CN115721707A - 一种重组流感微胶囊口服疫苗及其制备方法 - Google Patents

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李凤凯
高辉
胡文浩
张艳
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Abstract

本发明公开了一种重组流感微胶囊口服疫苗及其制备方法。属于生物技术领域。该疫苗包括胶囊壳和胶囊内容物；所述胶囊内容物为重组流感微胶囊冻干粉，包括壁材和芯材；所述壁材为复合微生态制剂，包括酵母菌和枯草芽孢杆菌；所述芯材为4个毒株的HA基因编码的抗原蛋白，4个毒株分别为甲型H1N1、甲型H3N2、乙型Yamagata系和乙型Victoria系。本发明的重组流感微胶囊口服疫苗可以提高蛋白类药物的实际利用效率，提高疫苗的治疗或预防效果，为研发新型流感口服疫苗奠定重要基础。

Description

一种重组流感微胶囊口服疫苗及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体的说是涉及一种重组流感微胶囊口服疫苗及其制备方法。
背景技术
流行性感冒简称流感，是由甲、乙、丙三型流感病毒分别引起的急性呼吸道传染病，目前在人群中传播的流感病毒仍然以甲型和乙型为主，该疾病本身及其合并症对人类造成了严重危害，并因此而带来直接和间接的巨大经济损失。而接种流感疫苗是预防流感的最有效手段，可以减少流感相关疾病带来的危害及对医疗资源的占用。
目前上市的商品化流感疫苗有流感病毒裂解疫苗、流感减毒活疫苗、流感全病毒灭活疫苗、流感亚单位疫苗和核酸疫苗。上述市售的疫苗多以肌肉注射、皮内注射或鼻内免疫方式为主。肌肉注射或皮内免疫的过程可能会引起注射部位疼痛、肉芽肿、局部红斑、皮肤出血及寒战等不良反应；鼻内免疫往往多需要添加免疫佐剂来提高疫苗的效果，佐剂可能存在副作用。与肌肉注射、皮内注射和鼻内免疫相比，口服疫苗方法简单、方便、快捷、高效，不需要专业的接种人员协助，口服疫苗能刺激系统和黏膜免疫反应，可避免肌肉或皮内注射的疼痛，能建立更广泛和持久的保护。但是口服给药是具有挑战性的，尤其是对蛋白药物而言，需要克服恶劣的胃肠道环境，避免诱导免疫耐受性，以实现有效的保护。
酵母菌和枯草芽孢杆菌是一类益生菌，对人体不致病，安全性高，遗传背景清晰，对胃环境和小肠具有一定的耐受性，本身具备佐剂的功能。科研人员往往通过枯草芽孢杆菌和酵母菌直接生产抗原蛋白直接作用于人体免疫系统，但重组工程菌口服疫苗在体内往往存在目标蛋白表达量低、抗原蛋白不纯度和糖基化修饰程度的问题，进入肠道内的微生物对宿主体内的抗原蛋白活性是否有影响仍未知。
鉴于此，针对现有问题开发一款适合口服的流感疫苗成为当前亟待解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种重组流感微胶囊口服疫苗及其制备方法。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种重组流感微胶囊口服疫苗，包括胶囊壳和胶囊内容物；
所述胶囊内容物为重组流感微胶囊冻干粉，包括壁材和芯材；
所述壁材为复合微生态制剂，包括酵母菌和枯草芽孢杆菌；
所述芯材为4个毒株的HA基因编码的抗原蛋白，4个毒株分别为甲型H1N1、甲型H3N2、乙型Yamagata系和乙型Victoria系；
甲型H1N1毒株的HA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
ATGACCCGTTTGACCGTGCTGGCCCTGCTGGCTGGTTTGTTGGCTTCCTCCCGCGCTGACACCTTGTGCATCGGTTACCACGCCAACAACTCCACCGACACCGTGGACACCGTGCTGGAAAAGAACGTGACAGTGACTCACTCCGTGAACTTGCTCGAAGATAAGCACAACGGCAAGCTGTGCAAGCTCAGGGGCGTCGCTCCATTGCACCTGGGTAAGTGCAACATCGCTGGTTGGATCTTGGGTAACCCTGAGTGCGAGAGCCTGTCCACCGCTAGATCCTGGAGCTACATCGTGGAGACCTCCAACTCTGACAACGGTACCTGCTACCCTGGTGACTTCATCAACTACGAGGAGCTGCGCGAACAACTGAGCAGCGTGTCCTCCTTCGAACGCTTCGAGATCTTCCCCAAGACCTCCTCCTGGCCCAACCACGATTCCGACAACGGTGTGACCGCTGCCTGCCCTCACGCTGGTGCTAAGTCATTCTACAAGAACCTGATCTGGCTGGTCAAGAAGGGCAAGTCCTACCCCAAGATCAACCAAACCTACATCAACGACAAGGGTAAGGAAGTGCTGGTGCTCTGGGGTATCCACCACCCTCCTACCATCGCTGACCAGCAGTCCCTGTACCAGAACGCTGACGCTTACGTGTTCGTGGGCACCTCCAGGTACTCCAAGAAGTTCAAGCCTGAGATCGCTACCCGCCCTAAGGTCCGTGACCAAGAGGGTCGTATGAACTACTACTGGACCCTGGTGGAACCTGGCGATAAGATCACCTTCGAGGCTACCGGTAACCTGGTCGCCCCTAGATACGCTTTCACCATGGAGCGCGATGCTGGTAGCGGTATCATCATCTCTGACACCCCTGTGCACGACTGCAACACTACCTGCCAGACCCCTGAGGGAGCTATCAACACCTCCCTCCCCTTCCAGAACGTGCACCCTATCACCATCGGTAAGTGTCCTAAGTACGTCAAGTCCACCAAGCTCCGCCTCGCCACTGGATTGCGTAACGTCCCAAGCATCCAGTCCCGCGGTCTCTTCGGTGCTATCGCTGGTTTCATCGAAGGCGGTTGGACCGGTATGGTGGATGGCTGGTACGGATACCACCACCAAAACGAGCAGGGTTCCGGTTACGCCGCCGATTTGAAGTCTACCCAGAACGCTATCGATAAGATCACAAACAAGGTGAACAGCGTGATCGAAAAGATGAACACCCAGTTCACTGCTGTGGGAAAGGAGTTCAACCACCTGGAGAAGCGCATCGAGAACCTGAACAAGAAGGTGGACGACGGCTTCCTGGACATCTGGACCTACAACGCTGAGCTGCTGGTGCTGTTGGAGAACGAGAGGACATTGGACTACCACGACAGCAACGTCAAGAACCTGTACGAGAAGGTGAGGAACCAACTGAAGAACAACGCCAAGGAGATCGGCAACGGTTGCTTCGAGTTCTACCACAAGTGCGACAACACCTGCATGGAGAGCGTGAAGAACGGAACATACGACTACCCCAAGTACAGCGAAGAGGCCAAGCTGAACCGCGAAAAGATCGACGGTGTGAAGCTGGACTCCACCCGCATCTACCAAATCCTGGCTATCTACAGTACCGTGGCTTCCTCCCTGGTGCTGGTGGTGTCACTGGGAGCTATCTCTTTCTGGATGTGCAGCAACGGTAGCCTGCAGTGTCGCATCTGCATCTAA；SEQ ID NO.1。
甲型H3N2毒株的HA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
