CN115725452B - 一株奥托类芽孢杆菌、菌剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一株奥托类芽孢杆菌、菌剂及其应用，涉及微生物开发与应用技术领域。所述奥托类芽孢杆菌为奥托类芽孢杆菌(Paenibacillus ottowii)KY616，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.25565。本发明筛选得到一株杀藻能力较强的微生物菌株KY616，同时经过实验验证，发现该菌株KY616还具有广谱杀植物病害病原菌、解磷、解钾、活化硅的功能，并且还可与多种农药一起使用，具有与农药复配的潜力，该菌株在农业生产以及生物防治方面具有巨大的应用潜力和良好的应用前景。

Description

一株奥托类芽孢杆菌、菌剂及其应用

技术领域

本发明涉及技术领域，尤其是涉及一株奥托类芽孢杆菌(Paenibacillusottowii)、菌剂及其应用。

背景技术

水体富营养化是指水体中氮、磷等植物生长所必需营养元素大量增加导致的水生生态系统的生产力大幅度增加的现象，包括水华和赤潮(龚雄虎，2018；

A等，2021)。

农业面源污染是造成水体富营养化的主要原因之一。例如化肥施用量过高，不被农作物吸收的化肥随地表径流进入水体，造成氮、磷等营养物质进入水体(王菲，2017)。在夏季高温及强紫外线的作用下，水中的营养物质促使藻类和微生物大量繁殖，在淡水中就会出现水华现象，在海洋中叫做赤潮。当藻类自然死亡后，细菌分解这些有机物时需要消耗溶解在水中的氧气，导致水体溶解氧含量下降，大量水生生物死亡，进一步促进细菌繁殖，导致水体发黑发臭，破坏了生态环境，成为淡水生态系统的主要生态环境问题之一。另外，作为供水厂水源的湖泊、水库等爆发藻类污染将给供水带来极大挑战，给人们的生活带来不便。同时，研究表明，某些藻类会释放藻毒素，给饮用水安全带来威胁。富营养化已经成为导致水质恶化的最主要因素。因此，藻类的污染防治具有重大意义。

目前，针对藻类的污染现象(水华、赤潮)的防治方法主要包括物理法、化学法和生物法(叶益华等，2022)。物理方法主要通过打捞藻类的手段实现，可以快速从富藻水中移除藻细胞，降低水中营养盐，从而有效地推迟其暴发(Xu Shengjun等，2022)。但是其处理能力受限，投入高，无法根除藻华，尤其是打捞丝状藻类，会加快丝状绿藻增殖，易出现“捞不净、越捞越多”的现象。化学方法主要是通过加入化学杀藻剂灭藻，比如氧化剂(H₂O₂、O₃、氯化物等)、除藻剂(硫酸铜、异噻唑啉酮等)、抗生素等。化学方法是现阶段见效快、效果好、操作简单的应急技术(陈修康，2021)。然而，杀藻剂不是藻类专杀剂，会对微生物、动植物造成损害，进而导致生态系统的失衡与退化。并且长期投用某些非氧化类药剂，藻类易产生抗药性。市面上广泛用作杀藻剂的硫酸铜是一种重金属盐类，使用后不可避免地产生毒副作用。首先是破坏水质环境，硫酸铜在水中溶解后所产生的硫酸根离子，在缺氧条件下还原成硫化物和硫化氢毒素，产生强烈毒害作用，引起鱼类中毒和缺氧死亡。其次是产生慢性中毒症状，影响鱼类正常生长。硫酸铜的铜离子通过渗透作用进入鱼体，破坏造血组织和损害肝胰脏细胞，还引起鱼的肾细管扩张及组织细胞坏死，降低肠道消化酶活性，抑制了鱼类正常生长发育。实验表明，用硫酸铜清除水华不仅毒副作用大，而且效果也不理想，是一种治标不治本的方法。生物方法是现阶段被认为对环境友好的除藻手段，其具有快速简单、无药残、低耗能、安全、不产生二次污染的优点，具有广阔前景(Gallardo-Rodríguez JJ等，2019)。其中，利用微生物控制藻类水华的实践得到了广泛关注(Coyne K J等，2022)。Xu等在大鹏湾搭建了500L含蓝藻的对虾养殖试验塘，用蜡样芽孢杆菌菌剂(Bacillus cereus CZBC1)对蓝藻虾塘进行了溶藻试验，56d后蓝藻的溶藻率高达93.75％。因此，利用微生物对藻类污染进行防治具有一定的发展潜力和前景。

此外，近年来藻类污染也发生在水田和旱地，并且已经影响到农作物的生产(曹彦圣等，2021)。同时，水田和旱地的藻类污染常常不是单独发生，而是伴随着土传病害和磷、钾等营养失衡同时发生。目前，针对藻类污染、土传病害和磷、钾等营养失衡的微生物鲜有报道。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一株奥托类芽孢杆菌(Paenibacillus ottowii)、菌剂及其应用。本发本研究开发了一株可高效杀藻、防治土传病害(即可广谱杀植物病害病原菌)并且具有可活化磷、钾的功能的微生物，为丰富微生物资源提供了基础，也为藻类污染、土传病害和磷、钾等营养失衡等问题的解决提供了方法和途径。

