CN115725450A - 一株橙色粘球菌及其在植物细菌性病害生物防治中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株橙色粘球菌及其在植物细菌性病害生物防治中的应用，属于微生物技术领域。该菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期是2022年5月30日，保藏编号为CGMCCNO.24981。本发明所述的橙色粘球菌WCH05对梨火疫病菌、细菌性软腐病菌、辣椒细菌性叶斑病菌、梨锈水病菌、瓜类细菌性果斑病菌多种植物病原细菌具有良好的捕食能力，表现出广谱的抗病原细菌特性。通过香梨离体花序和盆栽杜梨苗试验显示，橙色粘球菌WCH05对梨火疫病具有良好的预防和治疗性防治效果，是一株防效高，环境安全性好，不易产生抗药性，在植物细菌性病害的生物防治及捕食病原菌方面具有巨大应用潜力。

Description

一株橙色粘球菌及其在植物细菌性病害生物防治中的应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，更具体的涉及一株橙色粘球菌及其在植物细菌性病害生物防治中的应用。

背景技术

植物病害危害农业生产，造成巨大的经济损失，其防治研究具有重要的现实意义。目前各种防治方法都有其局限：化学农药对环境不友好，且易诱发抗药性；农业措施费工费时；抗病育种工作难度大，性状不稳定；微生物生物防治技术虽然见效较慢，但是因其具有不污染环境、对人和其他生物安全性好、防治作用持久、无残留、对病害的杀伤特异性强、易于同其他防治措施协调配合、节约能源等优点，具有广阔的发展前途。当今世界，人们对环境保护日益重视，对无公害产品需求不断提高，符合农业可持续发展要求的微生物生物防治技术，已逐渐成为植物病害防治的重要手段。

梨火疫病是由解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora)侵染多种蔷薇科植物造成的最具毁灭性的细菌病害，为我国一类农作物病害和农业植物检疫性有害生物。该病害寄主范围广，危害蔷薇科40余属的220多种植物，其中感病最严重的是梨、苹果、山楂和海棠等蔷薇科仁果类果树。病原菌侵染花、叶片、嫩梢、幼果、枝条和树干，造成花器枯萎，叶片枯萎不落如火烧状，嫩梢枯死成“牧羊鞭状”，果实腐烂发黑皱缩，病害严重时扩展速度极快，短短几周内就可以从发病的幼嫩器官扩展到主枝和主干上，直至根部，造成整株死亡，可以在一到几个生长季内将整个果园毁灭，造成严重的经济损失。

梨锈水病是我国梨树上特有的一种危害枝干的新的细菌性病害，最早在江苏徐淮地区发现，在浙江、山东、德州、新疆等地也有发生，其病原近期鉴定为迪克氏菌属中的一个新种方中达氏迪克氏菌Dickeya fangzhongdai。主要危害梨树的主干和骨干枝。病树患病初期不易被发现，外表无病斑，表皮颜色正常。锈水不多、病害较轻的枝干，枯死慢或不枯死，树叶变红早落，树势变弱。病果早期症状不明显，或在果皮上出现水渍状病斑，引起果实腐烂。

细菌性软腐病是全球性病害，主要由胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种(Pectobacterium carotovorum subsp.Carotovorum，Pcc)侵染引起。Pcc的寄主分布十分广泛，大白菜、马铃薯、萝卜、郁君香、君子兰、风信子等多种蔬菜和花卉植物，都能作为其寄主引发软腐病。其对作物田间生产和储存等可造成严重的产量和经济损失，病害一旦发生便难以控制。

瓜类细菌性果斑病，又称西瓜细菌性果腐病、西瓜细菌性果斑病等，是由西瓜食酸菌(Acidovorax citrulli)引起的一种极具危险性的检疫性种传病害。该病菌主要侵染西瓜、甜瓜、罗马甜瓜、网纹甜瓜、哈密瓜、香瓜、黄瓜和南瓜等葫芦科作物，另外还可以侵染番茄、胡椒和茄子等作物。

