CN115725643A - NtMYB35转录因子在烟草抗黑胫病中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及NtMYB35转录因子在烟草抗黑胫病中的应用。本发明构建了SEQ ID NO:1所示的烟草NtMYB35转录因子过表达载体和敲除载体的转基因植株，分析了烟草疫霉侵染后植株木质素含量和参与木质素合成的基因表达水平，经分析可知NtMYB35转录因子属于R2R3‑MYB转录因子亚家族成员，能通过对木质素代谢途径基因的转录调控实现其对该途径的正向调节，进而显著增加烟草疫霉侵染后过表达株系和野生型植株的木质素含量，提高烟草抗黑胫病能力。

Description

NtMYB35转录因子在烟草抗黑胫病中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及NtMYB35转录因子在烟草抗黑胫病中的应用。

背景技术

烟草黑胫病是由寄生疫霉烟草变种(Phytophthora parasiticavar.nicotianae)侵染引起的毁灭性土传病害，属于高温高湿型病害，对气候的依赖性较高，在平均气温低于20℃时很少发生，平均气温在20～22℃时开始发病，在23℃以上发病迅速，在28～30℃发病最快。病原菌通过气孔、伤口或者直接穿透表皮的角质层侵染烟株茎基部和根部。菌丝侵入细胞后会分泌毒素和多元半乳糖醛酶分解细胞壁和导管壁，堵塞输导组织，导致烟株萎蔫死亡。

在与病原菌的协同进化中，植物进化出了复杂的免疫机制，主要包括细胞壁等组成的物理屏障以及PAMP病原体相关分子模式(pathogen-associated molecularpatterns，PAMP)诱导的免疫反应(PAMP-triggered immunity，PTI)和效应子诱导的免疫反应(effector-triggered immunity，ETI)。当病原菌入侵植物细胞时，植物细胞壁上的受体可以感受并通过激素传递入侵病原菌的信息，引发PTI和ETI过程，该免疫过程可以通过关闭气孔、爆发活性氧、激活相关信号通路、改变相关基因表达量、合成抗菌物质(如木质素、胼胝质、白藜芦醇等)和诱导植物细胞的程序性死亡等方式应对病原菌入侵。

烟草(Nicotiana tabacum L.)是全球最重要的经济和模式作物之一。根据相关资料显示，中国烟草种植面积160万公顷，约占世界总产量的40％，是全球最大的生产、出口和消费市场。近年来，由于烟田面积减少，连作增多，导致烟草黑胫病有加重发生的趋势。加之长期大面积的单一品种种植和连续使用同一种或作用机理相同的化学农药，促使黑胫病病原菌快速产生抗药性，并且导致烟叶农药残留偏高、烟叶生产成本提高等一系列问题突出，给卷烟吸食安全性和烟叶出口带来严重的不利影响。因此可以通过研究烟草对黑胫病的抗性机理，为培育抗病新品种和提高烟叶安全性提供见解及思路。综上所述，目前对烟叶中调控抗病性相关基因的克隆、功能分析和应用研究尤为迫切。

发明内容

本发明发现烟草NtMYB35转录因子能通过对木质素代谢途径基因的转录调控实现其对该途径的正向调节，进而显著增加烟草疫霉侵染后过表达株系和野生型植株的木质素含量，提高烟草抗黑胫病能力。

本发明采用以下技术方案：

本发明首先构建了NtMYB35转录因子过表达的烟草植株，以及NtMYB35转录因子敲除的烟草植株，具体如下：

一种过表达NtMYB35转录因子烟草的制备方法，步骤为：构建烟草NtMYB35转录因子的植物过表达载体，经农杆菌介导转化，侵染野生型烟草，通过培育和筛选获得NtMYB35-Oe(NtMYB35转录因子过表达)转基因阳性株系。

一种敲除NtMYB35转录因子烟草的制备方法，步骤为：构建烟草NtMYB35转录因子的植物敲除载体，经农杆菌介导转化，侵染野生型烟草，通过培育和筛选获得NtMYB35-CAS(NtMYB35转录因子敲除)转基因阳性纯合株系。

