CN115772539A - 一种具有ⅰ型气管发育不全表型的双侧肺脏缺失小鼠模型及其构建方法 - Google Patents
一种具有ⅰ型气管发育不全表型的双侧肺脏缺失小鼠模型及其构建方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115772539A CN115772539A CN202211438555.5A CN202211438555A CN115772539A CN 115772539 A CN115772539 A CN 115772539A CN 202211438555 A CN202211438555 A CN 202211438555A CN 115772539 A CN115772539 A CN 115772539A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- mouse model
- mouse
- type
- phenotype
- ttf
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 title claims abstract description 47
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 title claims abstract description 35
- 230000002146 bilateral effect Effects 0.000 title claims abstract description 23
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 title claims abstract description 17
- 238000010276 construction Methods 0.000 title claims abstract description 11
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims abstract description 7
- 238000010171 animal model Methods 0.000 claims abstract description 6
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 claims abstract description 6
- 230000033667 organ regeneration Effects 0.000 claims abstract description 6
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims abstract description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 claims abstract description 3
- 241001494479 Pecora Species 0.000 claims abstract description 3
- 241000700159 Rattus Species 0.000 claims abstract description 3
- 101710114425 Homeobox protein Nkx-2.1 Proteins 0.000 claims abstract 3
- 101710088547 Thyroid transcription factor 1 Proteins 0.000 claims abstract 3
- 101710159262 Transcription termination factor 1 Proteins 0.000 claims abstract 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 12
- 102100027893 Homeobox protein Nkx-2.1 Human genes 0.000 claims description 10
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 9
- 230000002950 deficient Effects 0.000 claims description 8
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 claims description 8
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 7
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 7
- 101000632187 Mus musculus Homeobox protein Nkx-2.1 Proteins 0.000 claims description 6
- 101000845266 Mus musculus Transcription termination factor 1 Proteins 0.000 claims description 6
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 6
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 6
- 210000003101 oviduct Anatomy 0.000 claims description 5
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 claims description 4
- 101150038500 cas9 gene Proteins 0.000 claims description 4
- 238000011813 knockout mouse model Methods 0.000 claims description 4
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 claims description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 3
- 230000012173 estrus Effects 0.000 claims description 3