ATGACCCGTTTGACCGTGCTGGCCCTGCTGGCTGGTTTGTTGGCTTCCTCCCGCGCTCAGAAGATCCCCGGTAACGACAACTCCACCGCCACCTTGTGCCTGGGTCACCACGCTGTGCCTAACGGTACCATCGTGAAGACCATCACCAACGACCGCATCGAGGTGACCAACGCTACCGAGCTGGTCCAGAACTCCAGCATCGGCGAGATCTGCGGTTCCCCTCACCAAATCCTGGACGGCGGAAACTGCACCCTGATCGACGCTCTGTTGGGAGACCCACAGTGCGACGGATTCCAAAACAAGGAATGGGACCTGTTCGTGGAGCGCTCCCGTGCTAACTCCAACTGCTACCCTTACGACGTGCCTGACTACGCTTCCCTGCGCTCTTTGGTGGCTTCCAGCGGTACACTGGAGTTCAAGAACGAGTCCTTCAACTGGACCGGTGTCAAGCAGAACGGTACCTCCTCCGCCTGCATCCGTGGTTCTTCCTCTTCCTTCTTCTCTCGCCTGAACTGGTTGACTTCCCTCAACAACATCTACCCTGCTCAGAACGTGACCATGCCTAACAAGGAGCAATTCGACAAGCTGTACATCTGGGGTGTGCACCACCCTGACACCGACAAGAACCAAATCAGCCTGTTCGCTCAGTCCTCCGGCCGTATCACCGTGTCTACCAAGCGCTCCCAGCAGGCTGTGATCCCAAACATCGGCTCCCGCCCTAGAATCCGCGACATCCCTTCCAGAATCTCCATCTACTGGACCATCGTGAAGCCTGGTGACATCCTGCTCATCAACTCCACCGGTAACCTGATCGCCCCTCGCGGTTACTTCAAGATCCGCTCCGGTAAGTCCTCCATCATGCGCTCCGACGCCCCTATCGGTAAGTGCAAGAGCGAATGCATCACCCCAAACGGCTCCATCCCCAACGACAAGCCTTTCCAAAACGTGAACCGCATCACTTACGGTGCTTGCCCTCGCTACGTCAAGCAATCCACCCTGAAGCTGGCTACCGGAATGCGCAACGTCCCCGAAAAGCAGACCAGAGGTATCTTCGGTGCTATCGCTGGCTTCATCGAAAACGGTTGGGAGGGTATGGTGGATGGATGGTACGGCTTCCGCCACCAAAACAGCGAGGGTAGGGGTCAAGCTGCCGACTTGAAGAGCACCCAGGCTGCTATCGACCAGATCAACGGAAAGCTGAACAGGCTGATCGGTAAGACCAACGAGAAGTTCCACCAAATCGAAAAGGAGTTCAGCGAGGTCGAGGGTAGGGTGCAGGACTTGGAGAAGTACGTGGAGGATACCAAGATCGACCTGTGGTCCTACAACGCTGAACTGCTGGTGGCCCTGGAGAACCAGCACACAATCGACTTGACCGATTCCGAGATGAACAAGCTGTTCGAGAAGACCAAGAAGCAGCTCCGCGAGAACGCCGAGGACATGGGTAACGGATGCTTCAAGATCTACCACAAGTGCGACAACGCTTGCATCGGCTCCATCAGGAACGAAACCTACGACCACAACGTGTACAGAGACGAAGCTCTGAACAACAGATTCCAGATCAAGGGAGTGGAGCTGAAGTCCGGTTACAAGGACTGGATCTTGTGGATCTCCTTCGCCATGTCCTGCTTCCTGCTCTGCATCGCCCTGCTGGGTTTCATCATGTGGGCCTGTCAAAAGGGAAACATCCGTTGCAACATCTGTATCTAA；SEQ ID NO.2。
乙型Yamagata系毒株的HA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
ATGACCCGTTTGACCGTGCTGGCCCTGCTGGCTGGTTTGTTGGCTTCCTCCCGCGCTGACCGTATCTGCACTGGTATCACCTCCTCCAACTCCCCTCACGTGGTGAAGACCGCCACCCAAGGAGAGGTGAACGTGACTGGTGTCATCCCTCTGACTACCACTCCCACCAAGTCCTACTTCGCCAACCTCAAGGGCACCCGCACCAGAGGTAAGCTGTGCCCTGACTGCCTGAACTGCACTGACCTGGACGTGGCTTTGGGTCGCCCTATGTGCGTGGGTACCACCCCTTCTGCTAAGGCTAGCATCCTGCACGAGGTGCGCCCAGTGACATCCGGTTGTTTCCCTATCATGCACGACAGAACCAAGATCCGTCAGCTCCCTAACCTGCTGCGCGGTTACGAGAAGATCCGTCTGTCCACCCAGAACGTCATCGATGCTGAAAAGGCCCCTGGTGGTCCCTACCGTCTGGGTACTTCCGGAAGCTGCCCTAACGCTACCTCCAAGATCGGTTTCTTCGCTACCATGGCTTGGGCCGTGCCCAAGGATAACTACAAGAACGCTACCAACCCTCTCACCGTCGAGGTCCCTTACATCTGCACCGAGGGTGAAGATCAAATCACCGTGTGGGGTTTCCACTCCGACAACAAGACCCAAATGAAGTCCCTGTACGGTGACAGTAACCCCCAAAAGTTCACCAGCTCCGCTAACGGCGTGACCACCCACTACGTGTCCCAGATCGGTGACTTCCCCGACCAAACCGAAGACGGCGGTCTGCCTCAGTCCGGTAGAATCGTGGTCGACTACATGATGCAAAAGCCTGGTAAGACAGGTACCATCGTCTACCAGCGCGGTGTGCTGTTGCCTCAAAAGGTCTGGTGTGCTTCTGGTCGCTCCAAGGTGATCAAGGGTTCCCTGCCTCTGATCGGTGAGGCTGACTGTCTGCACGAGGAGTACGGTGGCCTCAACAAGTCTAAGCCTTACTACACAGGTAAGCACGCTAAGGCTATCGGTAACTGCCCTATCTGGGTCAAGACCCCTTTGAAGTTGGCTAACGGCACCAAGTACAGGCCACCTGCTAAGCTGCTGAAGGAGCGCGGTTTCTTCGGAGCCATCGCTGGTTTCTTGGAGGGTGGTTGGGAGGGTATGATCGCTGGTTGGCACGGTTACACAAGCCACGGTGCTCACGGTGTGGCTGTGGCTGCTGATTTGAAGTCTACTCAGGAGGCTATCAACAAGATCACCAAGAACTTGAACAGCTTGTCCGAGTTGGAGGTGAAGAACCTGCAGCGCCTCTCCGGTGCTATGGATGAGCTGCACAACGAGATCCTGGAGCTGGACGAGAAGGTGGACGACCTGAGGGCTGACACTATCTCCAGCCAGATCGAGTTGGCTGTGCTGCTCTCCAACGAGGGTATCATCAACAGCGAGGACGAACACCTGCTGGCTTTGGAGCGCAAGCTGAAGAAGATGCTGGGTCCTTCCGCTGTCGACATCGGTAACGGTTGTTTCGAGACCAAGCACAAGTGCAACCAAACCTGCTTGGACCGCATCGCCGCTGGTACTTTCAACGCTGGCGAATTCAGCCTGCCTACTTTCGACTCCCTGAACATCACTGCTGCTTCTTTGAACGACGACGGTCTGGACAACCACACCATCCTGCTGTACTACTCCACCGCTGCCTCCTCCCTGGCTGTGACTTTGATGCTCGCCATCTTCATCGTGTACATGGTGTCCCGCGACAACGTGAGCTGCTCTATCTGCCTGTAA；SEQ ID NO.3。