本发明提供的技术方案如下：

在一个方面，本发明提供了一株奥托类芽孢杆菌，所述奥托类芽孢杆菌为奥托类芽孢杆菌(Paenibacillus ottowii)KY616，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.25565。

本发明通过高通量筛选，得到一株具有高效杀藻、广谱杀植物病害病原菌、活化硅、解磷、解钾能力且可与农药复配的多功能微生物KY616。根据对其16sDNA序列测定结果，同时与国际细菌学委员会认可的16sRNA数据库(chun’s lab)进行序列比对并结合文献分析来确定目标微生物的分类地位(Yoon,S.H.,Ha,S.M.,Kwon,S.,Lim,J.,Kim,Y.,Seo,H.and Chun,J.(2017).Introducing EzBioCloud:A taxonomically united database of16S rRNA and whole genome assemblies.Int J Syst Evol Microbiol.67:1613-1617)，比对结果表明，该菌株确定为Paenibacillus ottowii。

Paenibacillus ottowii最初是从德克萨斯州派洛特的牛粪主要厌氧发酵系统中的巴氏杀菌溶液样品中分离得到(Velazquez L F，2022)，文献对其报道鲜少，已有报道主要集中在其生防功能上，例如对梨炭疽病菌、梨黑斑病菌、梨轮纹病菌、梨腐烂病菌等梨树上常见病原真菌、水稻纹枯病菌、番茄灰霉病菌、油菜菌核病菌、马铃薯晚疫病菌等病原菌具有拮抗作用。该菌种的其他功能和应用还没有报道，本发明筛选的奥托类芽孢杆菌(Paenibacillus ottowii)KY616菌株是一个新的菌株，其具有的杀藻、杀植物病原菌、活化硅、解磷、解钾、可与农药复配等功能的报道属于世界首次。

在本发明中，所述奥托类芽孢杆菌(Paenibacillus ottowii)KY616的16S rDNA的序列如SEQ ID No.1所示。奥托类芽孢杆菌(Paenibacillus ottowii)KY616在培养基上菌落形态菌落呈白色至奶白色的圆形菌落，表面光滑，边缘不规则；经显微镜(100倍油镜)测定其菌体长度约3-6μm。

在一个方面，本发明提供了一种菌剂，所述菌剂的活性成分含有前述的奥托类芽孢杆菌(Paenibacillus ottowii)KY616的菌体、菌液或其发酵物。

所述微生物菌剂包括液体微生物菌剂和固体微生物菌剂。所述菌剂的剂型为可湿性粉剂、水分散粒剂、水悬浮剂或可分散油悬浮剂。当所述菌剂为固体微生物菌剂时，所述固体微生物菌剂由所述的菌株附加固态载体和/或助剂制备而成，所述固态载体包括草炭、糠粉、麦麸、高岭土、轻质碳酸钙、硅藻土、白炭黑、滑石粉、细沙以及粘土中的一种或多种；所述助剂选自蔗糖、葡萄糖、蛋白胨、豆粕、十二烷基苯磺酸钠、木质素磺酸钠、烷基萘磺酸钠缩聚物中的一种或多种的混合物。

在本发明中，将所述微生物菌株利用培养基进行培养，可以得到发酵菌剂；将所述发酵菌剂进行干燥，可以得到菌粉。

在本发明中，液态菌剂可通过常规的灌根、浸种、喷雾方法施用，固态菌剂可通过根施、穴施方法使用，单独使用或者与对所述菌剂无副作用的杀菌剂、植物调节剂等混合使用。

在另一个方面，本发明提供了前述的奥托类芽孢杆菌(Paenibacillus ottowii)KY616或前述的菌剂在以下一个或多个方面中的应用：

(a)杀藻或制备溶藻产品或水体净化；(b)解硅或活化硅；(c)解磷；(d)解钾；(e)拮抗植物病原菌或防治植物病害。

本发明在含藻类培养基上培养时，KY616菌落附近可形成透明圈，表明其具有杀藻能力，可用于杀藻、除藻或制备溶藻产品，进而可用于净化水体，改良水质。此外本发明菌株还具有解硅、解钾以及解磷能力。可将所述菌株用于制备具有解硅、溶磷解钾功能的接种剂或促进硅元素、磷元素或钾吸收的制剂。可用于应用于增加土壤可溶性有效钾和磷，改良了土壤品质，调节土壤中的营养平衡。

本发明的奥托类芽孢杆菌(Paenibacillus ottowii)KY616菌株可用于制备杀藻剂。也可以用于具有解钾功能、解硅功能、解磷功能的生物产品；也可以用于制备生物防治产品如植物病菌拮抗剂，也可以用于制备肥料添加剂、肥料、植物生长改良剂或土壤改良剂等。

在一个实施方案中，所述藻包括蓝绿藻；优选地，所述蓝绿藻包括铜绿微囊藻、水华微囊藻、小球藻和鱼腥藻中的一种或多种。

在一个实施方案中，所述水体净化包括治理水华和/或赤潮。本发明的奥托类芽孢杆菌(Paenibacillus ottowii)KY616菌株可用于解决水体富营养化等问题。

在一个实施方案中，所述解磷包括降解培养基或土壤中的无机磷酸盐。

所述解钾包括降解培养基或土壤中的含钾矿物，所述含钾矿物包括钾长石。

在一个实施方案中，所述植物病害包括真菌性病害和细菌性病害，所述真菌性病害包括棉花枯萎病、西瓜枯萎病、香蕉枯萎病、根腐病、灰霉病、小麦纹枯病、苹果落叶斑点病、番茄早疫病、棉花黄萎病中的一种或多种；所述细菌性病害包括青枯病、白叶枯病、软腐病的一种或多种。

在另一个方面，本发明提供了一种抑制藻类生长或除藻的方法，所述方法包括使用如前述的奥托类芽孢杆菌(Paenibacillus ottowii)KY616或者如前述的菌剂处理藻体。

在另一个方面，本发明提供了一种农药组合物，所述农药组合物包含前述的奥托类芽孢杆菌(Paenibacillus ottowii)KY616或前述的菌剂以及农业上使用的农药。

在一个实施方案中，所述农业上使用的农药包括敌磺钠、咯菌腈、三氯乙腈尿酸、甲基硫菌灵、精甲霜灵、辛菌胺醋酸盐水剂、恶霉灵中的一种或多种。

在一个实施方案中，所述农药的浓度为45％的敌磺钠的200-500倍液、2.5％的咯菌腈、0.2％的三氯乙腈尿酸原药、0.4％的福美双、50％的甲基硫菌灵的700倍液、92％的精甲霜灵的333倍液、20％的辛菌胺醋酸盐水剂的2000倍液、98％的恶霉灵的500倍液。

在本发明的一个实施方案中，实施农药组合物还包括农药学上可接受的辅料，所述农药学上可接受的辅料选自分散剂、润湿剂、崩解剂、粘结剂、消泡剂、抗冻剂、增稠剂、填料和溶剂中的一种或多种。

此外，本发明还提供了所述的农药组合物在植物病害防治中的应用。将本发明的菌株或菌剂或农药组合物用于提高土壤钾磷利用率并防治植物土传病害，例如通过施用所述菌株的菌粉、菌饼、发酵液、菌悬液、孢子悬液和/或含有其的菌剂等。

生物样品保藏信息：奥托类芽孢杆菌(Paenibacillus ottowii)KY616，该菌株已于2022年8月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏号为：CGMCC No.25565；保藏地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。经保藏中心于2022年8月22日检测为存活菌株。

有益效果：

本发明提供的奥托类芽孢杆菌(Paenibacillus ottowii)KY616菌株，是一株综合性能非常优异的菌株，其具有较强的杀藻能力，可利用其对藻类污染进行防治。此外，该菌株还具有较强的杀菌活性且杀菌谱非常广，能有效抑制多种病原细菌和病原真菌，从而防止植物病害的发生。同时，该菌株还兼具解硅、解磷以及解钾功能，可制备微生物肥料，提高土壤磷、钾的有效利用率，节肥增产。

通过对农药敏感性的测试，本发明菌株KY616可在部分农药存在的情况下生长良好，具有与农药复配的潜力，可用于制备农药组合物，与常规农药一起发挥作用，协同解决植物所面临的土传病害和磷、钾等营养失衡同时发生的情况。

本发明菌株及含有其的菌剂对充分发挥土壤生态肥力、保持农业生态环境的平衡等均具有极其重要意义和应用价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例提供的高通量筛选得到的具杀藻微生物的示意图，其中，杀藻微生物如图中方框所示，方框中A菌产生的抑菌圈半径r为2mm；

图2为本发明实施例提供的菌株KY616在显微镜下的情况(100倍油镜)；

图3为本发明实施例提供的菌株KY616与商业菌株的广谱杀菌活性测试结果(真菌性)，依次为棉花枯萎病、西瓜枯萎病、香蕉枯萎病专化型1、香蕉枯萎病专化型2、香蕉枯萎病专化型3、根腐病、水稻纹枯病、灰霉病、小麦纹枯病、番茄早疫病、梨黑斑病、苹果落叶斑点病、棉花黄萎病专化型Vd991、棉花黄萎病专化型OD08047)；