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims description 3
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 claims description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 2
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 claims description 2
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 claims 3
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 abstract description 16
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 abstract description 9
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 9
- 210000003437 trachea Anatomy 0.000 abstract description 8
- 210000003238 esophagus Anatomy 0.000 abstract description 5
- 238000000926 separation method Methods 0.000 abstract description 4
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 abstract description 3
- 206010068051 Chimerism Diseases 0.000 abstract description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 abstract description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 abstract description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 2
- 238000010453 CRISPR/Cas method Methods 0.000 abstract 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 abstract 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 37
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 21
- 108010057966 Thyroid Nuclear Factor 1 Proteins 0.000 description 17
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 10
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 10
- 206010058314 Dysplasia Diseases 0.000 description 9
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 7
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 7
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 description 6
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 description 6
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 6
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 5
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 4
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 4
- 210000002451 diencephalon Anatomy 0.000 description 4
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 4
- 230000036244 malformation Effects 0.000 description 4
- 108060000903 Beta-catenin Proteins 0.000 description 3
- 206010044310 Tracheo-oesophageal fistula Diseases 0.000 description 3
- 208000005864 Tracheoesophageal Fistula Diseases 0.000 description 3
- 102000004243 Tubulin Human genes 0.000 description 3
- 108090000704 Tubulin Proteins 0.000 description 3
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 3
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 3
- 208000016274 isolated tracheo-esophageal fistula Diseases 0.000 description 3
- 210000001259 mesencephalon Anatomy 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 210000000115 thoracic cavity Anatomy 0.000 description 3
- 102000015735 Beta-catenin Human genes 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 102100035882 Catalase Human genes 0.000 description 2
