CN115770411A

CN115770411A - 一种键合原卟啉的镁离子固相萃取剂及其应用

Info

Publication number: CN115770411A
Application number: CN202211403525.0A
Authority: CN
Inventors: 林萍; 徐一峰; 赵敏; 李春波; 邵阳; 余雷; 宋立升
Original assignee: Shanghai Mental Health Center Shanghai Psychological Counselling Training Center
Current assignee: Shanghai Mental Health Center Shanghai Psychological Counselling Training Center
Priority date: 2022-11-10
Filing date: 2022-11-10
Publication date: 2023-03-10

Abstract

本发明公开了一种键合原卟啉的微晶纤维素固相萃取剂，所述的固相萃取剂可以用于选择性的络合镁离子，对钙离子几乎没有络合能力，排除钙离子对于镁离子检测的干扰；且被络合的镁离子可以被稀酸溶液定量洗脱，检测准确度高。本发明的固相萃取剂特别适用于血清镁离子浓度和常规样品游离态镁离子的检测。

Description

一种键合原卟啉的镁离子固相萃取剂及其应用

技术领域

本发明属于固相萃取领域，具体涉及一种键合原卟啉的镁离子固相萃取剂及其应用。

背景技术

在许多生理化学过程中，镁离子都参与反应并占重要地位，比如是多种酶的激活剂，是人类的遗传物质核酸所必需的元素，也是维持正常神经肌肉功能的重要元素。成人血浆中镁离子的浓度约为0.70～1.15mmol/L(1.70～2.79mg/dL)；儿童略低，约为0.60～0.78mmol/L(1.46～1.89mg/dL)。镁离子浓度过高或过低都会引起多种疾病，病理性升高则可能与(1)肾脏疾病，如慢性肾炎少尿期、尿毒症、急性或慢性肾衰竭等；(2)内分泌疾病，如甲状腺功能减退症、甲状旁腺机能减退症、阿狄森病、未治疗的糖尿病昏迷等；(3)其他疾病，如多发性骨髓瘤、严重脱水症、关节炎、急性病毒性肝炎、阿米巴肝脓肿、草酸中毒等；(4)镁制剂中毒等相关。病理性降低则可能与(1)经消化道丢失，如慢性腹泻、吸收不良综合征、肠道或胆道瘘管等；(2)内分泌疾病，如甲状腺机能亢进症、甲状旁腺机能亢进症、原发性醛固酮增多症以及长期使用皮质激素治疗后；(3)用利尿剂治疗而未及时补充镁(4)其他疾病，如急性胰腺炎、晚期肝硬化、急性心肌梗死、急性酒精中毒等相关。基于以上原因，血浆镁离子浓度检测具有重要的意义；镁离子测定是对血浆中的镁离子进行测定，常用方法是甲基麝香草酚蓝比色法，其是利用溶液中镁离子与甲基麝香草酚蓝(MTB)结合，生成蓝紫色的复合物，加入钙离子螯合剂，去除钙离子背景干扰，通过分光光度计检测600nm处吸光度，根据公式计算出镁含量。

由于血浆或血清中钙离子浓度较高，镁离子浓度相对较低，且甲基麝香草酚蓝比色法检测镁离子容易受到钙离子的干扰，因此该方法虽然绝对误差不大，但是往往造成较大相对误差，对检测人员的熟练度要求较高，操作不慎容易使得检测结果不稳定。为了解决上述问题，对镁离子进行富集，排除钙离子的干扰是切实可行的手段。

发明内容

本发明的主要目的在于解决现有技术中存在的问题，提供一种键合原卟啉的镁离子固相萃取剂及其应用；为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种镁离子固相萃取剂，其特征在于所述镁离子固相萃取剂的结构如式(II)所述：

其中所述A1、A2各自独立的选自微晶纤维素，所述L为A1、A2与原卟啉之间的连接基团(linker)。

进一步的，本发明提供一种镁离子固相萃取剂，其特征在于所述镁离子固相萃取剂的结构如式(II)所述：

其中所述A3、A4各自独立的选自微晶纤维素除羟基以外的残基，所述m、n各自独立的选自0-10的整数，优选的为3-9的整数，优选的为4-8的整数，优选的为5-7的整数，优选的为4的整数。

，其中所述A3、A4各自独立的选自微晶纤维素除羟基以外的残基。

进一步的，本发明提供一种上述镁离子固相萃取剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤:

其中P为羧基保护基，A3、A4的定义如上所述。

步骤1：式a所述的原卟啉在缩合剂的作用下与式b所述结构的化合物发生缩合反应，生成具有式c所示结构的化合物；

步骤2：式c所示结构的化合物脱除保护基P获得式d所述结构的化合物；

步骤3：式d所述结构的化合物与羧基活化剂在惰性有机溶剂中进行反应，得到活性中间体，加入微晶纤维素、有机碱和催化剂继续反应。

以及任选的，过滤，将反应后的产物用有机溶剂充分洗涤，干燥。

进一步的，本发明的上述反应步骤1所述的缩合剂选自DCC、DIC、EDCI中的一种或多种；所述缩合反应优选在有机碱的存在下在催化剂的催化下进行，所述的有机碱选自三乙胺、二异丙基乙基胺、吡啶、DBU中的一种或多种，所述催化剂选自DMAP、4-吡咯烷基吡啶中的一种或两种；所述反应优选在惰性非质子溶剂中进行，所述惰性非质子溶剂选自二氯甲烷、氯仿、二氯乙烷、乙醚、丙酮、THF、DMSO、DMF中的一种或多种。

进一步的，本发明的步骤1在-10-40℃的温度下进行，优选为10-30℃、20-25℃；

进一步的，本发明的步骤1化合物a与化合物b的摩尔比为1：(2-4)，优选为1：(2.4-4)，优选为1：(2.6-4)，优选为1：(3-4)；化合物a与缩合剂的摩尔比为1：(2-4)，优选为1：(2.4-4)，优选为1：(2.6-4)，优选为1：(3-4)；所述化合物a与催化剂的摩尔比为1：0.15-0.4，优选为1：0.2-0.3。

进一步的，本发明的羧基保护基(P)选自叔丁氧羰基(BOC)或叔丁基二甲基硅基(TBS)。

进一步的本发明步骤2脱除保护基的试剂选自酸性试剂或四丁基氟化铵，优选的所述酸性试剂选自选自甲酸、乙酸、三氟乙酸、甲磺酸、对甲基苯磺酸中的一种或多种，所述反应优选在溶剂中进行，所述溶剂选自甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、二氯甲烷、氯仿、二氯乙烷、丙酮、乙醚、THF、水中的一种或多种或四丁基氟化铵。

进一步的，本发明的步骤2在-10-40℃的温度下进行，优选为0-30℃、5-25℃或10-20℃。

进一步的，本发明的步骤3所述的羧基活化剂选自DCC、DIC、EDCI、2,4,6-三氯苯甲酰氯、氯甲酸甲酯、氯甲酸乙酯。所述有机溶剂选自惰性非质子溶剂，优选的所述惰性非质子溶剂选自二氯甲烷、氯仿、二氯乙烷、乙醚、丙酮、THF、DMSO、DMF中的一种或多种。

进一步的，本发明的步骤3所述的有机碱选自三乙胺、二异丙基乙基胺、吡啶、DBU中的一种或多种，所述催化剂选自DMAP、4-吡咯烷基吡啶中的一种或两种；

进一步的，本发明的步骤3优选在-10-40℃的温度下进行，优选为0-30℃、5-25℃或10-20℃。

所述化合物d、活化剂、有机碱的摩尔比为1：(2-6)：(2-6)，优选为1：(2.4-5)：(2.4-5)，优选为1：(2.6-4.8)：(2.6-4.8)；所述化合物d与催化剂的摩尔比为1：0.15-0.4，优选为1：0.2-0.3。

进一步的，本发明的步骤3化合物d与微晶纤维素的摩尔-质量比为1-10mmol/100g，优选为2-8mmol/100g，优选为3-6mmol/100g，或优选为4-5mmol/100g。

进一步的，本发明还提供了依据上述方法制备得到的化合物在制备固相萃取剂中的用途。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1、本发明制备得到的固相萃取剂对镁离子具有很高的亲和力，被截留的镁离子可以在酸性条件下被洗脱，可以用于固相萃取的固定相或填料。

