CN115728277B - 一种快速检测草甘膦含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速检测草甘膦含量方法。分析体系以碳点为光敏氧化剂和蓝色荧光内标，邻苯二胺为黄色荧光显色底物，Cu2+为调节剂，通过紫外灯照射引发分析体系荧光颜色改变，从而在短时间内对分析体系中草甘膦含量精准检测。该操作方法简单快捷耗时短，实验结果易分析，并且精准度较高。
Description
技术领域
本发明涉及荧光标记检测技术领域，具体为一种快速检测草甘膦含量的方法。
背景技术
在农作物的种植生长过程中，使用农药不仅可以预防虫害还可以调节植物生长，进而达到提高农作物产量的作用，但农药的滥用也会导致水源和土壤的污染，从而危害生态环境。
草甘膦作为一种非选择性、有机磷类除草剂，被广泛应用于农业生产，但草甘膦自身的生物毒性也引起了广泛关注。因此，开发快速、高效的草甘膦检测方法具有十分重要的意义。目前许多检测方法如色谱法、表面增强拉曼光谱法、电化学法、毛细管电泳法等被开发出来，用于环境样品中草甘膦的检测，但这些检测方法操作不简便，结果分析步骤繁琐。
碳点作为一种新型发光材料，具有发光波长可调、成本低、生物相容性好等优点，在化学和生物传感器中具有广阔的应用前景。杂原子掺杂碳点的激发三重态可以通过有效的系间跨越过程(即激发单重态到三重态的跃迁)被活化。因此，杂原子掺杂碳点可以作为光敏剂将激发三重态的能量通过能量转移或者电子转移过程产生活性氧(如单线态氧、超氧阴离子自由基)，具有氧化性的单线态氧、超氧阴离子自由基可以将一些显色底物氧化产生特征吸收或特征荧光，进而开发出简便的检测方法。
Cu2+属于一种顺磁性猝灭剂，能猝灭碳点激发三重态的能量，进而抑制碳点的光敏化效果，在不同pH值下Cu2+对碳点光敏氧化OPD的抑制作用是不同的，较高的pH值会使Cu2+容易产生氢氧化物沉淀，而较低的pH值会使表面含有氨基的碳点的氨基在较为酸性的作用条件下发生质子化，因而带有正电荷使其与调剂剂中的Cu2+发生经典排斥作用使光敏化效果下降，目前针对含有氨基的碳点且采用含有Cu2+的调节剂荧光检测中未能解决上述问题。
中国发明专利CN108593613A-一种草甘膦的检测方法提出了基于铜离子通过电子转移淬灭香豆素的绿色荧光，加入草甘膦与铜离子形成复合物从而恢复香豆素荧光的检测方法。但香豆素的合成过程繁琐，耗时长。
在本发明中利用碳点作为光敏剂，以邻苯二胺为显色底物，在光照条件下利用碳点敏化产生氧化性自由基，氧化邻苯二胺产生荧光性物质。以铜离子为调节剂，铜离子可以抑制碳点敏化产生强氧化性的自由基。通过加入草甘膦与体系内铜离子络合，碳点敏化产生氧化性自由基的能力恢复，实现草甘膦的检测。
中国发明专利CN107748156A-一种草甘膦的检测方法利用Fe3+可以与碳点表面的羧基和羟基发生配位作用使其发生聚集而荧光淬灭。而草甘膦中的膦酰基对于Fe3+有更强的配位作用，所以能将Fe3+从碳点中竞争出来，使得碳点得到分散而使荧光获得恢复，因此可以通过荧光强度来检测待测溶液中草甘膦的浓度。但碳点制备时间较长(24-48h)，检测时间同时也较长(14-18min)。
中国发明专利CN111982879A-一种基于SiNPs_OPD_Cu2+荧光传感体系对草甘膦的检测方法采用铜离子在Tris-HCl缓冲液中氧化邻苯二胺(OPD),从而产生荧光性物质。但依然具有检测时间长的问题(大于4-6h)。
中国发明专利CN113866138A-一种基于铜离子介导的银纳米簇荧光检测草甘膦的方法，基于Cu2+与草甘膦和DNA-AgNCs结合的竞争机制，草甘膦竞争捕获Cu2+，会抑制Cu2+对DNA-AgNCs的荧光猝灭，通过荧光变化来实现对草甘膦的检测。但需使用贵金属银盐和DNA等试剂，成本高。同时检测时间长较长(大于3h)。
发明内容
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了一种快速检测草甘膦含量的方法，解决了以下技术问题：