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 2
- 102000011022 Chorionic Gonadotropin Human genes 0.000 description 2
- 108010062540 Chorionic Gonadotropin Proteins 0.000 description 2
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 101150099234 FGF10 gene Proteins 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 description 2
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 2
- 102000007620 Pulmonary Surfactant-Associated Protein C Human genes 0.000 description 2
- 108010007125 Pulmonary Surfactant-Associated Protein C Proteins 0.000 description 2
- 206010042573 Superovulation Diseases 0.000 description 2
- 210000002588 alveolar type II cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000000270 basal cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000002224 dissection Methods 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 2
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 2
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 2
- 229940084986 human chorionic gonadotropin Drugs 0.000 description 2
- 230000000887 hydrating effect Effects 0.000 description 2
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 2
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 2
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 2
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 2
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 2
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 206010003598 Atelectasis Diseases 0.000 description 1
- 241001260012 Bursa Species 0.000 description 1
- 206010008723 Chondrodystrophy Diseases 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 238000000116 DAPI staining Methods 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 208000005156 Dehydration Diseases 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000005189 Embolism Diseases 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 102000004864 Fibroblast growth factor 10 Human genes 0.000 description 1
- 108090001047 Fibroblast growth factor 10 Proteins 0.000 description 1
- 102100023600 Fibroblast growth factor receptor 2 Human genes 0.000 description 1
- 101710182389 Fibroblast growth factor receptor 2 Proteins 0.000 description 1
- 206010016717 Fistula Diseases 0.000 description 1
- 102000006771 Gonadotropins Human genes 0.000 description 1
- 108010086677 Gonadotropins Proteins 0.000 description 1
- 101100371204 Homo sapiens TTF1 gene Proteins 0.000 description 1
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010050171 Oesophageal dysplasia Diseases 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 208000007123 Pulmonary Atelectasis Diseases 0.000 description 1
- 101150071739 Tp63 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 208000008919 achondroplasia Diseases 0.000 description 1
- 101150063416 add gene Proteins 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000001174 ascending effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 210000004952 blastocoel Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 210000000254 ciliated cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 230000003890 fistula Effects 0.000 description 1
- 230000003325 follicular Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000002622 gonadotropin Substances 0.000 description 1
- 210000004276 hyalin Anatomy 0.000 description 1
- 210000003016 hypothalamus Anatomy 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000007040 lung development Effects 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 230000022256 midbrain development Effects 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 210000004681 ovum Anatomy 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 239000008096 xylene Substances 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明属于医药领域，具体涉及一种具有Ⅰ型气管发育不全表型的双侧肺脏缺失小鼠模型及其构建方法。本发明利用CRISPR/Cas9，通过删除TTF‑1基因的第二外显子序列，制备一种气管和食管完全分离的双侧肺脏缺失的小鼠模型。本发明构建的小鼠模型可应用于囊胚干细胞互补研究并实现器官再生，同时可检测干细胞的嵌合能力和向组织器官发育的分化潜能；为探索TTF‑1基因在胚胎发育中的作用提供研究材料，为其他肺脏缺失动物模型（如大鼠、兔、猪、牛、羊等）的制备提供研究思路。
Description
技术领域
本发明属于医药领域，具体涉及一种具有Ⅰ型气管发育不全表型的双侧肺脏缺失小鼠模型及其构建方法。
背景技术
全世界范围都面临着临床供体器官短缺问题。通过干细胞囊胚互补在动物体内再生异种器官可能是潜在的解决途径。该方法通过敲除某一器官发育的主要基因构建该器官定向缺失的动物模型，然后以该动物模型的早期发育阶段的胚胎(囊胚)为宿主，通过向囊胚腔中注射干细胞以使外源注入的干细胞在宿主发育过程中优先形成缺失的器官。目前，用于囊胚互补研究的肺脏缺失模型主要是通过基因工程技术改造TTF-1(甲状腺转录因子-1)、Fgf-10(成纤维细胞生长因子-10)、Fgfr-2(成纤维细胞生长因子受体-2)或β-catenin(β-连环蛋白)基因实现的。其中，通过全身删除Fgf10基因获得的小鼠模型表现为肺缺失，但也导致了其他大量组织器官的严重发育异常[1]。另外，全身删除Fgf10基因或上皮特异性删除Fgfr2或β-catenin基因的小鼠模型的肺脏内部组织并没有完全缺失，故而作为囊胚互补研究的宿主胚胎时，对供体干细胞参与胚胎发育产生较大影响[1,2]。1996年Kimura等人通过传统同源重组方法获得一种肺脏缺失小鼠模型[3]，该模型通过向胚胎干细胞的TTF-1基因第3外显子处插入含终止密码子的新霉素耐药基因(neo+)，再经过种系嵌合和交配传代获得的TTF-1双等位基因敲除小鼠，以下简称为TTF1-E3stop小鼠(见图1)。TTF1-E3stop小鼠肺脏的形态呈半透明无定形的囊状，被认为是发育不全的支气管树上皮结构；而且多数TTF1-E3stop胎鼠的囊状肺脏仅存在于单侧胸腔内，这意味着以TTF1-E3stop小鼠为宿主胚胎的囊胚互补研究多数仅能获得单侧的由供体细胞衍生的肺脏。另外，所有的TTF1-E3stop小鼠均表现为胚胎期发育异常导致的气管和食管没有分离的气食管瘘畸形(Tracheoesophageal Fistula，TEF)；而以TTF1-E3stop作为宿主胚胎的囊胚互补研究已经证明，这种先天的气管和食管发育异常无法被小鼠胚胎干细胞救援，并最终导致获得的嵌合体子鼠由于仍然存在TEF表型而在出生时全部死亡[4]。除上述发育异常外，TTF1-E3stop小鼠还存在甲状腺缺失和间脑畸形[3,5]。
发明内容
针对TTF1-E3stop小鼠模型存在的不足之处，我们利用高效新型基因编辑技术CRISPR/Cas9，通过删除TTF-1基因的第二外显子序列，制备一种气管和食管完全分离的双侧肺脏缺失的小鼠模型，以下简称TTF1-E2del小鼠。
本发明解决其技术问题采用的技术方案是：
第一方面，本发明首先保护一种具有Ⅰ型气管发育不全表型的双侧肺脏缺失小鼠模型的构建方法，包括如下具体步骤：
(1)寻找小鼠TTF-1基因，确定第二外显子编码区作为目标区域；
(2)体外转录获得sgRNA和cas9 mRNA，将其显微注射到小鼠的细胞受精卵内，培养24h后，通过胚胎移植，将存活的细胞移植到同期发情的CD1假孕母鼠的输卵管中，通过手术获得发育到期的子鼠；
(3)PCR测序确认TTF-1第二外显子双等位基因敲除子鼠，小鼠模型构建成功。
具体的，针对TTF-1基因的第二外显子区域设计CRISPR/Cas9技术所需要的向导RNA(sgRNA)，合成sgRNA序列并克隆于sgRNA表达载体；在体外分别转录sgRNA和编码Cas9的mRNA，通过小鼠胚胎显微注射方法，向受精卵内注射两种RNA分子；再通过胚胎移植技术向同期发情的假孕母鼠输卵管内移植注射后的小鼠胚胎；待母鼠怀孕并妊娠到期时，通过手术获得即将发育到期的子鼠；通过PCR和Sanger测序鉴定子鼠的基因型，即TTF-1基因第二外显子的删除情况，确认哪些子鼠为TTF1-E2del。
本发明继续通过解剖、固定与石蜡包埋切片、H&E染色、免疫荧光染色、免疫组织化学染色等方法鉴定TTF1-E2del子鼠的肺脏、气管-食管、甲状腺和间脑等组织器官的表型。
作为本申请的优选技术方案，所述sgRNA包括sgRNA1、sgRNA2，
所述sgRNA1的序列为：5'-TGACATCTTGAGTCCCCTGG-3'，如SEQ ID No:1所示；