丁香假单胞菌丁香致病变种(Pseudomonas syringae pv.syringae)是辣椒细菌性叶斑病的病原之一，该病害是新疆南疆地区辣椒上的主要病害，部分重病田造成20％-30％减产损失。该病菌除危害辣椒外，人工接种还能侵染茄科的番茄、茄子、马铃薯以及葫芦科、豆科、十字花科、伞形花科等多种植物。

对于病原菌引起的植物病害，分离和应用拮抗菌来进行生物防治的策略形成较早，因而该领域的研究最为活跃，也最具现实意义。迄今为止，研究者已筛选到大量具有抑制植物病原菌效果的拮抗菌株，包括芽孢杆菌、链霉菌、假单胞杆菌、类芽孢杆菌和木霉菌等。这些菌株的主要生防机制是在生长代谢过程中产生多种拮抗病原菌的抗生素类物质、毒素、细菌素、蛋白质类抗菌物质等，达到抑制或杀灭病原菌的效果。由于次级谢产物的产生受环境因素影响较大，这类拮抗菌株在田间施用时往往面临防效不稳定、持久性差等问题。

粘细菌(myxobacteria)是一类具有多细胞群体行为和复杂生活史的高等原核生物，对细菌和真菌具有广泛的捕食能力，被公认为是一类通才型的微生物捕食者。相关报道研究证明粘细菌可通过向外界分泌裂解酶、合成抗菌代谢产物以及调控土壤微生物群落结构等策略对病原菌进行捕食和拮抗作用，被视为一类新型的生防微生物。粘细菌作为新型生防菌株具有优于已报道生防菌的特征，包括具有丰富多样的捕食策略、广泛的猎物谱、良好的定殖能力、能够产生丰富的新型次级代谢产物、能够产生抗逆性强的粘孢子以及参与土壤有机物代谢等，这些特征使得粘细菌作为生防菌具有良好的优势。然而目前大部分研究都集中在粘细菌发育学特征及代谢产物作为药物先导化合物的研究上，而粘细菌在农业生产过程中植物病害控制方面的研究和应用较少。目前作为专利保护的主要包括广东省微生物所申请的Myxococcus sp.e-3-1，Polyangium sp.8#-3和Cystobacter sp.XJ9-1在制备捕食和抑制植物病原细菌的药物中的应用(201611095485.2)；粘细菌M34在抑制植物病原菌中的应用(202010469601.2)；叶柄粘球菌BS在细菌性病害生物防治中的应用(201711363218.3)。然而不同种属菌株之间的抗菌效果存在较大的差异，如芽孢杆菌在抗植物病原菌方面显示不同的抗菌特性，相关菌株也均申请了专利保护(201380042989.6；201410164779.0及201510666311.6等)，并且关于橙色粘细菌在梨火疫病菌、细菌性软腐病菌、梨锈水病菌、辣椒细菌性叶斑病菌、瓜类细菌性果斑病菌生物防治中的应用尚未见报道。因此基于现有生防菌的专利保护现状，尤其粘细菌作为一类具有应用潜力的生防微生物，不同特性且具有良好的生防能力的新型粘细菌对于植物病害的生物防治具有重要的意义。

发明内容

针对以上问题，本发明提供了一株橙色粘球菌(Myxococcus fulvus)WCH05在植物细菌性病害生物防治中的应用。

一株橙色粘球菌(Myxococcus fulvus)WCH05，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期是2022年5月30日，保藏编号为CGMCC NO.24981。

本发明所述的橙色粘球菌WCH05的发酵培养液。

本发明所述的橙色粘球菌WCH05为活性成分的生物菌剂。

本发明所述的橙色粘球菌WCH05为活性成分的生物肥料。

本发明所述的橙色粘球菌WCH05在植物细菌性病害生物防治和捕食植物病原细菌中的应用。

本发明所述的橙色粘球菌WCH05的发酵培养液在植物细菌性病害生物防治和捕食植物病原细菌中的应用。

所述的应用，所述植物病原细菌包括梨火疫病菌Erwinia amylovora，细菌性软腐病菌Pectobacterterium carotovorum subsp.Carotovorum，梨锈水病菌Dickeyafangzhongdai，瓜类细菌性果斑病菌Acidovorax citrulli，和辣椒细菌性叶斑病菌Pseudomonas syringae pv.Syringae。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明采用兔粪子实体诱导法成功从所采集的土样中筛选到一株粘细菌菌株WCH05，经鉴定为橙色粘球菌(Myxococcus fulvus)，该菌株对多种植物病原细菌表现出具有强烈的捕食能力，显示出对植物病原细菌的广谱抗性。基于平板捕食实验，离体花序及盆栽杜梨苗试验，表明本发明涉及的粘细菌(Myxococcus fulvus)WCH05对梨火疫病具有良好的防治效果。本发明防病效果显著，对环境无污染，有利于绿色、无公害农产品的生产及生态环境保护，是一株具有良好应用前景的生防菌株，在植物病原细菌防治方面表现出巨大的应用潜力。

附图说明

图1为菌株WCH05的形态，其中图1a为子实体的形态图；图1b为菌株WCH05接种在VY/4固体培养基上菌膜的形态图；图1c为革兰氏染色后在油镜下的形态图；

图2a为16S rDNA基因构建的系统发育树，图2b为lepA基因构建的系统发育树；

图3为粘细菌菌株WCH05菌苔捕食试验结果；

图4为菌苔捕食试验5d后5种病原细菌的残留活菌数；

图5为粘细菌菌株WCH05与5种病原细菌的对峙培养结果；

图6为对峙培养5d后5种病原细菌的残留活菌数；

图7为采用香梨离体花序测定粘细菌菌株WCH05对梨火疫病的防治效果图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下述实施例所采用的培养基具体如下所述：

LB培养基：胰蛋白胨10.0g/L，酵母提取物5.0g/L，NaCl 10.0g/L，琼脂粉15g/L，pH7.0。

LBS液体培养基：可溶性淀粉7.0g/L，胰蛋白胨1.0g/L，酵母提取物5.0g/L，MgSO₄·7H₂O 1.0g/L，pH 7.2-7.4。

VY/4培养基：安琪酵母2.5g/L，CaCl₂ 1.0g/L，琼脂粉15g/L，pH 7.2-7.4。

VY/2液体培养基：安琪酵母5.0g/L，CaCl₂ 1.0g/L，pH 7.2，灭菌后加入VB₁₂(终浓度为50μg/mL)。

WCX培养基：CaCl₂ 1.0g/L，琼脂粉15g/L，pH 7.2。灭菌后，加入放线菌酮至终浓度25μg/mL。

TPM培养基：10.0mmol/L Tris-HCl，1.0mmol/L KH₂PO₄，MgSO₄·7H₂O 1.97g/L，琼脂粉15g/L。

实施例1粘细菌的分离、纯化与生长特性

1.土样的采集

在新疆不同地区采集土壤样品，除去石块立即自然风干，室温下干燥保存。

2.土样的预处理

称取10～15g土样，用筛网(40目)除去小石子和地膜残留物后，盛于无菌培养皿中，置于烘箱中65℃处理30min，待土样冷却后加入放线菌酮溶液(终浓度为25μg/mL)浸透后室温浸泡过夜。

3.粘细菌子实体的诱导

(1)兔粪诱导法：在超净工作台内除去土壤中的残液，在土样表面半包埋入2-4个无菌的兔粪，30℃恒温保湿培养，72h后开始观察兔粪上子实体形成情况。

(2)被捕食菌诱导法：将大肠杆菌(Escherichia coli)和梨火疫病菌(Erwiniaamylovora)作为被捕食菌分别接种于LB液体培养基中，30℃震荡培养过夜，吸取1mL菌悬液于离心管中，12000rpm，离心1min，收集菌体，用无菌水漂洗3次后留100μL作为细菌悬液。用无菌接种环沾取菌悬液在含放线菌酮(终浓度为25μg/mL)的WCX培养基表面划“田”字线，吹干后在四个方格中央放置处理好的少量土样，30℃恒温保湿培养，72h后开始观察子实体形成情况。