经检测转基因植株和野生型植株疫霉侵染后的表型特征、病情指数、病健交界处的ROS含量、抗氧化酶活性、患病部位的木质素含量、木质素代谢通路关键调控基因的表达水平，发现NtMYB35转录因子可以通过提高木质素含量，增加细胞壁的硬度，增强抗氧化能力，抑制ETI过程引起的过度程序性死亡来提高烟草植株对黑胫病的抗性。因此，上述NtMYB35转录因子过表达的转基因阳性株系为抗黑胫病烟草。NtMYB35转录因子敲除的转基因阳性纯合株系为易感黑胫病烟草。

其中，所述NtMYB35转录因子的序列如SEQ ID NO:1所示。所述野生型烟草为K326。

根据上述内容可知，SEQ ID NO:1所示的烟草NtMYB35转录因子可用于培育高木质素含量的烟草，以及培育抗黑胫病烟草。

本发明的有益效果为：

本发明构建了SEQ ID NO:1所示的烟草NtMYB35转录因子过表达载体和敲除载体的转基因植株，分析了烟草疫霉侵染后下植株木质素含量和参与木质素合成的基因表达水平，经分析可知NtMYB35转录因子属于R2R3-MYB转录因子亚家族成员，能通过对木质素代谢途径基因的转录调控实现其对该途径的正向调节，进而显著增加烟草疫霉侵染后过表达株系和野生型植株的木质素含量，提高烟草抗黑胫病能力。

本发明分析发现NtMYB35过表达烟草植株可以显著上调NtC4H、NtHCT和NtCOMT的表达量，促进患病部位木质素的生物合成，其含量分别是野生型烟草(WT)的1.64和1.77倍，还可以显著下调与植物细胞程序性死亡相关的NtR1-A和NtNB-ARC的表达量，抑制细胞程序性死亡的过度发生给烟草植株带来的危害，以此提高烟草对黑胫病的抗性。

附图说明

图1是在烟草疫霉侵染12h和72h后NtMYB35转录因子的表达量。

图2是NtMYB35转录因子在烟草表皮细胞中的亚细胞定位；GFP：绿色荧光蛋白；CHl：叶绿体自发荧光；DlC：明场；Merge：三个通道的叠加照片；GFP-CK：对照空载体；GFP-MYB；GFP-NtMYB35载体。

图3是本发明的重组表达载体pCAMBIA-NPT-NtMYB35和敲除载体NtMYB35Pore-Cas9/gRNA图谱。

图4是利用农杆菌介导的叶盘法将过表达载体转化入烟草体内，其中A为阳性对照，B为阴性对照，C为转基因叶片，D为过表达阳性鉴定，株系1、株系3、株系6、株系9、株系10、株系12为T0代株系，M：DL2000 Marker，WT为阴性对照，CK为空白对照，P为阳性对照；E为转基因和K326野生型烟草植株中NtMYB35转录因子的表达水平。

图5是利用农杆菌介导的叶盘法将敲除载体转化入烟草体内，其中A为阳性对照，B为阴性对照，C为转基因叶片，D为WT测序峰图，E为敲除阳性纯合株系测序峰图。

图6是本发明实施例提供的烟草疫霉侵染后烟草植株的表型变化，A：处理4天后的表型变化；B：处理4天后的根部变化；C：处理4天后的茎部解剖图；D：处理2天和4天后的病情指数；横排从左往右依次为：WT、OE9、OE10、ntmyb35-32和ntmyb35-39。

图7是本发明实施例提供的病健交界处的ROS含量，A：O₂ ^-含量；B：H₂O₂含量。

图8是本发明实施例提供的疫霉侵染后烟草抗氧化酶活性，A：CAT活性分析；B：POD活性分析；C：APX活性分析；D：POD活性。

图9是本发明实施例提供的患病部位木质素含量。

图10是本发明实施例提供的烟草疫霉侵染后的烟草木质素代谢通路调控基因表达量，A：NtHCT的相对表达量；B：NtCOMT的相对表达量；C：NtC4H的相对表达量。

图11是本发明实施例提供的烟草疫霉侵染后烟草茎部植物免疫信号传递基因表达量，A：NtR1-A的相对表达量；B：NtNB-ARC的相对表达量。

具体实施方式

下面通过具体实施方式对本发明进行更加详细的说明，以便于对本发明技术方案的理解，但并不用于对本发明保护范围的限制。

实施例1

1.确定NtMYB35转录因子响应烟草疫霉的侵染

从NCBI SRA数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/)中下载红花大金元幼苗在烟草疫霉侵染下的RNA-seq数据(PRJNA320659)，去除接头污染和低质量碱基，然后将其定位到烟草品种K326的参考基因组上，过滤后获得NtMYB35转录因子的表达量，如图1所示。结果表明，烟草NtMYB35转录因子可以响应烟草疫霉的侵染。

2.烟草NtMYB35转录因子的克隆

第一步：烟草叶总RNA的提取。

以K326幼叶为材料，按照PlantTotalDNAIsolation Kit(成都福际生物技术有限公司，中国成都)试剂盒提提供的方法提取总RNA；

第二步：烟草叶总cDNA和基因组总DNA的获得。

反转录使用的是HiScriptIIqRTSuperMixforqPCR(+gDNAwiper)(南京诺唯赞生物科技有限公司，中国南京)试剂盒，反转录总体系是20μL，包括12μL的RNA，4μL4×gDNAwiperMix(4μL)，4μL 5×HiScriptIIqRTSuperMixII，反转录后产物即为总cDNA；在本发明实施例中，反转录条件为：50℃15min，85℃5s。

烟草总DNA提取采用PlantTotalDNAIsolation Kit(成都福际生物技术有限公司，中国成都)试剂盒提取。

第三步：烟草NtMYB35基因克隆引物设计与PCR扩增。

选择NtMYB35 cDNA和基因组DNA的基因特异的位点，使用Prime5.0软件设计烟草NtMYB35转录因子克隆引物CAMNtMYB35-F/R，引物序列如表1所示。CAMNtMYB35-F/R中下划线部分表示与过表达载体同源的序列。

以烟草总cDNA为模板，使用CAMNtMYB35-F/R扩增烟草NtMYB35转录因子的开放阅读框。反应程序如下：94℃3min；94℃30s，60℃45s，72℃1min，35cycles；72℃10min。使用1％的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，使用百泰克胶回收试剂盒回收目的片段。NtMYB35转录因子的开放阅读框的序列为5’-ATGGGAAGATCACCAAGTTCTGATAAAAATGGACTCAAGA AAGGTCCTTGGACCTCAGAGGAAGATCATAAGCTCATAGAATATATTCAAGTTCATGGTCCTGGAAACTGGCGTAGCCTCCCTAAAAATGCTGGACTTCAAAGGTGTGGAAAGAGTTGTCGTCTTCGTTGGACGAATTATTTGAGACCAGATATTAAGAGAGGAAGATTCTCATTTGAAGAAGAAGAAACTATTATCCAACTTCACAGTGTTCTAGGCAACAAATGGTCAGCAATAGCTGCTCGTTTGCCAGGAAGAACGGACAATGAAGTAAAGAATTATTGGAACACACACATAAGAAAAAGGCTTCTAAGAATGGGACTTGATCCAGTAACTCACAGCCCTCGTCTTGATTTATTAGACTTATCATCCCTCCTTAACTCTACACAATTTAACCTTTCAAGTTTACTTGGACTACAAGCATTTGTAAACCCTCAAGTCTTGGCACTAATTTCTACAACCCTTTTTACATCCCATACAGAAAATCCAGAAATGTTATTACAAAGACAACTTCAAGAAAACCAATTTTTGAACGCACAAATACAAAACCAAGAAGGGTCTCAAGTGTTGTTGCAAAAATATCAAGAAAATCAAATTTTAAATGGCCCAATGGAAAACCCTACCCCAACTTTCCAACCTTATAATCAGTTCCAAGATCGGACTTCAGAAATACCAACATGCACTACATCAAACTTGGGATCATATAATTTGGTGAATGGCCAAAATTTACAAGAAAATGTGATGCTACCTTTGCAAAACTATGGCCAAATTTTACAAGAAAACTCCAGCGGTCAAAACTTTAGCTTTGATTCAGTGTTGTCAACACCATTGTCAAGCAGTACAGAAGATGAGAGAGATAGCTACTGCAGTAATTTCATGAAATTTGAAATTCCAGAAAGTTTATTTTTTGATGATTTAGTGTGA-3’，如SEQ ID NO:1所示。