2、本发明制备得到的固相萃取剂对钙离子几乎没有吸附作用，可以用于固相萃取排除钙离子的干扰，用于镁离子检测时方便排除钙离子的干扰。

本发明的相关术语表述：

微晶纤维素(MCC，Microcrystalline cellulose)，主要成分为以β-1,4-葡萄糖苷键结合的直链式多糖类物质，具有如下所述的结构：

本发明的所使用的微晶纤维素为柱色谱用微晶纤维素，市售产品，如国药集团化学试剂有限公司生产，粒度20-10oum；本发明的式II化合物表示微晶纤维素可通过linker键合多个原卟啉分子，具体为原卟啉与微晶纤维素的摩尔-质量比为1-10mmol/100g，优选为2-8mmol/100g，优选为3-6mmol/100g，或优选为4-5mmol/100g。

本发明的固相萃取柱中的填料的量可依据待检测样品的量进行调整，调整方式经本领域技术人员的摸索和测试即可确定。

本发明使用的其他试剂和溶剂均为市售化学纯或分析纯。

本发明的柱体积指的是固相萃取装置每一个萃取单元的有效体积，即装填有固相萃取柱填料部分的体积，示例性的为固相萃取柱填料4的体积。

附图说明

图1：本发明的固相萃取柱的结构示意图。

具体实施方式

为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。

实施例1：化合物c的制备

将1688mg式a化合物(3mmol)溶于50ml干燥的THF，加入1486mg N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC，7.2mmol)，室温搅拌反应10分钟，冰浴下冷却至0℃，加入729mg三乙胺(7.2mmol)和73mg的DMAP(0.6mmol)，以及2220mg化合物b(7.2mmol)，加毕室温搅拌反应，使用TLC监测反应，时间约为9小时；过滤，用3ml乙醚洗涤滤饼，蒸除反应溶剂和三乙胺，硅胶柱层析分离，获得3128mg暗黑色粉末，HPLC-ESI-MS(m/z):[M+H]⁺1143.6。

实施例2：化合物d的制备

将3030mg式c化合物(2.65mmol)溶于30ml甲醇，冷却至0℃，加入0.6ml三氟乙酸，加毕室温搅拌反应，使用TLC监测反应，时间约为6小时；常压蒸除甲醇，减压蒸除三氟乙酸和其他低沸点杂质，将其置于放置有氢氧化钙的真空干燥箱中在40℃干燥过夜，获得2544mg黑色粉末，HPLC-ESI-MS(m/z):[M+H]⁺1031.5。

实施例3：将式d化合物键载至微晶纤维素

将2475mg式d化合物(约2.4mmol)溶解在24ml干燥的二氯甲烷中，加入1118mg N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC，5.76mmol)，室温搅拌反应10分钟，冷却至10℃，加入583mg三乙胺(5.76mmol)和29mg的DMAP(0.24mmol)，称取约240g干燥的微晶纤维素，室温搅拌反应24小时，40℃搅拌反应24小时，TLC监测原料大部分消失，过滤，用二氯甲烷和甲醇洗涤，室温挥干溶剂，在40℃的真空干燥箱中烘干得到黑色固体，备用。

实施例4：本发明的一种固相萃取柱

本发明的一种固相萃取柱如图1所示，其中包括竖直布置的柱管1，柱管1中有过滤筒2，过滤筒2上过滤孔，所述过滤筒2下方的空腔柱管1中依次设置有上筛板3和下筛板5，上筛板3和下筛板5上均布有筛孔，上筛板3与下筛板5间填充有填料4，所述填料4选自实施例3制备得到的键合有原卟啉的微晶纤维素；柱管1的下端同心连接有锥形管6，锥形管6，锥形管6的下端连接有出液管7，出液管可对准96孔板或者其他储液器皿。