1、现有采用荧光法测量草甘膦含量的方法耗时较长，不能应对草甘膦高灵敏度的快速检测；
2、现有技术中采用含有Fe3+的调剂剂中碳点的制备时间较长(24-48h)，且检测时间也较长的问题(14-18min)；
3、现有技术中基于Cu2+与草甘膦和DNA-AgNCs结合的竞争机制，草甘膦竞争捕获Cu2+，会抑制Cu2+对DNA-AgNCs的荧光猝灭，通过荧光变化来实现对草甘膦的检测中需使用贵金属银盐和DNA等试剂，成本高，同时检测时间长较长(大于3h)；
4、现有技术中采用铜离子在Tris-HCl缓冲液中氧化邻苯二胺(OPD),从而产生荧光性物质，但依然具有检测时间长的问题(大于4-6h)；
5、在不同pH值下Cu2+对碳点光敏氧化OPD的抑制作用是不同的，较高的pH值会使Cu2+容易产生氢氧化物沉淀，而较低的pH值会使表面含有氨基的碳点的氨基在较为酸性的作用条件下发生质子化，因而带有正电荷使其与调剂剂中的Cu2+发生经典排斥作用使光敏化效果下降。
(二)技术方案
为实现以上目的，本发明设计了一种快速检测草甘膦含量的方法，主要基于以下原理：利用碳点做光敏剂，在紫外灯光照下快速产生活性氧自由基，将显色底物邻苯二胺(OPD)氧化为有黄色荧光发射的oxOPD。通过加入调节剂铜离子，在特定pH条件下高效抑制碳点光敏氧化OPD过程。然而草甘膦可以与铜离子螯合形成稳定配合物，因此加入草甘膦可以使碳点光敏氧化OPD的能力恢复。所以根据待测样品中草甘膦浓度的不同，使体系内黄色荧光不同程度的恢复。结合碳点本身的蓝色荧光作为内标，通过显色底物黄色荧光与碳点蓝色荧光比值对草甘膦浓度建立标准曲线，实现草甘膦含量的快速检测。
本发明通过以下技术方案予以实现：一种快速检测草甘膦含量的方法，采用比率荧光分析方法测量样本中草甘膦的浓度，其特征在于：包括如下步骤：
步骤一：将表面含有氨基的碳点、荧光显色底物、含有Cu2+的调节剂和待测试液充分混合为混合液，将混合液调节至一定的pH值至5～7以防止碳点表面的氨基发生质子化以及防止调节剂内的Cu2+产生氢氧化物沉淀；
步骤二：将步骤一中的混合液在紫外线灯下照射一定时间A，得到荧光显色底物的氧化产物与碳点荧光峰的比值，其中混合液在紫外线灯照射时处于激发三重态的碳点与Cu2+之间的能量转移过程中，Cu2+能够抑制氧化性自由基的产生，进而能快速、高效抑制荧光显色底物的光敏氧化过程；
步骤三：将步骤一中调节好pH值的混合液分组并分别加入不同浓度的草甘膦溶液，将每一组溶液放分别在紫外灯下照射相同的时间A后使用荧光分光光度计分别测试溶液在400nm的激发下，420nm-650nm的荧光发射图谱再分别计算不同草甘膦浓度下测得的荧光发射图谱在555nm及460nm的强度比值，即绘得线性标准曲线；
步骤四：通过荧光显色底物的氧化产物与碳点荧光峰的比值再结合检测草甘膦标准曲线的绘制中的线性标准曲线，即可求算出样本中草甘膦的浓度。
优选的，所述荧光显色底物为黄色荧光显色底物。
优选的，所述黄色荧光显色底物为邻苯二胺。
优选的，所述调节剂Cu2+的浓度为0.05-50μM。
优选的，所述含有氨基的碳点的制备过程如下：
S1：将马来酸酐和聚乙烯亚胺添加到水中，直到它们在超声波作用下完全溶解为混合溶液；
S2：将混合溶液转移至内衬聚四氟乙烯的不锈钢高压釜中，然后在一定温度下进行一定时长的水热处理；
S3：将S2处理后的混合溶液自然冷却至室温后，使用透析膜在超纯水中透析溶液一定时间后，冷冻干燥得到碳点粉末。
优选的，所述碳点荧光峰的确定过程如下：
S1：将碳点粉末溶于水配制为碳点溶液；
S2：测试碳点溶液在一定波长光照的激发下的荧光发射图谱。
优选的，所述马来酸酐和聚乙烯亚胺的摩尔比为0.01～100，水热温度为180℃～220℃，水热时间为8～12h。
优选的，所述骤一中pH值为6。
优选的，所述邻苯二胺的含量为5～500μM。
优选的，所述步骤二中的括紫外灯波长范围：250nm-380nm，光照时间：5-7min。
(三)有益效果
本发明提供了一种快速检测草甘膦含量的方法。具备以下有益效果：
(1)、该草甘膦含量检测方法选用碳点进行检测成本低廉、具有良好的稳定性。
