CN115745968A

CN115745968A - 4-(4-吲哚基嘧啶-2-基氨基)-n′-亚苄基苯甲酰肼衍生物及制备方法和应用

Info

Publication number: CN115745968A
Application number: CN202211548173.8A
Authority: CN
Inventors: 胡鸿雨; 黄建刚; 倪宇阳; 周新怡; 彭琴玮; 邵玲莉; 曾锦章
Original assignee: Xingzhi College of Zhejiang Normal University
Current assignee: Xingzhi College of Zhejiang Normal University
Priority date: 2022-12-05
Filing date: 2022-12-05
Publication date: 2023-03-07
Anticipated expiration: 2042-12-05
Also published as: CN115745968B

Abstract

本发明提供4‑(4‑吲哚基嘧啶‑2‑基氨基)‑N'‑亚苄基苯甲酰肼衍生物及制备方法和应用，该类衍生物的制备方法包括以下步骤：步骤一，3‑二甲基氨基‑1H‑吲哚‑3‑丙酮的制备；步骤二，4‑(4‑(1H‑吲哚‑3‑基)嘧啶‑2‑基氨基)苯甲酸乙酯的制备；步骤三，4‑(4‑(1H‑吲哚‑3‑基)嘧啶‑2‑基氨基)苯甲酰肼的制备；步骤四，4‑(4‑(1H‑吲哚‑3‑基)嘧啶‑2‑基氨基)‑N'‑亚苄基苯甲酰肼衍生物的制备。该衍生物反应成本低，产率高，适用于工业化生产。本发明制备的该类衍生物显著抑制了胃癌细胞MKN‑45和NCI‑N87的生长和增殖能力，能够以浓度依赖的方式抑制Nur77的表达。

Description

4-(4-吲哚基嘧啶-2-基氨基)-N′-亚苄基苯甲酰肼衍生物及制备方法和应用

技术领域

本发明涉及化学医药领域，具体涉及4-(4-吲哚基嘧啶-2-基氨基)-N′-亚苄基苯甲酰肼衍生物及制备方法和应用。

背景技术

胃癌，是一种分子和表型高度异质性的疾病，也是全球第五大常见癌症和第三大常见癌

症死亡原因，其致病风险因素主要包括幽门螺杆菌感染、年龄、高盐摄入量以及较低的水果蔬菜摄入量等。早期胃癌的主要治疗方法是内镜切除，晚期胃癌采用序贯化疗方案进行治疗，然而现有化疗药物或多或少都存在着特异性差、毒副作用大等问题，从而使胃癌化疗的应用受到了极大的限制。因此，迫切需要开发一些新型的胃癌靶向治疗药物。

孤儿核受体(Nur77)，作为立早基因NR4A1编码的产物，能够被各种刺激如血清、生长因子、促凋亡药物、化疗等诱导，起到调控细胞生长、自噬、代谢、死亡的作用。研究表明，Nur77的表达水平在不同肿瘤中存在差异，在包括结肠癌、胃癌、黑色素瘤组织中高表达，而在肝癌、乳腺癌组织中却低表达。根据统计数据表明，Nur77的表达水平与胃癌的发生发展存在密切的联系，这可能与某些药物通过Nur77靶点的介导起作用相关。因此，通过设计制备小分子调控Nur77表达是胃癌的潜在治疗方法。

此前已公开了与调控Nur77表达的相关的化合物有酰肼类化合物、吲哚类化合物等，但是毒副作用大。其中，吲哚类化合物是一类具有广泛生理活性的含氮杂环化合物，广泛应用在医药领域，具有包括杀菌、抗肿瘤、抗病毒、消炎及增强机体免疫等多种作用；酰肼类化合物具有如抗病毒、抗肿瘤、抗炎等广泛的生物活性。本发明旨在通过将不同生物活性分子中的药效基团结合，开发出一种具有潜在的高活性、低毒性和多重作用机理的杂合分子，用以制备具有一定的抗胃癌活性的抗胃癌药物，并为该类化合物的构效关系提供研究基础。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供4-(4-(1H-吲哚-3-基)嘧啶-2-基氨基)-N′-亚苄基苯甲酰肼衍生物及制备方法和应用。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下。