3.NtMYB35转录因子在细胞中的亚细胞定位

将扩增得到的NtMYB35转录因子cDNA产物与pBWA(V)HS-ccdb-GLosGFP载体连接，构建亚细胞定位载体。挑选阳性克隆进行菌液PCR鉴定，并送阳性克隆测序，验证序列正确，将经过测序确认后的阳性载体质粒转化到农杆菌GV3101中，使用无菌注射器注入生长30天的K326叶片下表皮，使用空载体作为对照。在弱光下培养2天后，用激光共聚焦显微镜观察荧光的定位信号并拍照。

结果如图2所示，NtMYB35转录因子定位于细胞核。

4.烟草NtMYB35转录因子过表达载体和敲除载体的构建

烟草NtMYB35转录因子过表达载体构建及检验：按照In-

HD Cloning Kit说明书设计烟草NtMYB35转录因子cDNA的扩增引物对CAMNtMYB35-F/R，该引物对5′端为18bp载体同源序列。接着利用

PCR一步定向克隆试剂盒来进行扩增NtMYB35转录因子的cDNA作为目的片段。PCR扩增反应程序为：94℃：3min；94℃：30sec；60℃：45sec；72℃：1kb/30s；35个循环；72℃：10min。扩增体系为：cDNA模板1μL、正反引物各1μL、2×FastPfu Master Mix 10μL、ddH₂O 7μL。然后分别在30℃和37℃下用XbaI和XhoI双酶切过表达载体pART-CAM质粒(即pCAMBIA-NPT)，然后将目的片段与载体相连接，挑选阳性克隆进行菌液PCR鉴定，并送阳性克隆测序，验证序列正确，载体构建成功，载体名称为pCAMBIA-NPT-NtMYB35，即图3上所示的pART-CAM-MYB。

烟草NtMYB35转录因子敲除载体构建及检验：在CAS9靶位点设计的网站CRISPRPrimer Designer(http://www.multicrispr.net/index.html)上分析NtMYB35转录因子合适的靶位点，选择没有跨内含子和特异性高(无脱靶)的3个靶位点，对序列反向互补和添加接头后进行引物(Target1-F/R、Target2-F/R和Target3-F/R)合成，引物序列详见表1。用BsaI酶酶切Pore-Cas 9/gRNA(kana抗性)表达载体，用T4连接酶将引物二聚体和Cas9表达载体进行连接，挑选阳性克隆进行菌液PCR鉴定，并送阳性克隆测序，验证序列正确，载体构建成功，载体名称为NtMYB35 Pore-Cas9/gRNA，即图3下的BGK012-DSG载体。

表3引物信息

名称	序列(5′→3′)
		CAMNtMYB35-F	<u>GGAGAGGACACGCTCGAG</u>ATGGGAAGATCACCAAGTTC
CAMNtMYB35-R	<u>TTAAAGCAGGACTCTAGA</u>TCACACTAAATCATCAAAAAATAAAC
		NtMYB35-F	ATGGGAAGATCACCAAGTTC
NtMYB35-R	TCACACTAAATCATCAAAAAATAAAC
		NtMYB-F	AGAAGACGTTCCAACCACG
NtMYB-R	CGGTAAGGATCTGAGCTACAC
		Target1-F	GATTGTCACCAAGTTCTGATAAAAA
Target1-R	AAACTTTTTATCAGAACTTGGTGAC
		Target2-F	GATTGATAAAAATGGACTCAAGAA
Target2-R	AAACTTCTTGAGTCCATTTTTATC
		Target3-F	GATTGAAAGGTCCTTGGACCTCAG
Target3-R	AAACCTGAGGTCCAAGGACCTTTC
		CASNtMYB35-R	AGGGAGGCTACGCCAGTTT
NtR1-A-F	GGAGTTCCAAAGCCGCAA
		NtR1-A-R	TGTTTTCCTTCTCCCCCTT
NtNB-ARC-F	CCGTTTGAGGAGCATTTTAG
		NtNB-ARC-R	ACGAGAATGAAGACCTACTGGA
C4H-F	GGCAATCCCTCTTTTAGTCCC
		C4H-R	CTCCTACCAACACCAAATGGA
HCT-F	CTCAACCCACTCCCAACCAT
		HCT-R	GCCTCCTTTAGCACTTTTCCG
COMT-F	GATGTTGGAGGTGGTCTTGGA
		COMT-R	CTGGTTTCACTGGTAAAATGGC
L25-F	CCCCTCACCACAGAGTCTGC
		L25-R	AAGGGTGTTGTTGTCCTCAATCTT

5.转基因阳性植株的获得

将检测结果为阳性的过表达载体pCAMBIA-NPT-NtMYB35和NtMYB35Pore-Cas9/gRNA表达载体转入农杆菌GV3101感受态细胞中，黑暗条件下培养2～3d后挑取菌液进行PCR鉴定(所用引物为NtMYB-F/R(引物序列如表1))，将鉴定结果为阳性的菌液进行保菌。之后再用叶盘法转化到烟草品种K326中(图4和图5)。一共获得了6株过表达烟草植株(株系1、株系3、株系6、株系9、株系10和株系12)和2个敲除阳性纯合烟草植株(图5E)。

对获得的植株选择成功生根并生长发育良好的过表达株系和烟草品种K326野生型株系提取DNA，利用引物NtMYB35-F/R进行PCR阳性鉴定，以质粒(pCAMBIA-NPT)DNA作为阳性对照，PCR鉴定结果发现转基因株系中检测到与用于筛选的基因大小相同的片段(图4D)，表明目的基因成功插入到K326烟草基因组中。选择表达量较高的OE9和OE10株系(图4E)进行后续实验。

提取敲除株系(图5E)和野生型(图5D)的基因组DNA，然后送往GENEWIZ公司使用反向引物(CASNtMYB35-R)测序，获得在gRNA处删除AA碱基的突变体，选取纯合株系ntmyb35-32和ntmyb35-39进行后续试验分析。

6.转基因株系对黑胫病的耐受性的验证

野生型烟草(WT)种子和转基因株系种子(T2代)经消毒后播种至MS培养基中(过表达株系用含卡那霉素浓度为100μg·ml^-1的筛选培养基，野生型和敲除株系用正常MS培养基)，培养至烟苗高度为1.5cm时将烟苗移栽到漂浮育苗盘上培养，待烟苗长到6叶1心时移栽到直径为10cm、高为10cm的花盆中继续培养，花盆中土壤(常规农田土壤)和基质(购自德沃多(河北)的栽培基质)的体积比为1:1。移栽所用花盆、土壤和基质均需经过灭菌处理，其中基质105℃灭菌1.5h，土壤105℃灭菌2.5～3h，花盆用75％乙醇消毒，培养所用肥料为德沃多植物浓缩营养液(德沃多，河北)。培养至烟苗高度为20～25cm，茎部直径约为0.5～0.8cm时进行侵染处理。

侵染方法：用钢针在烟苗茎基部制造伤口，用直径0.5cm的打孔器在培养一周的疫霉培养基和无菌燕麦培养基上打孔，把菌饼接种在长势优良的野生型和转基因烟苗茎部，用钢针固定菌饼，用蘸水脱脂棉和胶带保湿，对照组接种无菌燕麦培养基，对照和处理各6个重复，于高温高湿环境下培养。

对野生型和转基因株系样品进行以下分析：

(1)分析侵染后各株系的表型特征和病情指数。结果如图6所示，处理2天后，OE9株系的病情指数显著低于其余四个株系；处理4天后，OE9和OE10株系的病情指数显著低于野生型，ntmyb35-32和ntmyb35-39株系显著高于野生型。与对照组相比，侵染后所有株系的茎基部和根部均受到不同程度的影响，野生型茎基部发生病变，髓部呈黑色，敲除株系茎基部和根部腐烂，而过表达株系茎基部和根部完好。对接种部位进行解剖，发现野生型接种部位韧皮部发生黑色病变，髓部干缩呈褐色，并有少量白色菌丝，病健交界处髓部黑褐色，并有逐渐加重的趋势，接种部位木质部无明显变化，但病健交界处的木质部有加厚的趋势；过表达株系仅接种部位韧皮部发生黑色病变，髓部无病变但体积相较于对照组显著减少，木质部显著加厚；敲除株系接种部位韧皮部完全坏死，髓部干缩呈褐色，有大量白色菌丝，木质部相较于对照组无明显加厚，且敲除株系茎部接种部位出现了明显的软化。

(2)分析病健交界处的ROS含量。结果如图7所示，未侵染的过表达株系的O₂ ^-的含量低于野生型和敲除株系，而H₂O₂含量无显著差异；疫霉侵染后过表达株系、敲除株系和野生型两种活性氧的含量均上升，但过表达株系H₂O₂和O₂ ^-的含量均显著低于野生型，敲除株系H₂O₂和O₂ ^-含量均显著高于野生型。与对照组相比，过表达株系H₂O₂和O₂ ^-的含量变化相对较小，而敲除株系的含量变化较大。

(3)分析疫霉侵染后的抗氧化酶活性。结果如图8所示，对照组过表达株系CAT和POD活性显著高于敲除株系和野生型，而APX和SOD活性无显著差异；烟草疫霉侵染后四种氧化酶活性均显著上升，且过表达株系氧化酶活性显著高于敲除株系和野生型，抗氧化能力更强。

(4)分析患病部位的木质素含量。结果如图9所示，未侵染疫霉的对照组NtMYB35过表达株系和野生型木质素含量显著高于敲除株系；疫霉侵染后NtMYB35过表达株系木质素含量显著高于野生型和敲除株系，与对照组相比，疫霉侵染后过表达株系和野生型的木质素含量分别增加了15％、90％和80％，而敲除株系几乎没有变化。各株系相比，NtMYB35过表达株系木质素含量分别是野生型的1.64和1.77倍，而敲除株系分别是野生型的0.57和0.55倍。

(5)用qRT-PCR测定木质素代谢通路关键调控基因和植物免疫信号传递基因的表达水平。具体的，设计NtC4H、NtHCT、NtCOMT、NtR1-A和NtNB-ARC的实时荧光定量PCR检测引物分别为C4H-F/R、HCT-F/R、COMT-F/R、NtR1-A-F/R、NtNB-ARC-F/R(以L25-F/R为内参基因引物)，见表1，以检测转基因植株中NtC4H、NtHCT、NtCOMT、NtR1-A和NtNB-ARC五种基因的表达量变化。结果如图10和11所示，未侵染疫霉的对照组除过表达株系NtCOMT基因表达量显著高于野生型和敲除株系外，其余基因表达量无显著差异。疫霉侵染后过表达株系NtHCT、NtCOMT和NtC4H的表达量显著高于野生型，而敲除株系的表达量则显著降低。

总的来说，NtMYB35转录因子可以通过提高木质素含量，增加细胞壁的硬度，增强抗氧化能力，抑制ETI过程引起的过度程序性死亡来提高烟草植株对黑胫病的抗性。

以上所述之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，并非限制本发明的实施范围，故凡依本发明专利范围所述的构造、特征及原理所做的等效变化或修饰，均应包括于本发明申请专利范围内。

Claims (6)

1.SEQ ID NO:1所示的烟草NtMYB35转录因子在提高烟草木质素含量中的应用。

2.SEQ ID NO:1所示的烟草NtMYB35转录因子在培育抗黑胫病烟草中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，包括以下内容：构建烟草NtMYB35转录因子的植物过表达载体，经农杆菌介导转化，侵染野生型烟草，通过培育和筛选获得NtMYB35转录因子过表达转基因阳性株系，即为抗黑胫病烟草。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述野生型烟草为K326。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，构建烟草NtMYB35转录因子的植物过表达载体，包括以下内容：在30℃和37℃下用XbaI和XhoI双酶切过表达载体pART-CAM 质粒，然后将SEQ ID NO:1所示的烟草NtMYB35转录因子与载体相连接，挑选阳性克隆进行菌液PCR鉴定，阳性克隆测序，验证序列正确，载体构建成功。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，SEQ ID NO:1所示的烟草NtMYB35转录因子是以烟草总cDNA为模板，使用CAMNtMYB35-F/R扩增得到的，其中CAMNtMYB35-F：′-GGAGAGG ACACGCTCGAGATGGGAAGATCACCAAGTTC-3′，CAMNtMYB35-R：′-TTAAAGCAGGACTCTAGATCACACTAAATCATCAAAAAATAAAC-3′；CAMNtMYB35-F/R中下划线部分表示与过表达载体同源的序列。

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