所述sgRNA2的序列为：5'-CGCCTACCACATGACGGG-3'，如SEQ ID No:2所示。
第二方面，本发明还保护前文所述构建方法构建得到的具有Ⅰ型气管发育不全表型的双侧肺脏缺失小鼠模型。
第三方面，本发明保护前文所述的具有Ⅰ型气管发育不全表型的双侧肺脏缺失小鼠模型在囊胚干细胞互补研究中的应用。
第四方面，本发明还保护前文所述的具有Ⅰ型气管发育不全表型的双侧肺脏缺失小鼠模型在器官再生研究中的应用。
第五方面，本发明还保护前文所述的具有Ⅰ型气管发育不全表型的双侧肺脏缺失小鼠模型在小鼠TTF-1基因功能研究中的应用。
第六方面，本发明保护前文所述构建方法在构建其他肺脏缺失动物模型(如大鼠、兔、猪、牛、羊等)以及在此基础上的、器官再生和基因功能研究中的应用。
本发明构建的小鼠模型可应用于囊胚干细胞互补研究并实现器官再生，同时可检测干细胞的嵌合能力和向组织器官发育的分化潜能；为探索TTF-1基因在胚胎发育中的作用提供研究材料，为其他肺脏缺失动物模型的制备提供研究思路。
有益效果
本发明提供的一种具有Ⅰ型气管发育不全表型的双侧肺脏缺失小鼠模型的构建方法，与现有技术相比，具有以下有益效果：本发明利用CRISPR/Cas9技术，获得的32只子鼠。经基因型鉴定发现其中有27只子鼠的TTF1基因第二外显子序列发生双等位基因敲除(称为TTF1-E2del小鼠)，双等位基因编辑效率达到84.38％；所有TTF1-E2del小鼠的表型为双侧囊状肺脏(缺少肺实质，没有肺泡II型细胞和血管，含有基底细胞和发育不全的支气管树，见图2和图3)、甲状腺发育异常(见图4)以及间脑未见明显异常(见图5)，更为重要的是57％的TTF1-E2del小鼠出现了类似于人类先天气管食管发育畸形(气管和食管成功分离的Ⅰ型气管发育不全，见图6)，即获得了气管-食管完全分离的双侧肺脏缺失的小鼠模型。
附图说明
图1为TTF1-E2del小鼠模型的基因编辑模式图；
图2为TTF1-E2del小鼠模型的囊状肺；
图3为TTF1-E2del小鼠囊状肺脏内细胞组成；
图4为TTF1-E2del小鼠的甲状腺发育异常；
图5为TTF1-E2del小鼠的间脑未见明显异常；
图6为TTF1-E2del小鼠的Ⅰ型气管发育不全。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步详细说明。所用试剂或者仪器设备未注明生产厂商的，均视为可以通过市场购买的常规产品。
实施例1：
(1)设计并体外转录sgRNA：以小鼠TTF-1基因(GenBank,NC_000078.7)第二外显子编码区作为目标区域，使用在线CRISPR设计工具(http://crispr.mit.edu/)设计向导RNA(sgRNA)，分别命名为TTF1-sgRNA1和TTF1-sgRNA2。其具体序列分别为：5'-TGACATCTTGAGTCCCCTGG-3'和5'-CGCCTACCACATGACGGG-3'。合成sgRNA的DNA寡核苷酸序列，将其退火处理并通过BsaI限制内切酶酶切位点克隆至Addgene公司的sgRNA表达载体pUC57kan-T7-gRNA(#115520)，克隆成功的载体称为sgRNA表达质粒(pUC57kan-T7-TTF1-sgRNA1和pUC57kan-T7-TTF1-sgRNA2)。利用限制性内切酶DraI分别将上述sgRNA表达质粒线性化，再使用Invitrogen公司的MEGA shortscriptTMT7转录试剂盒(AM1354)体外转录线性化的sgRNA表达质粒，再利用Qiagen公司的miRNeasy Mini Kit试剂盒获得纯化后的sgRNA(TTF1-sgRNA1和TTF1-sgRNA2)。
(2)体外转录Cas9蛋白的mRNA：利用限制性内切酶AgeI将Addgene公司的Cas9蛋白表达质粒pST1374-N-NLS-flag-linker-Cas9(#44758)线性化，再使用Invitrogen公司的mMESSAGE mMACHINETMT7转录试剂盒(AM1344)体外转录线性化的Cas9蛋白表达质粒，再利用Qiagen公司的miRNeasy Mini Kit试剂盒获得纯化后的Cas9蛋白的mRNA(Cas9-mRNA)。
(3)小鼠受精卵的显微注射：先后向C57BL/6J雌性小鼠注射5IU的孕马血清促性腺激素(PMSG)和5IU人绒毛膜促性腺激素(hCG)，两者间隔48小时，完成超数排卵；超数排卵的雌鼠与雄鼠合笼。解剖经过合笼并已见栓的超数排卵雌鼠，由输卵管壶腹部收集受精卵，置于KSOM培养液中。通过显微注射的方法，将混合好的5ng/μl TTF1-sgRNA1、5ng/μl TTF1-sgRNA2和10ng/μl Cas9-mRNA共同注射到1-细胞受精卵的原核内。将注射后的受精卵转移培养至KSOM培养基中，在37℃、5％ CO2的培养箱中培养24h；通过胚胎移植，将存活的2-细胞期胚胎移植到同期发情的CD1假孕母鼠的输卵管中。观察母鼠妊娠情况，在妊娠期19天左右，通过手术获得即将发育到期的子鼠，进行以下基因型和表型鉴定。
(4)鉴定子鼠基因型：剪取E19子鼠的尾巴，利用北京天根生物有限公司的基因组DNA提取试剂盒提取子鼠的基因组DNA。通过PCR反应扩增TTF-1基因的第二外显子区域，PCR引物为正向5’-GGTGTTTACCTTGTCATCAGCATGTAAGCTAATTATCTCGG-3’和反向5’-TCACTTACTGGCGGGGAAGCGC-3’；PCR反应条件为94℃5min；94℃30s，65℃30s，72℃2min，35个循环；72℃7min，4℃∞。将纯化后的PCR产物克隆至TAKARA公司的pMD18-T载体中，并转化至DH5α大肠杆菌感受态细胞中；平板培养菌落后，随机挑取10个以上菌落进行Sanger测序；将测序结果与野生型小鼠的TTF-1基因进行比较，从而确认E19子鼠的TTF-1基因敲除情况，将TTF-1第二外显子双等位基因敲除子鼠命名为TTF1-E2del小鼠。
(5)解剖鉴定TTF1-E2del小鼠的肺部表型：随机拿取已获得的TTF1-E2del小鼠进行解剖，初步确认胸腔内的双侧透明囊状肺脏结构。
(6)苏木精-伊红(H&E)染色鉴定肺部、食管-气管、甲状腺和间脑各部位的组织形态和细胞组成：使用10％福尔马林固定解剖后肺部组织或整体TTF1-E2del小鼠，经脱水处理和石蜡包埋后，将目标组织以4μm厚度切片；切片经二甲苯中脱蜡和再水化后，分别使用苏木精染细胞核和伊红染细胞质，并在复水和树脂封片后用尼康正置显微镜拍照记录。
(7)免疫组织化学法分析各组织内蛋白的表达：将上述固定、石蜡包埋和切片的样本，经脱蜡和梯度水化后，用30％过氧化氢去除内源性过氧化氢酶，再用柠檬酸进行抗原修复，之后用1％牛血清白蛋白(BSA)将样本室温封闭1小时进行抗原阻断；完成抗原阻断的样本，按研究目标选择细胞特异性的一抗4℃过夜孵育样本，再使用相应的二抗在室温下孵育样本1-2小时；用含0.05％ Tween20的PBS(pH 7.4)缓冲液清洗完成抗体孵育的样本，再使用Invitrogen公司的DAB染色液进行染色，最后使用苏木精进行染色并封片。一抗TTF-1(SC53136)从Santa Cruz公司购买，稀释比例为1:300；一抗Trp63(ab124762)从Abcam公司购买，稀释比例为1:5000；二抗为山羊抗兔IgG(Abcam，ab6721，稀释比例1:10000)和山羊抗小鼠IgG(KeyGene，KGAA37，稀释比例1:500)。
(8)免疫荧光染色法分析各组织内蛋白的表达：将上述固定、石蜡包埋和切片的样本，经脱蜡和梯度水化后，用30％过氧化氢去除内源性过氧化氢酶，再用柠檬酸进行抗原修复后，用含0.2％Triton X-100的PBS浸泡样本20min，再用10％ BSA将样本室温封闭1小时进行抗原阻断；完成抗原阻断的样本，按研究目标选择细胞特异性的一抗4℃过夜孵育样本，再使用相应的二抗在室温下孵样本育1-2小时；拍照记录前滴加Sigma公司的DAPI染液(D9542)进行细胞核染色。一抗TTF-1(#12373)从Cell Signaling Technology公司购买，稀释比例为1:250；一抗SP-C(SC518029)从Santa Cruz公司购买，稀释比例为1:2000；一抗α-Tubulin(ab7291)从Abcam公司购买，稀释比例为1:1000；荧光二抗为Cy3山羊抗兔IgG(abclone，AS007，稀释比例1:5000)、山羊抗兔IgG Alexa Fluor 488(Invitrogen，A11034，稀释比例1:1000)、山羊抗小鼠IgG Alexa Fluor 546(Invitrogen，A11030，稀释比例1:500)和山羊抗小鼠IgG Alexa Fluor 488(Invitrogen，A32723，稀释比例1:1000)。
结果如下：
(1)图1为TTF1-E2del小鼠模型的基因编辑模式图，如图1所示，TTF1-E2del小鼠模型是利用CRISPR/Cas9技术删除小鼠TTF-1基因第二外显子(Exon2)序列获得的，而TTF1-E3stop小鼠模型是利用传统的同源重组技术在小鼠TTF-1基因第三外显子(Exon3)处插入新霉素抗性基因(Neo)获得的。
(2)图2为TTF1-E2del小鼠模型的囊状肺，由胸腔解剖图和肺脏H&E染色图可知，与野生型小鼠相比，TTF1-E2del小鼠模型为双侧囊状肺脏，缺少肺实质，没有肺泡II型细胞和血管。
(3)图3为TTF1-E2del小鼠囊状肺脏内细胞组成；由肺脏内各类细胞特异性蛋白的免疫荧光染色和免疫组织化学染色图可知，与野生型小鼠相比，TTF1-E2del小鼠的肺脏已完全不表达TTF-1蛋白(见图3A和3C)；肺泡细胞特异性的表面活性蛋白SP-C不表达(见图3B)；基底细胞特异性蛋白Trp63仅表达于缺少肺实质的残留支气管树结构内(见图3C)；肺脏内远端支气管区域不表达纤毛细胞特异性蛋白α-Tubulin，而α-Tubulin在近端支气管区域正常表达，表明肺脏区域内的支气管树发育不全(见图3D)。
(4)图4为TTF1-E2del小鼠的甲状腺发育异常；由甲状腺区域H&E染色图可知，与野生型小鼠相比，TTF1-E2del(简称E2del)小鼠模型的甲状腺发育异常，表现为内部组织结构缺失，缺少甲状腺滤泡等，仅存外部轮廓；由免疫荧光染色图可知，TTF1-E2del小鼠异常的甲状腺包含的细胞均不表达TTF-1蛋白。
(5)图5为TTF1-E2del小鼠的间脑未见明显异常；由间脑区域H&E染色图可知，与野生型小鼠相比，TTF1-E2del小鼠模型的间脑发育未见明显异常；由免疫组织化学染色图可知，TTF1-E2del小鼠的间脑区域的下丘脑包含的细胞均不表达TTF-1蛋白。
(6)图6为TTF1-E2del小鼠的Ⅰ型气管发育不全；从头部到颈部将小鼠气管和食管肺发育的区域水平划分为3个(水平位置1-3)，其中水平位置2的横截面示意图用于明确地区分野生型、气食管瘘畸形和Ⅰ型气管发育不全(见图6A)。由H&E染色图可知，与野生型小鼠相比，TTF1-E2del小鼠表现为Ⅰ型气管发育不全(包括水平位置1中气管和食管完全分离，水平位置2中由气管发育不全导致的主气管分支位置上移，水平位置3中左右主气管之间相距位置较远)，这有别于TTF1-E3stop小鼠的气食管瘘畸形(见图6B)。
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求为保护范围。
相关文献：
[1]Kitahara,A.；Ran,Q.；Oda,K.；Yasue,A.；Abe,M.；Ye,X.；Sasaoka,T.；Tsuchida,M.；Sakimura,K.；Ajioka,Y.；et al.Generation of lungs by blastocystcomplementation in Apneumic Fgf10-deficient mice.Cell Rep.2020,31,107626.
[2]Mori,M.；Furuhashi,K.；Danielsson,J.A.；Hirata,Y.；Kakiuchi,M.；Lin,C.S.；Ohta,M.；Riccio,P.；Takahashi,Y.；Xu,X.；et al.Generation of functionallungs via conditional blastocyst complementation using pluripotent stemcells.Nat.Med.2019,25,1691-1698.
[3]Kimura,S.；Hara,Y.；Pineau,T.；Fernandez-Salguero,P.；Fox,C.H.；Ward,J.M.；Gonzalez,F.J.The T/ebp null mouse:thy-roid-specific enhancer-bindingprotein is essential for the organogenesis of the thyroid,lung,ventralforebrain,and pituitary.Genes Dev.1996,10,60-69.
[4]Wen,B.；Li,E.；Ustiyan,V.；Wang,G.；Guo,M.；Na,C.L.；Kalin,G.T.；Galvan,V.；Xu,Y.；Weaver,T.E.；et al.In Vivo generation of lung and thyroid tissuesfrom embryonic stem cells using blastocyst complementation.Am.J.Respir.Crit.Care.Med.2020,203,471-483.
[5]Minoo,P.；Su,G.；Drum,H.；Bringas,P.；Kimura,S.Defects intracheoesophageal and lung morphogenesis in Nkx2.1(-/-)mouseembryos.Dev.Biol.1999,209,60-71.
Claims (8)
1.一种具有Ⅰ型气管发育不全表型的双侧肺脏缺失小鼠模型的构建方法，其特征在于，包括如下具体步骤：
（1）寻找小鼠TTF-1基因，确定第二外显子编码区作为目标区域；
（2）体外转录获得sgRNA和cas9 mRNA，将其显微注射到小鼠的细胞受精卵内，培养24h后，通过胚胎移植，将存活的细胞移植到同期发情的CD1假孕母鼠的输卵管中，通过手术获得发育到期的子鼠；
（3）PCR测序确认TTF-1第二外显子双等位基因敲除子鼠，小鼠模型构建成功。
2.根据权利要求1所述的一种具有Ⅰ型气管发育不全表型的双侧肺脏缺失小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述sgRNA包括sgRNA1、sgRNA2，
所述sgRNA1的序列为：5'-TGACATCTTGAGTCCCCTGG-3'，如SEQ ID No:1所示；
所述sgRNA2的序列为：5'-CGCCTACCACATGACGGG-3'，如SEQ ID No:2所示。
3.权利要求1或2所述的一种具有Ⅰ型气管发育不全表型的双侧肺脏缺失小鼠模型的构建方法构建得到的具有Ⅰ型气管发育不全表型的双侧肺脏缺失小鼠模型。
4.权利要求3所述的具有Ⅰ型气管发育不全表型的双侧肺脏缺失小鼠模型在囊胚干细胞互补研究中的应用。
5.权利要求3所述的具有Ⅰ型气管发育不全表型的双侧肺脏缺失小鼠模型在器官再生研究中的应用。
6.权利要求3所述的具有Ⅰ型气管发育不全表型的双侧肺脏缺失小鼠模型在小鼠TTF-1基因功能研究中的应用。
7.权利要求1或2所述的一种具有Ⅰ型气管发育不全表型的双侧肺脏缺失小鼠模型的构建方法在构建其他肺脏缺失动物模型以及在此基础上的干细胞互补、器官再生和基因功能研究中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述动物为大鼠、兔、猪、牛、或羊。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211438555.5A CN115772539B (zh) | 2022-11-17 | 一种具有ⅰ型气管发育不全表型的双侧肺脏缺失小鼠模型及其构建方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211438555.5A CN115772539B (zh) | 2022-11-17 | 一种具有ⅰ型气管发育不全表型的双侧肺脏缺失小鼠模型及其构建方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN115772539A true CN115772539A (zh) | 2023-03-10 |
| CN115772539B CN115772539B (zh) | 2024-06-21 |
Family
ID=
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1731932A (zh) * | 2002-12-09 | 2006-02-08 | 儿童医院医疗中心 | 诊断和治疗间质性肺病的方法 |
| WO2012096436A2 (ko) * | 2011-01-13 | 2012-07-19 | 이화여자대학교 산학협력단 | 과산소 노출에 의한 폐손상 모델 동물, 및 ｔａｚ 마커를 이용한 과산소 노출에 의한 폐손상 진단용 키트 |
| JP2018191579A (ja) * | 2017-05-17 | 2018-12-06 | 国立大学法人 新潟大学 | 肺の製造方法 |
| CN114946762A (zh) * | 2022-04-18 | 2022-08-30 | 安徽大学 | 一种气道纤毛上皮细胞缺失的动物模型的构建及应用 |
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1731932A (zh) * | 2002-12-09 | 2006-02-08 | 儿童医院医疗中心 | 诊断和治疗间质性肺病的方法 |
| WO2012096436A2 (ko) * | 2011-01-13 | 2012-07-19 | 이화여자대학교 산학협력단 | 과산소 노출에 의한 폐손상 모델 동물, 및 ｔａｚ 마커를 이용한 과산소 노출에 의한 폐손상 진단용 키트 |
| JP2018191579A (ja) * | 2017-05-17 | 2018-12-06 | 国立大学法人 新潟大学 | 肺の製造方法 |
| CN114946762A (zh) * | 2022-04-18 | 2022-08-30 | 安徽大学 | 一种气道纤毛上皮细胞缺失的动物模型的构建及应用 |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| DAISUKE MATSUBARA等: "Reciprocal expression of trefoil factor-1 and thyroid transcription factor-1 in lung adenocarcinomas", 《CANCER SCIENCE》, no. 111, 30 April 2020 (2020-04-30), pages 2183 * |