(2)、该草甘膦含量检测方法实现了草甘膦0-1μM高灵敏度的检测。
(3)、该草甘膦含量快速检测方法实现了草甘膦含量在5min紫外灯照射下的快速精准检测。
(4)、该草甘膦含量快速检测方法利用表面存在氨基的碳点且在微酸性作用下使Cu2+对碳点光敏氧化OPD的抑制作用达到最佳，搭配合适浓度的Cu2+即可在5min的紫外线灯照射下完成草甘膦含量的检测。
(5)、该草甘膦含量检测方法相比色谱法、表面增强拉曼光谱法、电化学法、毛细管电泳法等，比色分析法操作简单，实用性强，检测耗时短。
附图说明
图1是本发明的碳点在400nm激发下的荧光发射图谱。
图2是本发明的碳点在不同光照时间下光敏氧化OPD的荧光强度图。
图3是本发明检测草甘膦的调节剂选择柱状图。
图4是本发明不同pH下Cu2+对碳点光敏化OPD的抑制作用柱状图。
图5是本发明的不同浓度Cu2+对碳点光敏化OPD的抑制作用的荧光图谱。
图6是本发明Cu2+对碳点光敏化OPD的抑制效果的点线图。
图7是本发明的检测体系加入不同浓度草甘膦的荧光发射图谱。
图8是本发明的检测体系加入不同浓度草甘膦的荧光强度比值线性图谱。
图9是本发明草甘膦检测专一性柱状图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
碳点的制备：
将1g马来酸酐和0.1g的聚乙烯亚胺添加到15mL水中，直到它们在超声波作用下完全溶解。将混合物转移到25mL内衬聚四氟乙烯的不锈钢高压釜中，然后在200℃下进行10h的水热处理。自然冷却至室温后，将上述反应液使用分子量为500Da的透析膜在超纯水中透析溶液48小时后，冷冻干燥得到棕色的CDs粉末。将碳点粉末溶于水配制为5mg/mL的溶液，取20μL上述的碳点溶液加入1980μL的超纯水中，测试碳点在400nm激发下，420nm-650nm的荧光发射图谱，即绘得光谱图1。
碳点光敏化OPD作用与光照时间的关系：
将100μL的邻苯二胺(1mM)加入到pH＝6的缓冲溶液中致使体系总体积为2mL，将体系混合均匀，即为对照组。将20μL上述的碳点溶液、100μL的邻苯二胺(1mM)加入到pH＝6的缓冲溶液中致使体系总体积为2mL，将体系混合均匀，即为碳点组。分别将上述两组溶液体系放在365nm的紫外灯下进行光照，使用荧光分光光度计，每隔30s测试体系在400nm的激发下555nm处的荧光强度。即绘得点线图2。以上结果表明碳点光敏氧化OPD的程度随着光照时间的增长而增强。
检测草甘膦体系中调节剂金属离子的选择性：
将20μL上述的碳点溶液、100μL的邻苯二胺(1mM)和20μL的浓度皆为1mM的Cu2+、Co2 +、Zn2+、Cr3+、Ni2+、Eu2+、Ca2+、Mg2+、Pb2+、Ag+、Mn2+、Tb3+，分别加入到pH＝6的缓冲溶液中致使体系总体积为2mL。将体系混合均匀后，放在365nm的紫外灯下进行光照5min。使用荧光分光光度计，分别测试体系在400nm的激发下555nm处的荧光强度，即得柱状图3。
不同pH下Cu2+对碳点光敏氧化OPD的抑制作用：
将20μL上述的碳点溶液、100μL的邻苯二胺(1mM)分别加入到pH＝3、4、5、6、7的缓冲溶液中致使体系总体积为2mL，将体系混合均匀，即为对照组。将20μL上述的碳点溶液、100μL的邻苯二胺(1mM)和10μL的Cu2+(0.1mM)，分别加入到pH＝3、4、5、6、7的缓冲溶液中致使体系总体积为2mL，将体系混合均匀即为Cu2+组。分别将上述两组溶液放在365nm的紫外灯下进行光照5min。使用荧光分光光度计，分别测试体系在400nm的激发下555nm处的荧光强度，即得柱状图4。
本发明探究了pH值对碳点光敏氧化OPD效率的影响。相同光照时间优选出光敏氧化效率最佳的pH条件。同时还探索了铜离子在不同pH下的抑制能力，发现在pH＝6的条件下碳点实现最大光敏氧化效率，同时Cu2+也表现出良好的光敏氧化抑制作用。
从理论角度分析，Cu2+属于一种顺磁性猝灭剂，能猝灭碳点激发三重态的能量，进而抑制碳点的光敏化效果。在不同pH值下Cu2+对碳点光敏氧化OPD的抑制作用对比中发现，pH＝6的微酸性状态下，Cu2+能有效抑制光敏化过程。本发明使用的碳点表面含有氨基，在强酸性条件下会发生质子化，因而带有正电荷，会与调节剂Cu2+发生静电排斥作用，使光敏化效果下降。而在中性或碱性条件下，Cu2+容易产生氢氧化物沉淀。因此pH＝6微酸性的使用，使Cu2+对碳点光敏氧化OPD的抑制作用达到最佳。
不同浓度Cu2+对碳点光敏化OPD的抑制作用：
将20μL上述的碳点溶液、100μL的邻苯二胺(1mM)和0-20μL的Cu2+(0.1mM)，加入到不同体积的pH＝6的缓冲溶液中致使体系总体积为2mL。将体系混合均匀后，放在365nm的紫外灯下进行光照5min。使用荧光分光光度计，分别测试体系在400nm的激发下，420nm-650nm的荧光发射图谱，即绘得光谱图5。
在图6中可以看出不同浓度Cu2+对碳点光敏化OPD的抑制作用是不同的，大体可以得出Cu2+浓度越大，抑制效果越好。其原因是高浓度的铜离子能有效对体系中碳点形成包裹，抑制氧化性自由基的产生，无法使荧光显色底物OPD产生黄色荧光。
pH＝6下Cu2+调节剂的抑制效果：
将20μL上述的碳点溶液、100μL的邻苯二胺(1mM)加入到不同体积的pH＝6的缓冲溶液中致使体系总体积为2mL。再将20μL上述的碳点溶液、100μL的邻苯二胺(1mM)和10μL的Cu2+(1mM)，加入到不同体积的pH＝6的缓冲溶液中致使体系总体积为2mL。将分别将上述两个体系混合均匀后，放在365nm的紫外灯下进行光照，每隔30s测试体系在400nm的激发下555nm处的荧光强度，即得点线图6。
以上结果表明Cu2+能快速、高效抑制荧光显色底物的光敏氧化过程，进而可以实现草甘膦含量的快速检测。其原因是铜离子抑制氧化性自由基的产生，是基于碳点激发三重态与Cu2+之间的能量转移过程，这种能量转移过程能在极短的时间内迅速发生。
检测草甘膦标准曲线的绘制：
将20μL上述的碳点溶液、100μL的邻苯二胺(1mM)和10μL的Cu2+(1mM)，以及100μL的不同浓度的草甘膦加入到不同体积的pH＝6的缓冲溶液中致使体系总体积为2mL。将体系混合均匀后，放在365nm的紫外灯下进行光照5min。使用荧光分光光度计，分别测试体系在400nm的激发下，420nm-650nm的荧光发射图谱，即绘得光谱图7。分别计算不同草甘膦浓度下，测得的荧光发射图谱在555nm及460nm的强度比值，即绘得线性标准曲线8。
草甘膦检测方法的专一性：
将20μL上述的碳点溶液、100μL的邻苯二胺(1mM)和20μL的Cu2+(1mM)，加入到pH＝6的缓冲溶液中致使体系总体积为2mL。将体系混合均匀后，放在365nm的紫外灯下进行光照5min。使用荧光分光光度计，分别测试体系在400nm的激发下，420nm-650nm的荧光发射图谱，记算在555nm和460nm处的发射强度比值，即得空白组强度比值。再将20μL上述的碳点溶液、100μL的邻苯二胺(1mM)和20μL的Cu2+(1mM)，以及将50μL的常见农药乐果(1mM)、喹硫磷(1mM)、阿拉特津(1mM)、多菌灵(1mM)、马拉硫磷(1mM)和草甘膦(1mM)分别加入到的pH＝6的缓冲溶液中致使体系总体积为2mL。将体系混合均匀后，放在365nm的紫外灯下进行光照5min。使用荧光分光光度计，分别测试体系在400nm的激发下，420nm-650nm的荧光发射图谱，计算体系内加入不同农药时555nm和460nm处的发射强度比值，即绘得柱状图9。
未知样品中的草甘膦检测：
同检测草甘膦标准曲线的绘制中的操作方法，将100μL的不同浓度的草甘膦溶液替换为100μL的待测试样，配制检测溶液。将体系混合均匀后，放在365nm的紫外灯下进行光照5min。使用荧光分光光度计，测试体系在400nm的激发下，420nm-650nm的荧光发射图谱，并计算荧光发射图谱在555nm及460nm的强度比值。结合检测草甘膦标准曲线的绘制中的线性标准曲线，即可求算出未知样品中的草甘膦的浓度。
