5。

作为进一步改进的，在步骤S2中，所述透明质酸的TBA盐的浓度为4.5-5.5mg/mL；所述透明质酸的TBA盐、L-甘氨酸乙酯盐酸盐混合反应、4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐(DMT-MM)的质量比为1：1：1.1-1.4。

作为进一步改进的，在步骤S3中，所述透明质酸-甘氨酸(HA-Gly)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDCI)、N，N-二异丙基乙胺(DIEA)、FMOC-L-Pro-L-Hyp-OH和1-羟基苯并三唑(HOBT)的质量比为1：0.8-1.2：0.8-1.2：0.8-1.2：0.8-1.2。

作为进一步改进的，在步骤S4中，所述透明质酸-甘氨酸-L-脯氨酸-L-羟脯氨酸(HA-Gly-L-Pro-L-Hyp)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDCI)、N，N-二异丙基乙胺(DIEA)、DNB和1-羟基苯并三唑(HOBT)的质量比为1：0.8-1.2：0.8-1.2：0.8-1.2：0.8-1.2。

作为进一步改进的，在步骤S3中，将透明质酸-甘氨酸(HA-Gly)置于二氯甲烷中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDCI)、N，N-二异丙基乙胺(DIEA)充分搅拌反应的条件为冰浴，反应时间为50-70min。

作为进一步改进的，所述加入FMOC-L-Pro-L-Hyp-OH和1-羟基苯并三唑(HOBT)，搅拌反应的温度为25-35℃，反应时间为22-26h。

一种上述的胶原三肽透明质酸化合物在制备化妆品中的应用。

本发明的有益效果是：

本发明制备的胶原三肽透明质酸化合物，胶原三肽和透明质酸之间是共价键连接，有效避免了透明质酸和胶原三肽的混合物的问题，即在含有透明质酸和三肽混合物的体系中溶液/凝胶受热后，其粘度会急剧降低，致使其产品的吸收效率和作用效果降低。

本发明制备的胶原三肽透明质酸化合物具有较好的透皮能力，皮肤吸收效率高，在作用于皮肤部位时能够延长作用时长，有效渗透入肌肤内里，增加皮肤弹性，解决细纹等皮肤问题。

本发明制备的胶原三肽透明质酸化合物在较低浓度下还具有更好的粘弹性，也为其广泛应用提供了可能。

本发明制备的胶原三肽透明质酸化合物促进透明质酸的二次合成，还能减少不正常纤维胶原细胞的生长，能极大地提高透明质酸的在修复皮肤方面的作用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施方式的技术方案，下面将对实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1是HA-Gly-Pro-Hyp质谱图。

图2是HA-Gly-Pro-Hyp透皮吸收测试结果图。

图3是HA-Gly-Pro-Hyp粘弹性测试结果图。

图4是HA-Gly-Pro-Hyp毒性测试结果图。

图5是HA-Gly-Pro-Hyp抗紫外线干扰测试结果图。

图6是HA-Gly-Pro-Hyp对透明质酸合成的影响图。

图7是HA-Gly-Pro-Hyp皮肤恢复效果测试结果图。

具体实施方式

为使本发明实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施方式中的附图，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。因此，以下对在附图中提供的本发明的实施方式的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例提供一种胶原三肽透明质酸化合物，其结构式为HA-Gly-Pro-Hyp，其中，HA为透明质酸，Gly为甘氨酸，Pro为脯氨酸，Hyp为羟脯氨酸。

S1，将透明质酸和四丁基氢氧化铵混合，反应得到透明质酸的TBA盐；此步骤是为了透明质酸能更好的溶入有极溶剂。

S2，将透明质酸的TBA盐与L-甘氨酸乙酯盐酸盐混合反应，再加入4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐(DMT-MM)反应，在碱性环境下水解，得透明质酸-甘氨酸(HA-Gly)。

S3，将透明质酸-甘氨酸(HA-Gly)置于二氯甲烷中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDCI)、N，N-二异丙基乙胺(DIEA)充分搅拌反应，加入FMOC-L-Pro-L-Hyp-OH和1-羟基苯并三唑(HOBT)，搅拌反应，洗涤干燥后，将产物置于乙醇胺的二氯甲烷溶液中，室温搅拌，过滤，洗涤，干燥后，制得透明质酸-甘氨酸-L-脯氨酸-L-羟脯氨酸(HA-Gly-L-Pro-L-Hyp)。此为Fmoc多肽合成法，在Fmoc固相肽合成中，肽链逐步连接，一次连接一个氨基酸，同时连接至不溶性树脂载体。这允许在每个步骤通过简单的洗涤除去反应副产物。氨基酸在其氨基末端被Fmoc(9-芴基甲氧基羰基)基团保护，并在羧酸末端活化后与生长链偶联，然后通过哌啶处理除去Fmoc基团并重复该过程。

S4，将透明质酸-甘氨酸-L-脯氨酸-L-羟脯氨酸(HA-Gly-L-Pro-L-Hyp)置于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDCI)、N，N-二异丙基乙胺(DIEA)充分搅拌，加入DNB和1-羟基苯并三唑(HOBT)，搅拌反应，洗涤干燥后，制得透明质酸-甘氨酸-脯氨酸-羟脯氨酸(HA-Gly-Pro-Hyp)。此步骤是为了去除Fmoc基团。

作为进一步改进的，步骤S1之前还需对透明质酸进行脱盐。

实施例1

透明质酸-甘氨酸-脯氨酸-羟脯氨酸(HA-Gly-Pro-Hyp)的制备

1、透明质酸HA-Na制备(S1)：将1.0g透明质酸HA-Na(均18KDa)放置在透析袋中(3500g/mol)，在磁力搅拌的条件下加入到200mL的去离子水中24h，每隔8h更换一次去离子水确保完全洗脱，去除干扰成份。冷冻干燥将HA-Na保存在4℃冰箱中。

2、TBA盐制备(S2)：将四丁基氢氧化铵(TBA-OH)制备成浓度为40％(w/v)的水溶液，缓慢搅拌30min，备用。通过倾析法(阳离子交换树脂)去除掉多余的TBA-OH溶液，随即用超纯水重复洗涤三次，使用孔径为0.45μm的针孔过滤器过滤，制备得到TBA盐。

3、透明质酸-TBA(HA-TBA)盐制备方法(S3)：制备好的S1溶解在超纯水中制备成浓度为15mg/mL的溶液。随即添加制备好的TBA盐溶液，添加量为体积比例为1:5，搅拌30min，吸取混合溶液，0.45mm过滤，冷冻干燥滤液，即可得到透明质酸的TBA盐(HA-TBA，白色固体)。

4、透明质酸-甘氨酸(HA-Gly)的制备(S4)：将制备好的HA-TBA(S3)配置成浓度为5mg/mL的溶液，随即按照质量比1:1的比例添加等量的L-甘氨酸乙酯盐酸盐，轻微搅拌3min，待搅拌完成之后，加入4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐(DMT-MM)，添加量为与物质S3的质量比例为1:1.2，在25℃的条件下，搅拌12h。随即放置在透析袋中(3500g/mol)依次用0.3M NaCl水溶液、超纯水透析，向所得透析液中添加2NNaOH，pH12.5，搅拌1h，使乙酯水解。随后使2N HCl进行中和，进行二次透析，透析液进行冷冻干燥，制备得到HA-Gly。

5、透明质酸-甘氨酸-L-脯氨酸-L-羟脯氨酸(HA-Gly-L-Pro-L-Hyp)的制备(S5)：通过延长肽链的方法制得，将制备好的物质S4置于适量的二氯甲烷中(20ml)，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDCI)、N，N-二异丙基乙胺(DIEA)，其添加量均为与物质S4的质量比例为1:1，充分搅拌1h。在冰浴中，加入一定量的FMOC-L-Pro-L-Hyp-OH和1-羟基苯并三唑(HOBT)，其添加量均为与物质S4的质量比例为1:1，搅拌2.5h，移去冰浴，30℃反应24h。洗涤、干燥后，将产物置于200mL的50v/v％乙醇胺的二氯甲烷溶液中，室温搅拌3h，过滤，洗涤，干燥后，制得透明质酸-甘氨酸-L-脯氨酸-L-羟脯氨酸。

6、透明质酸-甘氨酸-脯氨酸-羟脯氨酸(HA-Gly-Pro-Hyp)(S6)：氨基修饰，将制备好的S5置于适量的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中(20ml)，加入一定量的EDCI、DIEA(添加量为与S5的质量比均为1:1)充分搅拌1h，之后置于冰浴中，加入一定量的3，5-二硝基苯甲酸DNB(2,4-二硝基苯)和HOBT(添加量为与S5的质量比均为1:1)，搅拌2.5h，移去冰浴，在30℃下反应24h。洗涤、干燥后，制得透明质酸-甘氨酸-脯氨酸-羟脯氨酸。

测试例1

采用MALDI-TOF质谱法进行测量(Autoflex I，Bruker Daltonik，Germany)，波长为337nm进行实施例1制备的HA-Gly-Pro-Hyp(样品125ng)的化学结构表征。正离子检测基质，2,5-二羟基苯甲酸(DHB)浓度为0.5mol/L的甲醇溶液，含有0.1％三氟乙酸(TFA)；负离子检测基质，9-AA(乙腈/异丙醇中浓度为10mg/ml，40/60v/v)。如图1所示。

可以发现Gly，Pro和Hyp的M/Z分别在330，308和286出现了特征峰，并且HA在6400出现特征峰，这均表示物质成功合成。

测试例2

HA-Gly-Pro-Hyp透皮吸收测试

准确称量S6中制备好的HA-Gly-Pro-Hyp 1mg溶于10ml超纯水中，轻微搅拌，终浓度为0.1mg/ml。采用透皮扩散池方法检测(GB/T 27818-2011)，制备多张小鼠的腹部皮肤(厚度为200μm)，将制备好的浓度为0.1mg/ml HA-Gly-Pro-Hyp均匀涂抹于制备好小鼠的腹部上，涂抹量为1ml。接收液选择生理盐水，温度设定为接近人体体表温度，在超净工作台中进行透皮吸收测试，避免发生二次污染。

对照组选用Gly-Pro-Hyp和HA混合添加，质量比例为1:1，终浓度为0.1mg/ml。设置三组平行实验。实验结果如图2所示。

由图2可知，在两组实验过程中，实验组明显高于对照组分，随着时间的延长其透皮吸收效率增加更加的明显。分析认为，HA在与Gly-Pro-Hyp结合成化合物后在一起的时候会存在一定程度的相互作用关系，起到协同增效作用。Gly-Pro-Hyp属于三肽化合物不溶于水，而在和HA结合成化合物之后其水溶性效果得到了加强，显著增强了皮肤透过效果。

测试例3

粘弹性测试

为了探究HA-Gly-Pro-Hyp的粘弹性，在不引入外部交联剂的情况下，我们设计了如下实验。将对照组、实验组1和实验组2分别加入等量的HA、HA与Gly-Pro-Hyp复合物(质量比1:1)和HA-Gly-Pro-Hyp，添加量为10、20、30、40、50和100，调节pH至7.2，然后置于25℃恒温水浴槽内恒温1h，使用NDJ-4旋转粘度计测定其动力粘度，3号转子，0.6r/min。实验结果如图3所示。

由图3可知，相同浓度下的HA-Gly-Pro-Hyp凝胶的动力粘度远远高于HA与Gly-Pro-Hyp复合物。

测试例4

毒性测试

为了测试HA-Gly-Pro-Hyp对细胞的毒性我们设计了如下的实验，通过MTT法来对实验结果进行评估。我们选取了HA-Gly-Pro-Hyp浓度范围内0、100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml、400μg/ml、500μg/ml的实验体系。细胞选用Hela，t＝48h。实验结果如图4所示。

由图4可知，在选定的实验浓度范围之内，我们可以明显的发现在培养48h之后Hela细胞的活性仍然保持在90％以上，表明该材料在该浓度范围之内没有毒性影响，且在浓度为100μg/ml有促进细胞分裂的效果。

测试例5

抗紫外线干扰测试

为了验证HA-Gly-Pro-Hyp分子对抗紫外线老化的影响我们设计了如下的实验。

选择五周龄雌性无毛小鼠(SKH-1)，喂养环境为：温度(252℃)、湿度(55210％)和模拟日光(白天/黑夜各12小时)，连续喂养14周。

每组分五只小鼠，喂养条件如表1所示.

表1

组分	喂养条件	辐照条件
			空白组	正常喂养	——
对照组	正常喂养	3次/周，辐照量为75mJ/cm<sup>2</sup>
			实验组1	正常喂养，添加HA和Gly-Pro-Hyp(1:1)	3次/周，辐照量为75mJ/cm<sup>2</sup>
实验组2	正常喂养，添加HA-Gly-Pro-Hyp	3次/周，辐照量为75mJ/cm<sup>2</sup>

实验组1和实验组2，HA+Gly-Pro-Hyp和HA-Gly-Pro-Hyp喂养量均为167mg/kg/天。

14周后，在麻醉下从背部皮肤获得的样品，在液氮中快速冷冻，并在-70℃下储存。用光学显微镜检测，检测样品固定在10％缓冲福尔马林溶液中，结果如图5所示。

由图5可知，重复性紫外辐射会诱导皮肤深皱纹和粗糙化，如对照组所示。在相同条件下，实验组2中用HA-Gly-Pro-Hyp喂养的小鼠皮肤皱纹有显著性的改善，具有抗紫外线干扰的功效，可减少由辐射引起的皱纹，其效果强于实验组1HA和Gly-Pro-Hyp的混合组分。

测试例6

对透明质酸合成的影响

文献研究表明，Gly-Pro-Hyp可以促进透明质酸的合成，本研究在此基础上检测HA-Gly-Pro-Hyp是否会对HA的合成产生影响。

HIG-82细胞在含有10％胎牛血清的DMEM(dulbecco's modified eaglemedium)培养基中(购置于Sigma-Aldrich)，置于环境条件为CO₂(5％)和37℃的培养皿中生长至融合状态，随后置于无血清的DMEM培养基中24小时。

培养结束之后设置成为三个组分，分别为对照组、实验组1和实验组2分别加入等量的HA、HA与Gly-Pro-Hyp复合物(质量比1：1)和HA-Gly-Pro-Hyp，添加量为50ng/ml，继续培养48h，使用透明质酸(HA)测定试剂盒(电化学发光免疫分析法)检测培养基中透明质酸的含量。测试结果如图6所示。

由图6可知，HA-Gly-Pro-Hyp比之HA与Gly-Pro-Hyp复合物能够更加有效的促进透明质酸的合成，这是因为HA的合成与酶有关并减少不正常纤维胶原细胞的生长所造成的；当添加物质为HA-Gly-Pro-Hyp时分子基团之间存在着相互作用，能够起到一定程度的激活作用。

测试例7

皮肤恢复效果测试

为了准确验证并证明该物质能够作用于人体的肌肤(确定无害)，我们设计了如下的实验，目的是为了检测处理后肌肤含水量的恢复、皮肤弹性以及对红肿皮肤的修复情况。

选择有红血丝问题肌肤的女性患者共计15人，随机分为3个组分。其中对照组分中选择涂抹HA溶液，实验组1中选择涂抹HA与Gly-Pro-Hyp复合物(质量比1：1)，实验组2中选择涂抹HA-Gly-Pro-Hyp，整个实验过程中不添加其他辅助物质，避免对实验效果造成干扰，其中涂抹浓度均为100μg/ml，涂抹量为5ml，每天涂抹三次，实验周期为14天。

期间在第1,3,7,14天分别测量红斑数量(Mexameter MX18测量)和表皮失水量(Corneometer CM825测量)。测试结果如图7所示。

由图7可知，含有HA-Gly-Pro-Hyp的组分更能具有红斑修复的效果，且在14天之后能恢复的比较明显。且在实验过程中我们发现，患者在涂抹含有HA-Gly-Pro-Hyp不会产生刺痛感等问题，这进一步说明该物质不会对肌肤造成二次损伤。

以上所述仅为本发明的优选实施方式而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种胶原三肽透明质酸化合物，其特征在于，其结构式为HA-Gly-Pro-Hyp，其中，HA为透明质酸，Gly为甘氨酸，Pro为脯氨酸，Hyp为羟脯氨酸。

2.一种权利要求1所述的胶原三肽透明质酸化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤S1之前还需对透明质酸进行脱盐。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤S1中，所述透明质酸的浓度为10-20mg/mL，所述四丁基氢氧化铵(TBA-OH)的浓度为35-45％(w/v)，所述透明质酸溶液、四丁基氢氧化铵(TBA-OH)溶液的体积比为1：5。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤S2中，所述透明质酸的TBA盐的浓度为4.5-5.5mg/mL；所述透明质酸的TBA盐、L-甘氨酸乙酯盐酸盐混合反应、4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐(DMT-MM)的质量比为1：1：1.1-1.4。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤S3中，所述透明质酸-甘氨酸(HA-Gly)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDCI)、N，N-二异丙基乙胺(DIEA)、FMOC-L-Pro-L-Hyp-OH和1-羟基苯并三唑(HOBT)的质量比为1：0.8-1.2：0.8-1.2：0.8-1.2：0.8-1.2。

7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤S4中，所述透明质酸-甘氨酸-L-脯氨酸-L-羟脯氨酸(HA-Gly-L-Pro-L-Hyp)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDCI)、N，N-二异丙基乙胺(DIEA)、DNB和1-羟基苯并三唑(HOBT)的质量比为1：0.8-1.2：0.8-1.2：0.8-1.2：0.8-1.2。

8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤S3中，将透明质酸-甘氨酸(HA-Gly)置于二氯甲烷中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDCI)、N，N-二异丙基乙胺(DIEA)充分搅拌反应的条件为冰浴，反应时间为50-70min。

9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述加入FMOC-L-Pro-L-Hyp-OH和1-羟基苯并三唑(HOBT)，搅拌反应的温度为25-35℃，反应时间为22-26h。

10.权利要求1所述的胶原三肽透明质酸化合物在制备化妆品中的应用。