| LIHUA ZHAO等: "Development of a Lung Vacancy Mouse Model through CRISPR/Cas9-Mediated Deletion of Thyroid Transcription Factor 1 Exon 2", 《CELLS》, no. 11, 1 December 2022 (2022-12-01), pages 3874 * |
| SHIOKO KIMURA等: "The T/ebp null mouse: thyroid-specific enhancer-binding protein is essential for the organogenesis of the thyroid, lung, ventral forebrain, and pituitary", 《GENES & DEVELOPMENT》, no. 10, 31 December 1996 (1996-12-31), pages 60 - 69, XP002537370, DOI: 10.1101/GAD.10.1.60 * |
| 王荣根: "大鼠-小鼠嵌合体异种肺器官的研究及GGTA1/CMAH/β4GalNT2敲除猪器官/组织的免疫原性的研究", 《中国博士学位论文全文数据库（电子期刊）医药卫生科技辑》, no. 11, 15 November 2018 (2018-11-15), pages 19 * |
| 胡菲菲: "利用大鼠iPSCs和囊胚互补技术再生肺器官的研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库（电子期刊）医药卫生科技辑》, no. 2, 15 February 2017 (2017-02-15), pages 066 - 385 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US8816150B2 (en) | Conditioned culture media | |
| EP3381278B1 (en) | Method for preparing a canine model of atherosclerosis | |
| CN109837307B (zh) | 建立含外源染色体的胚胎干细胞的方法 | |
| JP2023116719A (ja) | 安定した表現型を示す疾患モデルブタおよびその作製方法 | |
| Kalds et al. | When less is more: targeting the Myostatin gene in livestock for augmenting meat production | |
| WO2018205641A1 (zh) | 一种抗寒及瘦肉型转基因猪及其制备方法 | |
| US8119785B2 (en) | Nucleic acid sequences and homologous recombination vectors for distruption of a Fel D I gene | |
| CN106978416B (zh) | 一种基因定位整合表达系统及其应用 | |
| KR102636332B1 (ko) | 이개체 유래의 배우자를 생산하는 비인간 대형 포유 동물 또는 어류의 작출 방법 | |
| CN115772539B (zh) | 一种具有ⅰ型气管发育不全表型的双侧肺脏缺失小鼠模型及其构建方法 | |
| JP2003235558A (ja) | 分離始原生殖細胞の移植による生殖細胞系列への分化誘導法 | |
| CN115772539A (zh) | 一种具有ⅰ型气管发育不全表型的双侧肺脏缺失小鼠模型及其构建方法 | |
| US10626417B2 (en) | Method of genetically altering and producing allergy free cats | |
| JP4845073B2 (ja) | 再構築受精卵の作製方法及びそれを用いたトランスジェニック胚の作製方法 | |
| WO2005011371A1 (ja) | 核移植卵、単為発生胚および単為発生哺乳動物の作出方法 | |
| EP4144857A1 (en) | Animal preparation method | |
| CN109112160B (zh) | 一种提高哺乳动物克隆胚胎受体妊娠率的方法 | |
| WO2015163711A1 (ko) | 마이오스타틴 유전자를 표적으로 하는 talen 및 이를 이용한 마이오스타틴 유전자가 녹아웃된 동물을 제조하는 방법 | |
| JP4903392B2 (ja) | 遺伝子ホモ改変哺乳動物細胞、遺伝子ホモ改変非ヒト哺乳動物、及びそれらの樹立、作出方法。 | |
| WO2023127903A1 (ja) | 始原生殖細胞が富化された胚を調製する方法 | |
| 王乐韵 et al. | Overcoming Intrinsic H3K27me3 Imprinting Barriers Improves Post-implantation Development after Somatic Cell Nuclear Transfer | |
| CN116868959A (zh) | Rag2基因编辑免疫缺陷模型犬的建立方法 | |
| CN115029382A (zh) | 一种能够区分Tbx1两种可变剪切体的基因修饰小鼠的制备方法 | |
| WO2019225638A1 (ja) | 融合タンパク質、核酸、細胞及び動物の製造方法 | |
| CN115927455A (zh) | Bag5基因敲除小鼠动物模型的构建方法和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant |