CN115745888B - 用于检测硫氮酸的萘酰亚胺衍生物荧光探针分子及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于化学检测领域，涉及硫氮酸（HSNO）检测试剂，特别是指基于萘酰亚胺衍生物的用于硫氮酸检测的荧光分子及其制备方法和应用。该制备方法合成路线短，提纯方法简单。本发明提供的荧光探针（P1）本身在PBS溶液体系中具有微弱的荧光，当与HSNO发生特异性反应后，生成具有强烈荧光的产物。探针P1能够对HSNO实现专一性识别，抗干扰性强，灵敏度高，最低检出限为0.36μM。探针识别HSNO后荧光发射波长在可见光区内、斯托克斯位移大（130 nm）使得荧光探针P1具有背景干扰低、对生物样品的光损伤小、样品穿透性强的优点，在生理和病理微环境下探测HSNO具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于化学检测领域，涉及硫氮酸（HSNO）检测试剂，特别是指基于萘酰亚胺衍生物的用于硫氮酸检测的荧光分子及其制备方法和应用。
背景技术
作为两种重要的内源性信号分子，一氧化氮(nitricoxide, NO)和硫化氢(hydrogen sulfide, H2S)在生物体内发挥着重要的病理生理作用。NO和H2S同时存在于生物体的循环、呼吸、中枢、生殖等系统，还同样具有舒张血管等类似的生理作用，而且他们二者之间存在着一定的联系并且可以相互转化，共同发挥生理作用，调节着生命体的各个生理病理过程。H2S和NO经过交互作用（cross-talk）生成的HSNO，可调控酶的活性以及蛋白与蛋白之间的相互作用，从而影响蛋白质的生理功能。
HSNO被认为是一种生物体内连接NO和H2S的重要生物活性分子，可以代谢生成NO+、NO、NO-和多硫化氢等具有显著生理作用的活性氮和活性硫。它的形成是体内NO新陈代谢的一部分，并表现出许多类似NO的生理性质，例如： 抑制血小板聚集、扩张血管、平滑肌细胞增殖等。生物体内HSNO含量水平的失衡常与一些疾病的产生密切相关。例如，HSNO可以作为调节血管张力的分子开关，其含量水平的高低易诱发心血管疾病；HSNO含量的失衡与帕金森氏症的产生密切相关。因此，生物体内HSNO的实时检测研究对研究NO和H2S协同作用机制，揭示与NO、H2S等活性小分子相关重大疾病的发病机制具有重要科学意义。目前常见的对HSNO进行检测的方法是紫外-可见分光光度计法，但是该方法在实际检测过程中也受到诸多限制。首先，由于HSNO本身的不稳定性（ΔH ≥10 kcal/mol），导致该方法对HSNO的检测缺乏可靠性；其次，该方法需要生物体外检测，操作需要破坏细胞，无法实现细胞体内HSNO的实时、原位动态检测。因此，开发用于活细胞体内HSNO的实时、原位、动态检测的高效检测方法是十分必要的。
近年来发展起来的有机荧光分子传感技术，因其高灵敏性、高选择性、无需分离、易于观测等优点而被应用于生物体内各种活性小分子的实时原位检测，成为了一个热门的研究领域。荧光探针具有选择性好、灵敏度高、操作简便快速、对检测物损伤少等优点已被广泛应用于检测环境和生物体系中的金属阳离子、阴离子、生物体内活性小分子等方面。荧光探针分子的开发与利用研究是化学与生物、医学、农业等科学的交叉领域。
如果能够运用荧光探针技术和共聚焦成像技术选择性的研究细胞内HSNO的分布和浓度变化，将会极大地推动与HSNO信号转导相关的研究，也有利于更深层次的认识与揭示HSNO在生物体内的具体作用机制，更有利于研究NO和H2S信号转导以及促进相关疾病的诊断与治疗。
发明内容
本发明提出一种基于萘酰亚胺衍生物的用于硫氮酸检测的荧光分子及其制备方法和应用，合成的荧光探针能够灵敏快速的从多种活性小分子物质中高效专一识别硫氮酸（HSNO）。
本发明的技术方案是这样实现的：
一种用于检测硫氮酸（HSNO）的萘酰亚胺衍生物荧光探针，其结构式如下：
。
上述的用于检测硫氮酸（HSNO）的萘酰亚胺衍生物荧光探针分子的制备方法的合成路线为：
。
