CN115778921A - 一种红托竹荪多糖-plga纳米粒及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种红托竹荪多糖‑PLGA纳米粒及其制备方法和应用，制备方法包括如下步骤：(1)将红托竹荪多糖溶液与PLGA的丙酮溶液混合，通过超声使混悬液形成初乳，然后将初乳倒入‑泊洛沙姆溶液中，超声处理使其均质化；(2)将步骤(1)得到的溶液，通过旋蒸法去除丙酮，然后离心，收集上清液，最后通过冻干上清液，即可得到红托竹荪多糖‑PLGA纳米粒。本发明的纳米粒制备方法简单，通过该法制成的红托竹荪多糖PLGA纳米粒与原料药红托竹荪多糖相比，具有良好的缓释作用，生物利用度和药理活性得到提升，增强了对急性肺损伤的保护作用。
Description
一、技术领域
本发明涉及医药制剂领域，具体涉及一种红托竹荪多糖-PLGA纳米粒及其制备方法和应用。
二、背景技术
急性肺损伤(Acutelunginjury,ALI)/急性呼吸窘迫综合征(Acuterespiratorydistress syndrome,ARDS)是以顽固性低氧血症为显著特征的临床危重症，病程由急性弥漫性肺损伤进而发展为急性呼吸衰竭。ALI/ARDS的实质是由于严重的急性炎症反应，炎症细胞迁移造成肺泡-毛细血管膜完整性破坏、渗透性增加，从而引起肺水肿；产生的急性炎症渗出液可使肺泡表面活性剂失活，导致终末气道趋于陷闭，肺的气体交换面积减少，从而引发气体交换障碍且急性恶化。多种因素可诱发ALI/ARDS，包括败血症、肺炎、胃内容物误吸、胰腺炎，而COVID-19的爆发也使得ALI/ARDS患者急剧增加。
红托竹荪多糖是一种来源于红托竹荪的多糖，红托竹荪及其子实体均富含多糖，粗纤维和蛋白质等营养物质，并且它的脂肪含量较低。红托竹荪的药用价值主要体现在它那含有防癌抗癌的红托竹荪多糖，红托竹荪多糖的主要成分为葡萄糖、半乳糖，木糖和甘露糖等异多糖，也是红托竹荪发挥生物活性作用的基础，在治疗急性肺损伤方面有不错的疗效。但由于其属于大分子物质，存在作用时间短、生物利用率低等缺点。纳米粒封装的药物可以通过溶解效率从而延长循环时间，提高生物利用度，从而增加红托竹荪多糖对急性肺损伤的保护作用。
三、发明内容
为了解决红托竹荪多糖体内代谢快、作用时间短等缺点，本发明的目的是提供一种红托竹荪多糖-PLGA纳米粒及其制备方法，该方法制备工艺简单，且得到的纳米粒粒径较小，缓释作用好。
为了实现上述技术目的，本发明采用以下技术方案:
一种红托竹荪多糖-PLGA纳米粒的制备方法，所述方法包括如下步骤:
(1)将红托竹荪多糖溶液与PLGA的丙酮溶液混合，通过超声使混悬液形成初乳，然后将初乳倒入-泊洛沙姆溶液中，超声处理使其均质化；所述PLGA为聚乳酸-羟基乙酸共聚物；
(2)将步骤(1)得到的溶液，通过旋蒸法去除丙酮，然后离心，收集上清液，最后通过冻干上清液，即可得到红托竹荪多糖-PLGA纳米粒。
所述步骤(1)中，所述红托竹荪多糖和PLGA的质量比为1:9～17，优选为1：13；
优选地，所述步骤(1)中，所述红托竹荪多糖溶液中红托竹荪多糖的浓度为20～25mg/mL，溶剂为水。
优选地，所述步骤(1)中，所述PLGA为PLGA75：25、PLGA60：40或PLGA80：20，优选PLGA75：25；
所述PLGA75：25、PLGA60：40或PLGA50：50中，代表PLGA中乳酸和羟基乙酸的物质的量之比分别为75：25、60：40或50：50。这是本领域公知的PLGA型号表达方式。
优选地，所述步骤(1)中，所述PLGA的丙酮溶液中PLGA的浓度为20～40mg/mL。
优选地，所述步骤(1)中，所述红托竹荪多糖溶液与PLGA的丙酮溶液的体积比为1:9～10，优选为1：9。
优选地，所述步骤(1)中，所述泊洛沙姆溶液的质量浓度为0.7～0.8wt％。
优选地，所述步骤(1)中，所述初乳与泊洛沙姆溶液的体积之比为1:10～11，优选为1：10。
优选地，所述步骤(1)中，超声处理的条件一般在130～150W下超声2～3分钟，更优选超声探头开2～5s和关2～5s。
优选地，所述步骤(2)中，旋蒸温度一般为50～60℃，旋蒸时间一般为25～35min。
优选地，所述步骤(2)中，离心速度一般为3500～5000rpm，离心时间一般为10～20min。
本发明中，红托竹荪多糖可按以下方法提取得到：
先将红托竹荪粉末用水煎煮提取四次，之后合并滤液并浓缩，通过离心收集上清液，上清液中加入体积浓度95％乙醇至乙醇的终浓度80vol％，静置十分钟，收集沉淀，烘干制得粗多糖；粗多糖配成0.2mg/mL的粗多糖溶液，向其中加入4倍体积的Sevage试剂(氯仿:正丁醇体积比4:1)，搅拌混匀，然后离心，取上清液，重复用Sevage试剂提取5次，合并上清液并浓缩，用DEAE-52纤维素柱和SephadexG-100柱进行纯化，流出液冻干后即获得红托竹荪多糖多糖。这是本领域技术人员公知的红托竹荪多糖的提取方法。
本发明还提供了通过上述制备方法制得的红托竹荪多糖-PLGA纳米粒。
本发明还提供红托竹荪多糖-PLGA纳米粒在制备治疗肺损伤的药物中的应用。
本发明的有益效果在于:
1、本发明运用双重乳化-溶剂挥发法制备红托竹荪多糖PLGA纳米粒，污染小，适合大规模生产。
2、以红托竹荪多糖作为主药，用PLGA和泊洛沙姆将其包载成圆球状的纳米粒，相比原料药红托竹荪多糖具有良好的缓释作用，生物利用度和药理活性得到提升，增强了对急性肺损伤的保护作用。
四、附图说明
图1为实施例中制备红托竹荪多糖-PLGA纳米粒的工艺流程图。
图2为红托竹荪多糖与红托竹荪多糖-PLGA纳米粒的药时曲线图。
图3为正常组、LPS组、LPS+红托竹荪多糖组和LPS+红托竹荪多糖-PLGA纳米粒组的肺组织HE切片。
五、具体实施方式
以下结合说明书附图以及具体实施例对本发明的技术方案做进一步描述，但本发明的实施不限于此。
实施例1：
按照“连宾,郁建平.红托竹荪多糖的提取分离及组成研究[J].食品科学,2004(03):43-45.”公开的方法提取红托竹荪多糖：
首先将500g红托竹荪粉末完全浸泡在6000mL的去离子水中，煎煮1小时，随后用纱布过滤，滤渣加蒸馏水再煮两次，合并三次滤液，并将滤液浓缩至500mL，4000rpm离心10min，收集上清液。加入95％的乙醇直至乙醇浓度为75％(v/v)，收集沉淀，烘干后即得粗多糖。取0.1mg/mL的粗红托竹荪多糖溶液，然后向其中加入4倍体积的Sevage试剂(氯仿:正丁醇体积比4:1)，磁力搅拌30min后，3000rpm离心15min，收集上清液，重复上述操作4次，浓缩上清液。随后将样品过DEAE-52纤维素柱(2.6cm×30cm)和SephadexG-100柱(2.6cm×90cm)进行分离纯化。最后通过真空冷冻干燥机冻干流出液，获得红托竹荪多糖多糖。
实施例2：
红托竹荪多糖-PLGA纳米粒的制备：
将水相(10mg的红托竹荪多糖溶于0.5ml的去离子水中形成红托竹荪多糖溶液)与有机相(130mg的PLGA固体溶于4.5ml丙酮中)混匀，其中PLGA为PLGA75：25(乳酸：羟基乙酸的摩尔比为75：25)，制成混悬液，然后用超声波细胞粉碎仪在130W超声处理2分钟(开5s和关5s)，形成初乳(W/O)。然后将5ml初乳倒入水相(350mg泊洛沙姆188(F68)溶解于50mL的去离子水中)中，用超声探头150W处理2分钟(开启2秒和关闭3秒)进行均质化。用旋转蒸发仪在55℃，30分钟的条件下旋转蒸发以去除丙酮。随后通过3500rpm离心10分钟，收集上清液。随后将上清液冻干并密封保存，工艺流程如见图1所示。
实施例3：
本实验方法与实施例2基本一致，只有以下不同之处：PLGA中乳酸与羟基乙酸的摩尔比为80：20。
实施例4：
本实验方法与实施例2基本一致，只有以下不同之处：PLGA中乳酸与羟基乙酸的摩尔比为60：40。
实施例5：
本实验方法与实施例2基本一致，只有以下不同之处：红托竹荪多糖与PLGA的质量比不同，两者质量比为1：9，即10mg的红托竹荪多糖和90mgPLGA。丙酮的体积为4.5ml。
实施例6：
本实验方法与实施例5基本一致，只有以下不同之处：红托竹荪多糖与PLGA的质量比不同，两者质量比为1：13，即10mg的红托竹荪多糖和130mgPLGA。丙酮的体积为4.5ml。
实施例7：
本实验方法与实施例5基本一致，只有以下不同之处。红托竹荪多糖与PLGA的质量比不同，两者质量比为1：17，即10mg的红托竹荪多糖和170mgPLGA。丙酮的体积为4.5ml。
实施例8:
不同实施例制备的红托竹荪多糖-PLGA纳米粒的表征的测定：
量取2.0ml红托竹荪多糖-PLGA纳米粒水溶液至超滤离心管中，130000rpm离心50min，收集续滤液，通过HPLC法测定游离的红托竹荪多糖含量(m2)；然后精密量取2.0ml溶液至50ml量瓶中，之后加入适量甲醇破坏纳米粒，然后流动相定容，过0.45um微孔滤膜，收集2ml续滤液至10ml量瓶中，流动相定容后测定红托竹荪多糖总含量(m1)，计算包封率、载药量，公式分别为包封率＝[(m1-m2)/m1]×100％、载药量＝[(m1-m2)/m总]×100％，其中m总为红托竹荪多糖的总质量。最后将红托竹荪多糖-PLGA水溶液稀释至0.5mg/mL后，用激光粒度仪(DLS)测量粒径、PDI和Zeta电位。
表1为PLGA不同型号以及不同的红托竹荪多糖与PLGA质量比对产物红托竹荪多糖-PLGA纳米粒的表征(包封率、载药量、粒径、PDI、Zeta电位)的影响。从表1中可以看出乳酸和羟基乙酸的摩尔比为75：25，红托竹荪多糖与PLGA的质量比为1：13时，红托竹荪多糖-PLGA纳米粒的包封率、载药量、粒径、PDI和Zeta电位的数值为最优值，故此配比为最佳配比。
表1：红托竹荪多糖-PLGA纳米粒的表征情况
实施例9
红托竹荪多糖-PLGA纳米粒的药代动力学研究：
取空白雄性SD大鼠(200±20g)10只，随机分成两组,分别进行红托竹荪多糖和红托竹荪多糖-PLGA纳米粒的灌胃处理，按20mL/kg(单独红托竹荪多糖组用0.9％NaCl的生理盐水配成10mg/ml的溶液，红托竹荪多糖-PLGA纳米粒组配成200mg/ml的溶液)，灌胃给药，。实验前12h禁食不禁水,采集给药后0min、5min、10min、20min、40min、1h、2h、4h、6h、8h和12h的大鼠尾静脉血,置于抗凝管中。在9000r/min的转速下离心4min，然后收集血浆，进行上机检测，之后根据标准曲线计算浓度。最后将浓度的结果导入Phoenix WinNonlin8.3软件进行非房室模型拟合,算出药代动力学参数。红托竹荪多糖与红托竹荪多糖-PLGA纳米粒的药时曲线图如图2所示，从图2可以看出，在各个时间点，红托竹荪多糖-PLGA纳米粒的血药浓度明显高于红托竹荪多糖，提高了红托竹荪多糖的生物利用度，缓释效果明显提高。
实施例10
红托竹荪多糖-PLGA纳米粒治疗急性肺损伤的效果：
将24只6周的雄性C57BL/6小鼠(20±2g)随机分为四组，每组6只，分别为正常组、LPS(脂多糖)组、LPS+红托竹荪多糖组和LPS+红托竹荪多糖-PLGA纳米粒组。首先对小鼠进行药物预处理，分别对正常组、LPS组、LPS+红托竹荪多糖组和LPS+红托竹荪多糖-PLGA纳米粒组给予PBS、PBS、红托竹荪多糖(10mg/ml)和红托竹荪多糖-PLGA纳米粒(200mg/ml)灌胃处理,每只灌胃20ml/kg，3小时后进行腹腔注射LPS(5mg/kg)，6小时后脱颈处死并进行解剖，通过对小鼠的肺组织进行切片和HE染色，观察肺部损伤情况，结果如图3所示。从图3可以看出正常组大鼠肺组织病理学形态基本正常，肺泡壁薄，肺泡隔无明显增宽，LPS组大鼠肺组织肺泡间隔明显增宽，局部肺泡融合，大量炎性细胞浸润；红托竹荪多糖组大鼠肺组织形态得以改善，肺泡壁厚度较LPS组变薄，肺组织中浸润的炎症细胞减少；红托竹荪多糖-PLGA纳米粒组效果比之红托竹荪多糖组，治疗效果更好。因此，实验表明红托竹荪多糖-PLGA纳米粒对肺损伤的治疗效果明显优于单独给予红托竹荪多糖组。
以上所述的发明仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种红托竹荪多糖-PLGA纳米粒的制备方法，其特征在于所述方法包括如下步骤:
(1)将红托竹荪多糖溶液与PLGA的丙酮溶液混合，通过超声使混悬液形成初乳，然后将初乳倒入-泊洛沙姆溶液中，超声处理使其均质化；所述PLGA为聚乳酸-羟基乙酸共聚物；
(2)将步骤(1)得到的溶液，通过旋蒸法去除丙酮，然后离心，收集上清液，最后通过冻干上清液，即可得到红托竹荪多糖-PLGA纳米粒。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(1)中，所述红托竹荪多糖和PLGA的质量比为1:9～17。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述步骤(1)中，所述红托竹荪多糖和PLGA的质量比为1：13。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(1)中，所述PLGA为PLGA75：25、PLGA60：40或PLGA80：20。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述步骤(1)中，所述PLGA为PLGA75：25。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(1)中，所述红托竹荪多糖溶液中红托竹荪多糖的浓度为20～25mg/mL，溶剂为水；所述PLGA的丙酮溶液中PLGA的浓度为20～40mg/mL。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(1)中，所述红托竹荪多糖溶液与PLGA的丙酮溶液的体积比为1:9～10。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(1)中，所述泊洛沙姆溶液的质量浓度为0.7～0.8wt％；所述初乳与泊洛沙姆溶液的体积之比为1:10～11。
9.如权利要求1～8之一所述的制备方法制得的红托竹荪多糖-PLGA纳米粒。
10.如权利要求9所述的红托竹荪多糖-PLGA纳米粒在制备治疗肺损伤的药物中的应用。
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 王益等: "红托竹荪多糖对砷中毒大鼠肺损伤的影响（网络首发）", 《菌物学报》, vol. 42, no. 7, pages 1601 - 1610 * |
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