需要说明的是，在发明的描述中，术语“上”、“下”、“左”、“右”、“前”、“后”等指示的方位或位置关系为基于附图所示对本发明结构的说明，仅是为了便于描述本发明的简便，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
对于本技术方案中的“第一”和“第二”，仅为对相同或相似结构，或者起相似功能的对应结构的称谓区分，不是对这些结构重要性的排列，也没有排序、或比较大小、或其他含义。
另外，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“连接”应做广义理解，例如，连接可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个结构内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据本发明的总体思路，联系本方案上下文具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
Claims (9)
1.一种快速检测草甘膦含量的方法，采用比率荧光分析方法测量样本中草甘膦的浓度，其特征在于：包括如下步骤：
步骤一：将表面含有氨基的碳点、荧光显色底物、含有Cu2+的调节剂和待测试液充分混合为混合液，将混合液调节至一定的pH值至5～7以防止碳点表面的氨基发生质子化以及防止调节剂内的Cu2+产生氢氧化物沉淀；
步骤二：将步骤一中的混合液在紫外线灯下照射一定时间A，得到荧光显色底物的氧化产物与碳点荧光峰的比值，其中混合液在紫外线灯照射时处于激发三重态的碳点与Cu2+之间的能量转移过程中，Cu2+能够抑制氧化性自由基的产生，进而能快速、高效抑制荧光显色底物的光敏氧化过程；
步骤三：将步骤一中调节好pH值的混合液分组并分别加入不同浓度的草甘膦溶液，将每一组溶液分别放在紫外灯下照射相同的时间A后使用荧光分光光度计分别测试溶液在400nm的激发下，420nm-650nm的荧光发射图谱再分别计算不同草甘膦浓度下测得的荧光发射图谱在555nm及460nm的强度比值，即绘得线性标准曲线；
步骤四：通过荧光显色底物的氧化产物与碳点荧光峰的比值再结合检测草甘膦标准曲线的绘制中的线性标准曲线，即可求算出样本中草甘膦的浓度；
所述含有氨基的碳点的制备过程如下：
S1：将马来酸酐和聚乙烯亚胺添加到水中，直到它们在超声波作用下完全溶解为混合溶液；
S2：将混合溶液转移至内衬聚四氟乙烯的不锈钢高压釜中，然后在一定温度下进行一定时长的水热处理；
S3：将S2处理后的混合溶液自然冷却至室温后，使用透析膜在超纯水中透析溶液一定时间后，冷冻干燥得到碳点粉末。
2.根据权利要求1所述的一种快速检测草甘膦含量的方法，其特征在于：所述荧光显色底物为黄色荧光显色底物。
3.根据权利要求2所述的一种快速检测草甘膦含量的方法，其特征在于：所述黄色荧光显色底物为邻苯二胺。
4.根据权利要求1所述的一种快速检测草甘膦含量的方法，其特征在于：所述碳点荧光峰的确定过程如下：
S1：将碳点粉末溶于水配制为碳点溶液；
S2：测试碳点溶液在一定波长光照的激发下的荧光发射图谱。
5.根据权利要求3所述的一种快速检测草甘膦含量的方法，其特征在于：所述邻苯二胺的含量为5～500μM。
6.根据权利要求1所述的一种快速检测草甘膦含量的方法，其特征在于：所述调节剂Cu2 +的浓度为0.05-50μM。
7.根据权利要求1所述的一种快速检测草甘膦含量的方法，其特征在于：所述步骤二中的紫外线灯波长范围：250nm-380nm，光照时间：5min。
8.根据权利要求1所述的一种快速检测草甘膦含量的方法，其特征在于：所述pH值为6。
9.根据权利要求4所述的一种快速检测草甘膦含量的方法，其特征在于：所述马来酸酐和聚乙烯亚胺的摩尔比为0.01～100，水热温度为180℃～220℃，水热时间为8～12h。
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