4.粘细菌的纯化

在体视显微镜下用高温灭菌过的细针尖端挑取兔粪或WCX液体培养基中诱导出的子实体，点接于VY/4平板培养基表面，30℃恒温培养。待长出透明菌膜时，及时挑取透明菌膜外缘转至新鲜VY/4平板上继续纯化，直至无杂菌生长。

5.粘细菌的纯培养检验及菌种保藏

将分离纯化后的菌株接种于LB液体培养基中，30℃，180rpm震荡培养过夜。若培养基清澈透明，表明该粘细菌为纯菌株(粘细菌在LB液体培养基中不生长)；若培养基浑浊，则证明粘细菌菌落中混有其他杂菌。将纯菌株转入20％的甘油中，置于-80℃冰箱中保藏；或将纯化好的粘细菌粘附在无菌兔粪表面，30℃培养5-8d，待子实体形成后将兔粪转入无菌离心管中室温干燥保藏。

6.利用兔粪诱导法从新疆昌吉州吉木萨尔县五彩湾火烧山无植被覆盖的盐碱地土壤中分离纯化出1株粘细菌菌株，命名为WCH05。

实施例2菌株WCH05的鉴定

(1)菌株WCH05的形态和培养特征观察

将菌株WCH05接种在VY/4固体培养基上菌膜呈半透明薄膜状扩展(图1b)，菌膜上有整齐排列的子实体；体视显微镜下观察子实体形态多为球形或卵球形，单生，颜色为橘黄色(图1a)；革兰氏染色后在油镜下观察发现营养细胞杆状，粘孢子呈球形(图1c)。

(2)菌株WCH05的生长特性

以VY/4培养基为基础培养基，测定不同NaCl浓度(0～6％)及不同初始pH值(6.0～9.0)对菌株WCH05的影响，结果表明该菌株在不含NaCl的培养基中以及初始pH值为7.5的培养基中菌株生长最合适。但是在5％的NaCl浓度，初始pH9.0的培养环境下菌株仍然能够生长。表明该菌是一种长期适应盐碱土环境的耐盐碱粘细菌。

(3)菌株WCH05 16S rRNA和lepA基因的序列测定及分析

采用细菌基因组提取试剂盒(TIANamp Bacteria DNA Kit，TIANGEN)提取粘细菌总DNA。以细菌通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，SEQ ID No:1)和1492R(5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’，SEQ ID No:2)扩增16Sr DNA基因；以引物lepAF(5’-CATCGCCCACATCGAYCAYGGNAA-3’，SEQ ID No:3)和lepAR(5’-CATGTGCAGCAGGCCNARRAANCC-3’，SEQ ID No:4)扩增管家基因lepA。PCR反应体系为25μL：DNA模板1.0μL，10μmol/L引物对各1.0μL，10mmol/L dNTPs 1.5μL，10×PCR Buffer(2.5mmol/L MgCl₂)2.5μL，2.5U/μLTaqDNA聚合酶0.5μL，补足灭菌超纯水至25μL。反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，35个循环；72℃延伸10min，4℃保存。扩增产物经10g/L琼脂糖凝胶电泳检测后，由上海生工生物工程股份有限公司对PCR产物进行克隆测序，16S rDNA测序结果见SEQ ID No:5，lepA基因测序结果见SEQ ID No:6。