实施例5：本发明的固相萃取柱性能测试

取实施例4所述的固相萃取柱，其中填料质量为1g，用去离子充分润湿活化，然后用去离子水洗脱10个柱体积，备用；

准确称量氯化镁和氯化钙固体，将其混合后溶于去离子水，使用容量瓶定容，其中氯化镁的浓度为1mmol/L，氯化钙的浓度为1mmol/L。用移液枪量取1ml上述氯化镁和氯化钙的混合溶液，缓慢滴加至上述固相萃取柱，滴加后在25℃中陈化30分钟，用去离子水洗脱3个柱体积，用氮气吹干固相萃取柱至液滴不再出现，使用容量瓶收集洗脱液A，定容至10ml。然后用pH值为2的稀盐酸洗脱上述固相萃取柱4个体积，使用容量瓶收集洗脱液B，定容至10ml。使用甲基麝香草酚蓝比色法测定洗脱液A中的钙离子浓度和洗脱液B中的镁离子浓度，结果显示洗脱液A中的钙离子浓度为0.097mmol/L(计算折合原待检测样品中钙离子浓度为0.97mmol/L)，洗脱液B中的镁离子浓度为0.096mmol/L(计算折合原待检测样品中镁离子浓度为0.97mmol/L)，以上结果表明本发明的固相萃取填料可以实现对氯化镁的定向萃取，实现氯化镁和氯化钙的高效分离，利用以上方法可以用于降低镁离子检测过程中钙离子的干扰。

实施例6：利用本发明的固体萃取柱测试血浆中的镁离子浓度

取实施例5所述的固相萃取柱，其中填料质量为1g，用去离子充分润湿活化，然后用去离子水洗脱10个柱体积，备用；

用移液器量取1ml健康成人血浆，缓慢滴加至上述固相萃取柱，滴加后在25℃中陈化30分钟，用生理盐水洗脱一个柱体积，用去离子水洗脱3个柱体积；然后用pH值为2的稀盐酸洗脱上述固相萃取柱4个体积，使用容量瓶收集洗脱液，定容至10ml，使用甲基麝香草酚蓝比色法测定洗脱定容液的镁离子浓度0.095mmol/L，计算原血浆中镁离子浓度为0.95mmol/L。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims

1.一种镁离子固相萃取剂，其特征在于所述镁离子固相萃取剂的结构如式(II)所述：

2.一种镁离子固相萃取剂，其特征在于所述镁离子固相萃取剂的结构如式(II)所述：

其中所述A3、A4各自独立的选自微晶纤维素除羟基以外的残基，所述m、n各自独立的选自0-10的整数。

3.一种镁离子固相萃取剂，其特征在于所述镁离子固相萃取剂的结构如式(II)所述：

其中所述A3、A4各自独立的选自微晶纤维素除羟基以外的残基。

4.权利要求2-3任一项所述的镁离子固相萃取剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤:

其中P为羧基保护基；

5.根据权利要求4所述的镁离子固相萃取剂的制备方法，其特征在于所述步骤1的缩合剂选自DCC、DIC、EDCI中的一种或多种；所述缩合反应在有机碱的存在下在催化剂的催化下进行，所述的有机碱选自三乙胺、二异丙基乙基胺、吡啶、DBU中的一种或多种，所述催化剂选自DMAP、4-吡咯烷基吡啶中的一种或两种；所述反应在惰性非质子溶剂中进行，所述惰性非质子溶剂选自二氯甲烷、氯仿、二氯乙烷、乙醚、丙酮、THF、DMSO、DMF中的一种或多种。

6.根据权利要求4所述的镁离子固相萃取剂的制备方法，其特征在于步骤1在-10-40℃的温度下进行。

7.根据权利要求5所述的镁离子固相萃取剂的制备方法，其特征在于步骤1化合物a与化合物b的摩尔比为1：(2-4)；化合物a与缩合剂的摩尔比为1：(2-4)；所述化合物a与催化剂的摩尔比为1：0.15-0.4。

8.根据权利要求4所述的镁离子固相萃取剂的制备方法，其特征在于羧基保护基(P)选自叔丁氧羰基(BOC)或叔丁基二甲基硅基(TBS)。

9.根据权利要求4所述的镁离子固相萃取剂的制备方法，其特征在于所述羧基活化剂选自DCC、DIC、EDCI、2,4,6-三氯苯甲酰氯、氯甲酸甲酯或氯甲酸乙酯；所述有机溶剂选自惰性非质子溶剂；所述的有机碱选自三乙胺、二异丙基乙基胺、吡啶、DBU中的一种或多种，所述催化剂选自DMAP、4-吡咯烷基吡啶中的一种或两种。

10.权利要求1-3任一项所述的式II化合物或权利要求4-9任一项所述的方法制备得到的产物在制备镁离子固相萃取剂中的用途。