CN115747304A - 一种高gc含量文库环化用试剂盒及其用途和方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及高通量测序检测领域，特别是涉及一种高GC含量文库环化用试剂盒及其用途和方法，所述试剂盒包括单链环化试剂，所述单链环化试剂包括测序平台连接引物、连接酶和单链稳定添加剂，所述单链稳定添加剂选自甜菜碱、甲酰胺、DMSO或甘油中的任一种或多种。所述试剂盒能用于制备单链环化DNA产品。本发明的试剂盒对高GC含量文库的环化效率高，测序深度足够，不会造成漏检。

Description

一种高GC含量文库环化用试剂盒及其用途和方法

技术领域

本发明涉及高通量测序检测领域，特别是涉及一种高GC含量文库环化用试剂盒及其用途和方法。

背景技术

在生命科学领域，随着测序技术的发展，测序工具不断推陈出新。华大智造凭借其独有的新型DNBseq^TM测序技术以及高准确性、低错误积累、低重复序列、低标签跳跃等特点被广泛应用。

华大BGISEQ测序平台整体流程主要分为三个步骤：单链环化DNA制备、DNB的制备/加载和上机测序分析，其中单链环化DNA制备是整体流程中的基础。单链DNA环化的核心技术为使用一段寡核苷酸链辅助成环的连接反应。具体的，DNA单链环化是将带有接头序列的双链DNA(double-stranded DNA，dsDNA)，通过高温变性形成单链DNA(single-strandedDNA，ssDNA)，在连接酶的催化下，splint oligo引物与ssDNA的两端互补配对。ssDNA两端连接形成单链环状DNA分子，后续用于构建MGI高通量测序仪专用的单链环状DNA文库。

GC含量较高的基因组区域往往具有重要的生物学功能，该区域的变异或表观遗传状态的改变往往与肿瘤等疾病的发生发展直接相关，因此对于高GC基因组区域的变异检测具有重要的临床应用价值。然而，目前市面上已存在的几款单链环化DNA制备试剂盒，对于含有高GC文库片段环化效果不理想，从而导致测序下机数据性能指标不能满足常规的基因检测要求，尤其测序覆盖深度明显低于其他区域，易于造成基因变异的漏检，因此急需开发一种提高高GC含量文库环化方法，克服上述问题。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种高GC含量文库环化用试剂盒及其用途和方法，用于解决现有技术中的问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种用于高GC含量文库环化的试剂盒，所述试剂盒包括单链环化试剂，所述单链环化试剂包括测序平台连接引物、连接酶和单链稳定添加剂。

所述单链稳定添加剂选自甜菜碱、甲酰胺、DMSO或甘油中的任一种或多种

本发明还提供所述用于高GC含量文库环化的试剂盒在制备单链环化DNA产品中的用途。

本发明还提供一种高GC含量文库环化的方法，所述方法包括使用所述的用于高GC含量文库环化的试剂盒进行环化。

如上所述，本发明的高GC含量文库环化用试剂盒及其用途和方法，具有以下有益效果：对高GC含量文库的环化效率高，测序深度足够，不会造成漏检；同时不影响其他GC含量文库的测序深度，因此针对多对引物混样文库可有效的提高文库间的均一性，提高panel整体性能。

附图说明

图1显示为本发明的不同长度文库片段琼脂糖凝胶电泳图。

图2显示为本发明的不同文库片段环化效率对比图。

图3显示为不同浓度甜菜碱的环化效率对比图。

图4显示为不同浓度甲酰胺的环化效率对比图。

具体实施方式

本发明提供一种用于高GC含量文库环化的试剂盒，所述试剂盒包括单链环化试剂，所述单链环化试剂包括测序平台连接引物、连接酶和单链稳定添加剂。

在一种实施方式中，所述高GC含量是指GC含量为50～85％。例如GC含量为50～60％、60～70％、70～75％、75～80％、80～85％。

高GC含量文库片段大小在100-600bp范围内。优选的，所述高GC含量文库片段大小在200～400bp。

在一种实施方式中，所述测序平台连接引物长度为18-30bp。在一种实施方式中，所述测序平台连接引物为适配于华大BGISEQ测序平台的连接引物，即连接引物5’端序列与华大平台构建的文库3’端反向互补，3’端序列与华大平台构建的文库5’端反向互补。

在一种实施方式中，所述连接引物序列如SEQ ID NO：25所示：5’-GGAACCGAGTGTCTTGCTGTACCG-3’。

在一种实施方式中，所述连接酶选自T4连接酶、大肠杆菌DNA连接酶或热稳定DNA连接酶。

所述单链稳定添加剂选自甜菜碱、甲酰胺、DMSO或甘油中的任一种或多种。

在一种实施方式中，所述单链环化试剂还包括环化缓冲液。所述环化缓冲液为反应提供环化环境。本领域技术人员可根据实际情况选择合适的环化缓冲液。环化缓冲液中包括Tris-HCl,MgCl₂,DTT,ATP。例如环化缓冲液中以环化缓冲液的总体积为基准，包括300～500mM Tris-HCl，50～150mM MgCl₂，50～150mM DTT，3～8mM ATP。在一种实施方式中，所述环化缓冲液例如为T4 DNA连接酶缓冲液，品牌：Invitrogen，货号:46300018。

所述单链环化试剂用于制备将两端带有测序接头的文库制备成为带有连接引物的DNA环化中间产物。

所述单链环化试剂中各试剂可以是单独包装的试剂，也可以是各试剂混合形成的混合物。

在一种实施方式中，所述试剂盒中还包括酶切消化试剂。所述酶切消化试剂用于酶切消化所述DNA环化中间产物。

所述酶切消化试剂包括核酸酶和酶切缓冲液。所述核酸酶选自核酸外切酶I或核酸外切酶VII。所述酶切缓冲液为反应提供酶切环境。本领域技术人员可根据实际情况选择合适的酶切缓冲液。酶切缓冲液中包括甘氨酸-KOH，MgCl₂，DTT。例如酶切缓冲液中以酶切缓冲液的总体积为基准，包括600～700mM甘氨酸-KOH，60～75mM MgCl₂，5～15mM DTT。在一种实施方式中，所述酶切缓冲液例如为核酸外切酶I Buffer，品牌：睿璟生物，货号RJ001T-A。

在一种实施方式中，所述酶切消化试剂还包括消化终止试剂。所述消化终止试剂为金属螯合剂。本领域技术人员可以根据需要选择沉淀型螯合剂例如碳酸钠和正磷酸钠、络合型螯合剂例如氨基酸衍生物(如EDTA)和羟基羟酸类(如柠檬酸)、磷酸盐类螯合剂(如三聚磷酸钠)。

在一种实施方式中，试剂盒中还包括纯化试剂。所述纯化试剂用于纯化所述DNA环化产物。

所述纯化试剂包括磁珠、乙醇、TE缓冲液。

在一种实施方式中，所述试剂盒中还可以包括环化用耗材，例如磁力架、离心管、PCR管等。

本发明还提供所述用于高GC含量文库环化的试剂盒在制备单链环化DNA产品或基因测序中的用途。

所述基因测序为非疾病诊断用途。所述非疾病诊断用途例如：为研究疾病的发生发展机制观察或检测某基因。

本发明还提供一种高GC含量文库环化的方法，所述方法包括使用所述用于高GC含量文库环化的试剂盒进行环化。

在一种实施方式中，所述高GC含量文库环化的方法包括以下步骤：

1)将两端带有测序接头的单链DNA文库与单链环化试剂混合后反应得到带有连接引物的DNA环化中间产物；

2)将DNA环化中间产物与酶切消化试剂混合进行酶切消化；

3)酶切消化结束后，与消化终止试剂混合以终止酶切消化，得到环化产物。

在一种实施方式中，步骤1)中两端带有测序接头的单链DNA文库通过将两端带有测序接头的双链DNA文库退火变性获得。所述两端带有测序接头的双链DNA文库可以通过现有技术获得。例如所述两端带有测序接头的双链DNA文库通过2xKAPA 2G Fast MultiplexMix对目的DNA进行扩增并纯化后，再将纯化产物和接头引物混合进行第二轮扩增并纯化后获得。

步骤1)中，若建库过程中文库有特殊要求，则按照特殊要求获取所需的DNA量。若无特殊要求，以环化体系为基准，步骤1)中单链DNA文库量为0.5pmol～1pmol。

不同片段大小DNA 1pmol分子对应不同的量，可根据以下公式计算选择所需的单链DNA文库投入量：

摩尔数与质量间的换算公式：

所述单链DNA文库可以是一个DNA文库构成的单种样本，也可以是多个带有不同Barcode的DNA文库构成的样本混合物。

混合样本中单链DNA文库总量为0.5pmol～1pmol。若每个样本所需数据量相同，则等量混合。片段差距较大的多个DNA文库，建议分开环化，而不是作为混合样本共同环化。

所述单链DNA文库长度为200-400bp。在一种实施方式中，单链DNA文库两端带有华大测序接头。在一种实施方式中，单链DNA文库两端带有适配华大BGISEQ测序平台的接头。

以环化体系的总体积为基准，所述测序平台连接引物、连接酶的终浓度分别为0.2～0.8μM、0.2～1U/μL。优选的，所述测序平台连接引物的终浓度为0.2～0.4μM、0.4～0.6μM、0.6～0.8μM。优选的，所述连接酶的终浓度为0.2～0.4U/μL、0.4～0.6U/μL、0.6～0.8U/μL、0.8～1U/μL。

所述单链稳定添加剂为甜菜碱时，以环化体系的总体积为基准，所述甜菜碱的终浓度为0.4～1.2mol/L。优选的，终浓度选自0.4～0.6mol/L、0.6～0.8mol/L、0.8～1.0mol/L、1.0～1.2mol/L。

在一种实施方式中，环化的条件为35～38℃，12～18min。在一种实施方式中，环化在PCR仪上进行。在一种实施方式中，环化的条件还包括酶切结束后维持4～20℃。

步骤2)中，以酶切消化体系的总体积为基准，核酸酶的终浓度为0.5～2U/μL。

步骤3)中，以酶切消化体系的总体积为基准，消化终止试剂的终浓度为0.05～0.1mol/L。

在一种实施方式中，酶切消化的条件为35～38℃，8～12min。在一种实施方式中，酶切消化在PCR仪上进行。在一种实施方式中，酶切消化的条件还包括酶切结束后维持4～20℃。

在一种实施方式中，还包括用纯化试剂纯化步骤3)得到的环化产物。纯化步骤可以采用本领域常规的技术手段进行。

本发明还提供一种基因测序方法，包括使用所述用于高GC含量文库环化的试剂盒进行环化后利用测序平台进行测序。

本发明的基因测序方法尤其适用于高GC含量文库测序。在一种实施方式中，测序平台选自华大测序平台，例如BGISEQ测序平台。

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

实施例1一种基于片段大小的高GC文库环化方法

在肿瘤细胞中，TERT基因异常表达的驱动因素有很多，包括转录激活因子、TERT拷贝数变异、TERT启动子突变、TERT启动子区高甲基化等。其中最主要的两种机制为TERT基因启动子区甲基化，占53％；TERT基因启动子区突变，占31％。然而TERT启动子区GC含量高达70％以上，为肿瘤相关基因检测中一大难题。

实施例以TERT启动区为例，结合附图和实施例进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。

【材料】

1.环化反应通用试剂盒，睿璟生物，货号RJ001T-A；

2.2×KAPA 2G Fast Multiplex Mix，Kapa biosystems，货号KK5802；

3.TERT C250T低频DNA(5％)，睿璟生物，货号RJ005Y；

4.Agencourt AMPure XP(纯化磁珠)，Beckman，货号A63881；

5.Qubit仪及配套试剂(试剂为Thermo，货号：Q10212)；

6.MGISEQ-200测序仪及配套试剂(华大智造，试剂货号：1000019932)