乙型Victoria系毒株的HA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
ATGACCCGTTTGACCGTGCTGGCCCTGCTGGCTGGTTTGTTGGCTTCCTCCCGCGCTGACCGTATCTGCACTGGTATCACCTCCTCCAACTCCCCTCACGTGGTGAAGACCGCCACCCAAGGAGAGGTGAACGTGACTGGTGTCATCCCTCTGACTACCACTCCCACCAAGTCCCACTTCGCCAACCTCAAGGGCACCGAGACCAGGGGTAAGCTGTGCCCTAAGTGCCTCAACTGCACTGACCTGGACGTGGCTCTGGGTAGGCCTAAGTGCACCGGAAAGATCCCCTCCGCCCGTGTGTCAATCCTGCACGAAGTGCGCCCCGTGACCTCTGGTTGTTTCCCTATCATGCACGACCGCACCAAGATCCGTCAATTGCCCAACCTGCTGCGCGGTTACGAGCACGTGCGTTTGTCTACCCACAACGTCATCAACACTGAAGATGCCCCTGGTGGTCCTTACGAGATCGGTACCTCCGGCTCCTGCCTGAACATCACCAACGGTAAGGGTTTCTTCGCTACCATGGCTTGGGCCGTGCCCAAGAACAAGACCGCTACCAACCCTCTGACTATCGAGGTGCCTTACATCTGCACCGAAGAGGAGGACCAGATCACCGTGTGGGGCTTCCACTCCGATGACGAAACCCAGATGGCTCGCCTGTACGGAGACTCTAAGCCCCAAAAGTTCACCAGCTCCGCTAACGGAGTGACCACCCACTACGTGTCCCAGATCGGTGGTTTCCCTAACCAGACCGAAGACGGCGGTCTGCCTCAATCCGGACGTATCGTCGTCGACTACATGGTCCAGAAGTCCGGTAAGACCGGAACCATCACCTACCAGCGCGGTATCCTGCTGCCTCAAAAGGTGTGGTGCGCTAGCGGTAAGTCCAAGGTGATCAAGGGTAGCCTGCCTCTGATCGGTGAAGCCGACTGCCTGCACGAGAAGTACGGCGGTCTCAACAAGTCCAAGCCTTACTACACAGGTGAGCACGCTAAGGCTATCGGTAACTGCCCTATCTGGGTCAAGACCCCTTTGAAGCTGGCTAACGGTACCAAGTACAGGCCTCCTGCTAAGCTGCTGAAGGAACGCGGTTTCTTCGGTGCTATCGCTGGCTTCCTGGAGGGTGGTTGGGAGGGTATGATCGCTGGCTGGCACGGTTACACCAGTCACGGAGCTCACGGTGTGGCTGTGGCTGCTGATCTGAAGTCTACCCAGGAGGCTATCAACAAGATCACTAAGAACCTGAACAGCCTGTCCGAGCTGGAGGTGAAGAACCTGCAACGCCTCAGTGGTGCTATGGATGAACTGCACAACGAAATCCTGGAGCTGGACGAAAAGGTCGACGACCTGCGCGCTGACACCATCTCATCCCAGATCGAACTGGCTGTGCTGCTCTCCAACGAAGGAATCATCAACTCCGAGGACGAACACCTGCTGGCTCTGGAAAGGAAGCTGAAGAAGATGCTGGGTCCTTCCGCTGTGGAGATCGGTAACGGTTGCTTCGAGACCAAGCACAAGTGCAACCAGACCTGCCTGGATAGGATCGCTGCTGGTACCTTCGACGCTGGCGAATTCTCCCTGCCTACTTTCGACTCCTTGAACATCACTGCTGCTTCCCTGAACGACGACGGTCTCGACAACCACACCATCCTGCTGTACTACTCCACCGCTGCCTCCTCCCTGGCTGTGACTTTGATGATCGCCATCTTCGTCGTGTACATGGTGTCCCGCGACAACGTGAGCTGCTCCATCTGCCTGTAA；SEQ ID NO.4。
进一步的，所述酵母菌的活菌数量为1×109~3.0×1010CFU/g；所述枯草芽孢杆菌的活菌数量为2×109~5.0×1010CFU/g。
进一步的，所述壁材和芯材的体积比为0.01~3：0.01~1。
进一步的，所述抗原蛋白含量为15~65μg。
进一步的，还包括保护剂；
所述保护剂包括，按重量份数计，螺旋藻多肽0.1~0.3份、玉米蛋白多肽0.05~0.5份和小球藻多肽0.05~0.5份。
所述抗原蛋白与保护剂按质量比0.5~5：0.1~3混合。
进一步的，所述胶囊壳为灵芝复合水提物；
所述灵芝复合水提物由白灵芝水提物、黑灵芝水提物和辅料按质量比1~5：1~5：0.2~3组成；
所述辅料包括如下，按重量份数计，微晶纤维素0.1~0.5份、维生素C 0.02~0.1份、硬脂酸镁0.1~0.5份、聚乙二醇6000 0.2~0.7份、碳酸氢钠0.01~0.1份。
进一步的，重组流感微胶囊口服疫苗每粒胶囊壳0.1~0.3g，胶囊内容物0.1~1g。
一种重组流感微胶囊口服疫苗的制备方法，包括如下步骤：
（一）复合微生态制剂的制备
将酵母菌和枯草芽孢杆菌依次经过菌种活化、一级菌种制备、二级菌种制备和三级高密度发酵，得酵母菌发酵产物和枯草芽孢杆菌发酵产物；
（二）复合微生态制剂拮抗效果研究
将直径0.5~1cm的两片无菌的滤纸片分别置于固体培养基中央，两纸片之间间隔1~2cm，将50~200μL高密度发酵酵母菌和枯草芽孢杆菌菌液滴加到无菌滤纸片上，置于37℃条件下，分别有氧和厌氧条件下分别恒温静置培养12~120h测量两纸片的抑菌直径距离。
所述固体培养基包括如下质量份数的组分：葡萄糖0.01~0.5%、缬氨酸0.1~0.5%、牛蒡根低聚多肽0.3~1%、琼脂粉1.5~2%，pH 6.8~7.3。
（三）壁材的制备
将酵母菌发酵产物和枯草芽孢杆菌发酵产物经离心、重悬、冷冻干燥后，得酵母菌冻干粉和枯草芽孢杆菌冻干粉；
将酵母菌冻干粉和枯草芽孢杆菌冻干粉按质量比1~5:1~5混合均匀，即得壁材；
（四）芯材的制备
将流感甲型H1N1、甲型H3N2、乙型Yamagata系和乙型Victoria系4种毒株的HA基因通过同源重组的方式整合到杆状病毒基因组上，经过多级高密度发酵昆虫细胞Expisf9-ZY与杆状病毒，采用两步纯化，再经过0.22μm除菌过滤，获得甲型H1N1、甲型H3N2、乙型Yamagata系和乙型Victoria系的HA基因编码的抗原蛋白；
所述昆虫Expisf9-ZY细胞已于2022年08月19日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.45248，分类命名为草地贪夜蛾细胞，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号 中国科学院微生物研究所。
所述同源重组选取flashBac表达系统、flashBAC GOLD表达系统或flashBACULTRA表达系统中其中一种或多种；
所述两步纯化为Q离子交换层析法纯化和SP离子交换层析法纯化；
所述Q离子交换层析法纯化采用Capto Q impres、Q FF或Capto Q离子交换层析法中其中一种；
