CN115725763A - 一种快速鉴定鼠伤寒沙门菌及其单相变种的双重rt-rpa检测试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物鉴定技术领域，具体涉及一种快速鉴定鼠伤寒沙门菌与沙门菌血清型4,[5],12:i‑的双重RT‑RPA检测试剂盒及检测方法。该方法以鼠伤寒沙门菌和沙门菌血清型4,[5],12:i:‑均携带的STM4495基因以及鼠伤寒沙门菌携带的fljB1,2基因设计特异性的探针和引物组，建立起快速鉴定鼠伤寒沙门菌及沙门菌血清型4,[5],12:i:‑的双重RT‑RPA方法，该方法不仅特异性高，敏感性强；而且快速简便，20分钟可获取检测结果，与血清学分型鉴定相比具有成本更低、省时省力的优点，而与PCR和RT‑PCR相比在实现检测准确性的同时更为省时省力，能够用于鼠伤寒沙门菌及沙门菌血清型4,[5],12:i:‑的快速鉴定。
Description
技术领域
本发明属于生物鉴定技术领域，具体涉及一种快速鉴定鼠伤寒沙门菌及其单相变种的双重RT-RPA检测试剂盒及检测方法，具体是针对鼠伤寒沙门菌与沙门菌血清型4,[5],12:i-的双重RT-RPA检测试剂盒及检测方法。
背景技术
鼠伤寒沙门菌是引起食源性疾病最常见的血清型之一。沙门菌血清型4,[5],12:i:-，是一种鼠伤寒沙门菌单相变种，在20世纪90年代前很少分离到，但目前该血清型已经逐渐成为人类临床、食品动物和肉食品中的最主要血清型之一，威胁着人类公共卫生安全。多项研究已经表明，猪肉及其制品的污染，是沙门菌血清型4,[5],12:i:-引起人类健康风险的重要原因。同时，沙门菌血清型4,[5],12:i:-可能对猪具有鼠伤寒沙门菌相似的致病潜力。为了保护人类健康，维护食品公共卫生安全，针对临床样品、猪肉等食物、病猪源样品中分离获得沙门菌并对其进行鉴定十分必要。
目前，对于鼠伤寒沙门菌与沙门菌血清型4,[5],12:i:-的检测，仍旧依靠传统的常规血清学鉴定方法、聚合酶链式反应（PCR）和荧光定量PCR法，这些方法存在耗时长、操作繁琐、劳动量大的缺陷，常规血清学方法除了上述缺陷还具有成本高的问题。因此引进一种新的能够快速鉴定鼠伤寒沙门菌和沙门菌血清型4,[5],12:i:-的方法也十分必要。
重组酶聚合酶扩增( recombinase polymerase amplification，RPA) 是近年来兴起的一种等温核酸扩增技术，具有灵敏度高、特异性强、反应快速等特点，利用重组酶代替PCR的高温解链， 在37℃～42 ℃环境条件下完成对双链的解链，采用单链结合蛋白防止解链的DNA 复性，由DNA 聚合酶实现链的延伸，实现DNA的扩增，整个反应20 min 内完成，目前根据RPA产物检测方法，又将RPA分为直接重组酶聚合酶扩增技术( Direct－RPA)、重组酶聚合酶扩增侧流层析技术( RPA－LFD)、实时重组酶聚合酶扩增技术( RT－RPA)等。而该技术在鼠伤寒沙门菌和沙门菌血清型4,[5],12:i:-鉴定上目前还少有公开，亟需展开相关研究。
发明内容
针对传统的常规血清学鉴定方法在鉴定鼠伤寒沙门菌与沙门菌血清型4,[5],12:i:-存在的缺陷和问题，本发明提供一种快速鉴定鼠伤寒沙门菌与沙门菌血清型4,[5],12:i-的双重RT-RPA试剂盒及其检测方法。该方法针对鼠伤寒沙门菌、沙门菌血清型4,[5],12:i:-均携带的STM4495基因以及鼠伤寒沙门菌携带的fljB1,2 基因基于实时荧光重组酶聚合酶扩增技术（RT-RPA），对鼠伤寒沙门菌与沙门菌血清型4,[5],12:i-进行快速鉴定。
本发明解决其技术问题所采用的方案是：一种用于快速鉴定鼠伤寒沙门菌及其单相变种的双重RT-RPA引物组，其核苷酸序列如下所示：
4495F5：GTATTTGATTCTTTATTTGTGATAAGGGTT；
4495R3：CGCCACCATAAAAAACTTGGAGAAAAAAT；
H2F1：TAAATTTGACGCAGATAATAACAAGTACT；
H2R5：TCGCACCAGCAGGCATTGTGGTTTTAGTTG。
本发明还提供一种用于快速鉴定鼠伤寒沙门菌及其单相变种的双重RT-RPA探针，其核苷酸序列如下所示：
STM4495probe：
TATTGAAACCTCGTACCAATATCTTTGAAA[ROX-dT][THF][BHQ2-dT]AATATTGTCACCGG-C3Spacer；
H2 probe：
CGATTATGAAGTTAACGTTGCTACTGACGG[FAM-dT]A[THF]AG[BHQ1-dT]AACCCTTGCGGCTG-C3 Spacer。
本发明还提供一种用于快速鉴定鼠伤寒沙门菌及其单相变种的双重RT-RPA检测试剂盒，该试剂盒含有上述所述的引物组和探针。
上述的用于快速鉴定鼠伤寒沙门菌及其单相变种的双重RT-RPA检测试剂盒，该试剂盒还包括2×缓冲液A、ddH2O、缓冲液B。
上述的用于快速鉴定鼠伤寒沙门菌及其单相变种的双重RT-RPA检测试剂盒，该试剂盒包括2×缓冲液A 25μL，10μM上游引物各2μL、10μM下游引物各2μL，10μM相应的探针各0.6μL，细菌DNA模板5μL，缓冲液B 2.5μL、ddH2O。
本发明还提供一种用于快速鉴定鼠伤寒沙门菌及其单相变种的双重RT-RPA检测方法，该方法不以疾病的诊断和治疗为目的，主要包括以下步骤：
S1、提取待测样品的DNA；
S2、设计并合成权利要求1所述的双重RT-RPA引物组和权利要求2所述的双重RT-RPA探针；
S3、以提取的样品DNA为模板，进行双重RT-RPA扩增；
S4、对扩增产物进行曲线分析，确定样品中是否为鼠伤寒沙门菌或沙门菌血清型4,[5],12:i-。
上述的一种用于快速鉴定鼠伤寒沙门菌及其单相变种的双重RT-RPA检测方法，RT-RPA扩增反应体系为：2×缓冲液A 25μL、10μM上游引物各2μL、10μM下游引物各2μL、10μM相应的探针各0.6μL、细菌DNA模板5μL、缓冲液B 2.5μL、ddH2O；反应程序为：预热，39 ℃，40S；扩增，39 ℃，30 S，共40个循环。
上述的双重RT-RPA检测试剂盒和双重RT-RPA检测方法在鉴定鼠伤寒沙门菌及其单相变种方面的应用，其中鼠伤寒沙门菌的单相变种为沙门菌血清型4,[5],12:i-。
本发明的有益效果：
本发明以鼠伤寒沙门菌、沙门菌血清型4,[5],12:i:-均携带的STM4495基因以及鼠伤寒沙门菌携带的fljB1,2 基因设计特异性的探针和引物组，建立起双重RT-RPA法快速鉴定鼠伤寒沙门菌及沙门菌血清型4,[5],12:i:-的方法，该方法不仅特异性高，敏感性强；而且快速简便，20分钟可获取检测结果，与血清学分型鉴定相比具有成本更低、省时省力的优点，而与PCR和RT-PCR相比在实现检测准确性的同时更为省时省力，能够用于鼠伤寒沙门菌及沙门菌血清型4,[5],12:i:- 的快速鉴定，且效果更好。
附图说明
图1为针对STM4495基因，20种候选引物组合的RT-RPA扩增曲线。
图2为针对fljB1,2基因，20种候选引物组合的RT-RPA扩增曲线。
图3为鼠伤寒沙门菌的RT-RPA扩增曲线。
图4为沙门菌血清型4,[5],12:i-的RT-RPA扩增曲线。
图5为双重RT-RPA特异性试验扩增曲线。
图6为双重RT-RPA敏感性试验扩增曲线。
具体实施方式
为了详细说明本发明的具体内容，下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。需要注意的是：在下述各实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的试剂和培养基如无特别说明，均为常规市售；引物及探针为生工生物工程（上海）有限公司合成。
实施例1：本实施例提供一种快速鉴定鼠伤寒沙门菌与沙门菌血清型4,[5],12:i-的双重RT-RPA方法
1、探针和引物的设计
本实施例基于实时荧光重组酶聚合酶扩增技术探针和引物设计原则（一般探针长度为46-52bp,引物长度为30-35bp, 扩增产物大小100-200bp），根据GenBank已公布的鼠伤寒沙门菌LT2菌株（AE006468.2）基因组中的STM4495基因、fljB1,2基因序列，通过DNAMAN软件对其相应的靶基因序列进行二级结构分析，依据二级结构没有严重的发夹结构的条件下，首先确定探针序列，然后在其上下游80bp左右的区域内截取候选引物，最终设计出2条探针和一系列上下游引物，具体见表1。因此，探针和候选引物分别位于STM4495基因中219bp片段（对应AE006468.2基因组位点：4744771bp-4744989bp）、fljB1,2基因中204bp片段（对应AE006468.2基因组位点：2913874bp-2914077bp）区域中。
2、DNA提取
针对各种待测细菌，采取水煮法分别提取各细菌的DNA，即挑取生长良好的纯化单菌落，接种于适合的3mL胰蛋白酶大豆肉汤培养基中过夜培养，取1mL培养菌液，按照12000rpm离心1min，弃去上清液，加入200μL 去离子水，涡旋混匀后，放入沸水中煮沸10min，冰浴5min，取上清120μL作为提取DNA，-20℃保存备用。
、反应体系建立和引物筛选
（1）反应体系建立
根据实时荧光重组酶聚合酶试剂（RT-RPA试剂）要求，每1个RT-RPA反应总体积为50μL，反应体系包括：2×缓冲液A 25μL，上游引物（10μM）、下游引物（10μM）各2μL，相应的探针（10μM）0.6μL，细菌DNA模板5μL，一定量ddH2O，最后缓冲液B 2.5μL。
反应条件设置：预热，39 ℃，40S；扩增，39 ℃，30 S，共40个循环。
（2）引物筛选
以鼠伤寒沙门菌DNA为模板，针对STM4495基因，加入探针（STM4495 probe），分别按照上游引物（n=5）和下游引物(n=4)，共20种组合的扩增反应，根据RT-RPA 试验结果荧光值最高的绿色扩增曲线（见图1），优选4495F5、4495R3引物对，
4495F5：GTATTTGATTCTTTATTTGTGATAAGGGTT；
4495R3：CGCCACCATAAAAAACTTGGAGAAAAAAT；
扩增区域为AE006468.2基因组：4744814bp-4744947bp位点，扩增产物大小为134bp。
针对fljB1,2基因，加入探针（H2 probe），上游引物（n=4）和下游引物（n=5），也是共20种组合的扩增反应，根据RT-RPA 试验结果起峰最早的紫色扩增曲线（见图2），优选H2F1、H2R5引物对，
H2F1：TAAATTTGACGCAGATAATAACAAGTACT；
H2R5：TCGCACCAGCAGGCATTGTGGTTTTAGTTG；
扩增区域为AE006468.2基因组中：2913920bp-2914077bp位点，扩增产物大小为158bp。
利用筛选得到的上述两对引物和对应的两条探针，采取双重RT-RPA法分别进行鼠伤寒沙门菌和沙门菌血清型4,[5],12:i:-检测，结果分别见图3和图4。
结果表明，鼠伤寒沙门菌检测到STM4495基因、fljB1,2基因均检测为阳性；而沙门菌血清型4,[5],12:i:-只检测到STM4495基因为阳性。
、特异性
分别提取鼠伤寒沙门菌、大肠杆菌（CMCC 44101）、金黄色葡萄球菌（ATCC 6538）、铜绿假单胞菌（ATCC 9027）、溶血性链球菌（ATCC21059）、副溶血性弧菌（ATCC17802）、弗氏志贺氏菌（ATCC29903）、单核细胞增生李斯特氏菌（ATCC 19115）、蜡样芽胞杆菌（ATCC14579）、幽门螺旋杆菌（ATCC 43504）和无乳链球菌（ATCC 13813）的基因组为模板，ddH2O为对照组进行RT-RPA检测，结果见图5。
由图5可知，大肠杆菌（CMCC 44101）、金黄色葡萄球菌（ATCC 6538）、铜绿假单胞菌（ATCC 9027）、溶血性链球菌（ATCC21059）、副溶血性弧菌（ATCC17802）、弗氏志贺氏菌（ATCC29903）、单核细胞增生李斯特氏菌（ATCC 19115）、蜡样芽胞杆菌（ATCC 14579）、幽门螺旋杆菌（ATCC 43504）和无乳链球菌（ATCC 13813）等11株菌种，以及ddH2O均无扩增。而鼠伤寒沙门菌针对STM4495基因、fljB1,2基因均有扩增，呈现2条扩增曲线，表明建立的双重RT-RPA法只能检测到鼠伤寒沙门菌STM4495基因、fljB1,2基因，具有特异性。
、敏感性
使用鼠伤寒沙门菌进行双重RT-RPA敏感性试验，测得提取的细菌DNA核酸浓度为105ng/μL。
将细菌DNA核酸原液按照稀释梯度10-1-10-7进行稀释，并以原液和各稀释液为模板扩增，各取5μL，扩增曲线如图6所示。
由图6结果可以看出稀释倍数为10-5的样本为检测最低浓度，即最低检测DNA为1.05pg/μL。
实施例2：本实施例提供一种快速鉴定鼠伤寒沙门菌与沙门菌血清型4,[5],12:i-的双重RT-RPA检测试剂盒，具体包括：2×缓冲液A 25μL，10μM上游引物各2μL、10μM下游引物各2μL，10μM相应的探针各0.6μL，ddH2O 8.3μL，进行检测时加入待测样品DNA 5μL，最后加入缓冲液B 2.5μL。
实施例3：临床样品沙门菌验证
选取从河南省各地的猪粪便、猪肉等样品中共分离获得的99株沙门菌，按照White–Kauffmann–Le Minor 手册，使用O抗原和H抗原特异性血清，采用玻片凝集法进行血清分型，结果分型为鼠伤寒沙门菌（34株）、沙门菌血清型4,[5],12:i:-（60株）、鸭沙门菌（1株）、伦敦沙门菌（2株）、德尔卑沙门菌（1株）和肯塔基沙门菌（1株），共6种血清型沙门菌。
针对上述99株沙门菌，分别采取PCR、RT-PCR和本发明建立双重RT-RPA方法进行检测，结果显示3种检测结果一致，即分别检测为鼠伤寒沙门菌（n=42）、沙门菌血清型4,[5],12:i:- (n=52)和其他血清型(n=5)。
通过分析表明与传统血清学分型法相比，其中91.49%（n=86/94）的鼠伤寒沙门菌及沙门菌血清型4,[5],12:i:-菌株的鉴定与3种分子检测方法结果一致，8.51%（n=8/94）的鼠伤寒沙门菌及沙门菌血清型4,[5],12:i:-与3种分子检测方法结果不一致，另外5株非鼠伤寒沙门菌及沙门菌血清型4,[5],12:i:-菌株均鉴定为其他血清型。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不限制本发明，凡在本发明的精神和原则范围内所做的任何修改、等同替换和改进，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种用于快速鉴定鼠伤寒沙门菌及其单相变种的双重RT-RPA引物组，其特征在于：其核苷酸序列如下所示：
4495F5：GTATTTGATTCTTTATTTGTGATAAGGGTT；
4495R3：CGCCACCATAAAAAACTTGGAGAAAAAAT；
H2F1：TAAATTTGACGCAGATAATAACAAGTACT；
H2R5：TCGCACCAGCAGGCATTGTGGTTTTAGTTG。
2.一种用于快速鉴定鼠伤寒沙门菌及其单相变种的双重RT-RPA探针，其特征在于：其核苷酸序列如下所示：
STM4495probe：
TATTGAAACCTCGTACCAATATCTTTGAAA[ROX-dT][THF][BHQ2-dT]AATATTGTCACCGG-C3Spacer；
H2 probe：
CGATTATGAAGTTAACGTTGCTACTGACGG[FAM-dT]A[THF]AG[BHQ1-dT]AACCCTTGCGGCTG-C3Spacer。
3.一种用于快速鉴定鼠伤寒沙门菌及其单相变种的双重RT-RPA检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒含有权利要求1所述的引物组和权利要求2所述的探针。
4.根据权利要求3所述的用于快速鉴定鼠伤寒沙门菌及其单相变种的双重RT-RPA检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒还包括2×缓冲液A、ddH2O、缓冲液B。
5.根据权利要求4所述的用于快速鉴定鼠伤寒沙门菌及其单相变种的双重RT-RPA检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括2×缓冲液A 25μL，10μM上游引物各2μL、10μM下游引物各2μL，10μM相应的探针各0.6μL，缓冲液B 2.5μL、ddH2O。
6.一种用于快速鉴定鼠伤寒沙门菌及其单相变种的双重RT-RPA检测方法，其特征在于：该方法不以疾病的诊断和治疗为目的，主要包括以下步骤：
S1、提取待测样品的DNA；
S2、设计并合成权利要求1所述的双重RT-RPA引物组和权利要求2所述的双重RT-RPA探针；
S3、以提取的样品DNA为模板，进行双重RT-RPA扩增；
S4、对扩增产物进行曲线分析，确定样品是否为鼠伤寒沙门菌或沙门菌血清型4,[5],12:i-。
7.根据权利要求6所述的用于快速鉴定鼠伤寒沙门菌及其单相变种的双重RT-RPA检测方法，其特征在于：RT-RPA扩增反应体系为：2×缓冲液A 25μL，10μM上游引物各2μL、10μM下游引物各2μL，10μM相应的探针各0.6μL，细菌DNA模板5μL，缓冲液B 2.5μL、ddH2O；反应程序为：预热，39 ℃，40S；扩增，39 ℃，30 S，共40个循环。
8.如权利要求3所述双重RT-RPA检测试剂盒和如权利要求6所述的双重RT-RPA检测方法在鉴定鼠伤寒沙门菌及其单相变种方面的应用，其中鼠伤寒沙门菌的单相变种为沙门菌血清型4,[5],12:i-。
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