CN115747151A

CN115747151A - 一种通过调控端粒以稳定扩增脂肪干细胞的方法

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Publication number: CN115747151A
Application number: CN202211491800.9A
Authority: CN
Inventors: 金开让; 田成磊; 魏素芬; 刘林
Original assignee: Nankai University
Current assignee: Nankai University
Priority date: 2022-11-25
Filing date: 2022-11-25
Publication date: 2023-03-07
Anticipated expiration: 2042-11-25
Also published as: CN115747151B

Abstract

本发明公开了一种通过调控端粒以稳定扩增脂肪干细胞的方法，属于细胞工程技术领域。该方法采用低氧联合L‑抗坏血酸‑2‑磷酸酯镁和N‑乙酰半胱氨酸营养成分的培养条件培养脂肪干细胞，激活脂肪干细胞内端粒酶活力，缓解端粒损伤以及维持脂肪干细胞稳态，以稳定扩增脂肪干细胞。本发明通过实验发现，采用低氧联合L‑抗坏血酸‑2‑磷酸酯镁和N‑乙酰半胱氨酸成分的培养条件，可以最大程度激活端粒酶表达，延长端粒，减少端粒损伤和丢失，并维持细胞染色体核型正常，有效提高所获得的脂肪干细胞的数量和延缓细胞衰老，最终实现稳定扩增人脂肪干细胞的目的，可见，本发明公开的体外扩增脂肪干细胞的方法具备更高的临床应用价值。

Description

一种通过调控端粒以稳定扩增脂肪干细胞的方法

技术领域

本发明涉及细胞工程技术领域，特别是涉及一种通过调控端粒以稳定扩增脂肪干细胞的方法。

背景技术

干细胞是指未分化，并且可以自我更新以及具有分化成特定细胞类型的潜力，对生命体各个组织器官的更新和损伤修复具有重要作用的细胞。脂肪干细胞(adipose-dervied stem cells，hASCs)是指在脂肪组织中分离出的一种具有多向分化潜能的成体干细胞，与骨髓间充质干细胞一样，特定条件下可以分化为脂肪细胞、成软骨细胞、成肌细胞和成骨细胞等。脂肪干细胞因其取材方便，无伦理限制，且能诱导成多胚层细胞而成为最有应用前景的成体干细胞之一，据估计，和骨髓中的0.001～0.002％ MSC相比，脂肪组织中多达1％的细胞是间充质干细胞，是目前常见的干细胞来源之一(Fraser,J.K,TrendsBiotechnol,2006.24(4))，在组织工程和再生医学具有重要的应用前景。

端粒(Telomere)缩短是引起细胞衰老的重要原因之一，当端粒长度缩短至临界值时，保护端粒末端的蛋白因子会丢失，使短端粒暴露，引起严重的DNA损伤应答和细胞复制性衰老，激活端粒酶表达则可以防止细胞衰老，促进细胞继续增殖。

实际临床应用中通常所需hASCs的细胞数量大，常规的血清培养体系体外大量扩增hASCs往往又会伴随细胞衰老、增殖缓慢和端粒缩短，而端粒过短会造成端粒丢失和染色体不稳定性，大大提高了人脂肪干细胞临床应用的风险，这严重限制了脂肪来源的干细胞的临床应用。因此，需要寻求一种可有效减少端粒的缩短和端粒损伤来稳定扩增人脂肪干细胞的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种通过调控端粒以稳定扩增脂肪干细胞的方法，以解决上述现有技术存在的问题，本发明发现采用低氧联合L-抗坏血酸-2-磷酸酯镁和N-乙酰半胱氨酸成分的培养条件，可以最大程度激活端粒酶表达，延长端粒，减少端粒损伤和丢失，并维持细胞染色体核型正常，有效提高所获得的脂肪干细胞的数量和延缓细胞衰老，最终实现稳定扩增人脂肪干细胞的目的。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种通过调控端粒以稳定扩增脂肪干细胞的方法，采用低氧联合L-抗坏血酸-2-磷酸酯镁和N-乙酰半胱氨酸营养成分的培养条件培养脂肪干细胞，激活脂肪干细胞内端粒酶活力，缓解端粒损伤以及维持脂肪干细胞稳态，以稳定扩增脂肪干细胞。

进一步地，缓解端粒损伤包括延长端粒长度和减少端粒丢失。

进一步地，维持脂肪干细胞稳态包括减缓细胞衰老、促进细胞增殖以及维持细胞染色体核型正常。

进一步地，所述培养条件为：在5％氧气浓度下，将脂肪干细胞接种至营养培养基进行体外扩增培养。

进一步地，所述营养培养基以DMEM为基础培养基，向其中添加下述配比组分：

10-20％胎牛血清、1-5mM L-谷氨酰胺、1-2％非必须氨基酸、0.1mMβ-巯基乙醇、50U/mL青霉素、50μg/mL链霉素、10-50μg/mL L-抗坏血酸-2-磷酸酯镁、1-10mM N-乙酰半胱氨酸。

进一步地，在培养脂肪干细胞之前，还包括提取脂肪干细胞的步骤。

进一步地，所述提取脂肪干细胞的步骤具体为：用含双抗的磷酸盐缓冲液对脂肪提取物进行清洗，离心后加入Ⅰ型胶原酶混匀，在36-38℃下消化20-60min，消化终止后收集细胞。

本发明公开了以下技术效果：

本发明通过不断筛选和尝试，发现采用低氧联合L-抗坏血酸-2-磷酸酯镁和N-乙酰半胱氨酸成分的培养条件，可以最大程度激活端粒酶表达，延长端粒，减少端粒损伤和丢失，并维持细胞染色体核型正常，有效提高所获得的脂肪干细胞的数量和延缓细胞衰老，最终实现稳定扩增人脂肪干细胞的目的，可见，本发明公开的体外扩增脂肪干细胞的方法具备更高的临床应用价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为不同培养条件下体外扩增40天(14代)后细胞的光镜形态图；

图2为不同培养条件下体外扩增持续40天(14代)细胞的绝对数量曲线图；

图3为不同培养条件下体外扩增40天(14代)后细胞的增殖蛋白标记KI67的着色比例；

图4为不同培养条件下体外扩增40天(14代)后细胞的生长曲线图；

图5为不同培养策略下体外扩增40天(14代)后间充质干细胞标记物的流式分析图；

图6为不同培养条件下体外扩增40天(14代)后细胞的流式分析图和ROS水平；

图7为不同培养条件下体外扩增40天(14代)后细胞内的DNA损伤标记物53BP1和端粒的免疫荧光及53BP1定量、端粒共定位定量统计情况；

图8为不同培养条件下体外扩增40天(14代)后细胞的SA-β-Gal染色的光镜图；

图9为不同培养条件下体外扩增40天(14代)后Elisa检测细胞的端粒酶表达情况；

图10为不同培养条件下体外扩增40天(14代)后Southernblot检测细胞的端粒长度；

图11为不同培养条件下体外扩增40天(14代)后细胞的端粒丢失和染色体核型情况。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

1 实验设计及方法

1.1 体外扩增人脂肪干细胞

(1)原代分离：用含5％双抗(青霉素/链霉素)的磷酸盐缓冲液对脂肪提取物进行吹打清洗，离心后转移至加入1mg/ml的Ⅰ型胶原酶的1.5mL离心管中，用剪刀充分剪碎脂肪，然后吹打混匀。37℃水浴锅中充分消化20～60min，培养液终止消化后离心收集细胞，HBSS吹洗混匀细胞沉淀，重复几次清洗之后，接种到0.1％ Gelatin处理30min的培养板上，于5％ CO₂的加湿的培养箱中常氧培养。每3天换液一次，细胞生长至90％汇合度时传代。

(2)体外扩增：传代时使用0.25％胰蛋白酶消化1min，并按照1:3的比例接种到六孔板中，培养条件为37℃，5％ CO₂的加湿的培养箱，培养方式采用新的培养策略，新的策略包括5％氧气和新的培养基，新的培养基包括Knockout-DMEM基础培养基和添加成分，其中添加成分为：10％胎牛血清、1mM L-谷氨酰胺、1％非必须氨基酸(货号：11140050，ThermoScientific)、0.1mMβ-巯基乙醇、50U/mL青霉素、50μg/mL链霉素、20μg/mL L-抗坏血酸-2-磷酸酯镁(下述简称Vc)、1mM N-乙酰半胱氨酸(简称NAC)。持续培养传代超过40天(14代)，获得体外扩增后的人脂肪干细胞。

本实验中还设置常氧(21％氧气)为Normoxia组，低氧(5％氧气)为Hypoxia组，以本实验中不添加Vc和NAC的培养基作为对照组(Ctrl)来比较，单独添加Vc或NAC，添加Vc和NAC的培养液作为实验组，连续体外传代培养超40天(14代)，获得各组体外扩增后的人脂肪干细胞。

1.2检测方法及结果分析

1.2.1观察各组细胞形态及增殖特性

KI67阳性细胞比例检测方法：

使用4％多聚甲醛固定15min后，0.1％ Triton X-100通透20min，使用封闭液(3％羊血清+0.1％ BSA)封闭1h，使用KI67(1:200)4℃孵育过夜，PBS洗3次之后二抗孵育1h，最后使用DAPI染细胞核后蔡司Imager Z2显微镜下观察并拍照，最后统计着色的细胞比例。

细胞生长曲线检测方法：

消化离心收集细胞后，1mL培养液重悬细胞，使用血小板计数，之后加入培养液稀释细胞密度为10⁵个/ml。取100μl(10⁴个细胞)细胞悬液至24孔板中，每个孔3组重复。每12h对一组孔消化计数，测定细胞数量。最后用GraphPad Prism 9.0.2进行曲线拟定。

流式分析间充质干细胞表面标志物的表达的方法：将细胞消化为单细胞之后，PBS重悬并使用40μm滤网过滤，抗体CD29(1:200)、CD90(1:200)、CD34(1:50)冰上避光染色20min，PBS洗去抗体之后使用BD流式分析仪上机分析。

通过显微镜观察并记录体外培养扩增40天后的细胞形态(图1)，统计细胞数量(图2)、增殖蛋白标记物KI67的染色细胞比例(图3，结果显示低氧、Vc和NAC联合使用显著提高获得的人脂肪干细胞增殖能力)和细胞生长曲线(图4，结果显示低氧、Vc和NAC联合使用显著提高获得的人脂肪干细胞的细胞增殖分裂能力)，以及流式分析间充质干细胞表面标志物的表达(图5，CD34为阴性分子标记，CD29和CD90为阳性分子标记，在持续培养40天后，CD29与CD90在联合处理组别的hASCs均能保持在98％比例以上，CD34保持在0.11％以下，说明所用培养体系能较好维持hASCs的干细胞特性，且长期处理不会影响hASCs的干细胞特性，结果显示所得的人脂肪干细胞保持了较高的间充质干细胞表面分子表达特性)。结合图3-5可知，低氧(5％氧气)培养条件结合L-抗坏血酸-2-磷酸酯镁(Vc)和N-乙酰半胱甘酸(NAC)的联合处理后，细胞增殖能力显著提高，干细胞特性维持较好。

1.2.2检测各组细胞损伤及衰老状况

1.2.2.1通过流式分析细胞ROS水平，步骤如下：

ROS探针染色参考H2DCFDA(HY-D0940，MCE)说明书使用，待各组细胞培养40天并传代50h后，使用PBS稀释的5μm染色液37℃避光染色30min，使用0.25％胰酶消化1min为单细胞悬液后之后，4000rpm离心收集细胞后(避光)，PBS重悬并流式细胞仪进行分析。

结果如图6，结果显示NAC和低氧均可减少胞内ROS水平，并且可以协同发挥作用，而Vc并不能影响胞内的ROS水平。

1.2.2.2检测各组细胞胞内DNA损伤、端粒处损伤以及细胞衰老染色情况

实验过程：

端粒与53bp1的共染：

将细胞使用4％多聚甲醛4℃固定15min后，(1)PBS清洗玻片1次，4％甲醛固定2min，而后用PBS清洗3次，每次2min；(2)70％，95％，100％的乙醇依次脱水3分钟；(3)使用TelC-Cy3 PNAFISH probe(F1002，Bio Faith)端粒探针杂交液进行杂交(杂交液为10mMpH7.2Tris-HCl+70％去离子甲酰胺+2.5mM MgCl₂+0.9mM Citric acid+8.2mM Na₂HPO₄+0.25％Blocking reagent(1096176，Roche)+1.0μg/ml probe)，避光80℃杂交7分钟，杂交完后将载玻片放在湿槽中，37℃再杂交2.5h。(4)使用含70％的甲酰胺、10mM Tris-HCL、0.1％牛血清的清洗液清洗去除没有杂交的探针，在细菌培养摇床中剧烈摇晃清洗2次，每次15min；(5)将玻片放入染色缸中，TBS-Tween 20(0.08％)洗3次，每次5min；(6)再次4％多聚甲醛固定15min，0.1％ Triton X-100通透20min，使用封闭液(3％羊血清+0.1％ BSA)封闭1h，使用53bp1(1:200)室温孵育2h，PBS洗3次之后二抗孵育1h，最后使用DAPI染细胞核后蔡司Imager Z2显微镜下观察并拍照统计。

结果如图7所示，DAPI免疫荧光染色是为了标记细胞核DNA，Telomere染色是为了标记端粒DNA，53bp1是标记发生DNA损伤的位点，图7右上统计图代表各组别每个细胞核中DNA损伤位点的平均数量，指示细胞的整体DNA损伤情况，图7右中代表各组别每个细胞核中端粒DNA损伤位点的平均数量，指示端粒损伤情况；图7右下统计图代表各组别细胞每个细胞核中DNA损伤位点超过10个的细胞比例，指示具有高度DNA损伤的细胞比例。通过检测细胞内DNA损伤标志物53BP1和端粒(Telomere)的免疫荧光染色及共定位统计，可证明低氧(5％氧气)培养条件联合L-抗坏血酸-2-磷酸酯镁(Vc)和N-乙酰半胱甘酸(NAC)的联合处理后，胞内和端粒处DNA损伤均降低(图7)。

体外扩增40天(14代)后细胞的β-半乳糖苷酶染色：

按照细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒说明书(C0602)进行操作，(1)使用β-半乳糖苷酶染色固定液室温固定15min，PBS洗三次，加入染色工作液，37℃孵育过夜，镜下观察及拍照。

图8为体外扩增40天(14代)后细胞的SA-β-Gal染色的光镜图。结果显示低氧条件下联合Vc和NAC，细胞几乎不着色。由此证实低氧条件下联合Vc和NAC处理后，细胞不易衰老。

1.2.3检测各组处理对细胞端粒酶及端粒的影响

检测低氧(5％氧气)培养条件联合L-抗坏血酸-2-磷酸酯镁(Vc)和N-乙酰半胱甘酸(NAC)的联合处理后，对端粒酶及端粒的影响和机制初步探究。

1.2.3.1通过Elisa Kit实验(端粒酶表达检测)证实低氧(5％氧气)培养条件联合L-抗坏血酸-2-磷酸酯镁(Vc)和N-乙酰半胱甘酸(NAC)的联合处理后，端粒酶的表达显著增加(图9，其中WT为野生型ESCs，作为阳性对照；KO为Terc-KO ESCs(端粒酶成分Terc基因纯合敲除的ESCs)，为阴性对照；Heat为热灭活ESCs，作为空白组)。

具体步骤如下：按照人端粒酶(TE)ELISA Kit(CSB-E08021h，科赛博)使用说明进行检测，过程如下：(1)按照说明书部分准备所有试剂、工作标准和样品。(2)确定要使用的孔的数量，将剩余的孔和干燥剂放回袋中并密封，将未使用的孔储存在4℃。(3)每孔加入100μl标准品和样品。用提供的胶带封住。在37℃下孵育2h。(4)每孔加入抗体，37℃孵育1h。(5)吸出每个孔并洗涤，重复该过程两次，共洗涤3次。每个孔用Wash buffer缓冲液(200μl)进行清洗，然后静置2min。最后一次洗涤后，通过吸出或倾析除去任何剩余的Wash buffer。将板倒置并用干净的纸巾吸干。(6)每孔加入100μl HRP-avidin(1x)。用新的胶条盖住微量滴定板。在37℃下孵育1h。(7)重复步骤(5)中的抽吸/洗涤过程五次。(8)每孔加入90μl TMBSubstrate。在37℃下孵育15-30min。避光。(9)每孔加入50μl stop Mix，混合均匀。(10)使用450nm的波长进行校正后，将波长设置为540nm。获取对应读数。

1.2.3.2通过Southernblot实验结果表明低氧(5％氧气)培养条件联合L-抗坏血酸-2-磷酸酯镁(Vc)和N-乙酰半胱甘酸(NAC)的联合处理后，与与常规培养(Normoxia，Ctrl)相比，端粒长度显著延长(图10)。

Southernblot实验步骤如下：主要用试剂盒TeloTAGGG Telomere Length Assaykit(12209136001,Roche Life Science)提供的方法，并进行了一些改动和优化：(1)DNA提取和酶切：通过常规的DNA提取方法，主要是利用DNA抽提液(苯酚：氯仿：异戊醇＝25:24:1)进行DNA提取，使用10U的Hinf I和10U Rsa I对大约2ug的基因组DNA进行酶切，37℃酶切17h；(2)电泳分离：将酶切样品加入到0.8％的琼脂糖凝胶中，电压100V(约50mA)，电泳约2h40min。(3)转膜：电泳完成后使用0.25M HCL脱嘌呤5min，变性液、中和液各30min，中间分别使用ddH₂O洗胶5min；之后ddH₂O洗胶10min，并20X SSC缓冲液浸泡10min，同时尼龙膜ddH₂O浸泡1min，再用20×SSC浸泡10min。最后搭盐桥转膜，在托盘上方依次加入：玻璃板、3层滤纸(盐桥)、胶(反扣)、尼龙膜、3层滤纸(宽度比胶大约4cm)、吸水纸、1kg的重物，在20×SSC溶液中转膜过夜。(4)端粒探针杂交：转膜结束后，将膜正面向上放在一张干净的锡箔纸上，室温晾5min。之后放120℃烘箱烘烤25min，2×SSC中漂洗1min。然后42℃预热好的DIG EasyHyb杂交液(11796895001，Roche)，放42℃杂交炉中预杂交2-3h，然后弃预杂交液，加入10ml杂交液和2μl端粒探针，放42℃杂交炉中杂交过夜。(5)检测：弃杂交液，Wash buffer I(2XSSC+0.1％ SDS)室温洗2次，每次5min，Wash buffer II(0.4X SSC+0.1％ SDS)在50℃洗2次，每次15min，1×Washing buffer洗1次，5min。之后加入1×Blocking solution(11585762001，Roche)，室温孵育30min。弃封闭液再加入新的1×Blocking solution和3μlAP抗体，室温孵育4h。然后用1×Washing buffer洗2次，每次15min；用1×Detectionbuffer平衡5min。最后滴上约20滴Substrate solution。(9)将膜控干，正面向下放在Substrate solution上，反应7min并使用化学发光成像仪拍照。

1.2.3.3.通过中期染色体制备和定量端粒荧光原位杂交实验，证明低氧(5％氧气)培养条件联合L-抗坏血酸-2-磷酸酯镁(Vc)和N-乙酰半胱甘酸(NAC)的联合处理后，与常规培养(Normoxia，Ctrl)相比，染色体核型正常比例(Normal Karyotype)明显提高，端粒丢失比例(Telomere loss per Chromosome)明显降低(图11)。具体步骤如下：

中期染色体制备：(1)将hASCs细胞培养到合适大小的培养皿或孔板中，待培养至48～60h进入对数生长期后进行核型实验；(2)培养液中加入Nocodazole使其工作浓度为0.1μg/ml，于培养箱中孵育5～7h(对于Vc和Vc+NAC组处理5h，Ctrl和NAC组处理7h)；(3)按正常传代方法消化细胞，900rpm转速离心8min后去除上清液，然后加入10ml 0.075M的KCl进行低渗处理，于室温孵育25min；(4)加入几滴在-20℃预冷新鲜配制的预冷的固定液(甲醇：冰醋酸＝3:1)，轻轻的来回颠倒5次，将其完全混匀，然后在室温预固定5min；(5)900rpm离心8min后弃去上清，加入3ml在-20℃预冷的固定液，轻轻吹打混匀细胞后，再补加7ml固定液，于4℃固定20min；(6)900rpm转速离心8min后弃去上清，按照(5)中步骤再固定2～3次；(7)准备预冷的载玻片，将进口的载玻片放置于无水乙醇中浸泡，而后用无尘纸擦净，放置于冰上预冷，待用；(8)将固定的细胞进行重悬后，吸取100μl细胞，将预冷的载玻片平放于冰上，在20cm高度进行滴片(液滴应该延水滴均匀向外扩散，若不干净则液滴分散不均匀)，先滴一滴，待细胞扩散开后可再补一滴；(9)将滴好的片子放置于载玻片夹上自然风干后，统计染色体和后续定量端粒荧光原位杂交试验。

定量端粒荧光原位杂交：(1)PBS清洗玻片1次后4％甲醛固定2min，而后用PBS清洗3次，每次2min；(2)70％，95％，100％的乙醇依次脱水3分钟；(3)使用TelC-Cy3 PNA FISHprobe(F1002，Bio Faith)端粒探针杂交液进行杂交(杂交液为10mM pH 7.2Tris-HCl+70％去离子甲酰胺+2.5mM MgCl₂+0.9mM Citric acid+8.2mM Na₂HPO₄+0.25％ Blockingreagent(1096176，Roche)+1.0μg/ml probe)，避光80℃杂交7分钟，杂交完后将载玻片放在湿槽中,37℃再杂交2.5h。(4)使用含70％的甲酰胺、10mM Tris-HCL、0.1％牛血清的清洗液清洗去除没有杂交的探针，在细菌培养摇床中剧烈摇晃清洗2次，每次15min；(5)将玻片放入染色缸中，TBS-Tween 20(0.08％)洗3次，每次5min,(6)70％，95％，100％的乙醇依次脱水3分钟，脱水后进行风干；(7)将细胞核染色剂DAPI加入到抗淬灭的封片剂中染色封片并用蔡司Imager Z2拍照。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims

1.一种通过调控端粒以稳定扩增脂肪干细胞的方法，其特征在于，采用低氧联合L-抗坏血酸-2-磷酸酯镁和N-乙酰半胱氨酸营养成分的培养条件培养脂肪干细胞，激活脂肪干细胞内端粒酶活力，缓解端粒损伤以及维持脂肪干细胞稳态，以稳定扩增脂肪干细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，缓解端粒损伤包括延长端粒长度和减少端粒丢失。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，维持脂肪干细胞稳态包括减缓细胞衰老、促进细胞增殖以及维持细胞染色体核型正常。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养条件为：在5％氧气浓度下，将脂肪干细胞接种至营养培养基进行体外扩增培养。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述营养培养基以DMEM为基础培养基，向其中添加下述配比组分：

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在培养脂肪干细胞之前，还包括提取脂肪干细胞的步骤。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述提取脂肪干细胞的步骤具体为：用含双抗的磷酸盐缓冲液对脂肪提取物进行清洗，离心后加入Ⅰ型胶原酶混匀，在36-38℃下消化20-60min，消化终止后收集细胞。