图4为本发明实施例提供的菌株KY616与商业菌株的广谱杀菌活性测试结果(细菌性)，依次为青枯病、软腐病和白叶枯病；

图5为本发明实施例提供的菌株KY616与商业菌株的解磷、解钾、活化硅性测试结果；

图6为本发明实施例提供的菌株KY616与商业菌株的杀藻能力测试结果；

图7为本发明实施例提供的菌株KY616在含农药的培养基上的生长情况(依次为敌磺钠、咯菌腈、三氯乙腈尿酸、福美双、甲基硫菌灵、精甲霜灵、辛菌胺醋酸盐水剂、恶霉灵)。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1.高通量筛选具有杀藻功能的微生物

藻类污染已经对水生生物的生存、渔民的日常生活、淡水供应及农业生产造成威胁，筛选杀藻微生物具有重大意义。此外，藻类的生长周期较各类植物病害病原菌的生长周期短且便于进行大量筛选。因此，本发明首先采用高通量筛选方法筛选得到杀藻微生物。

具体的方法与结果如下：

1.1土样采集

从全国各地共采集85个土样样品，包括黑土、黏土、红土等多种土样，分别来源于森林、草地、小麦地、水稻田等。这些土样样品均标明采集地(省、市、县)、采集时间、采集来源(森林、草地、小麦地、水稻田等)。

1.2高通量筛选具杀藻功能的微生物

(1)取五个土壤样品(每个土壤样品各取0.2g)混合并置于50mL灭菌水中，摇匀后吸取少量液体分别稀释10倍、100倍、1000倍，各取100μL均匀涂布于R2A固体培养基上，在30℃下培养2-4天。

(2)将上述培养皿中菌落挑取至装有R2A固体培养基的96孔板中，在30℃下培养2天。(固体R2A培养基配制方法如下：0.25g蛋白胨、0.25g酵母、0.25g胰蛋白胨、0.25g葡萄糖、0.25g可溶性淀粉、0.15g丙酮酸钠、0.15g磷酸二氢钾、0.025g硫酸镁、500mL H₂O、7.5g琼脂，121.0℃高压灭菌30min。)

刮取适量藻类(铜绿微囊藻)置于灭菌水中，摇匀后制成均匀的藻液；再吸取少量藻液使之均匀分散于BG11和R2A的混合固体培养基(体积比BG11：R2A＝1：1)中制成选择性培养基A待用。(BG11固体培养基配制方法如下：1.5g硝酸钠、三水磷酸氢二钾0.04g、0.075g七水硫酸镁、0.036g二水氯化钙、0.006g柠檬酸、0.006g柠檬酸铁氨、0.001g EDTA、0.02g碳酸钠、0.00286g硼酸、0.00181g一水氯化锰、0.000222g七水硫酸锌、0.000079g五水硫酸铜、0.00039g二水钼酸钠、0.000049g六水硝酸钴、1000mL水、15g琼脂；pH＝7.1，121.0℃高压灭菌30min。)

(4)用灭菌后的微孔板复制器(96孔)蘸取96孔微孔板中的微生物并影印至选择性培养基A，在30℃下培养2-3天，观察微生物生长情况及杀藻圈形成情况。若菌落周围产生杀藻圈，表明该微生物具有明显杀藻活性，具体现象如图1所示。

选取产生抑菌圈半径≥1mm的微生物在R2A固体培养基上划线培养纯化，得到具有杀藻功能的微生物菌株。

1.3重复验证

将所得具有杀藻功能的微生物菌株再次接种在选择性培养基A上，排除不能在特定培养基上产生杀藻圈的假阳性微生物，最终得到具有杀藻功能的微生物。

1.4结果

85个土壤样品(近3.3万株微生物)通过高通量筛选和杀藻功能测试，共得到1191株具有杀藻功能的微生物。这些功能微生物的分类如表1所示：

表1.具有杀藻功能的微生物统计表(单位：mm)

(注：“2＞r≥1”表示该微生物具有杀藻的能力，但杀藻能力一般；“r≥2”表示该微生物具有杀藻的能力且杀藻能力较好。)

实施例2.筛选可杀根腐病和棉花枯萎病的病原菌的微生物

目前，除了藻类污染外，土传病害也在威胁农业生产，特别是根腐病和枯萎病这两种病害。它们可在土壤中存活数十年之久且已经严重威胁农业生产，现在暂未发现针对这些病害比较环保的特效药。同时兼顾杀藻、防治根腐病和枯萎病的微生物也鲜有报道。因此，针对根腐病和枯萎病的防治的研究显得尤为重要。为了获得可以有效防治根腐病和枯萎病的微生物，本发明针对生长周期较短的根腐病和棉花枯萎病的病原菌，对上述372株对藻类具有较好的杀菌能力的菌株进行杀菌活性测试。具体方法与结果如下：

2.1获取对根腐病和棉花枯萎病的病原菌具有杀菌活性的微生物

将上述具有杀藻功能的微生物与根腐病、棉花枯萎病的病原菌分别同时接种于R2A固体培养基上，30℃下培养6d。观察菌株对植物病原菌产生拮抗的强弱，测量杀菌圈和测试菌株的菌落半径，计算杀菌强度。