橙色粘球菌(Myxococcusfulvus)WCH05的16SrDNA基因序列如下：

tgcaagtcgagcgcgaataggggcaacccttagtagagcggcgcacgggtgcgtaacacgtggataatctgcctggatgctcgggataaccagtcgaaagattggctaataccggataagcccacggtttcttcggagactgagggaaaaggtggcctctgtatacaagctatcacaaccagatgagtccgcggcccatcagctagttggcggggtaatggcccaccaaggcaacgacgggtagctggtctgagaggacgatcagccacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaattttgcgcaatgggcgaaagcctgacgcagcaacgccgcgtgtgtgatgaaggtcttcggattgtaaagcactttcgaccgggacgaaaacccgtagcccaacacgctacggcttgacggtaccgggagaagaagcaccggctaactctgtgccagcagccgcggtaatacagagggtgcaagcgttgttcggaattattgggcgtaaagcgcgtgtaggcggcgtgacaagtcgggtgtgaaagccctcagctcaactgaggaagtgcgcccgaaactgtcgtgcttgagtgccggagagggtggcggaattccccaagtagaggtgaaattcgtagatatggggaggaacaccggtggcgaaggcggccacctggacggtaactgacgctgagacgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagaactaggtgtcgtgggagttgacccccgcggtgccgtagctaacgcattaagttctccgcctgggaagtacggtcgcaagactaaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgacgcaacgcgcagaaccttacctggtcttgacatcctcggaatctctcagagatgagggagtgcccgcaagggaaccgagagacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaaccctcgcctttagttgccacgcaagtggatctctagagggactgccggtgttaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaagtcctcatggcctttatgaccagggctacacacgtgctacaatggccggtacagagcgttgccaacccgcgagggggagctaatcgcataaaaccggtctcagttcagattggagtctgcaactcgactccatgaaggcggaatcgctagtaatcgcagatcagcacgctgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtcgattgctccagaagtcatctcaccaagagatgccc

橙色粘球菌(Myxococcus fulvus)WCH05的lepA基因如下：

cgctcctcgacagacggggacgctgagcaagcgcgaggcgcaggcccagttcctcgacaacatggacatcgagcgcgaacggggcatcaccatcaaggcccagtccgtgcggatgaactacacggcgaaggacggcaagcagtacgtcctgaacctcatcgacacgccggggcacgtggacttcgcctacgaggtgagccgcagcctggccgcgtgcgagggcgcgctgctggtggtggacgcgtcgcagggcgtggaggcgcagacgctcgccaacgtctacatggcgttggaccacgacctggagatcatcccggtcatcaacaagattgatttgcccagcgccgacgtcgaccgcacgcgcgccgagatcgaagacgtcatcggcatcgacgcgtcggtggccgtgcccgcgtccgcgaaggagggcatcggcatccacgagatcctcgagtccgtggtggcccgcgtgcccccgccgacgggcatgccggacgcaccgctcaaggccctgatcttcgactcctggtacgacaactaccggggcgtggtgacgctggtgcgcgtgctcgagggcacgctgaagctcaagcagaagatcaagctgtggagcaacaacaaggccttcgaggtcatggagctgggtgtcttcagcccgttctcccgtccggtgacgcagttgatggccggcgaggtgggcgtgctggtggccaacatcaaggagctccaggacgccaaggtcggtgacaccgtcacggaggaggcccgccccaccgcggagccgttccctggcttccaggaagtcaagccgatggtgttctccggcatcttcccggtggactcggaccagtacgagaacctgcgcgacgcgctggcgaagctgaagctcaacgactccgccttcacgtacgagcccgagtcctccacgcgctcgct

在NCBI中将16S rDNA基因和管家基因lepA的测序结果进行比对，并利用MEGA5.0软件中的邻接法(Neighbor-joining)构建2个基因的系统发育树。结果显示(图2)，基于16SrDNA和lepA基因构建的系统发育树都将粘细菌WCH05聚为粘球菌属，并且在系统发育树中均于Myxococcus fulvus的参比菌株聚为同一个系统发育分支上，16S rDNA和lepA基因的同源性分别为100％和98％。综合形态特征、生理生化特性及分子鉴定结果，将WCH05菌株鉴定为橙色粘球菌(Myxococcus fulvus)。菌株已保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)。保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。保藏日期为2022年5月30日，保藏编号为CGMCCNo.24981。

实施例3粘细菌捕食植物病原细菌能力测定

1.病原菌和粘细菌的准备

将梨火疫病菌解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora,Ea)、细菌性软腐病菌胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种(Pectobacterterium carotovorum subsp.Carotovorum,Pcc)、梨锈水病菌方中达氏迪克氏菌(Dickeya fangzhongdai,Df)、瓜类细菌性果斑病菌西瓜食酸菌(Acidovorax citrulli,Ac)、辣椒细菌性叶斑病菌丁香假单胞菌丁香致病变种(Pseudomonas syringae pv.Syringae,Pss)活化，挑取单菌落接入LB液体培养基中，在30℃，160rpm恒温摇床中震荡培养24h，12000rpm，离心1min，收集菌体，用无菌水漂洗三次后，再用TPM培养液重悬备用。将粘细菌纯培养物在VY/4平板上活化后，刮取适量粘细菌菌落转接至LBS液体培养基中，30℃，160rpm摇培至3～4d。将制备好的粘细菌菌悬液于12000rpm，离心1min，去除上清液收集菌体，之后用TPM液体培养基清洗3次，最后用500μLTPM液体培养基重悬，备用。

2.粘细菌捕食植物病原细菌能力评估

(1)菌苔捕食试验：在TPM无营养固体培养基上垂直悬空接种50μL病原细菌菌悬液，自然风干后将3μL粘细菌悬液接种在病原细菌菌苔中央，自然风干(记为WCH05处理)。以病原细菌菌苔中央不接种粘细菌的处理为对照组(记为CK)，30℃恒温培养5d。1、3、5d观察粘细菌的扩展情况。并在第5d用无菌毛细管刮下菌苔并用1mL无菌水混匀，采用稀释涂布的方法，每个梯度取100μL于LB平板涂布均匀，平板放置30℃恒温培养箱培养至单菌落长出，统计病原细菌菌落数，计算残留活细胞数，评估捕食能力。

(2)对峙培养试验：在TPM固体培养基上垂直悬空点接病原细菌菌悬液50μL，自然风干，在病原细菌菌苔边缘邻近位置点接3μL粘细菌菌悬液(记为WCH05处理)，对照组在梨火疫病菌苔边缘邻近位置点接3μL TPM液体培养基(记为CK)，待风干后置于30℃恒温培养箱中培养，1、3、5d观察粘细菌运动方向及运动距离，并在第5d用无菌毛细管刮下菌苔并用1mL无菌水混匀，采用稀释涂布的方法，每个梯度取100μL于LB平板涂布均匀，平板放置30℃恒温培养箱培养至单菌落长出，统计病原细菌菌落数，计算残留活细胞数，评估捕食能力。

3.菌苔试验结果表明(图3-4)，培养1天后，可观察到粘细菌能够以植物病原细菌为营养物质扩散性生长。培养5d后，粘细菌能够完全扩散并覆盖整个病原细菌菌苔，并且在跨过的区域形成子实体，说明粘细菌WCH05具有良好的捕食特性。此时将整个菌落刮取，通过稀释涂布法于LB固体平板中统计病原细菌的残留活细胞量，发现菌株WCH05对梨火疫病菌的捕食能力最强，残留的活细胞从10⁸cfu/mL下降至10³cfu/mL，其他4种病原细菌的残留的活细胞从10⁹cfu/mL下降至10⁵～10⁶cfu/mL。表明粘细菌WCH05对多种植物病原细菌均具有良好的捕食能力，显示其良好的广谱抗病原细菌能力。

为了进一步统计和评估粘细菌菌株WCH05的运动捕食能力，将粘细菌菌株WCH05与5种病原细菌对峙培养，定时观察粘细菌的运动方向和扩展速度。结果显示，粘细菌菌株WCH05对5种病原细菌具有明显的趋向性运动，能够覆盖并捕食病原细菌菌苔。5d后刮取菌苔并稀释涂布，计算病原细菌残留活细胞数，结果表明，菌株WCH05向外扩展捕食梨火疫病菌的能力最强，梨火疫病菌的残留量活细胞从10⁸cfu/mL下降到10⁴cfu/mL，其他4种病原细菌的残留的活细胞从10⁹cfu/mL下降至10⁷cfu/mL。(图5-6)。

