CN115725540A

CN115725540A - 鞘磷脂酶及其应用

Info

Publication number: CN115725540A
Application number: CN202211390511.XA
Authority: CN
Inventors: 刘鹏飞; 孙丰廷; 郑长龙; 赵占勇
Original assignee: Beijing Dacheng Biotechnology Co ltd
Current assignee: Beijing Dacheng Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-11-07
Filing date: 2022-11-07
Publication date: 2023-03-03

Abstract

本发明公开了一种鞘磷脂酶，具有良好的耐热能力；还提供一种鞘磷脂酶在小而密低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒中的应用，使试剂盒具有抗干扰能力强、检测值范围宽且稳定性好的优点。

Description

鞘磷脂酶及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地，涉及一种鞘磷脂酶及其应用。

背景技术

鞘磷脂酶是鞘脂类代谢途径中一类十分重要的水解酶，鞘磷脂在其作用下水解产生神经酰胺，所以鞘磷脂酶也被认为是控制神经酰胺合成的关键酶之一。基于其催化反应最适pH分为酸性鞘磷脂酶(Acid sphingomyelinase，aSMase)、中性鞘磷脂酶(Neutralsphingomyelinase，nSMase)和碱性鞘磷脂酶(Alkaline sphingomyelinase，alkSMase)。中性鞘磷脂酶(nSMase)是鞘磷脂－神经酰胺代谢途径中的关键酶，能够水解鞘磷脂产生神经酰胺和磷酸胆碱，参与细胞凋亡、细胞增殖、炎症和骨骼发育等生物学过程，中性鞘磷脂酶是鞘磷脂检测试剂盒中的关键酶，然而目前应用于生产中的产品非常少，价格昂贵且需要大量进口。

低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平升高是独立的致动脉粥样硬化危险因素,而小而密低密度脂蛋白胆固醇(sdLDL-C)作为LDL的主要组分，相对与大而轻低密度脂蛋白(LLDL)而言，由于其对血管壁的高侵入性，与LDL受体的低亲和性、更长的血浆半衰期且对于氧化应激的低耐受性，导致sdLDL-C更容易致动脉粥样硬化。

因此，提供一种抗干扰能力强、检测值范围宽且稳定性好的小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒，是满足临床开展小而密低密度脂蛋白胆固醇检测的迫切需求，同时也为动脉硬化性心血管疾病(ASCVD)的防控和危险评估领域的发展提供支持。

发明内容

本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供一种，鞘磷脂酶，本申请的鞘磷脂酶的具有良好的耐热能力。

提供一种鞘磷脂酶在小而密低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒中的应用，使试剂盒具有抗干扰能力强、检测值范围宽且稳定性好的优点。

为了实现根据本发明的这些目的和其它优点提供了一种鞘磷脂酶，所述鞘磷脂酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

提供一种编码鞘磷脂酶的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

提供一种包括所述基因的重组载体。

提供一种鞘磷脂酶在小而密低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒中的应用。

优选的是，所述的试剂盒由试剂R1、R2组成，具体组成组分包括：

R1：鞘磷脂酶、N,N-二羟乙基甘氨酸、胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、过氧化氢酶、N-乙基-N-(2过氧根基-3-磺酸丙基)-3-甲基苯胺；

R2：将N,N-二羟乙基甘氨酸、过氧化氢酶、氨基安替比林。

本发明至少包括以下有益效果：

首先，本申请的重组鞘磷脂酶大肠杆菌工程菌培养快速简单，诱导条件容易控制，生产成本低，具有工业化生产的潜力。更为重要的是由本申请发酵而获得的重组鞘磷脂酶具有鞘磷脂酶活性。同时还对获得的重组鞘磷脂酶进行最适作用pH稳定性、最适作用温度及温度稳定性分析。结果显示该重组鞘磷脂酶的温度稳定性和pH稳定性非常好，表明该重组鞘磷脂酶具有良好的耐热能力。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1为鞘磷脂酶在25℃的温度下不同pH中的稳定性图；

图2为鞘磷脂酶在37℃的温度下不同pH中的活性图；

图3为鞘磷脂酶在不同温度下的活性图；

图4为在100mL Tris-HCL中鞘磷脂酶在不同温度下的稳定性图；

图5为鞘磷脂酶电泳图；

图6为小而密低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒标准曲线图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

本申请的实施例提供了鞘磷脂酶，所述鞘磷脂酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，SEQ ID NO.1为mvsrrtatal tsaaaallig tggftaptas aatgtglsvf awnvdlgtaivdstqheqaa qrtptvesvi rehsadvvvl dedfnnssta ditgkladly pyhtpvvget csgggwtgisgdcsnspfvi nggtmilsky pitaqyahvf snstygtwdy hankgaalvq idkggvkswv vgthlqadesdtstdttqat rlaqlgeirs wvdgiagsng pvliggdmnv eyyggqsrgd yanaqsavng vlgtpatdssqtlrtmdcpv sawcqymsgv esfpkdyrdd ldyigylnap grpapaamsa vkvdfdpqsg wttgqtdtnapsdhypveaa。

本申请的实施例提供了编码鞘磷脂酶的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示，SEQ ID NO.2为：atggtctcgc gtcgtaccgc taccgccctc acctccgcgg cggcagccctgctgatcggc accggcggct tcacggcccc caccgcgagc gcggccaccg gcaccggcct gtcggtgttcgcctggaacg tcgacctcgg caccgcgatc gtcgacagca cccagcacga gcaggcggcc cagcgcaccccgaccgtcga atcggtcatc cgcgagcaca gcgcggacgt ggtggtgctg gacgaggact tcaacaacagctccaccgcc gacatcaccg gcaagctggc cgacctctac ccgtaccaca ccccggtcgt cggcgagacctgttccggcg gcggctggac gggcatcagc ggcgactgct ccaactcgcc gttcgtcatc aacggcggcacgatgatcct gtccaagtac ccgatcaccg cccagtacgc ccacgtcttc agcaactcca cctacggcacctgggactac cacgccaaca agggcgcggc gctggtgcag atcgacaagg gcggggtgaa gagctgggtggtcggcaccc acctccaggc cgacgagtcc gacacctcca ccgacaccac acaggccacc cggctcgcccaactcggcga gatccgcagc tgggtggacg gcatcgccgg gtcgaacggg ccggtgctga tcggcggcgacatgaacgtg gagtactacg gcggccagtc gcgcggcgac tacgccaacg cccagagcgc ggtgaacggtgtcctcggca cccccgccac cgactcctcc cagaccctgc ggaccatgga ctgcccggtc tccgcctggtgccagtacat gtccggcgtc gagtccttcc ccaaggacta ccgggacgac ctcgactaca tcggctacctgaacgcaccg ggccgtccgg ccccggccgc gatgtccgcc gtcaaggtcg acttcgaccc ccagtccggctggaccacgg gccagaccga caccaacgcc cccagcgacc actacccggt cgaggcggcc ttccagatcggctag。

本申请的实施例提供了包括所述基因的重组载体。

本申请的实施例提供了鞘磷脂酶在小而密低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒中的应用。

在另一种技术方案中，

所述的试剂盒由试剂R1、R2组成，具体组成组分包括：

R2：将N,N-二羟乙基甘氨酸、过氧化氢酶、氨基安替比林。

实施例1鞘磷脂酶基因的克隆

菌种活化：一株链霉菌FXJ1.172接种于GYM固体培养基上进行活化。用无菌竹签从甘油保藏管中取适量菌种接种于GYM固体培养基上进行划线培养，放入28℃培养箱恒温培养5-7d，培养至气生菌丝、孢子丝形成完毕。

菌种发酵：将活化好的菌体接种于GYD液体培养基中，放于摇床中(28℃，175r/min)条件下培养7d，提取质粒DNA。

以鞘磷脂酶的核苷酸序列为基础序列设计引物，以链霉菌质粒DNA为模板进行PCR扩增得到鞘磷脂酶基因，扩增程序：94℃,5min；(94℃,30s；55℃-65℃,45s 72℃,1min40s)30cycle；72℃,10min；4℃，10min；将PCR产物回收后用同源重组的方法，连接至表达载体pET-28a(+)得到pET28a-nSMase，其DNA序列如SEQ ID NO.2所示。

实施例2含鞘磷脂酶基因的重组质粒pET28a-nSMase及携带该质粒的菌株

E.coli-Top10/pET28a nSMase的构建。质粒pET28a-nSMase鞘磷脂酶基因后面带有终止密码子TAG。得到重组质粒pET28a-nSMase。含有正确重组质粒pET28a-cre的克隆菌株E.coli-Top10/pET28a-nSMase加25％甘油于-80℃保存。

实施例3鞘磷脂酶生产菌株Escherichia coli-BL21(DE3)/pET28a-nSMase的构建及重组鞘磷脂酶的表达

将重组质粒pET28a-nSMase转化Escherichia coli-BL21(DE3)感受态细胞，并在卡那霉素抗性平板进行阳性转化子筛选。以卡那霉素抗性平板筛选得到的转化子为模板，以F和R为引物进行PCR鉴定，PCR鉴定正确的转化子初步鉴定为鞘磷脂酶生产菌株Escherichia coli-BL21/pET28a-nSMase。

挑取3个PCR鉴定正确的转化子接种到LB培养基，37℃，120rpm培养16h，然后将培养的菌液按1％接种量转接至1000mL的TB液体培养基(50μg/mL卡那霉素)中，37℃，120rpm培养至OD₆₀₀约为0.4-0.8。降温至20℃，120rpm条件下培养12-18h；8000rpm离心15min处理发酵液，除去上清，用蒸馏水将菌体洗涤两次后加入10mM PBS(pH7.4)悬浮细胞，在冰浴条件下利用超声波细胞粉碎机对重组大肠杆菌进行破碎；对破碎后的悬浮液进行冷冻离心处理，8000rpm，4℃，40min，取离心上清液。用亲和层析方法对菌体破碎上清液中的重组鞘磷脂酶进行纯化。经纯化的重组鞘磷脂酶在4℃保存。

实施例4纯化的重组鞘磷脂酶的酶学性质

鞘磷脂酶酶活的测定方法：

试剂

A液：

0.2M Tris–HCl buffer pH8.0 0.25Ml；10mM MgCL₂溶液0.20mL；10mM鞘磷脂溶液0.10mL；500U/mL ALP溶液0.02mL；120U/mL COD溶液0.084mL；100U/mL POD溶液0.02mL；0.2％4–AA溶液0.10mL；0.2％ TODB溶液0.10mL；1.0M NaCL溶液0.01mL；1％(W/V)TritonX–100溶液0.10mL；纯化水0.016mL；

B液：10mM Tris–HCL buffer pH8.0包含0.1％(W/V)TritonX–100和10mM NaCl.

C液：1.0％(W/V)SDS溶液。

检测步骤：

S1、加入A液1mL预热至37℃；

S2、3min后加入40μL酶溶液混匀，空白对照加入40μLB液混匀；

S3、10min后加入2mLC液终止反应；

S4、测量546nm波长；

样品：As/min；空白：Ab/min；0.070Abs/min≦△A/min＝As/min－Ab/min

≦0.450Abs/min；

计算：

上式中，

16：TODB在546nm处的毫克分子消光系数；

1/2：2moL H₂O₂产生1mol染料；

2：由1moL的鞘磷脂产生2摩尔染料；

10：反应时间(min)

3.04：反应液总体积(3.04mL)

0.04：酶溶液的体积(mL)

X：样品在酶溶液中的浓度(mg/mL)。

经测定，如图1为鞘磷脂酶在25℃的温度下不同pH中的活性图，可以看出在25℃的温度下pH的稳定范围是5.0-8.0；

如图2为鞘磷脂酶在37℃的温度下不同pH中的活性图，可以看出在37℃的温度下pH7.0-8.0时活性最高；

如图3为鞘磷脂酶在不同温度下的活性图，可以看出鞘磷脂酶的最适温度为40℃；

如图4为在100mL Tris-HCL中鞘磷脂酶在不同温度下稳定性图，有图可以看出，鞘磷脂酶在无镁离子存在时40℃下稳定，加入50mM MgCl2后，50℃30min后仍保持80％的活性；

图5为鞘磷脂酶电泳图。

本申请中性鞘磷脂酶基因工程菌株提取到基因序列，并通过自己构建的载体在大肠杆菌中进行表达与筛选，得到中性鞘磷脂酶，得到的中性鞘磷脂酶的热稳定性好，能耐40℃高温30min，加入氯化镁后稳定性更佳。在用于发酵法生产得到中性鞘磷脂酶的应用中，生产能力高，酶活能达到20KU/L。而且，在发酵生产中性鞘磷脂酶的应用中，能够在不改变原有的生产过程，工艺步骤的情况下，使微生物发酵法生产中性鞘磷脂酶的生产能力提高，适合中性鞘磷脂酶大规模工业化生产,具有很高的应用价值和工业实用性。

实施例5小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒的制备

(1))制备R1：鞘磷脂酶、N,N-二羟乙基甘氨酸、胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、过氧化氢酶、N-乙基-N-(2过氧根基-3-磺酸丙基)-3-甲基苯胺适量分散在缓冲液中为R1；

(2)制备R2：将N,N-二羟乙基甘氨酸、过氧化氢酶、氨基安替比林适量分散在缓冲液中为R2；

(3)制备校准品：浓度分别为0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mmoL/L sdLDL-C的PBS缓冲溶液；