2.2结果

将上述372株具有良好杀藻能力的微生物通过杀菌活性测试(针对根腐病、棉花枯萎病)，得到87株(23.4％)可杀藻类和能够同时杀根腐病、棉花枯萎病的病原菌的微生物。

表2.具有杀根腐病和棉花枯萎病病原菌能力的微生物统计表

(注：A表示微生物具有杀根腐病病原菌的能力，B表示微生物具有杀棉花枯萎病病原菌的能力，C表示微生物同时具有杀根腐病和棉花枯萎病病原菌的能力。)

实施例3.获取具有更广谱杀植物病原菌活性的微生物

在农业生产过程中，农作物致病往往不是由单一病害引起的，而是由好几种病害同时引起的，甚至是真菌性病害和细菌性病害同时导致农作物损害。其中常见的植物病害包括真菌性病害(棉花枯萎病、西瓜枯萎病、香蕉枯萎病、根腐病、水稻纹枯病、小麦纹枯病、灰霉病、番茄早疫病、梨黑斑病、苹果斑点落叶病、棉花黄萎病)和细菌性病害(细菌青枯病、白叶枯病、软腐病)。因此，为开发具有更广的应用场景的微生物，本研究对上述87株可杀根腐病和棉花枯萎病病原菌的微生物进行广谱杀植物病害病原菌测试(包括真菌性病害：西瓜枯萎病、香蕉枯萎病三个转化型、根腐病、水稻纹枯病、小麦纹枯病、灰霉病、番茄早疫病、梨黑斑病、苹果斑点落叶病、棉花黄萎病两个专化型，细菌性病害：细菌青枯病、白叶枯病、软腐病)。具体的方法与结果如下：

3.1获取更广谱杀真菌性病害病原菌的微生物

设置西瓜枯萎病、香蕉枯萎病三个转化型、根腐病、水稻纹枯病、小麦纹枯病、灰霉病、番茄早疫病、梨黑斑病、苹果斑点落叶病、棉花黄萎病专化型Vd991和OD08047的病原菌为指示菌株，“2.2”中87株可杀根腐病和棉花枯萎病病原菌的杀藻微生物为测试菌株，进行广谱杀真菌性病害病原菌测试，具体步骤参照“2.1”。30℃下培养6d(其中棉花黄萎病的处理组需培养10d)，观察菌株对植物病原菌产生拮抗的强弱，测量杀菌圈和菌落半径，计算杀菌强度，结果见表3。

3.2获取更广谱杀细菌性病害病原菌的微生物

设置细菌青枯病、白叶枯病、软腐病的病原菌为指示菌株，“2.2”中87株可杀根腐病和棉花枯萎病病原菌的微生物为测试菌株，进行广谱杀细菌性病害病原菌测试，具体步骤如下：

(1)活化细菌青枯病、白叶枯病或软腐病病原菌；

(2)将上一步得到的细菌青枯病、白叶枯病或软腐病病原菌制成菌悬液，接种到R2A固体培养基并使其OD≈0.01，得到选择性培养基B、C或D。

(3)将上述具有杀根腐病和棉花枯萎病病原菌功能的微生物点在选择性培养基B、C或D上，在30℃下培养2d，观察杀菌圈大小，测量杀菌圈和菌落半径，计算杀菌强度，填入表3。

3.3结果

表3.广谱杀菌活性测试中4株微生物的杀菌强度

(注：表中显示的杀菌越大表示该菌株对相应病害的病原菌杀菌活性越强；“0”表示该菌株对相应病害的病原菌不具有杀菌活性)。

将87株可杀根腐病和棉花枯萎病病原菌的微生物进行广谱杀植物病害病原菌测试，得到4株表现优秀的微生物，命名为KY616、831①-21、J171、T134-1。这4株微生物广谱杀植物病害病原菌测试的结果如表3所示。由表3可得，KY616是4个测试菌株中唯一一株对所测试的14个植物病害病原菌均具有杀菌活性。与此同时，对比表3的数据，发现KY616不仅对所测试的16个植物病害病原菌均具有杀菌活性，而且KY616对大部分植物病害病原菌的杀菌强度优于其他测试菌株。综上所述，本发明将菌KY616作为研究对象，对其进行菌株鉴定及进一步研究。具体研究内容及结果如下。

实施例4.鉴定菌株KY616

4.1 DNA模板的制备

挑取纯化的单菌落至EP管底部，加入200μL的5％(w/v)的BT-chelex 100(蒸馏水配置，121℃灭菌30min)。沸水浴煮15min,迅速置于-20℃或-80℃速冻，然后室温解冻，6000r/min离心3min,取上清2μL作为模板。

按照16S扩增体系进行16S基因的扩增。

16S PCR扩增体系：25μL；

Total：25μL。

PCR扩增程序：第一步：95℃，5min；

第二步：94℃，1min；55℃，1min；72℃，1.5min，35个循环；

第三步：72℃，10min；4℃forever。

4.2菌株KY616的16sDNA序列测定结果

根据获得KY616的16S rDNA序列(SEQ ID No.1)在GenBank搜索同源序列并进行同源序列分析对比，同时与国际细菌学委员会认可的16sRNA数据库(Chun’slab)进行序列比对并结合文献分析，来确定目标微生物的分类地位(Yoon,S.H.,Ha,S.M.,Kwon,S.,Lim,J.,Kim,Y.,Seo,H.and Chun,J.(2017).Introducing EzBioCloud:A taxonomically uniteddatabase of 16S rRNA and whole genome assemblies.Int J Syst EvolMicrobiol.67:1613-1617)。结果表明，该菌株的1375碱基序列与菌株Paenibacillusottowii同源性最接近，确定KY616为Paenibacillus ottowii。

KY616的16sDNA序列测定结果(SEQ ID No.1):

AGCAATGCGCTCTATACTGCAGTCGAGCGGGGTTATTTAGAAGCTTGCTTCTAAATAACCTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTAGGCAACCTGCCCACAAGACAGGGATAACTACCGGAAACGGTAGCTAATACCCGATACATCCTTTTCCTGCATGGGAGAAGGAGGAAAGACGGAGCAATCTGTCACTTGTGGATGGGCCTGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGCCAGGGAAGAACGTCTTGTAGAGTAACTGCTACAAGAGTGACGGTACCTGAGAAGAAAGCCCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGCTCTTTAAGTCTGGTGTTTAATCCCGAGGCTCAACTTCGGGTCGCACTGGAAACTGGGGAGCTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGGCTGTAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAATGCTAGGTGTTAGGGGTTTCGATACCCTTGGTGCCGAAGTTAACACATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCAGTGGAGTATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCCTCTGACCGGTGTAGAGATATGGCTTTCCTTCGGGACAGAGGAGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATGCTTAGTTGCCAGCAGGTCAAGCTGGGCACTCTAAGCAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTACTACAATGGCCGGTACAACGGGAAGCGAAGCCGCGAGGTGGAGCCAATCCTAGAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGTCGGAATTGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTACAACACCCGAAGTCGGTGGGGTAACCCGCAAGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGGAATT。

实施例5.菌株形态观察

5.1操作

将筛选的菌株接种到R2A平板上，30℃培养2d，观察菌落的大小、形状、颜色、光泽度、黏稠度、隆起形状、透明度、边缘特征及有无芽孢等。

5.2菌株形态观察结果

经观察菌株KY616(Paenibacillus ottowii，奥托类芽孢杆菌)在R2A培养基上培养生长2d，菌落形态菌落呈白色至奶白色的圆形菌落，表面光滑，边缘不规则。经显微镜(100倍油镜)测定其菌体长度约3-6μm(如图2)。

实施例6.菌株KY616与商业菌株的比较

通过前面的试验，KY616已经被验证具有杀藻和广谱杀植物病害病原菌的能力。为了更好的了解KY616的功能及应用场景，现设置商业菌株92068(枯草芽孢杆菌，市面上常用于促进植物生长、防病、解钾和解磷)和DSM7(解淀粉芽孢杆菌，市面上用于防病)为对照，进行广谱杀植物病害病原菌活性和多功能(解磷、解钾、活化硅、杀藻的能力)的比较。

6.1比较KY616与商业菌株广谱杀植物病害病原菌活性

6.1.1比较KY616与商业菌株广谱杀真菌性植物病害病原菌活性

设置棉花枯萎病、棉花黄萎病两个专化型、西瓜枯萎病、香蕉枯萎病专化型1、香蕉枯萎病专化型2、香蕉枯萎病专化型3、根腐病、水稻纹枯病、小麦纹枯病、灰霉病、番茄早疫病、梨黑斑病、苹果斑点落叶病、棉花黄萎病专化型Vd991和OD08047的病原菌指示菌，KY616为测试菌株，92068、DSM7为对照菌株，进行广谱杀真菌性病害病原菌测试，具体步骤参照“2.1”。30℃下培养6d(其中棉花黄萎病的处理组需培养10d)，观察菌株对植物病原菌产生拮抗的强弱，测量杀菌圈和菌落半径，计算杀菌强度，结果见表4。

6.1.2比较KY616与商业菌株对细菌性植物病原菌的杀菌活性

设置细菌青枯病、白叶枯病和软腐病得病原菌指示菌，KY616为测试菌株，92068、DSM7为对照菌株，进行广谱杀细菌性病害病原菌测试，具体步骤参照“3.2”。在30℃下培养2d，观察杀菌圈大小，测量杀菌圈和菌落半径，计算杀菌强度，结果见表4。

6.2比较KY616与商业菌株解磷、解钾、活化硅的能力

磷、钾、硅是农作物生长所需的元素。探讨菌株KY616的解磷、解钾、活化硅的能力有利于解决当下化肥农药施用过量导致的营养失调问题，促进农作物安全生产。因此，本发明设置KY616为测试菌株，92068、DSM7为对照菌株，进行解磷、解钾、活化硅测试，具体如下：

6.2.1比较KY616与商业菌株的解磷能力

(1)菌株活化：从-80冰箱中取出适量KY616、92068、DSM7，分别接种在固体R2A培养基上，室温下培养48小时。其中，KY616为试验菌株，92068和DSM7为对照菌株。

(2)无机磷固体培养基配制：0.5g酵母、10g葡萄糖、0.5g(NH₄)₂SO₄、0.02g KCl、0.1g MgSO₄·7H₂O、1mL 0.2％FeSO₄、1mL MnSO₄·H₂O、15g琼脂、5g Ca₃(PO₄)₂、1000mL H₂O，121.0℃高压灭菌30min。

(3)接种：将“(1)”中微生物接种于“(2)”所述无机磷固体培养基中，30℃培养6天，取出观察，比较产生透明圈的大小。

6.2.2KY616与商业菌株解钾能力的比较

(1)菌株活化：操作同“6.2.1(1)”

(2)含钾固体培养基配制：0.5g酵母、10g葡萄糖、1.0g(NH₄)₂SO₄、2.0g Na₂HPO₄、0.5g MgSO₄·7H₂O、1.0g Ca₃(PO₄)₂、1.0g钾长石(100目)、1000mL H₂O、15g琼脂，121.0℃高压灭菌30min。

(3)接种：将“(1)”中微生物接种于“(2)”所述含钾固体培养基中，30℃培养6天，取出观察，比较产生透明圈的大小。

6.2.3KY616与商业菌株活化硅能力的比较

(1)菌株活化：操作同“6.2.1(1)”

(2)含硅固体培养基配制：5g MgSiO₄、0.5g蛋白胨、0.5g酵母、0.5g胰蛋白胨、0.5g葡萄糖、0.5g可溶性淀粉、0.3g丙酮酸钠、0.13g磷酸二氢钾、0.05g硫酸镁、1000mL H₂O、15g琼脂，121.0℃高压灭菌30min。

(3)接种：将“(1)”中微生物接种于“(2)”所述含硅固体培养基中，30℃培养6天，取出观察，比较产生透明圈的大小。

6.3 KY616与商业菌株杀藻能力的比较

(1)菌株活化：从-80℃冰箱中取出适量KY616、92068、DSM7，分别接种在固体R2A培养基上，室温下培养2d。其中，KY616为试验菌株，92068和DSM7为对照菌株。取出适量铜绿微囊藻接种在固体BG11培养基上，置于光照培养箱中培养15d。

(2)接种：将“(1)”中微生物接种于选择性培养基A中，28℃培养6d，取出观察，比较产生的透明杀藻圈大小。

6.4结果

由表4、图3、图4可得，与目前广泛应用于市场的生防菌株：枯草芽孢杆菌92068及解淀粉芽孢杆菌DSM7进行比较，KY616表现优秀，表现出杀菌活性强，杀菌谱非常广的优良特性。此外，由表5、图5可得，在含无机磷培养基、含钾培养基、含硅培养基上，KY616菌落附近可形成透明圈。同时，表5、图6可得，在含藻类培养基上，KY616菌落附近可形成透明圈。由此判断，KY616具有解磷(无机)、解钾、活化硅、杀藻的能力。

表4.KY616、92068、DSM7广谱杀植物病害病原菌的比较结果

(注：表中显示的杀菌强度越大表示该菌株对相应病害的病原菌杀菌活性越强；“0”表示该菌株对相应病害的病原菌不具有杀菌活性)。

表5.KY616、92068、DSM7解磷、解钾能力的比较结果

(注：“0”表示该微生物在含磷、钾、硅或藻类固体培养基种不能产生透明圈，不具有解磷、解钾、活化硅或除藻的能力；“+”表示该微生物在含磷、钾、硅或藻类固体培养基种可以产生透明圈，具有解磷、解钾、活化硅或除藻的能力，但解磷、解钾、活化硅或除藻能力一般；“++”表示该微生物在含磷、钾、硅或藻类固体培养基种可以产生透明圈，具有解磷、解钾、活化硅或除藻的能力且解磷、解钾、活化硅或除藻能力较好。)

实施例7.菌株KY616与农药的联合使用

根据文献报道，针对植物病害的防治，联合防治的效果更佳。

目前市面上常用的农药主要有以下几种：敌磺钠、咯菌腈、三氯乙腈尿酸、福美双、甲基硫菌灵、精甲霜灵、辛菌胺醋酸盐水剂、恶霉灵，它们的用量分别为：45％敌磺钠的200-500倍液、2.5％咯菌腈、0.2％的三氯乙腈尿酸原药、0.4％的福美双、50％甲基硫菌灵的700倍液、92％精甲霜灵的333倍液、20％的辛菌胺醋酸盐水剂的2000倍液、98％恶霉灵的500倍液。