所述SP离子交换层析法纯化采用Capto SP impres、SP FF或Capto SP离子交换层析法中其中一种；
将抗原蛋白和保护剂混合均匀即得芯材；
（五）重组流感微胶囊的制备
将壁材和芯材混合均匀，经喷雾干燥，得重组流感微胶囊；
所述重组流感微胶囊呈球状或扁球状，粒径为0.3~300μm；
（六）成品包装
将重组流感微胶囊装入胶囊壳内即可。
进一步的，步骤（一）的具体操作为：
（1）菌种活化
将酵母菌采用平板方式在酵母菌活化培养基进行培养，培养温度25~30℃，待培养出单菌落后移种至试管培养，培养温度25~30℃，菌苔布满整个斜面结束培养；
将枯草芽孢杆菌采用平板方式在枯草芽孢杆菌活化培养基进行培养，培养温度30~38℃，待培养出单菌落后移种至试管培养，培养温度30~38℃，菌苔布满整个斜面结束培养；
酵母菌活化培养基包括如下质量浓度的组分：土豆粉0.2~2%、葡萄糖0.5~1%和琼脂1.5~2%；
枯草芽孢杆菌活化培养基包括如下质量浓度的组分：大豆蛋白胨0.2~2%、乳糖0.5~1%和琼脂1.5~2%；
（2）一级菌种制备
将经平板活化后的菌种进行茄瓶培养，酵母菌茄瓶培养温度25~30℃，枯草芽孢杆菌茄瓶培养温度30~38℃，待菌体在250mL茄瓶斜面长满菌苔后结束培养；
酵母菌茄瓶培养基包括如下质量浓度的组分：土豆粉0.2~2%、葡萄糖0.5~1%和琼脂1.5~2%；
枯草芽孢杆菌茄瓶培养基包括如下质量浓度的组分：大豆蛋白胨0.2~2%、乳糖0.5~1%和琼脂1.5~2%；
（3）二级菌种制备
将酵母菌茄瓶斜面的菌苔按照0.2~5%接种至液体培养基，180~250rpm/min，培养温度25~30℃，培养12~96h结束培养；
将枯草芽孢杆菌茄瓶斜面的菌苔按照0.1~6%接种至液体培养基中，150~250rpm/min，培养温度30~38℃，培养12~72h结束培养；
二级酵母菌液体培养基包括如下质量浓度的组分：小麦粉4.5~6%、土豆粉10~15%和葡萄糖10~25%；
二级枯草芽孢杆菌液体培养基包括如下质量浓度的组分：赖氨酸0.1~1%、丙氨酸0.3~2%、精氨酸0.05~5%、乳糖0.1~3%、可溶性淀粉0.1~2.5%和大豆蛋白胨0.2~2%；
（4）三级高密度发酵
将二级酵母菌种子液以0.1~7%的接种比移种至发酵罐内，其中发酵罐装料量为30~60%，罐压0.01~0.05Mpa，培养温度控制在25~30℃，搅拌转速180~250rpm/min，发酵培养24~36h后，排出1~10%的发酵液，然后向罐内流加3~15%的三级酵母菌发酵培养基，再培养12~24h后结束发酵；
将二级枯草芽孢杆菌种子液以0.1~10%的接种比移种至发酵罐内，其中发酵罐装料量为30~60%，罐压0.01~0.05Mpa，培养温度控制在25~30℃，搅拌转速150~250rpm/min，采用0.1~1M的氢氧化钠调节发酵液pH值，使发酵过程中pH值维持在6.3~7.2，发酵培养24~48h后，排出1~10%的发酵液，然后向罐内流加3~15%的三级枯草芽孢杆菌发酵培养基，待枯草芽孢杆菌的营养体开始转化为芽孢态时结束发酵；
三级酵母菌发酵培养基包括如下质量浓度的组分：小麦粉4.5~6%、土豆粉10~15%和葡萄糖10~25%；
三级枯草芽孢杆菌发酵培养基包括如下质量浓度的组分：赖氨酸0.1~1%、丙氨酸0.3~2%、精氨酸0.05~5%、乳糖0.1~3%、可溶性淀粉0.1~2.5%和大豆蛋白胨0.2~2%。
进一步的，步骤（二）中酵母菌冻干粉活菌数为1×109~3×1010CFU/g；枯草芽孢杆菌冻干粉活菌数在2×109~5×1010CFU/g。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明取得的有益效果为：1、本发明制备的重组流感微胶囊口服疫苗使用方便，不需要医护人员的协助，可自行通过口服方式来实现机体免疫；2、本发明采用高密度多级连续发酵技术生产复合微生态制剂，可高效控制菌种的密度和生长速率，大大缩短生产周期，降低了重组流感微胶囊口服疫苗的生产成本；3、本发明使用的酵母菌和枯草芽孢杆菌在有氧和无氧的条件下均无拮抗抑制效果，以酵母菌和枯草芽孢杆菌作为复合微生态制剂作为壁材，有利于改善人体肠道内菌群环境。4、以灵芝复合水提物作为胶囊壳，因其主要活性成分为多糖类，氨基酸、蛋白质、核苷酸、维生素等，同时其具有明显的免疫调节功能；5、传统流感疫苗为混悬液，疫苗的存储与运输条件极为严格，本发明重组流感微胶囊口服疫苗，以固态形式存在，疫苗的免疫原性高，稳定性好，便于疫苗的运输与保存，可减轻冷链运输的压力。6、被包裹的HA抗原蛋白可以克服胃的酸性环境，成功将蛋白递送至肠道。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明所用酵母菌的菌落和菌体照片，其中左图为菌落图片，右图为菌体图片；
图2附图为本发明所用枯草芽孢杆菌的菌落和菌体照片，其中左图为菌落图片，右图为菌体图片；
图3附图为本发明重组流感微胶囊口服疫苗的结构图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
昆虫细胞Expisf9-ZY为本公司研发人员从市售的昆虫细胞Expisf9中筛选获得的无弹状病毒的昆虫细胞，现保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2022年08月19日，保藏编号为CGMCCNo.45248。
昆虫细胞sf 9，购自ATCC，现保藏于天津市北辰区高新大道86号 中逸安科生物技术股份有限公司研发中心，保藏编号sf 9-ZY。
酵母菌Y187，购自Clontech 生物公司，现保藏于天津市北辰区高新大道86号 中逸安科生物技术股份有限公司研发中心，保藏编号ZY.312，该菌种的菌落和菌体照片如图1所示。
枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501，购自北京三药科技开发公司，现保藏于天津市北辰区高新大道86号 中逸安科生物技术股份有限公司研发中心，保藏编号ZY.417，该菌种的菌落和菌体照片如图2所示。
甲型H1N1（A/Delawre/55/2019 CVR-45）购自澳大利亚Seqirus公司。
甲型H3N2（A/Darwin/11/2021）购自澳大利亚维多利亚传染病参考实验室。
乙型Yamagata系（B/Brisbane/9/2014）购自澳大利亚维多利亚传染病参考实验室。
乙型Victoria系（B/Conecticut/01/2021）购自美国疾病控制与预防中心。
Hartley豚鼠和BALB/c小鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。
未提及药剂为常规实验药剂，采购自市售渠道。
未提及的实验方法为常规实验方法，在此不再一一赘述。
实施例1
（一）复合微生态制剂的制备
（1）菌种活化
从-80℃超低温冷藏箱取出酵母菌ZY.312，将酵母菌采用平板方式在酵母菌活化培养基进行培养，培养温度25℃，待培养出单菌落后移种至试管培养，培养温度25℃，菌苔布满整个斜面结束培养。
从-80℃超低温冷藏箱取出枯草芽孢杆菌ZY.417，将枯草芽孢杆菌采用平板方式在枯草芽孢杆菌活化培养基进行培养，培养温度38℃，待培养出单菌落后移种至试管培养，培养温度38℃，菌苔布满整个斜面结束培养。
酵母菌活化培养基包括如下质量浓度的组分：土豆粉0.2%、葡萄糖0.5%和琼脂1.5%。
枯草芽孢杆菌活化培养基包括如下质量浓度的组分：大豆蛋白胨0.2%、乳糖1%和琼脂2%。
（2）一级菌种制备
将经平板活化后的菌种进行茄瓶培养，酵母菌茄瓶培养温度25℃，枯草芽孢杆菌茄瓶培养温度38℃，待菌体在250mL茄瓶斜面长满菌苔后结束培养。
酵母菌茄瓶培养基包括如下质量浓度的组分：土豆粉0.5%、葡萄糖0.5%和琼脂1.5%。
枯草芽孢杆菌茄瓶培养基包括如下质量浓度的组分：大豆蛋白胨1%、乳糖0.5%和琼脂2%。
（3）二级菌种制备
用50ml无菌水洗下酵母菌茄瓶斜面的菌苔，用无菌接种环打散菌悬液，将酵母菌茄瓶斜面的菌苔按照5%接种至1L的液体培养基（使用3L带挡板的培养瓶培养），250rpm/min，培养温度25℃，培养72h结束培养。
用80ml无菌水洗下枯草芽孢杆菌茄瓶斜面的菌苔，用无菌接种环打散菌悬液，将枯草芽孢杆菌茄瓶斜面的菌苔按照6%接种至1L的液体培养基中（使用3L带挡板的培养瓶培养），200rpm/min，培养温度38℃，培养72h结束培养。
二级酵母菌液体培养基包括如下质量浓度的组分：小麦粉4.5%、土豆粉10%和葡萄糖10%。
二级枯草芽孢杆菌液体培养基包括如下质量浓度的组分：赖氨酸0.1%、丙氨酸2%、精氨酸5%、乳糖0.1%、可溶性淀粉2.5%和大豆蛋白胨2%。
（4）三级高密度发酵
将二级酵母菌种子液以7%的接种比移种至发酵罐内，其中发酵罐装料量为60%，罐压0.05Mpa，培养温度控制在25℃，搅拌转速200rpm/min，发酵培养30h后，排出10%的发酵液，然后向罐内流加3%的三级酵母菌发酵培养基，再培养24h后结束发酵。
将二级枯草芽孢杆菌种子液以0.1%的接种比移种至发酵罐内，其中发酵罐装料量为30%，罐压0.01Mpa，培养温度控制在38℃，搅拌转速150rpm/min，采用1M的氢氧化钠调节发酵液pH值，使发酵过程中pH值维持在7.0，发酵培养24h后，排出10%的发酵液，然后向罐内流加15%的三级枯草芽孢杆菌发酵培养基，待枯草芽孢杆菌的营养体开始转化为芽孢态时，结束发酵。
三级酵母菌发酵培养基包括如下质量浓度的组分：小麦粉5.5%、土豆粉10%和葡萄糖25%。
三级枯草芽孢杆菌发酵培养基包括如下质量浓度的组分：赖氨酸0.5%、丙氨酸0.3%、精氨酸5%、乳糖0.1%、可溶性淀粉2.5%和大豆蛋白胨0.2%。
（二）复合微生态制剂拮抗效果研究
将直径0.5cm的两片无菌的滤纸片分别置于固体培养基中央，两纸片之间间隔1cm，将200μL高密度发酵酵母菌和枯草芽孢杆菌菌液滴加到无菌滤纸片上，置于37℃条件下，分别有氧和厌氧条件下分别恒温静置培养120h测量两纸片的抑菌直径距离，具体如下表1所示。
固体培养基包括如下质量浓度的组分：葡萄糖0.5%、缬氨酸0.1%、牛蒡根低聚多肽1%、琼脂粉2%，pH 7.0。
表1复合微生态制剂拮抗效果研究
编号 培养方式 平板对峙情况 是否生长 抑菌直径/cm
1 有氧培养 酵母菌-枯草芽孢杆菌 是 0
2 厌氧培养 酵母菌-枯草芽孢杆菌 是 0
实验结果表明：表1的结果表明酵母菌和枯草芽孢杆菌在有氧培养和无氧培养的条件下均生长，且两种菌的菌苔长到一起，抑菌直径为0cm，酵母菌和枯草芽孢杆菌无抑菌圈，表明酵母菌和枯草芽孢杆菌的生长无抑制效果，可用于重组流感微胶囊口服的高效制备与使用。
（三）壁材的制备
将酵母菌发酵产物，置于25℃条件下，12000rpm/min，离心5min，用无菌生理盐水重悬离心后的菌苔，重复处理5次，然后在用冷冻干燥方式制备酵母菌冻干粉，使酵母菌冻干粉活菌数在1×109CFU/g范围内。
将枯草芽孢杆菌发酵产物，置于4℃条件下，300rpm/min，离心30min，用无菌生理盐水重悬离心后的菌苔，重复处理3次，然后在用冷冻干燥方式制备枯草芽孢杆菌冻干粉，使枯草芽孢杆菌冻干粉活菌数在5×109CFU/g范围。将酵母菌冻干粉和枯草芽孢杆菌冻干粉按质量比5:1混合均匀，即得壁材。
（四）芯材的制备
将流感甲型H1N1、甲型H3N2、乙型Yamagata系和乙型Victoria系4种毒株的HA基因通过同源重组（选取FlashBac表达系统）的方式整合到杆状病毒基因组上，经过多级高密度发酵昆虫细胞Expisf9-ZY与杆状病毒，采用两步纯化(Capto Q离子交换层析法和Capto SP离子交换层析法)，再经过0.22μm除菌过滤，获得甲型H1N1、甲型H3N2、乙型Yamagata系和乙型Victoria系的HA基因编码的抗原蛋白。
将抗原蛋白和保护剂混合均匀即得芯材。
抗原蛋白含量为15μg。
保护剂包括如下，按重量份数计，螺旋藻多肽0.3份、玉米蛋白多肽0.05份和小球藻多肽0.5份。
抗原蛋白与保护剂的混合比例为0.5:0.1。
（五）重组流感微胶囊的制备
将壁材和芯材在4℃下混合均匀，经喷雾干燥，得重组流感微胶囊。
壁材和芯材的体积比为3:0.5。
重组流感微胶囊呈球状，粒径为100μm。
（六）成品包装
将重组流感微胶囊冻干粉装入胶囊壳内即可。
胶囊壳为灵芝复合水提物。
灵芝复合水提物由白灵芝水提物、黑灵芝水提物和辅料按质量比1:1:0.2组成。
辅料包括如下，按重量份数计，微晶纤维素0.5份、维生素C 0.05份、硬脂酸镁0.1份、聚乙二醇6000 0.5份、碳酸氢钠0.05份。
重组流感微胶囊口服疫苗每粒胶囊壳0.2g，胶囊内容物0.5g。
实施例2
（一）复合微生态制剂的制备
（1）菌种活化
从-80℃超低温冷藏箱取出酵母菌ZY.312，将酵母菌采用平板方式在酵母菌活化培养基进行培养，培养温度28℃，待培养出单菌落后移种至试管培养，培养温度28℃，菌苔布满整个斜面结束培养。
从-80℃超低温冷藏箱取出枯草芽孢杆菌ZY.417，将枯草芽孢杆菌采用平板方式在枯草芽孢杆菌活化培养基进行培养，培养温度30℃，待培养出单菌落后移种至试管培养，培养温度30℃，菌苔布满整个斜面结束培养。
酵母菌活化培养基包括如下质量浓度的组分：土豆粉0.2%、葡萄糖0.8%和琼脂1.5%。
枯草芽孢杆菌活化培养基包括如下质量浓度的组分：大豆蛋白胨2%、乳糖0.5%和琼脂1.5%。
（2）一级菌种制备
将经平板活化后的菌种进行茄瓶培养，酵母菌茄瓶培养温度28℃，枯草芽孢杆菌茄瓶培养温度30℃，待菌体在250mL茄瓶斜面长满菌苔后结束培养。
酵母菌茄瓶培养基包括如下质量浓度的组分：土豆粉0.2%、葡萄糖1%和琼脂1.5%。
枯草芽孢杆菌茄瓶培养基包括如下质量浓度的组分：大豆蛋白胨2%、乳糖1%和琼脂1.5%。
（3）二级菌种制备
用100ml无菌水洗下酵母菌茄瓶斜面的菌苔，用无菌接种环打散菌悬液，将酵母菌茄瓶斜面的菌苔按照0.2%接种至1L的液体培养基（使用3L带挡板的培养瓶培养），180rpm/min，培养温度28℃，培养48h结束培养。
用50ml无菌水洗下枯草芽孢杆菌茄瓶斜面的菌苔，用无菌接种环打散菌悬液，将枯草芽孢杆菌茄瓶斜面的菌苔按照0.1%接种至1L的液体培养基中（使用3L带挡板的培养瓶培养），150rpm/min，培养温度30℃，培养12h结束培养。
二级酵母菌液体培养基包括如下质量浓度的组分：小麦粉6%、土豆粉15%和葡萄糖25%。
二级枯草芽孢杆菌液体培养基包括如下质量浓度的组分：赖氨酸1%、丙氨酸0.3%、精氨酸0.05%、乳糖3%、可溶性淀粉0.1%和大豆蛋白胨1%。
（4）三级高密度发酵
将二级酵母菌种子液以0.1%的接种比移种至发酵罐内，其中发酵罐装料量为30%，罐压0.03Mpa，培养温度控制在28℃，搅拌转速250rpm/min，发酵培养24h后，排出1%的发酵液，然后向罐内流加15%的三级酵母菌发酵培养基，再培养12h后结束发酵。
将二级枯草芽孢杆菌种子液以5%的接种比移种至发酵罐内，其中发酵罐装料量为30%，罐压0.01Mpa，培养温度控制在30℃，搅拌转速150rpm/min，采用1M的氢氧化钠调节发酵液pH值，使发酵过程中pH值维持在6.3，发酵培养48h后，排出1%的发酵液，然后向罐内流加15%的三级枯草芽孢杆菌发酵培养基，待枯草芽孢杆菌的营养体开始转化为芽孢态时，结束发酵。
三级酵母菌发酵培养基包括如下质量浓度的组分：小麦粉4.5%、土豆粉15%和葡萄糖10%。
三级枯草芽孢杆菌发酵培养基包括如下质量浓度的组分：赖氨酸1%、丙氨酸0.3%、精氨酸5%、乳糖0.1%、可溶性淀粉2.5%和大豆蛋白胨0.2%。
（二）复合微生态制剂拮抗效果研究
将直径1cm的两片无菌的滤纸片分别置于固体培养基中央，两纸片之间间隔2cm，将50μL高密度发酵酵母菌和枯草芽孢杆菌菌液滴加到无菌滤纸片上，置于37℃条件下，分别有氧和厌氧条件下分别恒温静置培养12h测量两纸片的抑菌直径距离，具体如下表2所示。
固体培养基包括如下质量份数的组分：葡萄糖0.01%、缬氨酸0.5%、牛蒡根低聚多肽0.3%、琼脂粉1.5%，pH 6.8。
表2复合微生态制剂拮抗效果研究
编号 培养方式 平板对峙情况 是否生长 抑菌直径/cm
1 有氧培养 酵母菌-枯草芽孢杆菌 是 0
2 厌氧培养 酵母菌-枯草芽孢杆菌 是 0
实验结果表明：表2的结果表明酵母菌和枯草芽孢杆菌在有氧培养和无氧培养的条件下均生长，且两种菌的菌苔长到一起，抑菌直径为0cm，酵母菌和枯草芽孢杆菌无抑菌圈，表明酵母菌和枯草芽孢杆菌的生长无抑制效果，可用于重组流感微胶囊口服的高效制备与使用 。
（三）壁材的制备
将酵母菌发酵产物，置于4℃条件下，7000rpm/min，离心25min，用无菌生理盐水重悬离心后的菌苔，重复处理3次，然后在用冷冻干燥方式制备酵母菌冻干粉，使酵母菌冻干粉活菌数在3×109 CFU/g范围内。
将枯草芽孢杆菌发酵产物，置于4℃条件下，12000rpm/min，离心5min，用无菌生理盐水重悬离心后的菌苔，重复处理5次，然后在用冷冻干燥方式制备枯草芽孢杆菌冻干粉，使枯草芽孢杆菌冻干粉活菌数在2×109CFU/g范围。
将酵母菌冻干粉和枯草芽孢杆菌冻干粉按质量比3:1混合均匀，即得壁材。
（四）芯材的制备
将流感甲型H1N1、甲型H3N2、乙型Yamagata系和乙型Victoria系4种毒株的HA基因通过同源重组（选取flashBAC GOLD表达系统）的方式整合到杆状病毒基因组上，经过多级高密度发酵昆虫细胞Expisf9-ZY与杆状病毒，采用两步纯化（Q FF离子交换层析法和SP FF离子交换层析法），再经过0.22μm除菌过滤，获得甲型H1N1、甲型H3N2、乙型Yamagata系和乙型Victoria系的HA基因编码的抗原蛋白。
将抗原蛋白和保护剂混合均匀即得芯材。
抗原蛋白含量为45μg。
保护剂包括如下，按重量份数计，螺旋藻多肽0.01份、玉米蛋白多肽0.5份和小球藻多肽0.05份。
抗原蛋白与保护剂的混合比例为5:0.5。
（五）重组流感微胶囊的制备
将壁材和芯材在15℃下混合均匀，经喷雾干燥，得重组流感微胶囊。
壁材和芯材的体积比为0.3:1。
重组流感微胶囊呈扁球状，粒径为300μm。
（六）成品包装
将重组流感微胶囊冻干粉装入胶囊壳内即可。
胶囊壳为灵芝复合水提物。
灵芝复合水提物由白灵芝水提物、黑灵芝水提物和辅料按质量比3:1:3组成。
辅料包括如下，按重量份数计，微晶纤维素0.1份、维生素C 0.02份、硬脂酸镁0.5份、聚乙二醇6000 0.2份、碳酸氢钠0.01份。
重组流感微胶囊口服疫苗每粒胶囊壳0.1g，胶囊内容物0.1g。
实施例3
（一）复合微生态制剂的制备
（1）菌种活化
从-80℃超低温冷藏箱取出酵母菌ZY.312，将酵母菌采用平板方式在酵母菌活化培养基进行培养，培养温度30℃，待培养出单菌落后移种至试管培养，培养温度30℃，菌苔布满整个斜面结束培养。
从-80℃超低温冷藏箱取出枯草芽孢杆菌ZY.417，将枯草芽孢杆菌采用平板方式在枯草芽孢杆菌活化培养基进行培养，培养温度33℃，待培养出单菌落后移种至试管培养，培养温度33℃，菌苔布满整个斜面结束培养。
酵母菌活化培养基包括如下质量浓度的组分：土豆粉2%、葡萄糖1%和琼脂2%。
枯草芽孢杆菌活化培养基包括如下质量浓度的组分：大豆蛋白胨0.2%、乳糖1%和琼脂2%。
（2）一级菌种制备
将经平板活化后的菌种进行茄瓶培养，酵母菌茄瓶培养温度30℃，枯草芽孢杆菌茄瓶培养温度33℃，待菌体在250mL茄瓶斜面长满菌苔后结束培养。
酵母菌茄瓶培养基包括如下质量浓度的组分：土豆粉2%、葡萄糖0.5%和琼脂2%。
枯草芽孢杆菌茄瓶培养基包括如下质量浓度的组分：大豆蛋白胨2%、乳糖0.7%和琼脂1.5%。
（3）二级菌种制备
用75ml无菌水洗下酵母菌茄瓶斜面的菌苔，用无菌接种环打散菌悬液，将酵母菌茄瓶斜面的菌苔按照1%接种至1L的液体培养基（使用3L带挡板的培养瓶培养），200rpm/min，培养温度30℃，培养96h结束培养。
用100ml无菌水洗下枯草芽孢杆菌茄瓶斜面的菌苔，用无菌接种环打散菌悬液，将枯草芽孢杆菌茄瓶斜面的菌苔按照3%接种至1L的液体培养基中（使用3L带挡板的培养瓶培养），200rpm/min，培养温度33℃，培养12h结束培养。
二级酵母菌液体培养基包括如下质量浓度的组分：小麦粉5.5%、土豆粉15%和葡萄糖25%。
二级枯草芽孢杆菌液体培养基包括如下质量浓度的组分：赖氨酸0.5%、丙氨酸1%、精氨酸3%、乳糖2%、可溶性淀粉1%和大豆蛋白胨0.2%。
（4）三级高密度发酵
将二级酵母菌种子液以5%的接种比移种至发酵罐内，其中发酵罐装料量为30%，罐压0.01MPa，培养温度控制在30℃，搅拌转速180rpm/min，发酵培养36h后，排出3%的发酵液，然后向罐内流加5%的三级酵母菌发酵培养基，再培养24h后结束发酵。
将二级枯草芽孢杆菌种子液以10%的接种比移种至发酵罐内，其中发酵罐装料量为60%，罐压0.05Mpa，培养温度控制在33℃，搅拌转速250rpm/min，采用0.1M的氢氧化钠调节发酵液pH值，使发酵过程中pH值维持在7.2，发酵培养36h后，排出10%的发酵液，然后向罐内流加3%的三级枯草芽孢杆菌发酵培养基，待枯草芽孢杆菌的营养体开始转化为芽孢态时，结束发酵。
三级酵母菌发酵培养基包括如下质量浓度的组分：小麦粉6%、土豆粉10%和葡萄糖20%。
三级枯草芽孢杆菌发酵培养基包括如下质量浓度的组分：赖氨酸0.1%、丙氨酸2%、精氨酸0.05%、乳糖3%、可溶性淀粉0.1%和大豆蛋白胨2%。
（二）复合微生态制剂拮抗效果研究
将直径1cm的两片无菌的滤纸片分别置于固体培养基中央，两纸片之间间隔2cm，将50μL高密度发酵酵母菌和枯草芽孢杆菌菌液滴加到无菌滤纸片上，置于37℃条件下，分别有氧和厌氧条件下分别恒温静置培养12h测量两纸片的抑菌直径距离，具体如下表3所示。
固体培养基包括如下质量份数的组分：葡萄糖0.2%、缬氨酸0.25%、牛蒡根低聚多肽1%、琼脂粉1.8%，pH 7.3。
表3复合微生态制剂拮抗效果研究
编号 培养方式 平板对峙情况 是否生长 抑菌直径/cm
1 有氧培养 酵母菌-枯草芽孢杆菌 是 0
2 厌氧培养 酵母菌-枯草芽孢杆菌 是 0
实验结果表明：表3的结果表明酵母菌和枯草芽孢杆菌在有氧培养和无氧培养的条件下均生长，且两种菌的菌苔长到一起，抑菌直径为0cm，酵母菌和枯草芽孢杆菌无抑菌圈，表明酵母菌和枯草芽孢杆菌的生长无抑制效果，可用于重组流感微胶囊口服的高效制备与使用 。
（三）壁材的制备
将酵母菌发酵产物，置于25℃条件下，300rpm/min，离心30min，用无菌生理盐水重悬离心后的菌苔，重复处理5次，然后在用冷冻干燥方式制备酵母菌冻干粉，使酵母菌冻干粉活菌数在3×109 CFU/g范围内。
将枯草芽孢杆菌发酵产物，置于25℃条件下，5000rpm/min，离心10min，用无菌生理盐水重悬离心后的菌苔，重复处理3次，然后在用冷冻干燥方式制备枯草芽孢杆菌冻干粉，使枯草芽孢杆菌冻干粉活菌数在5×1010 CFU/g范围。
将酵母菌冻干粉和枯草芽孢杆菌冻干粉按质量比1:5混合均匀，即得壁材。
（四）芯材的制备
将流感甲型H1N1、甲型H3N2、乙型Yamagata系和乙型Victoria系4种毒株的HA基因通过同源重组（选取flashBAC ULTRA表达系统）的方式整合到杆状病毒基因组上，经过多级高密度发酵昆虫细胞Expisf9-ZY与杆状病毒，采用两步纯化（Capto Q impres离子交换层析法和Capto SP impres离子交换层析法），再经过0.22μm除菌过滤，获得甲型H1N1、甲型H3N2、乙型Yamagata系和乙型Victoria系的HA基因编码的抗原蛋白。