(4)上机检测：采用该试剂盒进行检测，采用具有500nm～700nm波长的全自动生化分析仪(日立7080型)，反应温度为37℃，样本体积为3μL，试剂R1体积为150μL，反应时间5min，测定样本吸光度，之后加入试剂R2体积为50μL，37℃恒温检测时间5min，测定样本吸光度，以上测定吸光度时选定的主/副波长为600/700nm，测定方法为两点终点法，定标曲线的方式为两点定标。

测定条件：(以日立仪器7080为例)如表1所示；

表1

产品名称：	sdLDL-C
		检测参数：	3/150/50
检测波长：	600/700
		检测方法：	2POINT END
读点信息：	16--31
		检测仪器：	日立7080
校准品：	0.708mmol/L

操作步骤见表2；

表2

实施例6小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒的参数评价

小而密低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒标准曲线

采用低密度脂蛋白胆固醇标准品，浓度分别为0、0.095、0.206、0.444、0.934、1.423、1.912、2.400mmol/L，以实验例5为例，按照上述测定步骤得到，测定低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒标准曲线(如图6所示)。其中，标准品的吸光度变化值ΔA(A标准-A空白)为纵坐标，以相应的标准品浓度c为横坐标，标准曲线方程：y＝2.4436x-0.0433R²＝0.998。

表3

线性范围测试

使用生理盐水分别配制浓度为、0.08、0.16、0.33、0.65、1.3、2.6mmol/L的低密度脂蛋白胆固醇标准品，分别用实施例1-5和对比例5所述的试剂盒测定低密度脂蛋白胆固醇的含量，结果见表4。

表4

稳定性试验1

在2℃～8℃、无腐蚀性气体的避光环境中贮存低密度脂蛋白胆固醇浓度为

1.30mmol/L的样本，检测实施例1-5及对比例试剂盒的稳定性。每月1号分别用两组试剂测定同一混合血清样本，测定三次取平均值，检测数据如表5所示。

表5

稳定性实验2：试剂R1加速开瓶稳定性实验

试剂R1在2℃～8℃和37℃无腐蚀性气体的避光环境中开瓶贮存，从第2天开始连续定标检测质控1、质控2和样本，观察试剂盒稳定性，至第14天，检测数据如表6所示。

表6

精密度试验

将实施例以及对比例所制得的小而密低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒对多个质控和样本进行的多次反复测定，对所得的结果进行SD和CV的计算，检测数据如表7。

表7

抗干扰实验

在正常血清中各自添加一定抗坏血酸、肝素锂和肝素钠，同时加入等体积的去离子水作为无干扰物血清，使用实施例1-5的LDL-C测定试剂盒，同时测定样本的浓度。以干扰程度为5％为测定系统对干扰物的最高忍受限，血清中抗坏血酸1g/L以下、肝素锂200U/mL以下和肝素钠200U/mL以下，不影响LDL-C测定结果。

本发明所使用的试剂简单易得，通过控制各种试剂的浓度比，明显提高了试剂盒的准确性、精密性以及稳定性，降低了试剂盒的成本，有利于试剂盒在临床的广泛应用。

以上述数仅为本发明的较佳实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围内。

表8

将实施例和比较例1～2试剂盒用于标准样品的检测，采用行业通用的方式对上述试剂盒进行性能评价，结果如下：

(1)最低检测限检测方法：取不同浓度梯度的低浓度值样本进行检测，每份样本检测5次，对检测结果按照大小进行排序，符合如下条件，即可得到空白限和检出限的范围；低于空白限数值的检测结果的数量应小于或等于3个。

检测结果：sdLDL-C的最低检测限≤0.20mmol/L。

(2)准确度

与已上市产品进行比对试验：相关系数r≥0.975，在[0.104，0.777]mmol/L区间内测定的偏差应不超过±0.0777mmol/L，在[0.777，2.59]mmol/L区间内测定的偏差应不超过±10％。

(3)测量精密度

对同一血清样本重复测定10次，其测定值的变异系数(CV％)应不大于10％。

(4)线性范围

在[0.104，2.59]mmol/L区间内，线性相关系数r≥0.990，在[0.104，0.777]mmol/L区间内测定的线性偏差应不超过±0.0777mmol/L，在[0.777，2.59]mmol/L区间内测定的线性偏差应不超过±10％。

(5)分析灵敏度

样本浓度为2.59mmol/L时，其吸光度变化在0.0500～0.2500之间。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims

1.鞘磷脂酶，其特征在于，所述鞘磷脂酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.编码鞘磷脂酶的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.包括权利要求2所述基因的重组载体。

4.鞘磷脂酶在小而密低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的试剂盒由试剂R1、R2组成，具体组成组分包括：

R2：将N,N-二羟乙基甘氨酸、过氧化氢酶、氨基安替比林。