本发明中制备荧光探针P1的过程中所使用的化学试剂、溶剂、活性小分子等均购自阿拉丁试剂有限公司和阿达玛斯试剂有限公司。在荧光探针P1的化学结构确证和分析性能测试过程采用Bruke公司DTX-400型核磁共振谱仪，溶剂为氘代氯仿，以四甲基硅烷（TMS）为内标记录核磁共振氢谱和碳谱。采用美国Thermo公司的Q-Exactive HR-MS质谱仪记录高分辨质谱数据。采用日本日立公司F-7000荧光光谱仪记录荧光光谱。
上述萘酰亚胺衍生物荧光探针分子的制备方法，具体步骤为：
（1）搅拌条件下，将叠氮化钠的水溶液滴加入4-溴-1,8-萘酸酐的DMF悬浊液中，滴加完毕后室温条件下搅拌反应一段时间A，将反应液倒入冰水中，有黄色固体沉淀生成，抽滤，干燥，粗产物用柱层析纯化得到中间体4-叠氮-1,8-萘酸酐。
（2）将4-叠氮-1,8-萘酸酐和4-氨基-N-甲基苯胺溶解于乙酸溶液中，加热回流反应一段时间B，冷却至室温。反应液中倒入水中，抽滤，干燥，粗产物用柱层析纯化得到棕黄色固体产物即为用于硫氮酸（HSNO）检测的荧光探针P1。
进一步的，所述步骤（1）中，叠氮化钠和4-溴-1,8-萘酸酐的摩尔比为（1.5-6）：1，反应时间A为4-10小时。
进一步的，所述步骤（1）中，柱层析分离采用的洗脱液为乙酸乙酯和石油醚按体积比1：（4-10），中间体4-叠氮-1,8-萘酸酐产率为45%-85%。
进一步的，所述步骤（2）中，4-叠氮-1,8-萘酸酐和4-氨基-N-甲基苯胺的摩尔比为1：（1-8），反应时间B为8-24小时。
进一步的，所述步骤（2）中，柱层析分离采用的洗脱液为甲醇和二氯甲烷按体积比1：（30-60），所得荧光探针P1产率为30%-60%。
进一步的，所述的用于硫氮酸（HSNO）检测的荧光探针的应用，作为特异地、高灵敏识别生物体系中硫氮酸（HSNO）的应用。
本发明具有以下有益效果：
（1）本发明的荧光探针结构新颖，合成方法简单且易分离提纯，能够对HSNO实现专一性识别，克服常见活性小分子的干扰，还能够对HSNO实现高灵敏性识别，最低检出限为0.36 μM。
（2）本发明的荧光探针P1识别HSNO的机理如下式所示：
本发明所选用的荧光团萘酰亚胺衍生物分子结构具有较大的共轭体系，分子结构中存在着一个大的吸-供电子共轭体系，易受到光的照射而发生跃迁。单独探针P1结构中，通过激活邻苯二胺的光诱导电子转移（PET）和阻断叠氮化物基团的内部电荷转移（ICT），探针P1荧光可以完全淬灭。因此，单独探针P1显示出非常低的背景荧光。在HSNO存在下，吸电子的叠氮化物基团将快速转移到给电子胺上，从而消除探针的ICT阻挡。同时，探针结构中P1的仲氨将转化为N-亚硝基，从而消除PET的荧光猝灭效应，所得最终产物显示出强烈的荧光。
（3）本发明的探针识别HSNO后荧光发射波长在可见光区内、斯托克斯位移大（130nm）使得荧光探针P1具有背景干扰低、对生物样品的光损伤小、样品穿透性强、检测灵敏度高等诸多优点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明的荧光探针P1核磁共振氢谱图。
图2为本发明的荧光探针P1核磁共振碳谱图。
图3为本发明的荧光探针P1高分辨质谱图。
图4为本发明的荧光探针P1的荧光选择性图，激发波长410 nm。
图5为本发明的荧光探针P1识别HSNO的抗干扰性图，激发波长410 nm，发射波长540 nm。
图6为本发明的荧光探针P1识别HSNO的荧光滴定图，激发波长410 nm。
图7为本发明的荧光探针P1识别HSNO的最低检出限图，激发波长410 nm，发射波长540 nm。
图8为本发明的荧光探针P1识别HSNO和Na2S的动力学曲线图，激发波长410 nm，发射波长540 nm。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种用于检测硫氮酸（HSNO）的萘酰亚胺衍生物荧光探针分子的制备方法，具体步骤为：
（1）中间体4-叠氮-1,8-萘酸酐的制备
室温搅拌条件下，将叠氮化钠（97.35 mg，1.5 mmol）的水溶液（10 mL）滴加入4-溴-1,8-萘酸酐（275.9 mg，1 mmol）的DMF（25 mL）悬浊液中，滴加完毕后室温条件下搅拌反应4小时，将反应液倒入冰水中，有黄色固体沉淀生成，抽滤，干燥，粗产物用柱层析（乙酸乙酯：石油醚=1:4）纯化得到中间体4-叠氮-1,8-萘酸酐107.5 mg，产率45%。
（2）探针P1的制备
将4-叠氮-1,8-萘酸酐（239 mg，1 mmol）和4-氨基-N-甲基苯胺（122.2 mg，1mmol）溶解于乙酸（20 mL）溶液中，加热回流反应8小时，冷却至室温。反应液中倒入水中，抽滤，干燥，粗产物用柱层析（甲醇：二氯甲烷=1:30）纯化得到棕黄色固体产物（102.9 mg）即为用于硫氮酸（HSNO）检测的荧光探针P1，产率30%。
核磁共振氢谱测定：1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 2.91 (s, 3 H), 6.76 (q,J=2.7 Hz, 2 H), 7.13 (q,J= 2.7 Hz, 2 H), 7.51 (d,J= 8.0 Hz, 1 H), 7.79 (q,J=5.3 Hz, 1 H), 8.50 (q,J= 4.0 Hz, 1 H), 8.65 (d,J= 8.0 Hz, 1 H), 8.70 (q,J=2.7 Hz, 1 H)。
核磁共振碳谱测定：13C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ 30.7, 112.8, 114.7, 119.3,123.0,124.4, 124.5, 126.9, 128.9, 129.1, 129.5, 132.0, 132.5, 143.5, 149.4,164.1, 164.6。核磁共振氢谱图如图1所示，核磁共振碳谱图如图2所示。
高分辨质谱测定：HR-ESI-MS calcd for C19H14N5O2 +: 344.1147, found344.1140 [M+H+]+。高分辨质谱图如图3所示。
实施例2
一种用于检测硫氮酸（HSNO）的萘酰亚胺衍生物荧光探针分子的制备方法，具体步骤为：
（1）中间体4-叠氮-1,8-萘酸酐的制备
室温搅拌条件下，将叠氮化钠（194.7 mg，3 mmol）的水溶液（10 mL）滴加入4-溴-1,8-萘酸酐（275.9 mg，1 mmol）的DMF（25 mL）悬浊液中，滴加完毕后室温条件下搅拌反应6小时，将反应液倒入冰水中，有黄色固体沉淀生成，抽滤，干燥，粗产物用柱层析（乙酸乙酯：石油醚=1:6）纯化得到中间体4-叠氮-1,8-萘酸酐131.45 mg，产率55%。
（2）探针P1的制备
将4-叠氮-1,8-萘酸酐（239 mg，1 mmol）和4-氨基-N-甲基苯胺（244.4 mg，2mmol）溶解于乙酸（20 mL）溶液中，加热回流反应10小时，冷却至室温。反应液中倒入水中，抽滤，干燥，粗产物用柱层析（甲醇：二氯甲烷=1:35）纯化得到棕黄色固体产物（137.2 mg）即为用于硫氮酸（HSNO）检测的荧光探针P1，产率40%。
核磁共振氢谱测定：1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 2.91 (s, 3 H), 6.76 (q,J=2.7 Hz, 2 H), 7.13 (q,J= 2.7 Hz, 2 H), 7.51 (d,J= 8.0 Hz, 1 H), 7.79 (q,J=5.3 Hz, 1 H), 8.50 (q,J= 4.0 Hz, 1 H), 8.65 (d,J= 8.0 Hz, 1 H), 8.70 (q,J=2.7 Hz, 1 H)。
核磁共振碳谱测定：13C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ 30.7, 112.8, 114.7, 119.3,123.0, 124.4,124.5, 126.9, 128.9, 129.1, 129.5, 132.0, 132.5, 143.5, 149.4,164.1, 164.6。核磁共振氢谱图如图1所示，核磁共振碳谱图如图2所示。
高分辨质谱测定：HR-ESI-MS calcd for C19H14N5O2 +: 344.1147, found344.1140 [M+H+]+。高分辨质谱图如图3所示。
实施例3
一种用于检测硫氮酸（HSNO）的萘酰亚胺衍生物荧光探针分子的制备方法，具体步骤为：
（1）中间体4-叠氮-1,8-萘酸酐的制备
室温搅拌条件下，将叠氮化钠（129.8 mg，4 mmol）的水溶液（10 mL）滴加入4-溴-1,8-萘酸酐（275.9 mg，1 mmol）的DMF（25 mL）悬浊液中，滴加完毕后室温条件下搅拌反应8小时，将反应液倒入冰水中，有黄色固体沉淀生成，抽滤，干燥，粗产物用柱层析（乙酸乙酯：石油醚=1:5）纯化得到中间体4-叠氮-1,8-萘酸酐155.3 mg，产率65%。
（2）探针P1的制备
将4-叠氮-1,8-萘酸酐（239 mg，1 mmol）和4-氨基-N-甲基苯胺（366.6 mg，3mmol）溶解于乙酸（20 mL）溶液中，加热回流反应15小时，冷却至室温。反应液中倒入水中，抽滤，干燥，粗产物用柱层析（甲醇：二氯甲烷=1:35）纯化得到棕黄色固体产物（154.35 mg）即为用于硫氮酸（HSNO）检测的荧光探针P1，产率45%。
核磁共振氢谱测定：1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 2.91 (s, 3 H), 6.76 (q,J=2.7 Hz, 2H), 7.13 (q,J= 2.7 Hz, 2 H), 7.51 (d,J= 8.0 Hz, 1 H), 7.79 (q,J= 5.3Hz, 1 H), 8.50 (q,J= 4.0 Hz, 1 H), 8.65 (d,J= 8.0 Hz, 1 H), 8.70 (q,J= 2.7Hz, 1 H)。
核磁共振碳谱测定：13C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ 30.7, 112.8, 114.7, 119.3,123.0,124.4, 124.5, 126.9, 128.9, 129.1, 129.5, 132.0, 132.5, 143.5, 149.4,164.1, 164.6。核磁共振氢谱图如图1所示，核磁共振碳谱图如图2所示。
高分辨质谱测定：HR-ESI-MS calcd for C19H14N5O2 +: 344.1147, found344.1140 [M+H+]+。高分辨质谱图如图3所示。
实施例4
一种用于检测硫氮酸（HSNO）的萘酰亚胺衍生物荧光探针分子的制备方法，具体步骤为：
（1）中间体4-叠氮-1,8-萘酸酐的制备
室温搅拌条件下，将叠氮化钠（194.7 mg，6 mmol）的水溶液（10 mL）滴加入4-溴-1,8-萘酸酐（275.9 mg，1 mmol）的DMF（25 mL）悬浊液中，滴加完毕后室温条件下搅拌反应10小时，将反应液倒入冰水中，有黄色固体沉淀生成，抽滤，干燥，粗产物用柱层析（乙酸乙酯：石油醚=1:10）纯化得到中间体4-叠氮-1,8-萘酸酐203.2 mg，产率85%。
（2）探针P1的制备
将4-叠氮-1,8-萘酸酐（239 mg，1 mmol）和4-氨基-N-甲基苯胺（733.2 mg，6mmol）溶解于乙酸（20 mL）溶液中，加热回流反应24小时，冷却至室温。反应液中倒入水中，抽滤，干燥，粗产物用柱层析（甲醇：二氯甲烷=1:60）纯化得到棕黄色固体产物（205.8 mg）即为用于硫氮酸（HSNO）检测的荧光探针P1，产率60%。
核磁共振氢谱测定：1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 2.91 (s, 3 H), 6.76 (q,J=2.7 Hz, 2 H), 7.13 (q,J= 2.7 Hz, 2 H), 7.51 (d,J= 8.0 Hz, 1 H), 7.79 (q,J=5.3 Hz, 1 H), 8.50 (q,J= 4.0 Hz, 1 H), 8.65 (d,J= 8.0 Hz, 1 H), 8.70 (q,J=2.7 Hz, 1 H)。
核磁共振碳谱测定：13C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ 30.7, 112.8, 114.7, 119.3,123.0,124.4, 124.5, 126.9, 128.9, 129.1, 129.5, 132.0, 132.5, 143.5, 149.4,164.1, 164.6。核磁共振氢谱图如图1所示，核磁共振碳谱图如图2所示。
高分辨质谱测定：HR-ESI-MS calcd for C19H14N5O2 +: 344.1147, found344.1140 [M+H+]+。高分辨质谱图如图3所示。
实施效果例
1 mM的探针溶液配制：准确称量实施例1制备的探针（P1），P1溶解在二甲基亚砜（DMSO）溶液中配制1 mM的溶液备用。
HSNO（300 μM）溶液的配制：PBS缓冲溶液（50 mM，pH=7.4）中将GSNO（亚硝基谷胱甘肽，1 mM）和Na2S（硫化钠，300 μM）同体积混合，现配现用。
荧光选择性实验：
专一的选择性是衡量荧光探针分子是否高效的重要标准。运用荧光光谱仪考察激发波长为410 nm条件下，探针P1对HSNO的荧光选择性。如附图4所示，单独的探针P1（5 μM）在PBS（50 mM, pH = 7.40）含CTAB（50 μM）的测试溶液中在540 nm处具有微弱的荧光发射强度，当加入HSNO（10eq.）后，在540 nm处的荧光发射强度明显增强（增强21倍），但是加入其它物质（常见小分子：HNO, GSNO, Na[Fe(CN]5NO).H2O, NO3 -, Hcy, Cys, GSH, O2 -,ONOO-, SO3 2-, OCl-, H2O2, GSSG, Glu, Arg, Met, Thr, Cl-, F-, Br-, I-, THBP, NaN3）后，溶液体系的荧光发射（F540）强度与单独探针体系的荧光发射（F540）强度相比没有明显变化；只有单独的Na2S或者Na2S与Na[Fe(CN]5NO).H2O的混合物加入后，溶液体系荧光发射（F540）强度有一定的增强（分别增强7.5倍和6倍，与HSNO的响应强度有明显的差距）。以上实验结果表明，在410 nm激发条件下，该探针对HSNO具有较好的荧光专一选择性。
荧光干扰性实验：
为了测试探针P1对HSNO识别的抗干扰能力，在荧光发射光谱中测试了其抗常见活性小分子干扰性。如附图5所示，在410 nm处激发条件下，在PBS（50 mM, pH = 7.40）含CTAB（50 μM）的测试溶液中,固定探针P1浓度为5 µM，分别加入测试的各种常见活性小分子（2.NO3 -, 3. GSH, 4. Cys, 5. Hcy, 6. ONOO-, 7. SO3 2-, 8. OCl-, 9. GSSG, 10. Glu,11. Arg, 12. Met, 13. Thr, 14. Cl-, 15. Br-, 16. I-, 17. F-, 18. NaN3），测试其相应的荧光发射强度（540 nm），然后再向上述溶液中分别加入10当量的HSNO溶液，由附图6可知，在常见活性小分子存在时加入HSNO与单独加入HSNO时所得到的荧光发射强度（540 nm）基本相同，该结果表明探针P1对HSNO的检测具有较强的抗常见活性小分子干扰性能力。
最低检出限实验：
良好的检测限是检验一个探针分子是否具有应用价值的标准之一。采用荧光光谱仪来测定探针P1对HSNO的最低检出限，在PBS（50 mM, pH = 7.40）含CTAB（50 μM）的测试溶液中，固定探针P1浓度为5 µM，在410 nm处激发条件下，测定其对不同浓度的HSNO的响应强度，随着HNSO浓度的增加，溶液体系在540 nm处的荧光强度不断增强（附图6），研究发现溶液荧光强度（540 nm）值在HNSO浓度为0-5.5 µM间呈线性（R 2 = 0.9928），根据IUPAC规则，经计算（3σ/k）得出该探针分子对HSNO的最低检出限为0.36 μM（附图7）。该测试结果表明探针P1对HSNO的检测具有较好的灵敏度，增大了其实际应用价值。
动力学实验：
良好的识别速度是考察探针的重要指标之一。采用荧光光谱仪考察了探针P1对HSNO的动力学实验。在PBS（50 mM, pH = 7.40）含CTAB（50 μM）的测试溶液中，固定探针P1浓度为5 µM，在410 nm处激发条件下，分别测定单独探针体系，探针加HSNO体系和探针加Na2S体系的荧光发射（540 nm）强度随时间的变化。如附图8所示，单独探针随时间的延长，溶液体系荧光发射强度基本保持不变；探针加HSNO体系中荧光发射强度随着时间的延长明显增强，并在约40 min后达到最大响应平台（增强21倍）；探针加Na2S体系中荧光发射强度随着时间的延长也明显增强，并在5 min后达到最大响应平台（增强7.5倍）。以上结果表明，探针对HSNO识别响应快速灵敏，并能通过延长识别时间来区分探针对HSNO和H2S的识别，具有较好的实际应用价值。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.基于萘酰亚胺衍生物的用于硫氮酸检测的荧光探针，其特征在于，所述荧光探针的结构式如下：
。
2.权利要求1所述的基于萘酰亚胺衍生物的用于硫氮酸检测的荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤如下：
（1）搅拌条件下，将叠氮化钠的水溶液滴加入4-溴-1,8-萘酸酐的DMF悬浊液中，滴加完毕后室温条件下搅拌反应一段时间A，将反应液倒入冰水中，有黄色固体沉淀生成，经抽滤、干燥、柱层析纯化得到中间体4-叠氮-1,8-萘酸酐；
（2）将4-叠氮-1,8-萘酸酐和4-氨基-N-甲基苯胺溶于乙酸溶液中，加热回流反应一段时间B，冷却至室温后，将反应液倒入水中，经抽滤、干燥、柱层析纯化得到棕黄色固体产物即为荧光探针P1。
3.根据权利要求2所述的基于萘酰亚胺衍生物的用于硫氮酸检测的荧光探针的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中，叠氮化钠和4-溴-1,8-萘酸酐的摩尔比为（1.5-6）：1。
4.根据权利要求3所述的基于萘酰亚胺衍生物的用于硫氮酸检测的荧光探针的制备方法，其特征在于：所述反应时间A为4-10小时。
5.根据权利要求4所述的基于萘酰亚胺衍生物的用于硫氮酸检测的荧光探针的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中柱层析分离采用的洗脱液为乙酸乙酯和石油醚按体积比1：（4-10）的混合溶液。
6.根据权利要求2-5任一项所述的基于萘酰亚胺衍生物的用于硫氮酸检测的荧光探针的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中，4-叠氮-1,8-萘酸酐和4-氨基-N-甲基苯胺的摩尔比为1：（1-8）。
7.根据权利要求6所述的基于萘酰亚胺衍生物的用于硫氮酸检测的荧光探针的制备方法，其特征在于：所述反应时间B为8-24小时。
8.根据权利要求6所述的基于萘酰亚胺衍生物的用于硫氮酸检测的荧光探针的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中柱层析分离采用的洗脱液为甲醇和二氯甲烷按体积比1：（30-60）的混合溶液。
9.权利要求1所述的荧光探针在非疾病诊断为目的的检测硫氮酸中的应用。
10.权利要求1所述的荧光探针在制备识别生物体系中硫氮酸的检测试剂中的应用。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant |