CN111411115B - 基因和改良根瘤菌的方法 - Google Patents

基因和改良根瘤菌的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111411115B
CN111411115B CN202010140743.4A CN202010140743A CN111411115B CN 111411115 B CN111411115 B CN 111411115B CN 202010140743 A CN202010140743 A CN 202010140743A CN 111411115 B CN111411115 B CN 111411115B
Authority
CN
China
Prior art keywords
ala
leu
pro
arg
asp
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202010140743.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111411115A (zh
Inventor
史德海林.奥斯丁.巴特瑟
谢致平
相其旺
蔡杰
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sun Yat Sen University
Original Assignee
Sun Yat Sen University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sun Yat Sen University filed Critical Sun Yat Sen University
Priority to CN202010140743.4A priority Critical patent/CN111411115B/zh
Publication of CN111411115A publication Critical patent/CN111411115A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111411115B publication Critical patent/CN111411115B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Abstract

本公开涉及一种基因，该基因为NopD基因，且编码如下(a)或(b)的蛋白质：(a)由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质，(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或至多n个氨基酸且具有蛋白质(a)的活性的由(a)衍生的蛋白质。本公开还提供了该基因编码的蛋白质、插入有该基因的重组载体、一种改良根瘤菌的方法和一种增加农作物产量的方法。NopD蛋白直接作为真核细胞内SUMO酶而抑制共生固氮。当NopD的酶活性位点突变后，突变体NopDC972‑A丧失酶活性，改造菌株在结瘤实验中表现更高的共生固氮效率。

Description

基因和改良根瘤菌的方法
技术领域
本公开涉及农业生物技术领域，具体地，涉及一种基因、该基因编码的蛋白质、插入有该基因的重组载体、一种改良根瘤菌的方法和一种增加农作物产量的方法。
背景技术
大量研究监测显示，土壤中有限的氮含量是限制农作物生长发育的重要因素。虽然氮以气体形式广泛存在，但植物在土壤中可直接吸收利用的氮则是以铵盐或硝酸盐形式存在的。人们只能通过大量使用化学固氮法生产化肥，以保证农作物的产量。然而这样的生产方法需要耗费大量的矿物燃料，并且增加温室气体二氧化碳的排放，而且近年来缘于化肥的过度使用也带来日益显著的环境问题，这显然不利于农业的可持续发展。
相比之下，生物固氮具有化学固氮无可比拟的优势。其不依赖于矿物能源，且生物固氮本身就是大自然不断进化的结果，是整个生态系统的一部分。一般情况下根瘤菌与宿主建立良好的共生关系后，就有强烈的固氮作用，为农作物提供丰富而廉价的氮素营养，对提高农作物产量、培肥土壤有着重大的作用。研究表明，在环境条件相同的条件下，根瘤菌并不能与豆科植物的每个品种都具有高效的共生固氮效果，因此进行菌剂菌种选择时必须将菌种与宿主作物共生后能否高效固氮放在第一位。
对于已经选择了的根瘤菌，如何进一步提高其固氮能力是亟待解决的问题。
发明内容
本公开的目的是提高根瘤菌的根瘤形成能力和固氮能力。
为了实现上述目的，本公开了提供一种基因，该基因编码如下(a)或(b)的蛋白质：
(a)由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质，
(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或至多n个氨基酸且具有蛋白质(a)的活性的由(a)衍生的蛋白质，其中n为2至100之间的任意整数。
可选地，其中，该基因编码(a)的蛋白质且该基因的碱基序列如SEQ ID NO.2所示，或者该基因编码(b)的蛋白质且该基因的碱基序列如SEQ ID NO.3所示。
另一方面，本公开还提供了一种蛋白质，该蛋白质为如下(a)或(b)的蛋白质：
(a)由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质，
(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或至多n个氨基酸且具有蛋白质(a)的活性的由(a)衍生的蛋白质，n为2至100之间的任意整数。
可选地，(b)的蛋白质如SEQ ID NO.4所示。
另一方面，本公开还提供了一种重组载体，该重组载体插入有如上所述的基因。
可选地，其中，该重组载体为重组表达载体或重组克隆载体，所述重组表达载体在转化到根瘤菌中时能够使得所插入的如上所述的基因在所述根瘤菌中过表达。
另一方面，本公开还提供了一种改良根瘤菌的方法，该方法包括：敲低或敲除待改良的根瘤菌中的如上所述的基因的表达，或者，在待改良的根瘤菌中对如上所述的基因进行点突变以使得点突变后的基因所表达得到的蛋白丧失SUMO酶的催化活性。
可选地，其中，该方法包括：在待改良的根瘤菌中对如上所述的基因进行点突变以使得点突变后的基因所表达得到的蛋白由于C端蛋白酶结构域的氨基酸发生突变而丧失SUMO酶的催化活性。
可选地，其中，该方法包括：在待改良的根瘤菌中对如上所述的基因进行点突变以使得点突变后的基因所表达得到的蛋白质为如SEQ ID NO.5所示的蛋白质。
另一方面，本公开还提供了一种增加农作物的产量的方法，其中，该方法包括如下步骤：
S1、按照如上所述的方法对根瘤菌进行改良，得到改良后的根瘤菌；
S2、将S1得到的改良后的根瘤菌施用至农作物的根部，以形成根瘤并进行生物固氮；
其中，所述植物为毛豆、花生、青刀豆和大豆中的至少一种。
通过上述技术方案，本公开能够将单位植物上的根瘤结节的数目和重量提高约40％，并且能够大幅提高植物的生物量。
本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
附图是用来提供对本公开的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本公开，但并不构成对本公开的限制。在附图中：
图1是大肠杆菌中纯化的NopD、NopDC972-A、NopD-C894的电泳图。
图2是NopD能特异性切割的植物来源SUMO的抗GST的WB图。
图3是NopD具有针对特异的植物来源SUMO的异肽酶活性的抗Myc的WB图。
图4是丧失NopD的SUMO酶活性的突变菌株能大大提高与毛豆(T.vogelii)的共生固氮的根瘤数量图。
图5是丧失NopD的SUMO酶活性的突变菌株能大大提高与毛豆(T.vogelii)的共生固氮的根瘤重量图。
具体实施方式
以下结合附图对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。
本公开了提供一种基因，该基因编码如下(a)或(b)的蛋白质：
(a)由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质，
(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或至多n个氨基酸且具有蛋白质(a)的活性的由(a)衍生的蛋白质，其中n为2至100之间的任意整数。
其中，SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列是NopD蛋白的氨基酸序列，NopD蛋白是本公开的发明人在根瘤菌(Bradyrhizobium sp.)中发现的一种新的蛋白质。该蛋白质共有1016个氨基酸残基，分子量为112kDa，其中，第1-390位的氨基酸残基为N端结构域(N-terminaldomain)，该结构域的功能与NopD蛋白通过T3SS系统从根瘤菌中分泌并转移到植物细胞内相关，第391-720位的氨基酸残基为具有7个重复的串联重复结构域(tandem repeat(TR)domain with 7repeats)，该结构域的功能与NopD蛋白识别植物细胞内的特定SUMO化蛋白质有关，第721-1016位的氨基酸残基为C端蛋白酶结构域(C-terminal protease domain)，该结构域的功能与NopD蛋白定位于植物的细胞核内并作为蛋白酶对SUMO化蛋白质的酶切作用相关。本公开的发明人还发现，如果在根瘤菌中将NopD敲除或者对NopD蛋白进行点突变使NopD蛋白丧失活性，即可增强根瘤菌形成根瘤结节的能力和生物固氮促植物生长的能力。
可选地，其中，该基因编码(a)的蛋白质且该基因的碱基序列如SEQ ID NO.2所示，或者该基因编码(b)的蛋白质且该基因的碱基序列如SEQ ID NO.3所示。
其中，碱基序列如SEQ ID NO.2所示的核酸序列是野生型的NopD蛋白的基因编码序列，碱基序列如SEQ ID NO.3所示的核酸序列是野生型的NopD蛋白进行了点突变但没有改变NopD蛋白活性的基因编码序列(即NopD-C894的核苷酸序列)，具体为将野生型的NopD蛋白第972位氨基酸残基C定点突变为氨基酸残基A。
另一方面，本公开还提供了一种蛋白质，该蛋白质为如下(a)或(b)的蛋白质：
(a)由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质，
(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或至多n个氨基酸且具有蛋白质(a)的活性的由(a)衍生的蛋白质，n为2至100之间的任意整数。
可选地，(b)的蛋白质如SEQ ID NO.4所示(即NopD-C894的氨基酸序列)。
另一方面，本公开还提供了一种重组载体，该重组载体插入有如上所述的基因。
可选地，其中，该重组载体为重组表达载体或重组克隆载体，所述重组表达载体在转化到根瘤菌中时能够使得所插入的如上所述的基因在所述根瘤菌中过表达。
