CN115747235B - 一种新型糖苷水解酶DogH基因及其提高生物抗逆性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种使用dogH基因提高生物抗逆性的方法，该方法包括：将dogH基因转入宿主生物中，并且使得宿主生物中表达所述dogH基因；所述宿主生物为植物或微生物；所述dogH基因编码如下蛋白(a)或(b)：(a)由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白；(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加n个氨基酸且具有糖苷水解酶活性的由(a)衍生的蛋白，其中，n为1～4之间的任意一个整数。通过上述技术方案，本发明提高了植物或微生物的生物抗逆性，特别是提高了植物或微生物的渗透胁迫抗性。

Description

一种新型糖苷水解酶DogH基因及其提高生物抗逆性的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种使用dogH基因提高生物抗逆性的方法。

背景技术

植物或微生物受到胁迫后，一些被伤害致死，另一些的生理活动虽然受到不同程度的影响，但它们可以存活下来。如果长期生活在这种胁迫环境中，通过自然选择，有利性状被保留下来，并不断加强，不利性状不断被淘汰。这样，在植物或微生物长期的进化和适应过程中，不同环境条件下生长的植物或微生物就会形成对某些环境因子的适应能力，即能采取不同的方式去抵抗各种胁迫因子。植物或微生物对各种胁迫(或称逆境)因子的抗御能力，称为抗性(stress resistance)，也称抗逆性。

极端微生物是一类可以在极端环境下存活的微生物。已知的极端微生物主要包括耐辐射菌、嗜热菌、嗜盐菌、嗜酸菌、嗜碱菌、嗜冷菌和嗜压菌等。从特殊环境中筛选极端抗性的菌株，挖掘相关抗性基因资源，可为培育优良性状的转基因作物新品种及品系等实际应用，提供丰富的抗逆功能基因来源。

发明内容

本发明的目的是提高植物或微生物的生物抗逆性，特别是提高植物或微生物的渗透胁迫抗性。

为了实现上述目的，本发明提供了一种使用dogH基因提高生物抗逆性的方法，该方法包括：将dogH基因转入宿主生物中，并且使得宿主生物中表达所述dogH基因；所述宿主生物为植物或微生物；所述dogH基因编码如下蛋白(a)或(b)：(a)由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白；(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加n个氨基酸且具有糖苷水解酶活性的由(a)衍生的蛋白，其中，n为1～4之间的任意一个整数。

通过上述技术方案，本发明提高了植物或微生物的生物抗逆性，特别是提高了植物或微生物的渗透胁迫抗性。

本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为重组工程菌株DH5α-dogH构建示意图。

图2为重组工程菌株BL21-dogH构建示意图。

图3为DH5α-dogH重组工程菌株耐渗透胁迫抗性实验结果图。

图4为BL21-dogH重组工程菌株耐渗透胁迫抗性实验结果图。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

本发明提供了一种使用dogH基因提高生物抗逆性的方法，该方法包括：将dogH基因转入宿主生物中，并且使得宿主生物中表达所述dogH基因；所述宿主生物为植物或微生物；所述dogH基因编码如下蛋白(a)或(b)：(a)由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白；(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加n个氨基酸且具有糖苷水解酶活性的由(a)衍生的蛋白，其中，n为1～4之间的任意一个整数。

其中，优选地，所述dogH基因是核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示的DNA分子。

其中，dogH基因是从土壤宏基因组样本中克隆得到的基因。dogH基因所编码的蛋白(SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列)含有糖苷水解酶GHL10家族结构域(Glycosylhydrolase-like 10)，与已报到Clostridium difficile中糖苷水解酶Cwp19相似性最高，仅为39％，由此命名为dogH。dogH基因的DNA(SEQ ID NO.1所示的DNA分子)与耐辐射异常球菌(Deinococcusradiodurans)的基因组片段相同。本发明的发明人意外地发现，该基因转入耐辐射异常球菌以外的其它生物(宿主生物)后，能够为宿主生物带来明显增强的渗透胁迫抗性。

其中，优选地，该方法还包括将所述dogH基因插入载体中得到重组载体，并且将所述重组载体转入所述宿主生物中。

其中，优选地，所述重组载体是核苷酸序列如SEQ ID NO.3或4所示的DNA分子。其中，SEQ ID NO.3是是含有T7启动子的完整dogH基因重组质粒pET28a-dogH，其是将dogH基因片段连接于线性化的pET28a表达载体上，该质粒含有高效表达目的基因的T7启动子。

其中，优选地，所述宿主生物为大肠杆菌。

其中，优选地，所述宿主生物为大肠杆菌DH5α菌株。

其中，优选地，所述宿主生物为大肠杆菌BL21菌株。

其中，优选地，所述宿主生物为真菌。

其中，优选地，所述宿主生物为酿酒酵母、假丝酵母或毕赤酵母。

其中，优选地，所述宿主生物为植物，优选为拟南芥、玉米、水稻、小麦、烟草、大豆或棉花。

以下通过实施例进一步详细说明本发明。

以下实施例中所举的质粒、菌株只用于对本发明作进一步详细说明，并不对本发明的实质内容加以限制。凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(NewYork：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