7.甜菜碱，睿璟生物，货号RJ003H；

8.PCR仪。

文库构建方法如下：

1样本类型：含华大测序接头引物的TERT启动子区双链DNA文库，GC含量为75％，长度分别为100bp,200bp,300bp,400bp,500bp,600bp；含华大测序接头引物的内参基因GAPDH双链DNA文库，GC含量50％，长度分别为100bp,200bp,300bp,400bp,500bp,600bp。

1.1样本的制备

1.1.1根据TERT启动区设计不同长度的引物序列，其引物序列入下表1所示：

表1 TERT启动区不同长度的引物序列

1.1.2根据GAPDH外显子设计不同长度的引物序列，其引物序列入下表2所示：

表2 GAPDH外显子不同长度的引物序列

1.1.3含华大测序接头引物文库构建

1.1.3.1分别用不同长度的TERT和GAPDH扩增子引物(表1，表2)和扩增试剂2xKAPA2GFast Multiplex Mix对DNA进行扩增，反应液体系及反应条件如下(表3，表4)：

表3反应液的配制

表4 PCR仪上设置如下条件进行反应：

1.1.3.2第一轮PCR产物纯化

1)程序反应结束后，样本短暂离心，将样本加无核酸水补足20μL后转移至含14μL(0.7×)XP磁珠中，涡旋混匀，室温孵育2min；

2)将样本放置磁力架上，待溶液澄清后，将上清转移至含10μL(0.5×)XP磁珠中，涡旋混匀，室温孵育5min；

3)将样本放置磁力架上，待溶液澄清后，弃上清；

4)向样本加入200μL新鲜配制的80％乙醇，磁力架上旋转一圈，30S后，弃乙醇；重复此步骤1次，共2次；

5)将样本离心，磁力架上弃残余液体，开盖干燥磁珠1-2min至磁珠不反光；

6)向磁珠中加入9μL Nuclease-Free Water，涡旋混匀，短暂离心；

7)将带磁珠样本转移至新的PCR管中，无需去除磁珠，直接进行第二轮扩增；

1.1.3.3第二轮扩增

应用扩增试剂2xKAPA 2G Fast Multiplex Mix和接头引物(购自于南京诺唯赞生物科技股份有限公司，货号：NM108)对上一轮产物进行扩增，反应液体系及反应条件如下(表5，表6)：

表5反应液的配制

*接头引物购自于南京诺唯赞生物科技股份有限公司，货号：NM108

表6 PCR仪上设置如下条件进行反应

1.1.3.4第二轮PCR产物纯化

1)将带磁珠样本20μL转移至含20μL(1×)XP磁珠中，涡旋混匀，室温孵育5min；

2)将样本放置磁力架上，待溶液澄清后，弃上清；

3)在样本中加入200μL新鲜配制的80％乙醇，磁力架上旋转一圈，30S后，弃乙醇；重复此步骤1次，共2次；

4)将样本管离心，磁力架上弃残余液体，开盖干燥磁珠1-3min至磁珠表面不反光；

5)在磁珠中加入15μL无核酸酶水，涡旋混匀，室温孵育5min；

6)将样本管放置磁力架上，待澄清后，转移上清至新的标记清楚的1.5mL EP管中，该纯化产物为构建好的两端带有测序接头的双链DNA文库；

1.1.3.5文库的检验：

构建好的文库用Qubit准确定量，对文库片段用琼脂糖电泳进行质检，文库片段如图1所示。

【环化操作流程】

1变性

1.1根据投入DNA的片段长度，取1pmol至新的0.2ml PCR管中，用TE缓冲液补充至50μL。

1.2混匀离心后，放置PCR上，设置变性反应条件：98℃，3min；热盖105℃。

1.3反应结束后，立即置于冰上，冰浴2min后瞬时离心，置于冰上待用。

2单链环化

2.1在冰上配制单链环化反应液(表7)

表7单链环化反应液的配制

注：表7中连接引物**序列为5’-GGAACCGAGTGTCTTGCTGTACCG-3’。

2.2向上一步的产物中加入20μL单链环化反应液，总体积为70μL，轻微涡旋震荡混匀，瞬时离心。

2.3将上述PCR管置于PCR仪上进行环化，并设置环化反应条件：37℃，15min；10℃，hold；无热盖。

2.4反应结束后，取出PCR管，瞬时离心后立即进行下一步反应。

3酶切消化过程

3.1在冰上配制酶切消化反应液(表8)

表8酶切消化反应液的配制

3.2向上一步的产物中加入10μL酶切消化反应液，轻微涡旋震荡混匀，瞬时离心。

3.3置于PCR仪上进行酶切，并设置酶切反应条件：37℃，10min；10℃，hold；无热盖。

3.4待程序反应结束，瞬时离心，分别加入8μL消化终止液(0.5M的EDTA)，涡旋混匀后，短暂离心，立刻进行下一步纯化。

4环化产物纯化

4.1提前30min取出纯化磁珠平衡至室温，使用前充分涡旋混匀。

4.2吸取143μL纯化磁珠至新的1.5ml离心管中，将消化产物全部转移至对应编号含纯化磁珠的1.5ml离心管中，用移液器轻轻吹打至少10次至完全混匀，室温孵育10min。

4.3将离心管放置磁力架上，待溶液澄清后，弃上清；

4.4保持在离心管置于磁力架上，加入200μL新鲜配制的80％乙醇，30s后，弃乙醇；重复此步骤1次，共2次；

4.5离心管短暂离心，磁力架上弃残余液体，开盖干燥磁珠5-10min至磁珠不反光；

4.6向磁珠中加入22μL TE缓冲液，涡旋混匀，室温孵育10min；

4.7将离心管放置磁力架上，待澄清后，转移上清至新的标记清楚的1.5ml离心管中。

5环化产物质检

5.1使用QubitssDNA荧光定量试剂盒，按照定量试剂盒的操作说明对环化纯化后产物进行定量，根据产出量/投入量的比值计算环化效率。结果如图2显示TERT启动子区不同长度文库的环化效率明显低于内参基因文库，但文库片段在200-400bp之间时环化效率均大于10％。

6扩增子深度生信分析

上一步骤检测合格的文库环化后用测序平台进行高通量测序：

先用Q30对碱基的测序质量进行评估，再统计各个扩增子深度文库，具体如表9所示:

表9不同长度扩增子的测序深度对比

扩增子长度	TERT启动子区覆盖深度	TERT C250T突变丰度	GAPDH基因深度
				100bp	1102	0.3％	10300
200bp	11141	4.3％	19759
				300bp	11561	5.1％	19128
400bp	11036	5.5％	18077
				500bp	6306	2.9％	16606
600bp	5255	3.0％	15555

相对于GAPDH基因的不同扩增子，TERT启动子区扩增子覆盖深度具有明显的区别，其中长度为100bp、500bp、600bp测序覆盖深度及突变丰度明显低于其他区域。

结合图2分析，TERT启动区扩增子覆盖深度和环化效率具有正相关性。

实施例2：添加单链稳定添加剂的环化方法

本实施例的实验步骤和实施例1完全相同，不同之处在于选用300bp长度的文库且在单链环化反应体系中加入甜菜碱或甲酰胺，含甜菜碱的单链环化反应液配制如下表10，含甲酰胺的单链环化反应液配制只需将表10中的甜菜碱替换为甲酰胺即可，甲酰胺终质量浓度为1％-4％：

表10单链环化反应液的配置

注：表10中，**连接引物序列为5’-GGAACCGAGTGTCTTGCTGTACCG-3’

如图3所示，相对于没有添加甜菜碱的对照组，添加甜菜碱对环化效率具有明显提升，特别是终浓度为0.4-0.8M时环化效率最佳，同时TERT启动子区文库环化效率与内参基因文库效果相当。相对于未添加单链稳定剂对照组，添加甲酰胺组环化效率无明显变化(图4)。

加入甜菜碱后TERT扩增子深度明显增加，具体如表11所示:

表11加入甜菜碱扩增子的测序深度对比

甜菜碱添加剂	TERT启动子区覆盖深度	TERT C250T突变丰度	GAPDH基因深度
				0	11561	5.1％	19128
0.4M	16578	5.3％	18790
				0.8M	16004	5.2％	17998
1.2M	11289	4.7％	18320

综上所述，针对高GC含量的文库构建时，建议文库片段的长度在200-400bp，同时环化反应体系中加入0.4-0.8M的甜菜碱可有效提高环化效率及扩增子测序深度，环化效率最高达21％。

以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。

Claims (12)

1.一种用于高GC含量文库环化的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括单链环化试剂，所述单链环化试剂包括测序平台连接引物、连接酶和单链稳定添加剂。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述测序平台连接引物为适配于华大BGISEQ测序平台的连接引物；优选的，所述连接引物序列如SEQ ID NO：25所示。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述连接酶选自T4连接酶、大肠杆菌DNA连接酶或热稳定DNA连接酶，和/或，所述单链稳定添加剂选自甜菜碱、甲酰胺、DMSO或甘油中的任一种或多种。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述单链环化试剂还包括环化缓冲液。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括酶切消化试剂；优选的，所述酶切消化试剂包括核酸酶和酶切缓冲液；更优选的，所述核酸酶选自核酸外切酶I或核酸外切酶VII。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述酶切消化试剂还包括消化终止试剂；优选的，所述消化终止试剂为金属螯合剂；更优选的，所述消化终止试剂为EDTA。

7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括纯化试剂；优选的，所述纯化试剂包括磁珠、乙醇、TE缓冲液。

8.权利要求1-7任一所述的用于高GC含量文库环化的试剂盒在制备单链环化DNA产品或基因测序中的用途。

9.一种高GC含量文库环化的方法，其特征在于，所述方法包括使用权利要求1-7任一所述的用于高GC含量文库环化的试剂盒进行环化。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述高GC含量文库环化的方法包括以下步骤：

1)将两端带有测序接头的单链DNA文库与单链环化试剂混合后反应得到带有连接引物的DNA环化中间产物；

2)将DNA环化中间产物与酶切消化试剂混合进行酶切消化；

3)酶切消化结束后，与消化终止试剂混合以终止酶切消化，得到环化产物。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，还包括以下特征中的一项或多项：

I)步骤1)中两端带有测序接头的单链DNA文库通过将两端带有测序接头的双链DNA文库退火变性获得；

II)步骤1)中，以环化体系为基准，单链DNA文库量为0.5pmol～1pmol；

III)步骤1)中，单链DNA文库两端带有华大测序接头；优选的，单链DNA文库两端带有适配华大BGISEQ测序平台的接头；

IV)步骤1)中，以环化体系的总体积为基准，所述测序平台连接引物的终浓度为0.2～0.8μM；

V)步骤1)中，以环化体系的总体积为基准，所述连接酶的终浓度为0.2～1U/μL；

VI)步骤1)中，所述单链稳定添加剂为甜菜碱，以环化体系的总体积为基准，甜菜碱的终浓度为0.4～1.2mol/L；

VII)步骤1)中，环化的条件为35～38℃，12～18min；

VIII)步骤2)中，以酶切消化体系的总体积为基准，核酸酶的终浓度为0.5～2U/μL；

IX)步骤3)中，以酶切消化体系的总体积为基准，消化终止试剂的终浓度为0.05～0.1mol/L；

X)步骤3)中，酶切消化的条件为35～38℃，8～12min；

XI)所述方法还包括用纯化试剂纯化步骤3)得到的环化产物。

12.一种基因测序方法，其特征在于，包括使用权利要求1-7任一所述的用于高GC含量文库环化的试剂盒进行环化后再利用测序平台进行测序。

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