实施例4粘细菌菌株WCH05胞外代谢产物对梨火疫病菌的抑菌能力测定

1.菌株WCH05发酵上清液对梨火疫病菌生长的影响

将粘细菌菌株接种于LBS液体培养基中，30℃，160rpm摇培至稳定期，12000rpm，离心20min收集上清液，并用0.22μm细菌过滤器过滤获得无菌发酵上清液。取1mL无菌发酵上清液与100μL梨火疫病菌菌悬液共培养，重复3次，30℃静置培养24h后，稀释涂布统计梨火疫病菌残留活细胞数，以发酵上清液热煮沸处理和生理盐水为对照。

2.菌株WCH05的次级代谢产物对梨火疫病菌生长的影响

参照发明专利(201611095485.2，201711363218.3)中的制备方法，在VY/2液体培养基中接种粘细菌WCH05，30℃，于160rpm培养5d，8000rpm离心，收集菌体和发酵液上清。发酵上清液用等体积的乙酸乙酯萃取12h，萃取液旋转蒸发后，用甲醇溶解萃取物，得到发酵液萃取物。菌体用丙酮浸泡后超声波破碎，然后用乙酸乙酯萃取12h，萃取液旋蒸后，用甲醇溶解萃取物，得到菌体破碎液萃取物。发酵液萃取物和菌体破碎液萃取物用甲醇分别溶解成50mg/mL和100mg/mL浓度。接种梨火疫病菌到LB液体培养基180rpm，30℃培养到对数期。将对数期的梨火疫病菌菌悬液按体积比1∶100比例与50℃左右的LB培养基(液体状态)混合，摇均后每个平皿加20mL。在平板上粘附已滴加5μL不同浓度的发酵液萃取物或者菌体破碎液萃取物溶液的6mm直径滤纸片。与37℃培养24-36h后测定抑菌圈直径。

结果表明，菌株WCH05的无菌发酵上清液和次级代谢产物对梨火疫病菌的生长均未产生抑菌作用，结合实施例3中获得的结果说明菌株WCH05对梨火疫病菌的抗菌效果完全是通过直接接触的方式来捕食梨火疫病菌。该抑菌性质与发明专利(201611095485.2)中涉及的Myxococcus sp.e-3-1和发明专利(201711363218.3)中涉及的Myxococcusstipitatus BS存在显著差异。其中Myxococcus sp.e-3-1产生的代谢产物具有良好的抑菌作用，而Myxococcus stipitatus BS尽管其抗菌效果主要通过粘细菌的捕食作用实现的，但其无菌发酵培养液和次级代谢产物对病原细菌仍有部分抑菌作用。

实施例5粘细菌菌株WCH05对梨火疫病的生防效果评估

1.粘细菌和病原菌接种液的制备

将活化好的粘细菌菌株接种至3mL LBS液体培养基中，30℃，160rpm摇培24h后，全部接种至200mL VY/4液体培养基中，30℃，160rpm摇培3～4d。将梨火疫病菌活化，挑取单菌落接入LB液体培养基中，在28℃，160rpm恒温摇床中震荡培养24h至菌液OD₆₀₀＝1.0，用无菌水稀释至10⁷cfu/mL，备用。

2.香梨离体花序测定粘细菌菌株WCH05对梨火疫病的防治效果

在梨园采集花枝，插入0.05％NaCl溶液中保湿防腐。用手持压力喷雾器将粘细菌菌液喷雾接种梨花序，在28℃、70％空气湿度的人工气候箱中培养24h后喷雾接种病原菌液。将接种后的花序置于人工气候箱中28℃、70％空气湿度培养，3d、4d、5d和7d后定时观察记录发病情况，统计花腐率、计算防效。同时以无菌水代替粘细菌发酵液，再喷雾接种病原菌液作为CK，同时设喷施农用链霉素(华北制药厂生产，有效成分72％)4000倍液，然后喷雾接种病原菌液对照，并以只喷施无菌水作为空白对照。试验结束后将发病植株材料干热灭菌后销毁。花腐率(％)＝(病花数/总花数)×100％；花腐防效(％)＝(对照花腐率-处理花腐率)/对照花腐率×100％。