其中，所述重组载体的骨架和多克隆位点可以为分子生物学领域常规的选择。
另一方面，本公开还提供了一种改良根瘤菌的方法，该方法包括：敲低或敲除待改良的根瘤菌中的如上所述的基因的表达，或者，在待改良的根瘤菌中对如上所述的基因进行点突变以使得点突变后的基因所表达得到的蛋白丧失SUMO酶的催化活性。
可选地，其中，该方法包括：在待改良的根瘤菌中对如上所述的基因进行点突变以使得点突变后的基因所表达得到的蛋白由于C端蛋白酶结构域的氨基酸发生突变而丧失SUMO酶的催化活性。
可选地，其中，该方法包括：在待改良的根瘤菌中对如上所述的基因进行点突变以使得点突变后的基因所表达得到的蛋白质为如SEQ ID NO.5所示的蛋白质(NopDC972-A的氨基酸序列)。
具体地，在待改良的根瘤菌中对如上所述的基因进行点突变可以得到SEQ IDNO.6所示的核酸。进而，可以使得SEQ ID NO.6所示的核酸在根瘤菌中表达SEQ ID NO.5所示的蛋白质。进一步地，可以使得SEQ ID NO.6所示的核酸在根瘤菌中表达SEQ ID NO.5所示的蛋白质而使得SEQ IDNO.2所示的核酸不在根瘤菌中表达SEQ ID NO.1所示的蛋白质。
另一方面，本公开还提供了一种增加农作物的产量的方法，其中，该方法包括如下步骤：
S1、按照如上所述的方法对根瘤菌进行改良，得到改良后的根瘤菌；
S2、将S1得到的改良后的根瘤菌施用至农作物的根部，以形成根瘤并进行生物固氮；
其中，所述植物为毛豆、花生、青刀豆和大豆中的至少一种。
以下通过实施例进一步详细说明本发明。
实施例1
以XS1150基因组为模板进行PCR扩增获得DNA片段以及定点突变构建pET28b-nopD,pET28b-nopD-C894,pET28b-nopDC972-A:
设计引物NopD-F和NopD-R，并在引物两端引入NdeI和EcoRI酶切位点，以方便其插入pET28b载体。引物序列如下：
NopD-F：5’-GGAATTCCATATGGTGGACCCGTACAAT-3’(SEQ ID NO.6)；
NopD-R：5’-ATAGAATCCTCAGTTGAAGCCGAC-3’(SEQ ID NO.7)。
设计引物NopDC972-A-F和NopDC972-A-R，以便对NopD进行第972位氨基酸的突变。引物序列如下：
NopDC972-A-F：5’-GGAATTCCATATGGTGGACCCGTACAAT-3’(SEQ ID NO.8)；
NopDC972-A-R：5’-ATAGAATCCTCAGTTGAAGCCGAC-3’(SEQ ID NO.9)。
设计引物NopD-C894-F，并在引物端引入NdeI酶切位点，以方便其插入pET28b载体。引物序列如下：
NopD-C894-F：5’-G GGAATTCCATATGGCCGGTAAACCCGC-3’(SEQ ID NO.10)；
以XS1150菌株基因组为模板，利用上述引物对进行PCR扩增反应，反应体系如表1所示：
表1扩增外源片段的PCR反应体系
溶液 体积(μl)
模板(50ng) 1
dNTP Mix(2.5mM) 4
引物F(10μM) 1
引物R(10μM) 1
PrimerStar DNA Polymerase(2.5U/μl) 1
5×PrimerStar reaction buffer 10
dd H<sub>2</sub>O 32
总体积 50
PCR反应条件为：94℃5min，95℃30s，55℃30s，72℃3min，32个循环，72℃10min。
PCR产物用NdeI和EcoRI于37℃双酶切3h，与同样用NdeI和EcoRI双酶切的pET28b表达载体连接。取10μl连接产物转化大肠杆菌DH5α并将转化后的菌悬液涂布于含有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB固体培养基表面，37℃培养12-16h后随机挑取6株单菌落接种到3ml含有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB液体培养基中培养过夜。将菌液离心后提取质粒做双酶切检测，并交测序验证。
取5μl酶切和测序检测都正确的重组质粒转化表达型大肠杆菌BL21(DE3)，同样按照上述方法筛选出含有重组质粒的宿主菌BL21(DE3：nopD；DE3：nopDC972-A；DE3：nopD-C894)。
实施例2
重组蛋白的诱导表达及纯化
将重组后的工程菌BL21(DE3：nopD；DE3：nopDC972-A；DE3：nopD-C894)划线到含有氨苄青霉素(50μg/ml)的LB固体培养基中，37℃培养12-16h。随机挑出一个单菌落接种到3ml含有氨苄青霉素(50μg/ml)的LB液体培养基中，37℃、220rpm震荡培养12h。培养好的菌液按1:100比例接种到300ml含有氨苄青霉素(50μg/ml)的LB液体培养基中，37℃震荡培养大约3h至OD600＝0.6时加入IPTG至终浓度为1mM，继续37℃、220rpm条件下震荡培养20h。
诱导后的菌液于5500g条件下离心5min后弃去上清液，将收集的菌体重悬于预冷的10ml的裂解缓冲液(50mM磷酸二氢钾，1M氯化钠，10mM咪唑)中。用超生波破碎仪(MISONIX)破碎细胞后，15000g离心20min，收集的上清液即为含重组蛋白的粗制液。此粗提物再用Ni-NTA树脂凝胶柱(Qiagen)纯化，具体步骤可以参见产品说明书。
获得纯化后的重组蛋白用SDS-PAGE(12％)电泳分离和Western blot检测后发现，此重组蛋白可以在大肠杆菌体内大量表达并能够用亲和层析进行纯化(纯化结果见图1，可见纯化的NopD、NopDC972-A、NopD-C894)。
实施例3
体外SUMO酶功能检测实验证明NopD具有针对特异的植物来源SUMO的酶活性
表达纯化不同来源的各种SUMO融合体(GST-AtSUMO1-3HA,GST-AtSUMO2-3HA,GST-AtSUMO3-3HA,GST-AtSUMO5-3HA,GST-GmSUMO1-3HA,GST-PvSUMO1-3HA,GST-smt3-3HA,GST-HuSUMO1-3HA,GST-HuSUMO2-3HA,GST-HuSUMO4-3HA)作为SUMO酶检测底物。将各种待检测的SUMO酶(NopD，NopDC972-A，NopD-C894)分别与底物加入PBS缓冲液(135mM NaCl,2.7mM KCl,1.5mM KH2PO4,and 8mM K2HPO4,pH 7.2)中，于37℃中反应30min。
将反应后的产物进行SDS-PAGE电泳分离，而后以GST抗体为一抗进行WesternBlot。结果发现NopD以及NopD-C894能特异的切割植物来源的SUMO(GST-AtSUMO1-3HA,GST-AtSUMO2-3HA,GST-GmSUMO1-3HA,GST-PvSUMO1-3HA),而不能切割酵母以及人源SUMO。而NopDC972-A则丧失了SUMO酶的活性(酶切结果见图2)。
实施例4
体外SUMO异肽酶功能检测实验证明NopD具有针对特异的植物来源SUMO的异肽酶活性
表达纯化His-AtSE1,His-AtSE2,His-AtUbc9以及不同来源的各种SUMO成熟体(GST-AtSUMO1-GG,GST-AtSUMO2-GG,GST-AtSUMO3-GG,GST-AtSUMO5-GG,GST-GmSUMO1-GG,GST-PvSUMO1-GG,GST-smt3-GG,GST-HuSUMO1-GG,GST-HuSUMO2-GG,GST-HuSUMO4-GG)作为SUMO化反应元件,His-RanGAP-Myc作为SUMO化反应底物。将各种SUMO化反应元件(8μgRanGAP-Myc-6×His,8μg GST-SUMO(GG),1μg AtSAE1-His6,1μg AtSAE2-His6,2μgAtUbc9-His6)以及底物分别依次加入SUMO化缓冲液(50mM Tris-HCl buffer(pH 7.8),100mM NaCl,15％glycerol,5mM ATP,and 10mM MgCl2 a)于22℃反应6到8小时。
将各种待检测的SUMO酶(NopD，NopDC972-A，NopD-C894)分别加入上述反应后的产物，于37℃中反应30min。
将反应后的产物进行SDS-PAGE电泳分离，而后以Myc抗体为一抗进行WesternBlot。结果发现NopD以及NopD-C894能特异的切割植物来源的SUMO修饰的RanGAP(GST-AtSUMO1-GG,GST-AtSUMO2-GG,GST-GmSUMO1-GG,GST-PvSUMO1-GG),而不能切割酵母以及人源SUMO修饰的RanGAP。而NopDC972-A则丧失了SUMO异肽酶的活性(酶切结果见图3)。
实施例5
丧失NopD的SUMO酶活性的突变菌株能大大提高与毛豆(T.vogelii)的共生固氮
使用野生型根瘤菌XS1150，XS1150ΩnopD(XS1150的nopD突变体，也就是ΔnopD)，XS1150ΩnopD+nopD(XS1150ΩnopD的NopD的回补菌株，也就是ΔnopD+nopD)XS1150ΩnopD+nopDC972-A(XS1150ΩnopD的NopDC972-A的回补菌株，也就是ΔnopD+NopDC972-A)和与宿主毛豆(T.vogelii)进行结瘤实验。具体操作如下：
将毛豆(T.vogelii)的种子进行表面消毒后，使用已灭菌的双蒸水洗去表面残留的硫酸，并将种子在双蒸水中浸泡过夜。随后，待种子转移入琼脂糖平皿里并在暗处萌发后，便将它们进一步转移入无色透明的塑料罐在中。罐子里放置有以3:1的体积比混合的蛭石和陶粒，其下方还有一个用棉绳连在一起的另一个同样的罐子，里面放置不含氮源的B&D营养液(1mM氯化钙，0.5mM磷酸二氢钾，10μM柠檬酸铁，0.25mM硫酸镁，0.25mM硫酸钾，1μM硫酸锰，2μM硼酸，0.5μM硫酸锌，0.2μM硫酸铜，0.1μM硫酸钴，0.1μM钼酸钠)。五天后，用YMA液体培养基(K2HPO4 0.5g/L，MgSO4 0.2g/L，NaCl 0.1g/L，甘露醇10g/L，酵母提取物0.4g/L(pH＝7.0))接种根瘤菌野生型XS1150，XS1150ΩnopD，XS1150ΩnopD+nopD，XS1150ΩnopD+nopDC972-A。待细菌生长饱和后离心收集菌体，并使用10mM硫酸镁重悬菌体至OD600值为0.2。每一盆植物接种2ml这样的重悬液。每一种根瘤菌接种5盆植物。最后，植物培育在16/8h的光暗周期下，24±2℃的环境中，36天后收获成熟根瘤并对有效瘤的数目以及重量进行统计(结果见图4和图5)，此外还对不同处理组的毛豆生物量进行统计。
结果显示，相比于野生型根瘤菌诱导产生的根瘤来说，不表达或表达NopDC972-A的突变菌株与宿主毛豆(T.vogelii)的共生固氮效率更高，具体表现在根瘤的数量更多、根瘤重量更高且毛豆生物量更多。说明NopD的SUMO酶活性在与该豆科植物共生过程中极大抑制了菌株的共生固氮能力。
综上所述，NopD蛋白直接作为真核细胞内SUMO酶而抑制共生固氮。当NopD的酶活性位点突变后，突变体NopDC972-A丧失酶活性，改造菌株在结瘤实验中表现更高的共生固氮效率。