因此，本发明对KY616与上述农药的协同作用进行考察，对KY616进行农药敏感性试验。具体的步骤及结果如下：

7.1 KY616对农药敏感性的试验

(1)设置KY616为测试菌株，敌磺钠、咯菌腈、三氯乙腈尿酸、福美双、甲基硫菌灵、精甲霜灵、辛菌胺醋酸盐水剂、恶霉灵的上述浓度为处理组。

(2)将所述农药的均匀溶液涂布于固体R2A上病最终使平板上的药物浓度与上述农药的应用浓度保持一致。

(3)将KY616接种于“7.1(2)”中的培养基中，采用“三线法”划线，30℃下培养2d，取出观察KY616的生长情况。若KY616能长出单菌落即表示KY616对该农药的敏感性较低，具有与该农药复配的潜力；若KY616不能长出单菌落即表示KY616对该农药的较敏感性高，不具有与该农药复配的潜力。

7.2 KY616对农药敏感性的试验结果

对KY616进行农药的敏感性测试，发现KY616可在敌磺钠(45％敌磺钠的200-500倍)、咯菌腈(2.5％咯菌腈)、三氯乙腈尿酸原药(0.2％的三氯乙腈尿酸原药)、甲基硫菌灵(50％甲基硫菌灵的700倍液)、精甲霜灵(92％精甲霜灵的333倍液)、辛菌胺醋酸盐水剂(20％的辛菌胺醋酸盐水剂的2000倍液)、恶霉灵(98％恶霉灵的500倍液)存在的情况下长出单菌落，而不能在福美双(0.4％的福美双)存在的情况下生长，如图7所示。

由此可得，KY616具有与农药(敌磺钠、咯菌腈、三氯乙腈尿酸、福美双、甲基硫菌灵、精甲霜灵、辛菌胺醋酸盐水剂、恶霉灵)复配的潜力。

结论

本发明通过采用高通量筛选方法从全国各地采集的土壤中分离到了一株杀藻微生物(KY616)。同时，通过相关试验，发现KY616还具有广谱杀植物病害病原菌、解磷、解钾、活化硅的功能和与农药复配的潜力。该菌株的16s rDNA的序列测定结果表明，该菌株与Paenibacillus ottowii具有高度同源。由KY616与商业菌株92068(枯草芽孢杆菌，常用于促进植物生长、防病、解钾和解磷)、DSM7(解淀粉芽孢杆菌，市面上用于防病)对比结果可得知菌株KY616具有强效的杀藻活性、针对17种植物病害病原菌的优秀杀菌活性、解磷能力、解钾能力和活化硅能力，在农业生产上具有巨大的应用潜力。通过对农药敏感性的测试，KY616可在部分农药存在的情况下生长良好，具有与农药复配的潜力。由此可见，KY616是一株具有高效杀藻、广谱杀植物病害病原菌、解磷、解钾、活化硅能力且可与农药复配的功能微生物，在农业生产和生物防治上具有巨大的应用前景。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (5)

1.一株奥托类芽孢杆菌，其特征在于，所述奥托类芽孢杆菌为奥托类芽孢杆菌（Paenibacillus ottowii）KY616，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 25565。

2.一种菌剂，其特征在于，所述菌剂的活性成分含有权利要求1所述的奥托类芽孢杆菌（Paenibacillus ottowii）KY616的菌体。

3.权利要求1所述的奥托类芽孢杆菌（Paenibacillus ottowii）KY616或权利要求2所述的菌剂在以下一个或多个方面中的应用：

（a）杀藻或制备溶藻产品；（b）解硅或活化硅；（c）解磷；（d）解钾；（e）防治植物病害；

所述藻为铜绿微囊藻；

所述植物病害选自棉花枯萎病、西瓜枯萎病、香蕉枯萎病、根腐病、灰霉病、小麦纹枯病、苹果落叶斑点病、番茄早疫病、棉花黄萎病、青枯病、白叶枯病、软腐病的一种或多种。

4.一种抑制藻类生长或除藻的方法，其特征在于，所述方法包括使用如权利要求1所述的奥托类芽孢杆菌（Paenibacillus ottowii）KY616或者如权利要求2所述的菌剂处理藻体；

所述藻为铜绿微囊藻。

5.一种农药组合物，其特征在于，所述农药组合物包含权利要求1所述的奥托类芽孢杆菌（Paenibacillus ottowii）KY616或权利要求2所述的菌剂以及农业上使用的农药；

所述农业上使用的农药选自敌磺钠、咯菌腈、三氯乙腈尿酸、甲基硫菌灵、精甲霜灵、辛菌胺醋酸盐水剂、恶霉灵中的一种或多种。

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