将抗原蛋白和保护剂混合均匀即得芯材。
抗原蛋白含量为65μg。
所述保护剂包括如下，按重量份数计，螺旋藻多肽0.1份、玉米蛋白多肽0.3份和小球藻多肽0.05份。
抗原蛋白与保护剂的混合比例为0.5:3。
（五）重组流感微胶囊的制备
将壁材和芯材在25℃下混合均匀，经喷雾干燥，得重组流感微胶囊。
壁材和芯材的体积比为0.01:0.2。
重组流感微胶囊呈球状，粒径为0.3μm。
（六）成品包装
将重组流感微胶囊冻干粉装入胶囊壳内即可。
胶囊壳为灵芝复合水提物。
灵芝复合水提物由白灵芝水提物、黑灵芝水提物和辅料按质量比5:5:1组成。
辅料包括如下，按重量份数计，微晶纤维素0.2份、维生素C 0.1份、硬脂酸镁0.2份、聚乙二醇6000 0.7份、碳酸氢钠0.1份。
进一步的，重组流感微胶囊口服疫苗每粒胶囊壳0.3g，胶囊内容物1g。
实施例4 重组流感微胶囊口服疫苗的应用效果研究
（1）安全性评价实验
本发明共设11组：其中，
第一组为口服疫苗低剂量组（一日一粒），为本发明实施例1制备的重组流感微胶囊口服疫苗，其芯材HA来源于昆虫细胞Expisf9-ZY基质生产的4个毒株的抗原蛋白；
第二组为口服疫苗中剂量组（一日二粒），为本发明实施例1制备的重组流感微胶囊口服疫苗，其芯材HA来源于昆虫细胞Expisf9-ZY基质生产的4个毒株的抗原蛋白；
第三组为口服疫苗高剂量组（一日三粒），为本发明实施例1制备的重组流感微胶囊口服疫苗，其芯材HA来源于昆虫细胞Expisf9-ZY基质生产的4个毒株的抗原蛋白；
第四组为口服疫苗低剂量组（一日一粒），为重组流感微胶囊口服疫苗，其芯材HA来源于传统鸡胚基质生产的4个毒株的抗原蛋白，芯材制备方法参照CN202010392775.3；
第五组为口服疫苗中剂量组（一日二粒），为重组流感微胶囊口服疫苗，其芯材HA来源于传统鸡胚基质生产的4个毒株的抗原蛋白，芯材制备方法参照CN202010392775.3；
第六组为口服疫苗高剂量组（一日三粒），为重组流感微胶囊口服疫苗，其芯材HA来源于传统鸡胚基质生产的4个毒株的抗原蛋白，芯材制备方法参照CN202010392775.3；
第七组为口服疫苗低剂量组（一日一粒），为重组流感微胶囊口服疫苗，其芯材HA来源于昆虫细胞sf 9-ZY基质生产的4个毒株的抗原蛋白，即将昆虫细胞Expisf9-ZY替换成昆虫细胞sf 9-ZY，其余操作同实施例1；
第八组为口服疫苗中剂量组（一日二粒），为重组流感微胶囊口服疫苗，其芯材HA来源于昆虫细胞sf 9-ZY基质生产的4个毒株的抗原蛋白，即将昆虫细胞Expisf9-ZY替换成昆虫细胞sf 9-ZY，其余操作同实施例1；
第九组为口服疫苗高剂量组（一日三粒），为重组流感微胶囊口服疫苗，其芯材HA来源于昆虫细胞sf 9-ZY基质生产的4个毒株的抗原蛋白，即将昆虫细胞Expisf9-ZY替换成昆虫细胞sf 9-ZY，其余操作同实施例1；
第十组为口服疫苗组（一日三粒），为重组流感微胶囊口服疫苗（不含有芯材HA抗原蛋白）；
第十一组为未接种疫苗组（阴性对照组）。
本发明选用出生和体重接近的Hartley豚鼠和BALB/c小鼠。
免疫对象：实验对象1：选取3周龄豚鼠，雌雄各半，每组120只，每组6个重复；实验对象2：选取6周龄BALB/c小鼠，雌雄各半，每组120只，每组6个重复。
免疫地点：在中逸安科生物技术股份有限公司SPF级动物房进行实验。
免疫计划：豚鼠和小鼠每日口服，连续服用2天。记录免疫后21天的Hartley豚鼠和BALB/c小鼠的存活率、体重、通眼眶收集血液样品，并检测抗体水平情况。考察整个培养过程是否存在过敏反应或异常毒性。豚鼠和小鼠安全性评价结果见表4。
表4 安全性评价
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结果显示：免疫后的豚鼠和小鼠均未出现死亡情况，无过敏反应或异常毒性现象的发生；与第十组（未含芯材HA抗原蛋白）相比，第一组到第九组均在豚鼠和小鼠体内均产生抗体，说明重组流感微胶囊口服疫苗的制备工艺是可行的；芯材来源于杆状病毒昆虫细胞Expisf9-ZY表达的HA抗体效价（第一组到第三组）均高于芯材为来源于鸡胚基质的HA抗体效价(第四组到第六组)，说明杆状病毒昆虫细胞表达的HA抗原蛋白明显优于鸡胚基质的HA抗原蛋白的免疫效果；芯材来源于杆状病毒昆虫细胞Expisf9-ZY表达的HA抗体效价（第一组到第三组）均高于芯材来源于杆状病毒昆虫细胞sf 9-ZY表达的HA抗体效价（第七组到第九组），说明昆虫细胞Expisf9-ZY的抗原蛋白表达水平高于昆虫细胞sf 9-ZY的抗原蛋白表达水平；从实验结果看第二组重组流感微胶囊口服疫苗中剂量组抗体效价最高，且在豚鼠和小鼠上均看到相同的规律，表明适宜剂量的重组流感微胶囊口服疫苗是安全，能够达到流感免疫的目的，且芯材的HA抗原蛋白来源于昆虫细胞Expisf9-ZY的最佳。
（2）免疫后攻毒情况研究
本发明共设6组：其中，
第一组为口服疫苗组为本发明实施例1制备的重组流感微胶囊口服疫苗（一日二粒，含胶囊壳），以昆虫细胞Expisf9-ZY基质生产的4个毒株的抗原蛋白；
第二组为口服疫苗组为重组流感微胶囊口服疫苗（一日二粒，含胶囊壳），以昆虫细胞sf 9-ZY基质生产的4个毒株的抗原蛋白，即将昆虫细胞Expisf9-ZY替换成昆虫细胞sf9-ZY，其余操作同实施例1；
第三组为重组流感微胶囊口服疫苗（一日二粒，不含胶囊壳，其余操作同实施例1）；
第四组为注射组疫苗为市售四价重组流感亚单位流感疫苗；
第五组为阳性对照组（未接种疫苗组，攻毒）；
第六组为阴性对照组（未接种疫苗组，未攻毒）。
免疫对象：实验对象1：选取3周龄豚鼠，雌雄各半，每组120只，每组6个重复；实验对象2：选取6周龄BALB/c小鼠，雌雄各半，每组120只，每组6个重复。
免疫计划：口服疫苗组（第一组、第二组、第三组）豚鼠和小鼠每日口服，连续服用2天；注射组：免疫接种一次。
供试毒株：甲型H1N1（A/Delawre/55/2019 CVR-45）、甲型H3N2（A/Darwin/11/2021）、乙型Yamagata系（B/Brisbane/9/2014）和乙型Victoria系（B/Conecticut/01/2021）。
攻毒实验于中逸安科生物技术股份有限公司SPF级动物房进行，对Hartley豚鼠和BALB/c小鼠免疫14天后进行攻毒实验，以350μL/只（107EID50）的剂量分别对豚鼠和小鼠的颈部皮下进行接毒（甲型H1N1（A/Delawre/55/2019 CVR-45）、甲型H3N2（A/Darwin/11/2021）、乙型Yamagata系（B/Brisbane/9/2014）和乙型Victoria系（B/Conecticut/01/2021））处理。考察周期为15天，记录攻毒后豚鼠和小鼠的存活率、体重情况（若豚鼠和小鼠体重减轻≥25%，则为不符合要求项）和检查血清抗体效价情况。考察整个培养过程是否存在过敏反应或异常毒性。应用效果对比研究结果见表5。
表5 应用效果对比研究
Figure DEST_PATH_IMAGE003
结果显示：第六组（阴性对照组）豚鼠和小鼠的存活率均高于其他剩余五组，且未产生抗体；第五组（阳性对照组）豚鼠和小鼠的体内无抗体，攻毒后死亡，说明豚鼠和小鼠体内无抗体时不能阻止病毒的复制；第一组的豚鼠和小鼠的存活率、体重和抗体水平均高于第二组的豚鼠和小鼠的存活率、体重和抗体效价，表明以昆虫细胞Expisf9-ZY基质生产的疫苗免疫效果均好于以昆虫细胞sf 9-ZY基质生产的疫苗免疫效果；第一组的豚鼠和小鼠的存活率、体重和抗体水平比第三组的豚鼠和小鼠的存活率、体重和抗体水平高，表明含胶囊壳的重组流感微胶囊口服疫苗比不含有胶囊壳的重组流感微胶囊口服疫苗的防护效果强；第一组的豚鼠和小鼠的存活率、体重和抗体水平比第四组的豚鼠和小鼠的存活率、体重和抗体水平高，说明含胶囊壳的重组流感微胶囊口服疫苗比市售的注射组疫苗效果强，表明口服流感疫苗能够达到或高于注射型疫苗的效果。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (9)

1.一种重组流感微胶囊口服疫苗，其特征在于，包括胶囊壳和胶囊内容物；
所述胶囊内容物为重组流感微胶囊冻干粉，包括壁材和芯材；
所述壁材为复合微生态制剂，包括酵母菌和枯草芽孢杆菌；
所述芯材为4个毒株的HA基因编码的抗原蛋白，4个毒株分别为甲型H1N1、甲型H3N2、乙型Yamagata系和乙型Victoria系；
甲型H1N1毒株的HA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
甲型H3N2毒株的HA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
乙型Yamagata系毒株的HA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
乙型Victoria系毒株的HA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
2.如权利要求1所述的一种重组流感微胶囊口服疫苗，其特征在于，所述酵母菌的活菌数量为1×109~3.0×1010CFU/g；所述枯草芽孢杆菌的活菌数量为2×109~5.0×1010CFU/g。
3.如权利要求1所述的一种重组流感微胶囊口服疫苗，其特征在于，所述壁材和芯材的体积比为0.01~3：0.01~1。
4.如权利要求1所述的一种重组流感微胶囊口服疫苗，其特征在于，所述抗原蛋白含量为15~65μg。
5.如权利要求1所述的一重组流感微胶囊口服疫苗，其特征在于，还包括保护剂；
所述保护剂包括如下，按重量份数计，螺旋藻多肽0.1~0.3份、玉米蛋白多肽0.05~0.5份和小球藻多肽0.05~0.5份；
所述抗原蛋白与保护剂按质量比0.5~5：0.1~3混合。
6.如权利要求1所述的一种重组流感微胶囊口服疫苗，其特征在于，所述胶囊壳为灵芝复合水提物；
所述灵芝复合水提物由白灵芝水提物、黑灵芝水提物和辅料按质量比1~5：1~5：0.2~3组成；
所述辅料包括如下，按重量份数计，微晶纤维素0.1~0.5份、维生素C 0.02~0.1份、硬脂酸镁0.1~0.5份、聚乙二醇6000 0.2~0.7份、碳酸氢钠0.01~0.1份。
7.如权利要求1~6任一所述的一种重组流感微胶囊口服疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（一）复合微生态制剂的制备
将酵母菌和枯草芽孢杆菌依次经过菌种活化、一级菌种制备、二级菌种制备和三级高密度发酵，得酵母菌发酵产物和枯草芽孢杆菌发酵产物；
（二）壁材的制备
将酵母菌发酵产物和枯草芽孢杆菌发酵产物经离心、重悬、冷冻干燥后，得酵母菌冻干粉和枯草芽孢杆菌冻干粉；
将酵母菌冻干粉和枯草芽孢杆菌冻干粉按质量比1~5:1~5混合均匀，即得壁材；
（三）芯材的制备
将流感甲型H1N1、甲型H3N2、乙型Yamagata系和乙型Victoria系4种毒株的HA基因通过同源重组的方式整合到杆状病毒基因组上，经过多级高密度发酵昆虫Expisf9-ZY细胞与杆状病毒，采用两步纯化，再经过0.22μm除菌过滤，获得甲型H1N1、甲型H3N2、乙型Yamagata系和乙型Victoria系的HA基因编码的抗原蛋白；
所述昆虫Expisf9-ZY细胞保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.45248；
所述同源重组选取flashBac表达系统、flashBAC GOLD表达系统或flashBAC ULTRA表达系统中其中一种或多种；
所述两步纯化为Q离子交换层析法纯化和SP离子交换层析法纯化；
将抗原蛋白和保护剂混合均匀即得芯材；
（四）重组流感微胶囊的制备
将壁材和芯材混合均匀，经喷雾干燥，得重组流感微胶囊；
（五）成品包装
将重组流感微胶囊装入胶囊壳内即可。
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤（一）的具体操作为：
（1）菌种活化
将酵母菌采用平板方式在酵母菌活化培养基进行培养，培养温度25~30℃，待培养出单菌落后移种至试管培养，培养温度25~30℃，菌苔布满整个斜面结束培养；
将枯草芽孢杆菌采用平板方式在枯草芽孢杆菌活化培养基进行培养，培养温度30~38℃，待培养出单菌落后移种至试管培养，培养温度30~38℃，菌苔布满整个斜面结束培养；
酵母菌活化培养基包括如下质量浓度的组分：土豆粉0.2~2%、葡萄糖0.5~1%和琼脂1.5~2%；
枯草芽孢杆菌活化培养基包括如下质量浓度的组分：大豆蛋白胨0.2~2%、乳糖0.5~1%和琼脂1.5~2%；
（2）一级菌种制备
将经平板活化后的菌种进行茄瓶培养，酵母菌茄瓶培养温度25~30℃，枯草芽孢杆菌茄瓶培养温度30~38℃，待菌体在250mL茄瓶斜面长满菌苔后结束培养；
酵母菌茄瓶培养基包括如下质量浓度的组分：土豆粉0.2~2%、葡萄糖0.5~1%和琼脂1.5~2%；
枯草芽孢杆菌茄瓶培养基包括如下质量浓度的组分：大豆蛋白胨0.2~2%、乳糖0.5~1%和琼脂1.5~2%；
（3）二级菌种制备
将酵母菌茄瓶斜面的菌苔按照0.2~5%接种至液体培养基，180~250rpm/min，培养温度25~30℃，培养12~96h结束培养；
将枯草芽孢杆菌茄瓶斜面的菌苔按照0.1~6%接种至液体培养基中，150~250rpm/min，培养温度30~38℃，培养12~72h结束培养；
二级酵母菌液体培养基包括如下质量浓度的组分：小麦粉4.5~6%、土豆粉10~15%和葡萄糖10~25%；
二级枯草芽孢杆菌液体培养基包括如下质量浓度的组分：赖氨酸0.1~1%、丙氨酸0.3~2%、精氨酸0.05~5%、乳糖0.1~3%、可溶性淀粉0.1~2.5%和大豆蛋白胨0.2~2%；
（4）三级高密度发酵
将二级酵母菌种子液以0.1~7%的接种比移种至发酵罐内，其中发酵罐装料量为30~60%，罐压0.01~0.05Mpa，培养温度控制在25~30℃，搅拌转速180~250rpm/min，发酵培养24~36h后，排出1~10%的发酵液，然后向罐内流加3~15%的三级酵母菌发酵培养基，再培养12~24h后结束发酵；
将二级枯草芽孢杆菌种子液以0.1~10%的接种比移种至发酵罐内，其中发酵罐装料量为30~60%，罐压0.01~0.05Mpa，培养温度控制在30~38℃，搅拌转速150~250rpm/min，采用0.1~1M的氢氧化钠调节发酵液pH值，使发酵过程中pH值维持在6.3~7.2，发酵培养24~48h后，排出1~10%的发酵液，然后向罐内流加3~15%的三级枯草芽孢杆菌发酵培养基，待枯草芽孢杆菌的营养体开始转化为芽孢态时结束发酵；
三级酵母菌发酵培养基包括如下质量浓度的组分：小麦粉4.5~6%、土豆粉10~15%和葡萄糖10~25%；
三级枯草芽孢杆菌发酵培养基包括如下质量浓度的组分：赖氨酸0.1~1%、丙氨酸0.3~2%、精氨酸0.05~5%、乳糖0.1~3%、可溶性淀粉0.1~2.5%和大豆蛋白胨0.2~2%。
9.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤（二）中酵母菌冻干粉活菌数为1×109~3×1010CFU/g；枯草芽孢杆菌冻干粉活菌数在2×109~5×1010CFU/g。
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