4-(4-吲哚基嘧啶-2-基氨基)-N′-亚苄基苯甲酰肼衍生物，其结构通式如下式(I)所示：

其中，R选自氢、卤素、甲基、甲氧基中的任意一种。

进一步，具体为如下化合物中的一种：

本发明还提供4-(4-吲哚基嘧啶-2-基氨基)-N′-亚苄基苯甲酰肼衍生物的制备方法，包括以下步骤：

步骤一，3-二甲基氨基-1H-吲哚-3-丙酮的制备

将三乙酰吲哚和N,N-二甲基甲酰胺二甲缩醛进行回流反应，制备得到3-二甲基氨基-1H-吲哚-3-丙酮；

步骤二，4-(4-(1H-吲哚-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯甲酸乙酯的制备

将对氨基苯甲酸乙酯、氰胺和乙醇混合后，在搅拌下加入浓盐酸，回流反应，反应结束后，浓缩去除溶剂，加入水，在冰水浴下加入硝酸铵水溶液，继续搅拌直至析出固体，过滤，得到中间体A；

将中间体A溶于乙醇中，加入3-二甲基氨基-1H-吲哚-3-丙酮，在搅拌下加入氢氧化钠乙醇溶液，回流反应，反应结束后，析出固体，过滤，得到4-(4-(1H-吲哚-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯甲酸乙酯；

步骤三，4-(4-(1H-吲哚-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯甲酰肼的制备

将4-(4-(1H-吲哚-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯甲酸乙酯、水合肼和乙醇进行回流反应，制备得到4-(4-(1H-吲哚-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯甲酰肼；

步骤四，4-(4-(1H-吲哚-3-基)嘧啶-2-基氨基)-N′-亚苄基苯甲酰肼衍生物的制备

将4-(4-(1H-吲哚-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯甲酰、取代苯甲醛和乙醇进行回流反应，制备得到4-(4-(1H-吲哚-3-基)嘧啶-2-基氨基)-N′-亚苄基苯甲酰肼衍生物；所述取代苯甲醛中的取代基选自氢、卤素、甲基、甲氧基中的任意一种。

进一步，步骤一中，三乙酰吲哚与N,N-二甲基甲酰胺二甲缩醛的摩尔比为1：2～3。

进一步，步骤二中，对氨基苯甲酸乙酯与氰胺的摩尔比为1：2～4；

对氨基苯甲酸乙酯与3-二甲基氨基-1H-吲哚-3-丙酮的摩尔比为1：1.0～1.1。

进一步，步骤二中，氢氧化钠乙醇溶液的质量百分浓度为10％。

进一步，步骤三中，4-(4-(1H-吲哚-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯甲酸乙酯与水合肼的用量比为3.5g：6.5～10mL。

进一步，步骤四中，4-(4-(1H-吲哚-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯甲酰与取代苯甲醛的摩尔比为1：1.0～1.1。

本发明还提供4-(4-吲哚基嘧啶-2-基氨基)-N′-亚苄基苯甲酰肼衍生物在制备治疗胃癌的药物中的应用。

进一步，所述4-(4-吲哚基嘧啶-2-基氨基)-N′-亚苄基苯甲酰肼衍生物在制备抑制胃癌细胞生长的药物中的应用，所述胃癌细胞包括MKN-45和NCI-N87。

本发明的有益效果：

1、本发明设计制备了4-(4-(1H-吲哚-3-基)嘧啶-2-基氨基)-N′-亚苄基苯甲酰肼衍生物，该衍生物反应成本低，产率高，反应过程简单易控制，适用于工业化生产。

2、本发明制备的该类衍生物具有一定的抗胃癌活性，在正常胃上皮细胞GES-1中毒性较小，并且显著的抑制了胃癌细胞MKN-45和NCI-N87的生长，可用于制备抗胃癌药物和研究该类化合物的构效关系。

3、本发明制备的该类衍生物能够明显抑制胃癌细胞MKN-45和NCI-N87的增殖能力，且能够以浓度依赖的方式抑制Nur77的表达。

附图说明

图1为采用实施例5制备的化合物H2和DMSO处理的MKN-45和NCI-N87细胞的照片。其中，Ctrl为空白对照组；H2为药物处理组。

图2是用不同浓度的H2处理MKN-45细胞对Nur77蛋白表达的影响结果。其中，Nur77代表H2处理对Nur77表达的影响；β-Actin代表H2处理对β-Actin表达的影响。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下述各实施例中，浓盐酸的质量浓度为36％～38％。

下述各实施例中所述实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可在市场上购买得到。

实施例1

3-二甲基氨基-1H-吲哚-3-丙酮的制备：

取50mL的圆底烧瓶，依次加入三乙酰吲哚4.78g(0.02mol)和N,N-二甲基甲酰胺二甲缩醛12.39mL(0.04mol)，搅拌加热升温至90℃回流，保温反应8h，TLC跟踪检测。反应完成后，冷却至室温，进行抽滤，后烘干可得到黄色固体5.21g。收率：81.13％。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)：δ11.61(brs.,1H),8.28(d,J＝7.5Hz,1H),8.15(d,J＝2.8Hz,1H),7.53(d,J＝12.4Hz,1H),7.40(d,J＝7.8Hz,1H),7.16-7.13(m,1H),7.11(dd,J＝1.4,3.5Hz,1H),7.10-7.07(m,1H),5.78(d,J＝12.5Hz,1H),2.98(brs,5H),3.13-2.81(m,1H).

实施例2

4-(4-(1H-吲哚-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯甲酸乙酯的制备：

在干燥的100mL反应瓶中，室温下依次加入乙醇50mL，对氨基苯甲酸乙酯(1.37g,8.3mmoL)，氰胺(0.8g,18.9mmoL)，在磁力搅拌状态下滴加浓盐酸(1.05mL，12.5mmoL)，滴加结束后升温至回流再反应24h。薄层色谱法监测反应结束，停止反应。反应液冷却后减压浓缩除去乙醇后再加入水，在0℃滴加硝酸铵(1.32g，16.5mmoL)水溶液，滴加结束后在0℃磁力搅拌反应1h，析出白色固体2，过滤，适量乙醚洗涤滤饼2次，滤饼在50℃鼓风干燥箱中干燥12h，得到中间体A。

将中间体A溶解在乙醇中，再加入3-二甲基氨基-1H-吲哚-3-丙酮(1.77g，8.3mmoL)，在磁力搅拌状态下滴加10％氢氧化钠-乙醇溶液(0.80g，10.0mmoL)，滴加结束后升温至回流状态反应48h。薄层色谱法监测反应结束，停止反应。冷却后析出4-(4-(1H-吲哚-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯甲酸乙酯1.79g，收率70.8％,mp 189.7～190.8℃。

¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆)：δ11.86(brs,1H),9.90(s,1H),8.63(d,J＝8.0Hz,1H),8.42(d,J＝5.5Hz,1H),8.37(d,J＝2.9Hz,1H),8.03(d,J＝8.8Hz,2H),7.93(d,J＝8.8Hz,2H),7.51(d,J＝8.0Hz,1H),7.39(d,J＝5.5Hz,1H),7.27-7.15(m,2H),4.29(q,J＝7.2Hz,2H),1.32(t,J＝6.9Hz,3H).

¹³C NMR(150MHz,DMSO-d₆):δ166.1,163.2,160.0,157.2,146.1,137.7,130.6,129.8,125.6,122.7,122.6,122.1,121.1,118.2,113.8,112.6,108.9,60.6,14.8；HRMS(+):calcd for C₂₁H₁₉N₄O₂[M+H]⁺359.1503,found 359.1525.实施例3

4-(4-(1H-吲哚-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯甲酰肼的制备：

在25mL圆底烧瓶内，分别加入4-(4-(1H-吲哚-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯甲酸乙酯3.58g(10mmol)，6.49ml水合肼和20ml乙醇，搅拌加热升温至80℃回流，保温反应9h，TLC跟踪监测。反应后完全后停止反应，待冷却到室温，加入2ml无水乙醇，有沉淀析出，抽滤烘干可以得到淡黄色固体2.74g，收率：79％。

¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆):δ11.85(brs,1H),9.72(s,1H),9.65(s,1H),8.63(d,J＝7.7Hz,1H),8.39(d,J＝5.5Hz,1H),8.35(s,1H),7.95(d,J＝8.8Hz,2H),7.83(d,J＝8.8Hz,2H),7.50(d,J＝7.7Hz,1H),7.35(d,J＝5.1Hz,1H),7.26-7.15(m,2H),4.47(brs,2H).¹³CNMR(150MHz,DMSO-d₆):δ

166.4,163.1,160.2,157.2,144.1,137.6,129.7,128.1,125.8,125.6,122.7,122.6,121.1,118.2,113.9,112.5,108.6；HRMS(+):calcd for C₁₉H₁₇N₆O[M+H]⁺

345.1458,found 345.1456.

实施例4

4-(4-(1H-吲哚-3-基)嘧啶-2-基氨基)-N′-亚苄基苯甲酰肼的制备(H1)：

在干燥的反应瓶中，先依次加入苯甲醛(0.106g,0.001mol)、4-(4-(1H-吲哚-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯甲酰肼(0.266g,0.001mol)、乙醇(10ml)，再在搅拌状态升温至回流反应。TLC检测反应已完全，停止反应。过滤，乙醇洗涤滤饼，烘干得1-(2-(1H-吲哚-3-基)-6-甲基烟酰基)-4-苯基氨基脲0.32g，收率74％。

¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆)：δ12.02(brs,1H),11.81(brs,1H),10.09(brs,1H),8.59(d,J＝7.7Hz,1H),8.50(brs,1H),8.46(d,J＝2.5Hz,1H),8.40(d,J＝5.8Hz,1H),7.99(s,4H),7.75(d,J＝6.6Hz,2H),7.52(d,J＝7.7Hz,1H),7.49-7.44(m,2H),7.43(d,J＝5.5Hz,1H),7.45-7.41(m,1H),

7.28-7.15(m,2H).

¹³C NMR(150MHz,DMSO-d₆)：δ164.2,163.2,159.2,159.0,147.6,144.0,137.7,134.9,131.0,130.4,129.3,129.0,127.5,126.5,125.6,123.0,122.6,121.5,119.1,113.8,112.7,108.5；HRMS(+):calcd for C₂₆H₂₁N₆O[M+H]⁺:433.1771,found:433.1771.

实施例5

4-(4-(1H-吲哚-3-基)嘧啶-2-基氨基)-N′-(3-氯亚苄基)苯甲酰肼的制备(H2)：

在干燥的反应瓶中，先依次加入对间氯苯甲醛(0.14g,0.001mol)、4-(4-(1H-吲哚-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯甲酰肼(0.266g,0.001mol)、乙醇(10ml)，再在搅拌状态升温至回流反应。TLC检测反应已完全，停止反应。过滤，乙醇洗涤滤饼，烘干得4-(4-(1H-吲哚-3-基)嘧啶-2-基氨基)-N′-(3-氯亚苄基)苯甲酰肼0.35g，收率75％。

¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆)：δ12.07(brs,1H),11.95(brs,1H),10.19(brs,1H),8.56(d,J＝7.9Hz,1H),8.49(d,J＝2.7Hz,1H),8.47(brs,1H),8.39(d,J＝5.6Hz,1H),8.01-7.95(m,4H),7.81(brs,1H),7.70(brs,1H),7.52(d,J＝8.0Hz,1H),7.49(d,J＝3.4Hz,2H),7.45(d,J＝5.6Hz,1H),7.27-7.22(m,1H),7.22-7.16(m,1H).

¹³C NMR(150MHz,DMSO-d₆)：δ163.3,159.2,158.9,158.2,148.9,145.9,137.8,137.2,134.1,131.5,131.2,130.0,129.0,126.6,126.2,125.5,123.0,122.6,121.6,119.4,117.0,115.1,113.8,112.7,108.5；HRMS(+):calcd for C₂₆H₂₀ClN₆O[M+H]⁺:467.1382,found:467.1380.

实施例6

4-(4-(1H-吲哚-3-基)嘧啶-2-氨基)-N′-(3-甲基亚苄基)苯甲酰肼的制备(H3)：

在干燥的反应瓶中，先依次加入对3-甲基苯甲醛(0.120g,0.001mol)、4-(4-(1H-吲哚-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯甲酰肼(0.266g,0.001mol)、乙醇(10ml)，再在搅拌状态升温至回流反应。TLC检测反应已完全，停止反应。过滤，乙醇洗涤滤饼，烘干得4-(4-(1H-吲哚-3-基)嘧啶-2-氨基)-N′-(3-甲基亚苄基)苯甲酰肼0.32g,收率83％。

¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆)：δ12.09(brs,1H),11.81(brs,1H),10.21(brs,1H),8.56(d,J＝7.7Hz,1H),8.50(d,J＝2.20Hz,1H),8.46(brs,1H),8.39(d,J＝5.8Hz,1H),8.02-7.94(m,4H),7.58(brs,1H),7.52(d,J＝7.7Hz,2H),7.45(d,J＝5.8Hz,1H),7.35(t,J＝7.3Hz,1H),7.26-7.23(m,2H),7.22-7.17(m,1H),2.36(s,3H).

¹³C NMR(151MHz,DMSO-d₆)：δ164.6,163.2,159.2,159.0,147.8,143.6,138.5,137.8,134.9,131.6,131.1,129.2,129.0,127.7,126.9,125.5,125.0,123.1,122.6,119.5,115.1,113.8,112.8,108.4,21.4；HRMS(+):calcd for C₂₇H₂₃N₆O[M+H]⁺:447.1928,found:447.1929.

一、细胞毒性测试

利用MTT法对化合物进行体外肿瘤细胞毒性和正常细胞毒性测试。

将实施例4～6制备的化合物编号为H1、H2、H3，并对各化合物分别设置0.39μM、0.78μM、1.56μM、3.12μM、6.25μM、12.5μM、25μM和50μM共8个浓度；用不同浓度化合物处理GES-1、MKN-45和NCI-N87细胞48小时，测定其OD值并计算IC50值。结果见表1。

表1MTT法对化合物细胞毒性筛选(μM)

如表1结果显示，化合物4-(4-(1H-吲哚-3-基)嘧啶-2-基氨基)-N′-亚苄基苯甲酰肼(H1)、4-(4-(1H-吲哚-3-基)嘧啶-2-基氨基)-N′-(3-氯亚苄基)苯甲酰肼(H2)和4-(4-(1H-吲哚-3-基)嘧啶-2-氨基)-N′-(3-甲基亚苄基)苯甲酰肼(H3)对胃癌细胞MKN-45和NCI-N87都有很好的抑制作用。特别是H2在正常胃上皮细胞GES-1中毒性较小，并且显著的抑制了胃癌细胞MKN-45和NCI-N87的生长，如表1所示。

二、抗增殖能力检测

基于化合物H1、H2、H3对癌细胞MKN-45和NCI-N87都有很好的抑制作用，因此，下面仅以化合物H2为例，采用克隆形成法对毒性较小且能够很好的抑制胃癌细胞生长的化合物H2进行抗增殖能力检测。

用2μM浓度的H2分别处理MKN-45和NCI-N87细胞，每2天换液1次，处理10天后，收样并吸弃培养基，用结晶紫染色并拍照。以DMSO处理的MKN-45和NCI-N87细胞作为空白对照，标记为Ctrl。结果见图1。

图1是采用H2和DMSO处理的MKN-45和NCI-N87细胞的照片。其中，Ctrl为空白对照组；H2为药物处理组。

由图1结果表明，H2能够明显抑制胃癌细胞MKN-45和NCI-N87的增殖能力。

三、用Western blotting方法研究化合物H2对Nur77表达的调控作用。

基于化合物H1、H2、H3对癌细胞MKN-45和NCI-N87都有很好的抑制作用，因此，下面仅以对胃癌细胞的显著抑制作用的化合物H2为例，采用Western blotting方法研究化合物H2对Nur77表达的调控作用。

用不同浓度的H2处理MKN-45细胞，药物浓度分别是0.5μM，1μM和2μM，3小时后收样并用Western blotting检测Nur77蛋白表达，GAPDH为内参。结果见图2。

由图2结果表明，与对照组相比，化合物H2能够以浓度依赖的方式抑制Nur77的表达。

以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.4-(4-吲哚基嘧啶-2-基氨基)-N'-亚苄基苯甲酰肼衍生物，其特征在于，其结构通式如下式(I)所示：

其中，R选自氢、卤素、甲基、甲氧基中的任意一种。

2.根据权利要求1所述的4-(4-吲哚基嘧啶-2-基氨基)-N'-亚苄基苯甲酰肼衍生物，其特征在于，具体为如下化合物中的一种：

3.权利要求1所述的4-(4-吲哚基嘧啶-2-基氨基)-N'-亚苄基苯甲酰肼衍生物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一，3-二甲基氨基-1H-吲哚-3-丙酮的制备

步骤二，4-(4-(1H-吲哚-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯甲酸乙酯的制备

将对氨基苯甲酸乙酯、氰胺和乙醇混合后，在搅拌下加入催化剂浓盐酸，回流反应，反应结束后，浓缩去除溶剂，加入水，在冰水浴下加入硝酸铵水溶液，继续搅拌直至析出固体，过滤，得到中间体A；

将中间体A溶于乙醇中，加入3-二甲基氨基-1H-吲哚-3-丙酮，在搅拌下加入催化剂氢氧化钠乙醇溶液，回流反应，反应结束后，析出固体，过滤，得到4-(4-(1H-吲哚-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯甲酸乙酯；

步骤三，4-(4-(1H-吲哚-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯甲酰肼的制备

步骤四，4-(4-(1H-吲哚-3-基)嘧啶-2-基氨基)-N'-亚苄基苯甲酰肼衍生物的制备

将4-(4-(1H-吲哚-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯甲酰肼、取代苯甲醛和乙醇进行回流反应，制备得到4-(4-(1H-吲哚-3-基)嘧啶-2-基氨基)-N'-亚苄基苯甲酰肼衍生物；所述取代苯甲醛中的取代基选自氢、卤素、甲基、甲氧基中的任意一种。

4.根据权利要求3所述的4-(4-吲哚基嘧啶-2-基氨基)-N'-亚苄基苯甲酰肼衍生物的制备方法，其特征在于，步骤一中，三乙酰吲哚与N,N-二甲基甲酰胺二甲缩醛的摩尔比为1：2～3。

5.根据权利要求3所述的4-(4-吲哚基嘧啶-2-基氨基)-N'-亚苄基苯甲酰肼衍生物的制备方法，其特征在于，步骤二中，对氨基苯甲酸乙酯与氰胺的摩尔比为1：2～4；

对氨基苯甲酸乙酯与3-二甲基氨基-1H-吲哚-3-丙酮的摩尔比1：1.0～1.1。

6.根据权利要求3所述的4-(4-吲哚基嘧啶-2-基氨基)-N'-亚苄基苯甲酰肼衍生物的制备方法，其特征在于，步骤二中，氢氧化钠乙醇溶液的质量百分浓度为10％。

7.根据权利要求3所述的4-(4-吲哚基嘧啶-2-基氨基)-N'-亚苄基苯甲酰肼衍生物的制备方法，其特征在于，步骤三中，4-(4-(1H-吲哚-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯甲酸乙酯与水合肼的用量比为3.5g：6.5～10mL。

8.根据权利要求3所述的4-(4-吲哚基嘧啶-2-基氨基)-N'-亚苄基苯甲酰肼衍生物的制备方法，其特征在于，步骤四中，4-(4-(1H-吲哚-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯甲酰肼与取代苯甲醛的摩尔比为1：1.0～1.1。

9.权利要求1所述的4-(4-吲哚基嘧啶-2-基氨基)-N'-亚苄基苯甲酰肼衍生物在制备治疗胃癌的药物中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述4-(4-吲哚基嘧啶-2-基氨基)-N'-亚苄基苯甲酰肼衍生物在制备抑制胃癌细胞生长的药物中的应用，所述胃癌细胞包括MKN-45和NCI-N87。