以上结合附图详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。
Figure BDA0002398993060000061
Figure BDA0002398993060000071
Figure BDA0002398993060000081
序列表
<110> 中山大学
<120> 基因和改良根瘤菌的方法
<130> 8076SYSU
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2032
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Val Asp Pro Tyr Asn Phe Asp Pro Pro Asn Pro Thr Ala Trp Ser Pro
1 5 10 15
Val Gln His Ala Val Leu Glu Glu Asp Gln Gly Gly His Ala Gly Gln
20 25 30
Glu Gly Phe Glu Gln His Leu Ala Glu Ala Arg Ser Pro Asp Pro Gly
35 40 45
Pro Val Ser Arg Gly Gly Arg Asn Tyr His Pro His Leu Ser Ala Glu
50 55 60
His Arg Asp Thr Ile Asp Lys Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Gln Lys
65 70 75 80
Asn Pro Gln Arg Asn Thr Val Lys Arg Tyr Thr Gln Ala Leu Arg Arg
85 90 95
Leu Gly Asn Asp Leu Gly Ala His Arg Ile Thr Ile Asp Leu Arg Asp
100 105 110
His Gln Ser Leu Val Arg His Val Lys Thr Tyr Phe Pro Asn Asp Glu
115 120 125
Asp Met Lys Lys Gly Leu Gly Val Leu Arg Ala Tyr His Asp Arg Ser
130 135 140
Tyr Val Ala Ser Gly Gly Arg Pro Arg Thr Ile Pro Ser Ala Glu Asp
145 150 155 160
Ala Pro Leu Ser Glu Arg Leu Asn Ala Ser Gly Met Thr Ser Gly Ser
165 170 175
Ala Ala Arg His Asp Arg Ser Leu Arg Arg Phe Ser Asn Ala Leu Asn
180 185 190
Leu Ala Gly Tyr Ser Ile Ser Gly Leu Asp His Ala Ala Arg Ile Glu
195 200 205
Phe Ala Gln Lys Leu Phe Pro Asn Asp Glu Leu Leu Leu Phe Ala Leu
210 215 220
Gly Lys Val Arg Asp Ala Glu Asn Val Pro Gly Ala Arg Ala Ser Arg
225 230 235 240
Lys Pro Ser Gly Arg Ala Val Pro Ser Pro Ala Leu His Leu Tyr Pro
245 250 255
Asp Asp Ala Arg Ile Ile Asp Gly Leu Glu Lys Ala Glu Leu Ser Met
260 265 270
Leu Lys Pro Glu Glu Lys Ser Arg Lys Lys Val Val Gln Asn Leu Ala
275 280 285
Arg Asn Gln Arg Arg Leu Gly Ala Trp Leu Gln Arg Glu Gly Arg Gly
290 295 300
Ser Ile Val Ser Arg Leu Thr Gly Thr Ser Glu Gln Gln Lys Ser Leu
305 310 315 320
Asn Asp Asp His Thr Asp Phe Lys Lys Ser Asn Arg Asn Ala Asp Met
325 330 335
Gly Phe Asp Arg Leu Arg Ser Tyr Leu Leu Leu Val Glu Ala Asn Ala
340 345 350
Ala Leu Gly Val Cys Pro Glu Gln Ala Gly Gly Glu Pro Arg Arg Gly
355 360 365
Glu Ser Asn Ser Thr Trp Ser Pro His Leu Pro Tyr Asp Phe Glu Trp
370 375 380
Pro Thr Pro Glu Ala Val Pro Asp Gly Ser Ser Ala Ile Tyr Arg Gly
385 390 395 400
Leu Asp Ser Phe Val Asp Leu Pro Tyr Thr Ser Gln Glu Val Arg Asp
405 410 415
Asp Ala Gln Ser Thr Pro Val Gly Arg Ala Ala Ala Arg Pro Pro Leu
420 425 430
Phe Asn Gly Pro Ser Asp Ala Pro Ala Gln Ser Pro Asp Ile Phe Arg
435 440 445
Gly Leu Gln Ser Phe Val Asp Leu Pro Tyr Thr Pro Gln Gln Met Arg
450 455 460
Asp Asp Ala Gln Ser Ala Pro Val Ser Gly Ala Ala Ala Lys Pro Pro
465 470 475 480
Leu Phe Thr Gly Pro Pro Asp Ala Pro Ala Gln Ser Ser Asp Ile Tyr
485 490 495
Arg Gly Leu Asn Ser Phe Val Asp Leu Pro Tyr Thr Pro Gln Gln Met
500 505 510
Arg Asp Asp Ala Gln Pro Ala Pro Val Gly Gly Ala Ala Ala Arg Pro
515 520 525
Pro Leu Phe Thr Gly Pro Ser Asp Ala Pro Ala Gln Ser Ser Asp Ile
530 535 540
Tyr Arg Gly Leu Asn Ser Phe Val Asp Leu Pro Tyr Thr Pro Gln Gln
545 550 555 560
Met Arg Asp Asp Ala Gln Ser Ala Pro Val Gly Trp Ala Ala Ala Lys
565 570 575
Pro Pro Val Phe Thr Glu Pro Ser Asp Val Ala Thr Gln Ser Ser Gln
580 585 590
Ile Tyr His Gly Leu Asn Ser Phe Val Asp Leu Pro Tyr Thr Pro Gln
595 600 605
Gln Met Arg Asp Asp Ala Gln Ser Ala Pro Val Gly Gly Ala Ala Ala
610 615 620
Arg Leu Val Leu Phe Thr Glu Pro Ser Asp Ala Pro Thr Gln Ser Ser
625 630 635 640
His Ile Tyr Arg Asp Leu Asn Pro Phe Val Asp Leu Pro Tyr Thr Pro
645 650 655
Gln Gln Met Arg Asp Asp Ala Gln Ser Ala Pro Val Gly Gly Ala Ala
660 665 670
Ala Arg Pro Pro Leu Phe Thr Glu Pro Ser Asp Thr Pro Ala Gln Ser
675 680 685
Ser Asp Ile Tyr Arg Gly Leu Asn Ser Phe Val Asp Leu Pro Tyr Thr
690 695 700
Pro Gln Gln Met Arg Asp Asp Ala Gln Ser Ala Pro Val Leu Ser Pro
705 710 715 720
Ala Gly Lys Pro Ala Phe Phe Val Gly Arg Ser Gly Val Leu Gln Glu
725 730 735
Leu Glu Asp Ile Gly Tyr Arg Val Asp Glu Asp Trp Gln Asp Gly Ser
740 745 750
Gln Pro Val Pro Asp Phe Leu Ile Asp Val Leu Asp Asn Ile Arg Val
755 760 765
Leu Pro Thr Gln Phe Ser Gly Pro Thr Gln Leu Ser Met Asn Gly Glu
770 775 780
Thr Tyr Ser Ile Thr Leu Gly Pro Arg Gly Arg Arg Val Ala Gln Phe
785 790 795 800
Ile His His Pro Arg Pro Ser Pro Val Pro Gly Ala Gln Ile Gly Pro
805 810 815
Ser Ala Thr Val Ala Ser Ser Gly His Arg Ser Gly Pro Val Leu Gly
820 825 830
Pro Thr Gln Trp Leu Gly Asp Glu His Ile Gln Arg Asp Tyr Glu Leu
835 840 845
Leu Ala Gln Glu Leu Gln Gln Asn Asn Pro Asp Leu Ala Ala Arg Thr
850 855 860
Arg Phe Val Asp Pro Leu Ile Ala Gln Met Leu Arg Ser Pro Ser Lys
865 870 875 880
Glu Val Ala Glu Arg Ala Leu Gly Trp Val Arg Pro Gly Thr Ala Asp
885 890 895
Phe Leu Phe Leu Pro Val Ser Asp Ala Ser Asp Thr Asp Arg His Gln
900 905 910
Arg Gly Ser His Trp Ser Leu Leu Leu Val Asp Arg Arg Asp Arg Gly
915 920 925
Arg Arg Val Ala Tyr His Tyr Asp Ser Thr Gln Gly Tyr Asn Asp Gly
930 935 940
Leu Ala Ala Glu Leu Ala Gly Arg Leu Asp Ala Asn Leu Gln Gln Ala
945 950 955 960
Pro Ile Arg Gln Gln Gln Asn Ser Tyr Asp Cys Gly Val Phe Val Leu
965 970 975
Asp Gly Thr Arg Glu Leu Val Arg Arg Leu Ala Ala Arg Arg Pro Asp
980 985 990
Leu Asn Leu Asn Asn Leu Val Ile Ser Arg Gln Glu Leu Arg Asp Arg
995 1000 1005
Leu Gly Ala Gly Val Gly Phe Asn Val Asp Pro Tyr Asn Phe Asp Pro
1010 1015 1020
Pro Asn Pro Thr Ala Trp Ser Pro Val Gln His Ala Val Leu Glu Glu
1025 1030 1035 1040
Asp Gln Gly Gly His Ala Gly Gln Glu Gly Phe Glu Gln His Leu Ala
1045 1050 1055
Glu Ala Arg Ser Pro Asp Pro Gly Pro Val Ser Arg Gly Gly Arg Asn
1060 1065 1070
Tyr His Pro His Leu Ser Ala Glu His Arg Asp Thr Ile Asp Lys Ala
1075 1080 1085
Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Gln Lys Asn Pro Gln Arg Asn Thr Val Lys
1090 1095 1100
Arg Tyr Thr Gln Ala Leu Arg Arg Leu Gly Asn Asp Leu Gly Ala His
1105 1110 1115 1120
Arg Ile Thr Ile Asp Leu Arg Asp His Gln Ser Leu Val Arg His Val
1125 1130 1135
Lys Thr Tyr Phe Pro Asn Asp Glu Asp Met Lys Lys Gly Leu Gly Val
1140 1145 1150
Leu Arg Ala Tyr His Asp Arg Ser Tyr Val Ala Ser Gly Gly Arg Pro
1155 1160 1165
Arg Thr Ile Pro Ser Ala Glu Asp Ala Pro Leu Ser Glu Arg Leu Asn
1170 1175 1180
Ala Ser Gly Met Thr Ser Gly Ser Ala Ala Arg His Asp Arg Ser Leu
1185 1190 1195 1200
Arg Arg Phe Ser Asn Ala Leu Asn Leu Ala Gly Tyr Ser Ile Ser Gly
1205 1210 1215
Leu Asp His Ala Ala Arg Ile Glu Phe Ala Gln Lys Leu Phe Pro Asn
1220 1225 1230
Asp Glu Leu Leu Leu Phe Ala Leu Gly Lys Val Arg Asp Ala Glu Asn
1235 1240 1245
Val Pro Gly Ala Arg Ala Ser Arg Lys Pro Ser Gly Arg Ala Val Pro
1250 1255 1260
Ser Pro Ala Leu His Leu Tyr Pro Asp Asp Ala Arg Ile Ile Asp Gly
1265 1270 1275 1280
Leu Glu Lys Ala Glu Leu Ser Met Leu Lys Pro Glu Glu Lys Ser Arg
1285 1290 1295
Lys Lys Val Val Gln Asn Leu Ala Arg Asn Gln Arg Arg Leu Gly Ala
1300 1305 1310
Trp Leu Gln Arg Glu Gly Arg Gly Ser Ile Val Ser Arg Leu Thr Gly
1315 1320 1325
Thr Ser Glu Gln Gln Lys Ser Leu Asn Asp Asp His Thr Asp Phe Lys
1330 1335 1340
Lys Ser Asn Arg Asn Ala Asp Met Gly Phe Asp Arg Leu Arg Ser Tyr
1345 1350 1355 1360
Leu Leu Leu Val Glu Ala Asn Ala Ala Leu Gly Val Cys Pro Glu Gln
1365 1370 1375
Ala Gly Gly Glu Pro Arg Arg Gly Glu Ser Asn Ser Thr Trp Ser Pro
1380 1385 1390
His Leu Pro Tyr Asp Phe Glu Trp Pro Thr Pro Glu Ala Val Pro Asp
1395 1400 1405
Gly Ser Ser Ala Ile Tyr Arg Gly Leu Asp Ser Phe Val Asp Leu Pro
1410 1415 1420
Tyr Thr Ser Gln Glu Val Arg Asp Asp Ala Gln Ser Thr Pro Val Gly
1425 1430 1435 1440
Arg Ala Ala Ala Arg Pro Pro Leu Phe Asn Gly Pro Ser Asp Ala Pro
1445 1450 1455
Ala Gln Ser Pro Asp Ile Phe Arg Gly Leu Gln Ser Phe Val Asp Leu
1460 1465 1470
Pro Tyr Thr Pro Gln Gln Met Arg Asp Asp Ala Gln Ser Ala Pro Val
1475 1480 1485
Ser Gly Ala Ala Ala Lys Pro Pro Leu Phe Thr Gly Pro Pro Asp Ala
1490 1495 1500
Pro Ala Gln Ser Ser Asp Ile Tyr Arg Gly Leu Asn Ser Phe Val Asp
1505 1510 1515 1520
Leu Pro Tyr Thr Pro Gln Gln Met Arg Asp Asp Ala Gln Pro Ala Pro
1525 1530 1535
Val Gly Gly Ala Ala Ala Arg Pro Pro Leu Phe Thr Gly Pro Ser Asp
1540 1545 1550
Ala Pro Ala Gln Ser Ser Asp Ile Tyr Arg Gly Leu Asn Ser Phe Val
1555 1560 1565
Asp Leu Pro Tyr Thr Pro Gln Gln Met Arg Asp Asp Ala Gln Ser Ala
1570 1575 1580
Pro Val Gly Trp Ala Ala Ala Lys Pro Pro Val Phe Thr Glu Pro Ser
1585 1590 1595 1600
Asp Val Ala Thr Gln Ser Ser Gln Ile Tyr His Gly Leu Asn Ser Phe
1605 1610 1615
Val Asp Leu Pro Tyr Thr Pro Gln Gln Met Arg Asp Asp Ala Gln Ser
1620 1625 1630
Ala Pro Val Gly Gly Ala Ala Ala Arg Leu Val Leu Phe Thr Glu Pro
1635 1640 1645
Ser Asp Ala Pro Thr Gln Ser Ser His Ile Tyr Arg Asp Leu Asn Pro
1650 1655 1660
Phe Val Asp Leu Pro Tyr Thr Pro Gln Gln Met Arg Asp Asp Ala Gln
1665 1670 1675 1680
Ser Ala Pro Val Gly Gly Ala Ala Ala Arg Pro Pro Leu Phe Thr Glu
1685 1690 1695
Pro Ser Asp Thr Pro Ala Gln Ser Ser Asp Ile Tyr Arg Gly Leu Asn
1700 1705 1710
Ser Phe Val Asp Leu Pro Tyr Thr Pro Gln Gln Met Arg Asp Asp Ala
1715 1720 1725
Gln Ser Ala Pro Val Leu Ser Pro Ala Gly Lys Pro Ala Phe Phe Val
1730 1735 1740
Gly Arg Ser Gly Val Leu Gln Glu Leu Glu Asp Ile Gly Tyr Arg Val
1745 1750 1755 1760
Asp Glu Asp Trp Gln Asp Gly Ser Gln Pro Val Pro Asp Phe Leu Ile
1765 1770 1775
Asp Val Leu Asp Asn Ile Arg Val Leu Pro Thr Gln Phe Ser Gly Pro
1780 1785 1790
Thr Gln Leu Ser Met Asn Gly Glu Thr Tyr Ser Ile Thr Leu Gly Pro
1795 1800 1805
Arg Gly Arg Arg Val Ala Gln Phe Ile His His Pro Arg Pro Ser Pro
1810 1815 1820
Val Pro Gly Ala Gln Ile Gly Pro Ser Ala Thr Val Ala Ser Ser Gly
1825 1830 1835 1840
His Arg Ser Gly Pro Val Leu Gly Pro Thr Gln Trp Leu Gly Asp Glu
1845 1850 1855
His Ile Gln Arg Asp Tyr Glu Leu Leu Ala Gln Glu Leu Gln Gln Asn
1860 1865 1870
Asn Pro Asp Leu Ala Ala Arg Thr Arg Phe Val Asp Pro Leu Ile Ala
1875 1880 1885
Gln Met Leu Arg Ser Pro Ser Lys Glu Val Ala Glu Arg Ala Leu Gly
1890 1895 1900
Trp Val Arg Pro Gly Thr Ala Asp Phe Leu Phe Leu Pro Val Ser Asp
1905 1910 1915 1920
Ala Ser Asp Thr Asp Arg His Gln Arg Gly Ser His Trp Ser Leu Leu
1925 1930 1935
Leu Val Asp Arg Arg Asp Arg Gly Arg Arg Val Ala Tyr His Tyr Asp
1940 1945 1950
Ser Thr Gln Gly Tyr Asn Asp Gly Leu Ala Ala Glu Leu Ala Gly Arg
1955 1960 1965
Leu Asp Ala Asn Leu Gln Gln Ala Pro Ile Arg Gln Gln Gln Asn Ser
1970 1975 1980
Tyr Asp Cys Gly Val Phe Val Leu Asp Gly Thr Arg Glu Leu Val Arg
1985 1990 1995 2000
Arg Leu Ala Ala Arg Arg Pro Asp Leu Asn Leu Asn Asn Leu Val Ile
2005 2010 2015
Ser Arg Gln Glu Leu Arg Asp Arg Leu Gly Ala Gly Val Gly Phe Asn
2020 2025 2030
<210> 2
<211> 3051
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtggacccgt acaatttcga tccacccaat ccaacagctt ggtccccggt gcagcacgcc 60
gtcttggaag aggaccaggg gggccatgcc gggcaagagg gctttgagca gcacttggcc 120
gaggcgcgct cacccgatcc gggtcctgtc tcccgtggcg gccgcaacta ccatccccat 180
ctctctgcag aacatcggga cactatcgac aaggcgattg ccgaatatgc agctcagaaa 240
aacccacaac ggaacacggt taagcgctat actcaggcgc ttcgccgact tggaaatgat 300
cttggcgctc atcgcattac gattgatctg agggaccacc agtccctggt ccgtcatgtc 360
aagacttact tcccgaacga cgaagacatg aagaaagggt tgggtgtcct tcgtgcgtat 420
catgatcgga gctatgtagc ttctggcggg cggccgcgca cgatcccttc agcggaagat 480
gcgcccctct cagagcggct taatgccagt ggcatgacgt cgggcagtgc tgctcgtcat 540
gatcgtagtc ttcgcagatt ttctaacgcg cttaatcttg cgggctactc gatatccggg 600
ttagaccacg cggcgcgcat tgaatttgct cagaagttgt tcccgaacga cgagcttctg 660
ttgttcgcat taggcaaggt tcgcgatgcc gagaacgttc ccggcgcgcg tgcatctcgg 720
aagcccagcg gtcgtgctgt cccgtcgccc gcgttgcatc tttatcccga tgacgcccgc 780
atcattgatg gcctggaaaa ggcagagctg agcatgctca aacccgagga gaagagccgg 840
aaaaaagttg ttcaaaatct ggcccgcaac caacgaagat tgggtgcttg gctccaaagg 900
gaggggcggg ggagcatagt gagccgactc accggcacca gtgagcagca aaagtcgttg 960
aacgacgatc acaccgactt taaaaaatcc aatcgaaacg cggacatggg cttcgatcgg 1020
cttaggagct acctattgct cgtcgaggcg aacgctgcgc tgggcgtctg ccctgaacag 1080
gcgggtgggg agccgcggcg tggcgagtcg aactcaacgt ggtcgccgca cctgccgtac 1140
gattttgagt ggccgacgcc ggaagcggtg ccagatgggt cgtcggcgat ctaccgaggt 1200
ctcgactcct tcgttgatct gccgtacacc tcgcaggagg tgagagacga tgctcagtca 1260
acgccggtgg gtagggctgc cgccagaccg ccgctcttca acggaccatc ggacgcgcca 1320
gctcagtcgc ccgacatttt ccgcggtctt cagtctttcg ttgatttgcc gtacacgccg 1380
caacagatgc gagacgatgc tcagtcggcg ccggtgagtg gggctgccgc caaaccgccg 1440
ctcttcaccg gaccgccgga cgcgccagct cagtcgtcag acatctaccg cggtctcaac 1500
tctttcgttg atctgccgta cacaccgcag cagatgcgag acgatgctca gccagcgccg 1560
gtgggtgggg ctgccgccag accgccgctc ttcaccggac cgtcggacgc gccagctcag 1620
tcgtcagaca tctaccgcgg tctcaactct ttcgttgatc tgccgtacac accgcagcag 1680
atgcgagacg atgctcagtc agcgccggtg ggttgggctg ccgccaaacc gccggtcttc 1740
accgaaccat cagacgtggc aactcagtcg tcacagatct accacggtct caactctttc 1800
gttgatctgc cgtacacacc acagcagatg cgagacgatg ctcagtcggc gccggtgggt 1860
ggggctgccg ctagactggt gctcttcacc gaaccatcag acgcgccaac tcagtcgtca 1920
cacatctacc gcgatctcaa ccctttcgtt gatctgccgt acacgccgca gcagatgcga 1980
gacgatgctc agtccgcgcc ggtgggtggg gctgccgcca gaccgccact cttcaccgaa 2040
ccatcagaca cgccagctca gtcgtcagac atctatcgcg gtctcaactc tttcgttgat 2100
ctgccgtaca caccgcagca gatgcgtgac gatgctcagt cagcgccggt gctcagccct 2160
gccggtaaac ccgcgttctt cgtcgggcga tcgggcgtac ttcaggagct tgaggacatc 2220
ggataccgag tcgacgagga ttggcaggat ggctcccagc cggtgccgga tttcttaatc 2280
gatgtcctgg ataatatcag ggtcctgccg acccagttca gcggcccaac ccagctctcc 2340
atgaacggtg agacctactc gatcacattg gggccgcgag gacgccgcgt tgcgcaattc 2400
atccatcatc ctcgcccgtc ccctgtcccg ggtgctcaga tcggcccctc ggctactgtt 2460
gcctcttccg gccaccgcag cggtcccgtg ctggggccca cgcagtggct gggggacgag 2520
catatccagc gggactatga gctcctggcg caggagttgc agcagaacaa tccggatctc 2580
gccgctcgga cgcggttcgt ggatcccctg atagcccaaa tgttgcgatc cccctccaag 2640
gaggtagccg aacgagcatt agggtgggtt cgccctggta cagctgactt cctgttcctg 2700
ccggtaagcg atgccagcga tacggataga catcagcgcg gcagtcactg gtcgctgctg 2760
ctggttgatc gccgcgatcg tggccggcgg gtcgcctatc actatgactc tacccaggga 2820
tacaatgacg ggctcgcagc ggaactcgca ggacggctcg acgctaacct gcaacaggcc 2880
ccgataagac agcagcagaa cagttatgac tgcggcgtct ttgtcctgga cggcaccagg 2940
gaactggtaa ggcgattggc agcaagacgg ccggacctga acctcaacaa tcttgtcatc 3000
agtcggcagg aactgcggga ccgactaggc gctggtgtcg gcttcaactg a 3051
<210> 3
<211> 894
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cctgccggta aacccgcgtt cttcgtcggg cgatcgggcg tacttcagga gcttgaggac 60
atcggatacc gagtcgacga ggattggcag gatggctccc agccggtgcc ggatttctta 120
atcgatgtcc tggataatat cagggtcctg ccgacccagt tcagcggccc aacccagctc 180
tccatgaacg gtgagaccta ctcgatcaca ttggggccgc gaggacgccg cgttgcgcaa 240
ttcatccatc atcctcgccc gtcccctgtc ccgggtgctc agatcggccc ctcggctact 300
gttgcctctt ccggccaccg cagcggtccc gtgctggggc ccacgcagtg gctgggggac 360
gagcatatcc agcgggacta tgagctcctg gcgcaggagt tgcagcagaa caatccggat 420
ctcgccgctc ggacgcggtt cgtggatccc ctgatagccc aaatgttgcg atccccctcc 480
aaggaggtag ccgaacgagc attagggtgg gttcgccctg gtacagctga cttcctgttc 540
ctgccggtaa gcgatgccag cgatacggat agacatcagc gcggcagtca ctggtcgctg 600
ctgctggttg atcgccgcga tcgtggccgg cgggtcgcct atcactatga ctctacccag 660
ggatacaatg acgggctcgc agcggaactc gcaggacggc tcgacgctaa cctgcaacag 720
gccccgataa gacagcagca gaacagttat gactgcggcg tctttgtcct ggacggcacc 780
agggaactgg taaggcgatt ggcagcaaga cggccggacc tgaacctcaa caatcttgtc 840
atcagtcggc aggaactgcg ggaccgacta ggcgctggtg tcggcttcaa ctga 894
<210> 4
<211> 297
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Pro Ala Gly Lys Pro Ala Phe Phe Val Gly Arg Ser Gly Val Leu Gln
1 5 10 15
Glu Leu Glu Asp Ile Gly Tyr Arg Val Asp Glu Asp Trp Gln Asp Gly
20 25 30
Ser Gln Pro Val Pro Asp Phe Leu Ile Asp Val Leu Asp Asn Ile Arg
35 40 45
Val Leu Pro Thr Gln Phe Ser Gly Pro Thr Gln Leu Ser Met Asn Gly
50 55 60
Glu Thr Tyr Ser Ile Thr Leu Gly Pro Arg Gly Arg Arg Val Ala Gln
65 70 75 80
Phe Ile His His Pro Arg Pro Ser Pro Val Pro Gly Ala Gln Ile Gly
85 90 95
Pro Ser Ala Thr Val Ala Ser Ser Gly His Arg Ser Gly Pro Val Leu
100 105 110
Gly Pro Thr Gln Trp Leu Gly Asp Glu His Ile Gln Arg Asp Tyr Glu
115 120 125
Leu Leu Ala Gln Glu Leu Gln Gln Asn Asn Pro Asp Leu Ala Ala Arg
130 135 140
Thr Arg Phe Val Asp Pro Leu Ile Ala Gln Met Leu Arg Ser Pro Ser
145 150 155 160
Lys Glu Val Ala Glu Arg Ala Leu Gly Trp Val Arg Pro Gly Thr Ala
165 170 175
Asp Phe Leu Phe Leu Pro Val Ser Asp Ala Ser Asp Thr Asp Arg His
180 185 190
Gln Arg Gly Ser His Trp Ser Leu Leu Leu Val Asp Arg Arg Asp Arg
195 200 205
Gly Arg Arg Val Ala Tyr His Tyr Asp Ser Thr Gln Gly Tyr Asn Asp
210 215 220
Gly Leu Ala Ala Glu Leu Ala Gly Arg Leu Asp Ala Asn Leu Gln Gln
225 230 235 240
Ala Pro Ile Arg Gln Gln Gln Asn Ser Tyr Asp Cys Gly Val Phe Val
245 250 255
Leu Asp Gly Thr Arg Glu Leu Val Arg Arg Leu Ala Ala Arg Arg Pro
260 265 270
Asp Leu Asn Leu Asn Asn Leu Val Ile Ser Arg Gln Glu Leu Arg Asp
275 280 285
Arg Leu Gly Ala Gly Val Gly Phe Asn
290 295
<210> 5
<211> 1016
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Val Asp Pro Tyr Asn Phe Asp Pro Pro Asn Pro Thr Ala Trp Ser Pro
1 5 10 15
Val Gln His Ala Val Leu Glu Glu Asp Gln Gly Gly His Ala Gly Gln
20 25 30
Glu Gly Phe Glu Gln His Leu Ala Glu Ala Arg Ser Pro Asp Pro Gly
35 40 45
Pro Val Ser Arg Gly Gly Arg Asn Tyr His Pro His Leu Ser Ala Glu
50 55 60
His Arg Asp Thr Ile Asp Lys Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Gln Lys
65 70 75 80
Asn Pro Gln Arg Asn Thr Val Lys Arg Tyr Thr Gln Ala Leu Arg Arg
85 90 95
Leu Gly Asn Asp Leu Gly Ala His Arg Ile Thr Ile Asp Leu Arg Asp
100 105 110
His Gln Ser Leu Val Arg His Val Lys Thr Tyr Phe Pro Asn Asp Glu
115 120 125
Asp Met Lys Lys Gly Leu Gly Val Leu Arg Ala Tyr His Asp Arg Ser
130 135 140
Tyr Val Ala Ser Gly Gly Arg Pro Arg Thr Ile Pro Ser Ala Glu Asp
145 150 155 160
Ala Pro Leu Ser Glu Arg Leu Asn Ala Ser Gly Met Thr Ser Gly Ser
165 170 175
Ala Ala Arg His Asp Arg Ser Leu Arg Arg Phe Ser Asn Ala Leu Asn
180 185 190
Leu Ala Gly Tyr Ser Ile Ser Gly Leu Asp His Ala Ala Arg Ile Glu
195 200 205
Phe Ala Gln Lys Leu Phe Pro Asn Asp Glu Leu Leu Leu Phe Ala Leu
210 215 220
Gly Lys Val Arg Asp Ala Glu Asn Val Pro Gly Ala Arg Ala Ser Arg
225 230 235 240
Lys Pro Ser Gly Arg Ala Val Pro Ser Pro Ala Leu His Leu Tyr Pro
245 250 255
Asp Asp Ala Arg Ile Ile Asp Gly Leu Glu Lys Ala Glu Leu Ser Met
260 265 270
Leu Lys Pro Glu Glu Lys Ser Arg Lys Lys Val Val Gln Asn Leu Ala
275 280 285
Arg Asn Gln Arg Arg Leu Gly Ala Trp Leu Gln Arg Glu Gly Arg Gly
290 295 300
Ser Ile Val Ser Arg Leu Thr Gly Thr Ser Glu Gln Gln Lys Ser Leu
305 310 315 320
Asn Asp Asp His Thr Asp Phe Lys Lys Ser Asn Arg Asn Ala Asp Met
325 330 335
Gly Phe Asp Arg Leu Arg Ser Tyr Leu Leu Leu Val Glu Ala Asn Ala
340 345 350
Ala Leu Gly Val Cys Pro Glu Gln Ala Gly Gly Glu Pro Arg Arg Gly
355 360 365
Glu Ser Asn Ser Thr Trp Ser Pro His Leu Pro Tyr Asp Phe Glu Trp
370 375 380
Pro Thr Pro Glu Ala Val Pro Asp Gly Ser Ser Ala Ile Tyr Arg Gly
385 390 395 400
Leu Asp Ser Phe Val Asp Leu Pro Tyr Thr Ser Gln Glu Val Arg Asp
405 410 415
Asp Ala Gln Ser Thr Pro Val Gly Arg Ala Ala Ala Arg Pro Pro Leu
420 425 430
Phe Asn Gly Pro Ser Asp Ala Pro Ala Gln Ser Pro Asp Ile Phe Arg
435 440 445
Gly Leu Gln Ser Phe Val Asp Leu Pro Tyr Thr Pro Gln Gln Met Arg
450 455 460
Asp Asp Ala Gln Ser Ala Pro Val Ser Gly Ala Ala Ala Lys Pro Pro
465 470 475 480
Leu Phe Thr Gly Pro Pro Asp Ala Pro Ala Gln Ser Ser Asp Ile Tyr
485 490 495
Arg Gly Leu Asn Ser Phe Val Asp Leu Pro Tyr Thr Pro Gln Gln Met
500 505 510
Arg Asp Asp Ala Gln Pro Ala Pro Val Gly Gly Ala Ala Ala Arg Pro
515 520 525