结果显示(表1，图7)，在离体香梨花序上喷施粘细菌发酵液，再接种病原菌，之后调查3d、4d、5d和7d各处理的花腐率，计算保护性防效。未喷施粘细菌发酵液的对照在病原菌接种后第2天香梨花序的花药、柱头、蜜腺、花萼、子房、花柄等处即陆续开始出现花腐症状，而喷施粘细菌WCH05的处理能在一定程度上延缓花腐症状出现的时间，降低花腐率。其7d平均防效达71.46％，与农用链霉素的防效相当(70.89％)。

表1粘细菌菌株WCH05对离体花序梨火疫病防效测定

3.杜梨盆栽试验测定粘细菌菌株WCH05对梨火疫病的防治效果

(1)粘细菌对梨火疫病的保护性防效

试验在温室中进行，选用2年生盆栽杜梨苗为接种材料。用手持式压力喷雾器将待测粘细菌发酵液喷雾至叶片及枝条完全湿润，24h后喷雾接种病原菌菌悬液，每个粘细菌菌株喷雾3盆(每盆约20个枝条)，重复3次。同时设农用链霉素(华北制药厂，有效成分72％)4000倍液对照和无菌水对照(即先喷施无菌水24h后再接种梨火疫病菌，CK)。每天观察发病情况，记录发病枝条数、测定枝枯长度、枝枯长度占接种枝条长度的比例及发病级别，计算发病率和病情指数，统计防效。试验结束后将发病植株材料干热灭菌后销毁。

(2)粘细菌对梨火疫病的治疗性防效

治疗性试验病原菌和粘细菌的接种顺序与保护性试验相反，即先在杜梨苗上喷施接种梨火疫病菌菌液24h后再喷施粘细菌发酵液，其他试验材料及培养条件、防效调查方法等均与保护性试验一致。

参照Paprstein等的方法并改进，制定梨火疫病原菌接种盆栽杜梨苗的病情分级标准：0级，枝条无病斑；Ⅰ级，枝条病斑长度占接种枝条长度的1/3；Ⅲ级，枝条病斑长度占接种枝条长度的1/3-2/3；Ⅴ级，枝条病斑长度占接种枝条长度的2/3以上。

发病率(％)＝(发病枝条数/接种总枝条数)×100％；病情指数＝∑(各级发病枝条数×病级代表值)/(接种总枝条数×最高级值)×100；枝枯防效(％)＝(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100％。

保护性试验结果表明(表2)，在杜梨苗上事先喷施WCH05能显著降低杜梨苗的发病率和病情指数，7～21d的平均保护性防效为81.53％。其中WCH05第7d的防效最高(84.58％)，到21d仍能保持在80.19％，略低于农用链霉素的防效(81.15％)。

治疗性试验结果表明(表3)，喷施WCH05菌液对杜梨苗的枝枯具有明显的治疗效果，其中第7d的防效达到76.44％，14～21d的防效有所下降，7～21d的平均防效达到63.84％，略低于农用链霉素的防效(67.32％)。

表2菌株WCH05对杜梨苗梨火疫病的保护性防效

表3菌株WCH05对杜梨苗梨火疫病的治疗性防效

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (7)

1.一株橙色粘球菌(Myxococcusfulvus)WCH05，其特征在于，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期是2022年5月30日，保藏编号为CGMCC NO.24981。

2.权利要求1所述的橙色粘球菌WCH05的发酵培养液。

3.权利要求1所述的橙色粘球菌WCH05为活性成分的生物菌剂。

4.权利要求1所述的橙色粘球菌WCH05为活性成分的生物肥料。

5.权利要求1所述的橙色粘球菌WCH05在植物细菌性病害生物防治和捕食植物病原细菌中的应用。

6.权利要求2所述的橙色粘球菌WCH05的发酵培养液在植物细菌性病害生物防治和捕食植物病原细菌中的应用。

7.权利要求5或6的应用，其特征在于，所述植物病原细菌包括梨火疫病菌Erwiniaamylovora，细菌性软腐病菌Pectobacterterium carotovorum subsp.Carotovorum，梨锈水病菌Dickeya fangzhongdai，瓜类细菌性果斑病菌Acidovorax citrulli，和辣椒细菌性叶斑病菌Pseudomonas syringaepv.Syringae。

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