重组工程菌株DH5α-dogH的构建。

如图1所示，从中国新疆戈壁沙漠上层土壤宏基因组样本中克隆出dogH基因，其大小为1740bp。随后进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收，纯化获得目的片段。同时用BamHI和SpeI内切酶将载体pRADZ3进行双酶切，随后进行切胶回收，纯化获得线性化载体片段。将纯化后dogH基因片段连接于线性化的pRADZ3穿梭质粒上，该质粒含有能在大肠杆菌和异常球菌中都起作用的groEL启动子，构建含有groEL启动子的完整dogH基因重组质粒pRADZ3-dogH。将导入dogH基因的重组质粒pRADZ3-dogH转入受体E.coli DH5α-中，获得重组工程菌株，命名为DH5α--dogH，含pRADZ3空质粒的菌株命名为DH5α--0

具体地，使用表1的含有同源臂的引物(SEQ ID NO.4和5)从沙漠上层土壤宏基因组样本中克隆dogH基因序列。

表1

PCR扩增反应条件包括：98℃10min，[95℃30sec，60℃30sec，72℃2min]35个循环，72℃10min。

PCR扩增反应结束后，进行1％琼脂糖凝胶电泳，约为30min，在紫外照胶仪下观察到条带分离清晰时，切胶并参照美基生物HiPure Gel Pure Micro Kit说明书进行产物纯化操作。

分别用BamHI和SpeI内切酶将载体pRADZ3进行双酶切。将体系置于37℃PCR仪中，酶切反应2h。酶切产物进行纯化回收，纯化产物于-20℃保存备用。

将酶切、纯化后的线性化载体与带有同源臂的目的基因进行同源重组，参照Vazyme公司CloneUItra One Step Cloning Kit(C115)试剂盒说明书，置于55℃金属浴中，进行30min连接反应。

在超净工作台中，利用热激法直接转化克隆菌株E.coli DH5α感受态细胞，倒置于37℃培养箱中过夜培养。

从转化后的平皿中挑取单菌落，进行菌落PCR、酶切验证，并测序证实菌落中转入了pRADZ3-dogH。将该菌株命名为DH5α-dogH。含有pRADZ3空质粒菌株命名为DH5α-0。

实施例2

重组工程菌株BL21-dogH的构建。

如图2所示，从中国新疆戈壁沙漠上层土壤宏基因组样本中克隆出dogH基因，其大小为1740bp。随后进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收，获得目的片段。同时用HindⅢ和BamHI内切酶将载体pET28a进行双酶切，切胶回收，纯化获得线性化载体片段。将纯化后dogH基因片段连接于线性化的pET28a表达载体上，该质粒含有高效表达目的基因的T7启动子，构建含有T7启动子的完整dogH基因重组质粒pET28a-dogH。将导入dogH基因的重组质粒pET28a-dogH转入受体E.coli BL21(DE3)表达菌株中，获得重组工程菌株，命名为BL21-dogH，含pET28a空质粒的菌株命名为BL21-0。

具体地，使用表2的含有同源臂的引物(SEQ ID NO.6和7)通过从沙漠上层土壤宏基因组样本中克隆出dogH基因序列。

表2

PCR扩增的反应条件包括：98℃10min，[95℃30sec，60℃30sec，72℃2min]35个循环，72℃10min。

PCR扩增反应结束后，进行1％琼脂糖凝胶电泳，约为30min，在紫外照胶仪下观察到条带分离清晰时，切胶并参照美基生物HiPure Gel Pure Micro Kit说明书进行产物纯化操作。

分别用HindⅢ和BamHI内切酶将载体pET28a进行双酶切。将体系置于37℃PCR仪中，酶切反应2h。酶切产物进行纯化回收，纯化产物于-20℃保存备用。

将酶切、纯化后的线性化载体与带有同源臂的目的基因进行同源重组，参照Vazyme公司CloneUItra One Step Cloning Kit(C115)试剂盒说明书，置于55℃金属浴中，进行30min连接反应。

在超净工作台中，利用热激法直接转化克隆菌株E.coli DH5α感受态细胞，倒置于37℃培养箱中过夜培养。

从转化后的平皿中挑取单菌落，进行菌落PCR、酶切验证，并送华大基因生物公司测序。测序成功后，提取重组质粒重新转化E.coli BL21(DE3)表达菌株。将该菌株命名为BL21-dogH。含有pET28a空质粒菌株命名为BL21-0。

实施例3

含dogH基因重组工程菌株胁迫抗性实验。

将成功构建的含dogH基因的重组质粒pRADZ3-dogH，转入受体大肠杆菌DH5α-菌株中，获得重组工程菌株DH5α--dogH。实验证实，菌株在1.3M山梨醇胁迫处理5d后，含有dogH基因的重组菌株生长状况良好，DH5α--dogH重组菌株菌落数高于仅含空质粒的DH5α--0菌株约2个数量级。此实验表明该工程菌株具有耐受山梨醇胁迫冲击的能力，进一步证实dogH基因，显著增强了细胞对渗透胁迫的抗性。

具体地，重组工程菌株为实施例1得到的含有dogH基因的DH5α-dogH菌株；对照菌株为实施例1所述含空质粒的DH5α-0菌株。

将对照菌株和重组工程菌株在LB固体培养基平板上划线活化；挑取单菌落分别接种于5mL新鲜的LB液体培养基(重组菌株添加50μg/mL Amp氨苄青霉素抗生素)中37℃过夜培养，至指数中后期；按1％重新转接到20mL新鲜的LB液体培养基中(重组菌株添加50μg/mLAmp抗生素)，培养至菌液OD₆₀₀＝0.6～0.8左右；取出1mL菌液，室温下6,000rpm离心5min收集菌体，然后用相同体积的已灭菌磷酸缓冲液(pH7.0)将菌体洗涤两次，震荡均匀；高浓度山梨糖醇胁迫实验：将重悬后的菌体进行倍比稀释(10^-1-10^-5)，每个稀释度各取8μL点在含有1.3M山梨醇浓度的LB固体培养基表面，以不添加山梨醇的LB固体培养基点样板作为空白对照，经37℃培养约5d左右，观察菌落形成情况。且分别进行三次独立重复实验。

如图3所示，在长时间(5d)的高浓度山梨醇胁迫处理条件下，含有dogH基因的重组工程菌株DH5α-dogH生长状况良好，菌落数显著多于只含空质粒的DH5α-0菌株。且耐受渗透胁迫抗性较对照菌株提高接近2个数量级，约100倍。由此证实，dogH基因显著增强了原核宿主细胞抵抗渗透胁迫的能力。

实施例4

含dogH基因重组工程菌株胁迫抗性实验。

将成功构建的含dogH基因的重组质粒pET28a-dogH，转入受体大肠杆菌BL21(DE3)菌株中，获得重组工程菌株BL21-dogH。实验证实，菌株在1.5M山梨醇胁迫处理5d后，BL21-dogH重组菌株菌落数高于仅含空质粒的BL21-0菌株2个数量级。此实验表明该工程菌株具有耐受山梨醇胁迫冲击的能力，进一步证实dogH基因，显著增强了细胞对渗透胁迫的抗性。

重组工程菌株为实施例2得到的含有dogH基因的BL21-dogH菌株；对照菌株为实施例2所述含空质粒的BL21-0菌株。

将对照菌株和重组工程菌株在LB固体培养基平板上划线活化；挑取单菌落分别接种于5mL新鲜的LB液体培养基(重组菌株添加50μg/mLKm抗生素)中37℃过夜培养，至指数中后期；按1％重新转接到20mL新鲜的LB液体培养基中(重组菌株添加50μg/mLKm抗生素)，37℃培养1h后，加入终浓度为0.1mMIPTG诱导表达，继续培养至菌液OD₆₀₀＝0.6～0.8左右；取出1mL菌液，室温下6,000rpm离心5min收集菌体，然后用相同体积的已灭菌磷酸缓冲液(pH7.0)将菌体洗涤两次，震荡均匀；高浓度山梨糖醇胁迫实验：将重悬后的菌体进行倍比稀释(10^-1-10^-5)，每个稀释度各取8μL点在含有不同山梨醇浓度(1.0M、1.3M、1.5M)的LB固体培养基表面，以不添加山梨醇的LB固体培养基点样板作为空白对照，经37℃培养约5d左右，观察菌落形成情况。且分别进行三次独立重复实验。

如图4所示，在长时间(5d)的不同高浓度山梨醇胁迫处理条件下，含有dogH基因的重组工程菌株BL21-dogH生长状况良好。在1.0M山梨醇胁迫条件下，重组工程菌株BL21-dogH菌落数与空质粒菌株BL21-0菌落数相差一个数量级，约10倍；但随着山梨醇浓度不断增加，两者之间菌落数的生长状况差异逐渐增大，在1.5M山梨醇胁迫条件下，含空质粒的BL21-0菌株几乎全部无生长迹象，但含dogH基因的重组工程菌株BL21-dogH菌落数显著多于只含空质粒。且耐受渗透胁迫抗性较对照菌株提高接近2个数量级，约100倍。

由此可以证实：dogH基因的表达显著增强了原核生物抵抗渗透胁迫的能力。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (3)

1.一种使用dogH基因提高生物抗逆性的方法，其特征在于，该方法包括：

将dogH基因转入宿主生物中，并且使得宿主生物中表达所述dogH基因；所述宿主生物为微生物；所述dogH基因是核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的DNA分子；

所述生物抗逆性为渗透抗性；

所述微生物为大肠杆菌。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，该方法还包括将所述dogH基因插入载体中得到重组载体，并且将所述重组载体转入所述宿主生物中。

3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述重组载体是核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的DNA分子。