Pro Leu Phe Thr Gly Pro Ser Asp Ala Pro Ala Gln Ser Ser Asp Ile
530 535 540
Tyr Arg Gly Leu Asn Ser Phe Val Asp Leu Pro Tyr Thr Pro Gln Gln
545 550 555 560
Met Arg Asp Asp Ala Gln Ser Ala Pro Val Gly Trp Ala Ala Ala Lys
565 570 575
Pro Pro Val Phe Thr Glu Pro Ser Asp Val Ala Thr Gln Ser Ser Gln
580 585 590
Ile Tyr His Gly Leu Asn Ser Phe Val Asp Leu Pro Tyr Thr Pro Gln
595 600 605
Gln Met Arg Asp Asp Ala Gln Ser Ala Pro Val Gly Gly Ala Ala Ala
610 615 620
Arg Leu Val Leu Phe Thr Glu Pro Ser Asp Ala Pro Thr Gln Ser Ser
625 630 635 640
His Ile Tyr Arg Asp Leu Asn Pro Phe Val Asp Leu Pro Tyr Thr Pro
645 650 655
Gln Gln Met Arg Asp Asp Ala Gln Ser Ala Pro Val Gly Gly Ala Ala
660 665 670
Ala Arg Pro Pro Leu Phe Thr Glu Pro Ser Asp Thr Pro Ala Gln Ser
675 680 685
Ser Asp Ile Tyr Arg Gly Leu Asn Ser Phe Val Asp Leu Pro Tyr Thr
690 695 700
Pro Gln Gln Met Arg Asp Asp Ala Gln Ser Ala Pro Val Leu Ser Pro
705 710 715 720
Ala Gly Lys Pro Ala Phe Phe Val Gly Arg Ser Gly Val Leu Gln Glu
725 730 735
Leu Glu Asp Ile Gly Tyr Arg Val Asp Glu Asp Trp Gln Asp Gly Ser
740 745 750
Gln Pro Val Pro Asp Phe Leu Ile Asp Val Leu Asp Asn Ile Arg Val
755 760 765
Leu Pro Thr Gln Phe Ser Gly Pro Thr Gln Leu Ser Met Asn Gly Glu
770 775 780
Thr Tyr Ser Ile Thr Leu Gly Pro Arg Gly Arg Arg Val Ala Gln Phe
785 790 795 800
Ile His His Pro Arg Pro Ser Pro Val Pro Gly Ala Gln Ile Gly Pro
805 810 815
Ser Ala Thr Val Ala Ser Ser Gly His Arg Ser Gly Pro Val Leu Gly
820 825 830
Pro Thr Gln Trp Leu Gly Asp Glu His Ile Gln Arg Asp Tyr Glu Leu
835 840 845
Leu Ala Gln Glu Leu Gln Gln Asn Asn Pro Asp Leu Ala Ala Arg Thr
850 855 860
Arg Phe Val Asp Pro Leu Ile Ala Gln Met Leu Arg Ser Pro Ser Lys
865 870 875 880
Glu Val Ala Glu Arg Ala Leu Gly Trp Val Arg Pro Gly Thr Ala Asp
885 890 895
Phe Leu Phe Leu Pro Val Ser Asp Ala Ser Asp Thr Asp Arg His Gln
900 905 910
Arg Gly Ser His Trp Ser Leu Leu Leu Val Asp Arg Arg Asp Arg Gly
915 920 925
Arg Arg Val Ala Tyr His Tyr Asp Ser Thr Gln Gly Tyr Asn Asp Gly
930 935 940
Leu Ala Ala Glu Leu Ala Gly Arg Leu Asp Ala Asn Leu Gln Gln Ala
945 950 955 960
Pro Ile Arg Gln Gln Gln Asn Ser Tyr Asp Ala Gly Val Phe Val Leu
965 970 975
Asp Gly Thr Arg Glu Leu Val Arg Arg Leu Ala Ala Arg Arg Pro Asp
980 985 990
Leu Asn Leu Asn Asn Leu Val Ile Ser Arg Gln Glu Leu Arg Asp Arg
995 1000 1005
Leu Gly Ala Gly Val Gly Phe Asn
1010 1015
<210> 6
<211> 3051
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gtggacccgt acaatttcga tccacccaat ccaacagctt ggtccccggt gcagcacgcc 60
gtcttggaag aggaccaggg gggccatgcc gggcaagagg gctttgagca gcacttggcc 120
gaggcgcgct cacccgatcc gggtcctgtc tcccgtggcg gccgcaacta ccatccccat 180
ctctctgcag aacatcggga cactatcgac aaggcgattg ccgaatatgc agctcagaaa 240
aacccacaac ggaacacggt taagcgctat actcaggcgc ttcgccgact tggaaatgat 300
cttggcgctc atcgcattac gattgatctg agggaccacc agtccctggt ccgtcatgtc 360
aagacttact tcccgaacga cgaagacatg aagaaagggt tgggtgtcct tcgtgcgtat 420
catgatcgga gctatgtagc ttctggcggg cggccgcgca cgatcccttc agcggaagat 480
gcgcccctct cagagcggct taatgccagt ggcatgacgt cgggcagtgc tgctcgtcat 540
gatcgtagtc ttcgcagatt ttctaacgcg cttaatcttg cgggctactc gatatccggg 600
ttagaccacg cggcgcgcat tgaatttgct cagaagttgt tcccgaacga cgagcttctg 660
ttgttcgcat taggcaaggt tcgcgatgcc gagaacgttc ccggcgcgcg tgcatctcgg 720
aagcccagcg gtcgtgctgt cccgtcgccc gcgttgcatc tttatcccga tgacgcccgc 780
atcattgatg gcctggaaaa ggcagagctg agcatgctca aacccgagga gaagagccgg 840
aaaaaagttg ttcaaaatct ggcccgcaac caacgaagat tgggtgcttg gctccaaagg 900
gaggggcggg ggagcatagt gagccgactc accggcacca gtgagcagca aaagtcgttg 960
aacgacgatc acaccgactt taaaaaatcc aatcgaaacg cggacatggg cttcgatcgg 1020
cttaggagct acctattgct cgtcgaggcg aacgctgcgc tgggcgtctg ccctgaacag 1080
gcgggtgggg agccgcggcg tggcgagtcg aactcaacgt ggtcgccgca cctgccgtac 1140
gattttgagt ggccgacgcc ggaagcggtg ccagatgggt cgtcggcgat ctaccgaggt 1200
ctcgactcct tcgttgatct gccgtacacc tcgcaggagg tgagagacga tgctcagtca 1260
acgccggtgg gtagggctgc cgccagaccg ccgctcttca acggaccatc ggacgcgcca 1320
gctcagtcgc ccgacatttt ccgcggtctt cagtctttcg ttgatttgcc gtacacgccg 1380
caacagatgc gagacgatgc tcagtcggcg ccggtgagtg gggctgccgc caaaccgccg 1440
ctcttcaccg gaccgccgga cgcgccagct cagtcgtcag acatctaccg cggtctcaac 1500
tctttcgttg atctgccgta cacaccgcag cagatgcgag acgatgctca gccagcgccg 1560
gtgggtgggg ctgccgccag accgccgctc ttcaccggac cgtcggacgc gccagctcag 1620
tcgtcagaca tctaccgcgg tctcaactct ttcgttgatc tgccgtacac accgcagcag 1680
atgcgagacg atgctcagtc agcgccggtg ggttgggctg ccgccaaacc gccggtcttc 1740
accgaaccat cagacgtggc aactcagtcg tcacagatct accacggtct caactctttc 1800
gttgatctgc cgtacacacc acagcagatg cgagacgatg ctcagtcggc gccggtgggt 1860
ggggctgccg ctagactggt gctcttcacc gaaccatcag acgcgccaac tcagtcgtca 1920
cacatctacc gcgatctcaa ccctttcgtt gatctgccgt acacgccgca gcagatgcga 1980
gacgatgctc agtccgcgcc ggtgggtggg gctgccgcca gaccgccact cttcaccgaa 2040
ccatcagaca cgccagctca gtcgtcagac atctatcgcg gtctcaactc tttcgttgat 2100
ctgccgtaca caccgcagca gatgcgtgac gatgctcagt cagcgccggt gctcagccct 2160
gccggtaaac ccgcgttctt cgtcgggcga tcgggcgtac ttcaggagct tgaggacatc 2220
ggataccgag tcgacgagga ttggcaggat ggctcccagc cggtgccgga tttcttaatc 2280
gatgtcctgg ataatatcag ggtcctgccg acccagttca gcggcccaac ccagctctcc 2340
atgaacggtg agacctactc gatcacattg gggccgcgag gacgccgcgt tgcgcaattc 2400
atccatcatc ctcgcccgtc ccctgtcccg ggtgctcaga tcggcccctc ggctactgtt 2460
gcctcttccg gccaccgcag cggtcccgtg ctggggccca cgcagtggct gggggacgag 2520
catatccagc gggactatga gctcctggcg caggagttgc agcagaacaa tccggatctc 2580
gccgctcgga cgcggttcgt ggatcccctg atagcccaaa tgttgcgatc cccctccaag 2640
gaggtagccg aacgagcatt agggtgggtt cgccctggta cagctgactt cctgttcctg 2700
ccggtaagcg atgccagcga tacggataga catcagcgcg gcagtcactg gtcgctgctg 2760
ctggttgatc gccgcgatcg tggccggcgg gtcgcctatc actatgactc tacccaggga 2820
tacaatgacg ggctcgcagc ggaactcgca ggacggctcg acgctaacct gcaacaggcc 2880
ccgataagac agcagcagaa cagttatgac gccggcgtct ttgtcctgga cggcaccagg 2940
gaactggtaa ggcgattggc agcaagacgg ccggacctga acctcaacaa tcttgtcatc 3000
agtcggcagg aactgcggga ccgactaggc gctggtgtcg gcttcaactg a 3051

Claims (4)

1.一种改良根瘤菌的方法，其特征在于，该方法包括：敲低或敲除待改良的根瘤菌中编码由SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的基因的表达。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，编码由SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的基因的碱基序列如SEQ ID NO. 2所示。
3.一种改良根瘤菌的方法，其特征在于，该方法包括：在待改良的根瘤菌中对编码由SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的基因进行点突变以使得点突变后的基因所表达得到的蛋白为如SEQ ID NO. 5所示的蛋白质。
4.一种增加农作物的产量的方法，其中，该方法包括如下步骤：
S1、按照权利要求1-3中任意一项所述的方法对根瘤菌进行改良，得到改良后的根瘤菌；
S2、将S1得到的改良后的根瘤菌施用至农作物的根部，以形成根瘤并进行生物固氮；
其中，所述植物为毛豆、花生、青刀豆和大豆中的至少一种。
CN202010140743.4A 2020-03-03 2020-03-03 基因和改良根瘤菌的方法 Active CN111411115B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010140743.4A CN111411115B (zh) 2020-03-03 2020-03-03 基因和改良根瘤菌的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010140743.4A CN111411115B (zh) 2020-03-03 2020-03-03 基因和改良根瘤菌的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111411115A CN111411115A (zh) 2020-07-14
CN111411115B true CN111411115B (zh) 2022-05-27

Family

ID=71491143

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010140743.4A Active CN111411115B (zh) 2020-03-03 2020-03-03 基因和改良根瘤菌的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111411115B (zh)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101852148B1 (ko) * 2015-06-26 2018-04-25 한국생명공학연구원 타입 III 에펙터 HopQ1 및 LIM 도메인 키나아제1(LIMK1)의 상호작용을 이용한 HopQ1에 의한 면역 억제에 대한 억제제 스크리닝 방법 및 이를 위한 조성물
CN110483628A (zh) * 2019-08-16 2019-11-22 江西省农业科学院水稻研究所 促进植物根系与共生菌共生的蛋白、分离的核酸分子及其应用培育方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101852148B1 (ko) * 2015-06-26 2018-04-25 한국생명공학연구원 타입 III 에펙터 HopQ1 및 LIM 도메인 키나아제1(LIMK1)의 상호작용을 이용한 HopQ1에 의한 면역 억제에 대한 억제제 스크리닝 방법 및 이를 위한 조성물
CN110483628A (zh) * 2019-08-16 2019-11-22 江西省农业科学院水稻研究所 促进植物根系与共生菌共生的蛋白、分离的核酸分子及其应用培育方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A Putative Type III Secretion System Effector Encoded by the MA2012780 Gene in Bradyrhizobium japonicum Is-34 Causes Incompatibility with Rj4 Genotype Soybeans;Hirohito Tsurumaru等;《Applied and Environmental Microbiology》;20150901;第81卷;第5812-5819页，参见全文 *
Bradyrhizobium sp. strain XS1150 type III effector (nopD) gene, complete cds;Xiang,Q.-W.等;《GenBank: MF100854.1》;20180613;参见序列及相关信息 *
华癸中慢生根瘤菌7653R效应蛋白NopP的共生功能及蛋白互作研究;潘悦;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 基础科学辑》;20140915(第09期);参见全文 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN111411115A (zh) 2020-07-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106591271A (zh) 一株酶活和温度稳定性提高的精氨酸脱亚胺酶突变体及其应用
CN107603937A (zh) 一种表达赖氨酸氨肽酶的重组大肠杆菌及其构建方法
CN114015676B (zh) 一种适配中药饲料添加剂的纤维素酶的构建方法
CN102041241A (zh) 高效泌铵的联合固氮菌株
CN106566823A (zh) 一种新型谷氨酸脱羧酶基因的克隆及其应用
CN114667346A (zh) EanB酶突变体及其应用
EP3487871A1 (en) Biocatalyst comprising photoautotrophic organisms producing recombinant enzyme for degradation of harmful algal bloom toxins
CN111944790B (zh) 中性蛋白酶基因、中性蛋白酶及其制备方法和应用
CN111411115B (zh) 基因和改良根瘤菌的方法
CN108034642B (zh) 葡萄糖氧化酶CnGOD19及其改良酶、基因和应用
CN107858364A (zh) 一种适于甲醇酵母表达的耐高温高比活细菌植酸酶基因
CN110283797B (zh) 一种酪氨酸酶及其基因、工程菌和制备方法
CN110791508A (zh) 密码子优化的片球菌素基因、表达载体及重组工程菌株
CN115058408B (zh) 一种宏基因组来源的高比活耐酸性d-阿洛酮糖3-差向异构酶及其编码基因和应用
CN108165559B (zh) 一种c2h2型转录因子基因及其应用
CN114426976A (zh) 一种耦合ATP再生酶和聚谷氨酸合成酶的γ-PGA制备方法
CN109097315B (zh) 一种高产脂肽的基因工程菌及其构建方法和应用
CN110093390A (zh) 受DNA guide引导的具有核酸内切酶活性的RecJ蛋白及其在基因编辑中的应用
CN109402084B (zh) 构建具有溶磷活性重组微生物的方法及其所用核酸分子
CN110862977B (zh) 一种耐氯化钠和氯化钾的木糖苷酶突变体h328d及其应用
CN113637657B (zh) 一种羧酸酯酶CarCB2及其全细胞催化剂和应用
KR20180007725A (ko) 베타-아가라제의 대량 생산방법
CN102061300A (zh) 一种链霉菌柠檬酸合酶基因及其编码蛋白
CN114438000B (zh) 一株铜绿假单胞菌及其构建方法与应用
CN110904076B (zh) 一种耐氯化钾的木糖苷酶突变体k317d及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant