CN115720638A - 具有三种或更多种颜色荧光光源的光学模块及其使用方法 - Google Patents

Abstract

提供了一种包括荧光显微镜(115)、成像传感器(120)和光学模块(110)以及相位灯(125)的成像装置以促进三个(或更多个)颜色通道的落射荧光成像以及执行样品的相位衬度和/或明场成像，而无需手动调节成像装置。这允许通过位于培养箱(180)内部的成像装置在延长的时间段内对多个样品进行自动成像，而不会干扰培养箱环境以手动调节该装置。还提供了促进可拆卸光学模块(110)和/或透照模块(125)的用户更换的实施例，以允许成像装置适应测定和/或荧光指示剂的不同组合，以便增加可以使用成像装置成像的实验和/或荧光染料的种类。

Description

具有三种或更多种颜色荧光光源的光学模块及其使用方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2020年4月21日提交的美国非临时专利申请No.16/854,756的优先权，该申请的内容通过引用全部并入本文。

技术领域

背景技术

可以各种方式对活细胞生物样品进行显微成像，以评估该样品在一个或更多个时间点的生长、代谢、形态、或其他特性。该显微成像可以包括荧光成像，其中样品中的荧光团被荧光团激发波长的光激发，使它们以荧光团的发射波长荧光发射光。在落射荧光成像中，经由用于收集发射光的同一物镜提供激发光。

实现多通道荧光成像经常涉及每次针对特定发射波长采集荧光图像时将不同的滤光器集以及偶尔的激发光源移动到恰当位置。然而，由于需要物理地移动部件，这样的布置导致系统更大、速度更慢、成本更高且可靠性更低。

发明内容

在第一方面，公开了一种用于对活细胞生物样品中的荧光团进行成像的示例光学模块。该光学模块包括：(a)第一光源，该第一光源被配置为发射第一激发波长带中的第一光；(b)第一滤光器，该第一滤光器被布置在该第一光源的第一光路中，该第一滤光器被配置为使一个或更多个波长的光通过以及反射一个或更多个波长的光；(c)第二光源，该第二光源被配置为发射第二激发波长带中的第二光；(d)第二滤光器，该第二滤光器被布置在该第二光源的第二光路中，该第二滤光器被配置为使一个或更多个波长的光通过以及反射一个或更多个波长的光；(e)第三光源，该第三光源被配置为发射第三激发波长带中的第三光；(f)第三滤光器，该第三滤光器被布置在该第三光源的第三光路中，该第三滤光器被配置为使一个或更多个波长的光通过以及反射一个或更多个波长的光，其中，第一光路、第二光路以及第三光路沿着主传输光路会聚，主传输光路被配置为朝向活细胞生物样品引导；以及(g)发射滤光器，该发射滤光器被布置在由活细胞生物样品中的荧光团发射的光的主发射光路中，其中，主发射光路被配置为在成像传感器处终止，其中，该发射滤光器被配置为使第一发射波长带、第二发射波长带和第三发射波长带中的光通过，以及该发射滤光器被配置为反射第一激发波长带、第二激发波长带和第三激发波长带中的光。

在第二方面，公开了一种用于测定活细胞生物样品的示例系统。该系统包括：(a)根据本公开的第一方面的光学模块；(b)荧光显微镜，该荧光显微镜可拆卸地耦接到光学模块，其中荧光显微镜具有至少一个物镜；(c)成像传感器，该成像传感器被布置在由来自物镜的活细胞生物样品中的荧光团发射的光的发射路径中；以及(d)相位灯，该相位灯可拆卸地耦接到荧光显微镜并且被布置在主传输光路的终端处。

在第三方面，公开了一种用于对活细胞生物样品中的荧光团进行成像的示例方法。该方法包括：(i)将第一生物样品和荧光显微镜对准，使得该第一生物样品位于该荧光显微镜的视场内，其中，该第一生物样品包含：(a)第一荧光团，该第一荧光团响应于由第一激发波长带中的光的照射而发射第一发射波长带中的光；(b)第二荧光团，该第二荧光团响应于由第二激发波长带中的光的照射而发射第二发射波长带中的光；以及(c)第三荧光团，该第三荧光团响应于由第三激发波长带中的光的照射而发射第三发射波长带中的光；(ii)使用该荧光显微镜获得该第一生物样品的图像集，其中图像集中的图像在焦点设置方面不同；(iii)基于该图像集，分别为第一发射波长带、第二发射波长带和第三发射波长带确定第一对焦设置、第二对焦设置和第三对焦设置；(iv)在第一时间段期间，使用第一光源以第一激发波长带中的光照射第一生物样品，并且根据第一对焦设置操作荧光显微镜以经由荧光显微镜的图像传感器获得第一发射波长带中的光的第一图像；(v)在第二时间段期间，使用第二光源以第二激发波长带中的光照射该第一生物样品，并且根据第二对焦设置操作荧光显微镜以经由图像传感器获得第二发射波长带中的光的第二图像；以及(vi)在第三时间段期间，使用第三光源以第三激发波长带中的光照射第一生物样品，并且根据第三对焦设置操作荧光显微镜以经由图像传感器获得第三发射波长带中的光的第三图像。

在第四方面，公开了一种示例非暂时性计算机可读介质。该计算机可读介质上存储有程序指令，该程序指令在由处理器执行时使第三方面的方法执行。

已经讨论的特征、功能和优点可以在各种示例中独立地实现或者可以与其他示例结合，更多细节可以参考以下描述和附图。

附图说明

图1是根据一个示例实施方式的系统的功能框图；

图2描绘了根据示例实施方式的计算设备和计算机网络的框图；

图3示出了根据示例实施方式的用于测定活细胞生物样品的系统(包括光学模块)的功能框图；

图4示出了根据示例实施方式的用于测定活细胞生物样品的系统(包括光学模块)的功能框图；

图5示出了根据示例实施方式的用于测定活细胞生物样品的系统(包括光学模块)的功能框图；

图6示出了根据示例实施方式的光学模块的前视图；

图7示出了根据图6的示例实施方式的光学模块的后视图；

图8示出了根据图6的示例实施方式的光学模块的侧视图；

图9示出了根据图6的示例实施方式的光学模块的前截面视图；

图10示出了根据图6的示例实施方式的光学模块的侧截面视图；

图11示出了根据图6的示例实施方式的光学模块的侧截面视图；

图12示出了根据图11的示例实施方式的光学模块的轴的详细视图；

图13示出了根据示例实施方式的用于测定活细胞生物样品的系统(包括光学模块)的功能框图；

图14示出了根据示例实施方式的相位灯(phaselamp)的透视图；

图15示出了根据示例实施方式的耦接到荧光显微镜上的相位灯的截面视图；以及

图16示出了根据示例实施方式的方法的流程图。

附图是用于说明示例的目的，但应理解的是，本发明并不限于在附图中示出的布置和工具。

具体实施方式

I.概述

活细胞样品的显微成像可以提供关于在各种实验条件下细胞群的健康、生长和活性的信息。该信息可以包括：关于样品中细胞随时间变化的数量、细胞的形态或其他结构特征、细胞的内部内含物或结构(例如，与细胞的有丝分裂期或其他代谢过程相关的内含物)或关于细胞的其他信息的信息。该信息可用于评估细胞在“正常”条件下和/或在各种施加的实验条件下的行为。例如，细胞的显微成像可以用于评估细胞对实验药物或其他添加物质的反应、细胞的基因修饰的影响、添加的癌细胞、其他添加的细胞类型和/或添加的细菌、真菌、病毒或其他微生物对细胞的影响、或一些其他施加的实验条件对活细胞样品的影响。

为了降低这种成像的成本，为了减小用于执行成像的装置(例如，培养箱、成像装置)的大小、为了减少对施加于细胞样品的条件的稳定性的影响、和/或为了提供其他益处，可以由被配置为与活细胞样品一起存在于培养箱内部的自动成像装置来执行多个活细胞样品的显微成像。这样的自动成像装置可以包括：台架或其他致动器，台架或其他致动器被配置为移动成像装置和/或活细胞样品(例如，多孔板或其他多样品容器)以促进培养箱内的多个活细胞样品的自动成像。这样的活细胞样品可以包括多个活细胞样品，多个活细胞样品可以在活细胞内含物的身份(identity)或混合、添加的药物、微生物、癌细胞、或其他添加的物质的身份或量、施加于活细胞内含物的基因修饰的类型、或一些其他实验条件方面不同。

这种系统的显微成像装置可以包括：反射镜、滤光器、或其他元件以折叠该成像装置的光路，以便减小该成像装置的大小，使得该成像装置可以安装在培养箱内。附加地或可替代地，该成像装置的元件可以被分成分立的子组件以促进各种显微成像模态。例如，相位灯和/或其他透照光源可以被提供在模块中，该模块与包含图像传感器的模块分开并且与活细胞样品容器相对，以促进明场成像、相位衬度成像、或其他显微成像模式。

可以将荧光染料、非荧光染料或颜料、纳米棒或在适当波长下表现出表面等离子体共振的其他导电元件、拉曼染料、或其他光学可区分物质添加至活细胞样品中，以促进对样品的内含物和/或其过程或内含物进行成像。可以(例如，用抗体)将光学可区分物质功能化，以特异性地结合至样品内的感兴趣的物质或以其他方式与样品内的感兴趣的物质相互作用。例如，造影剂可以被功能化以特异性地结合至生物样品内的蛋白质、特定细胞的表面标记、DNA/RNA/等的特定序列、或一些其他感兴趣的物质或元件，或以其他方式与生物样品内的蛋白质、特定细胞的表面标记、DNA/RNA/等的特定序列、或一些其他感兴趣的物质或元件相互作用。这种功能化可以促进对样品内的特定物质成像，例如对样品中蛋白质或其他感兴趣的物质的存在、量、分布或其他信息进行成像。可以通过作为外在物质引入活细胞样品中(例如，通过向多孔样品板的每个孔中添加特定量的荧光团，该荧光团与对特定类型的细胞或受体特异的抗体缀合)而添加光学可区分物质。附加地或可替代地，可以通过基因修饰样品中的活细胞以表达光学可区分物质(例如，通过向样品中的活细胞添加绿色荧光蛋白的基因)来添加光学可区分物质。附加地或可替代地，此类光学可区分物质可以天然存在于活细胞中和/或其分泌的物质(例如，由活细胞群天然表达的自发荧光蛋白)中。

响应于由与发射带不同的激发带中的光的激发而在发射带中发射光的荧光团或其他物质(例如，拉曼染料)在对样品的内含物成像中是尤其有用的。这部分是由于将激发光与响应地发射的发射光区分开的能力，以及通过控制激发光来控制发射光的量值和定时的能力。这些特性允许荧光染料以比其他物质(例如，在一定波长范围内散射光使得所散射的光的波长与照射光的波长基本上相同的染料)更高的保真度成像。此外，光学上可区分的不同荧光团可用于促进对多个不同荧光团独立地成像。这些不同的荧光团可以在激发光谱、发射光谱、或其他特性(例如，荧光寿命)方面不同，以促进这样的独立成像。可以通过在相应的不同时间点以不同荧光团的相应不同激发波长提供光来实现这样的成像。当激发光经由与用于收集和成像来自样品的发射光相同的物镜(或物镜系统)递送至样品时，该过程可以称为“落射荧光成像”。

为了在不同的时间点对不同的荧光团(或其他光学可区分的样品内含物)进行成像，荧光成像仪(例如，落射荧光成像仪)可以机械地将一个或更多个波长选择性滤光器、反射镜、或其他波长选择性光学元件移入和移出该成像仪的光路，以促进用在不同激发波长带中的光照射该样品和/或促进在不同发射波长带中的光的选择性接收和成像。然而，这种成像仪可能在机械上更加复杂、成本更高、更大、可靠性更低，或者可能展现出一些其他不希望的性能特性。相反，该成像仪可以包括：一组静态二向色镜、光学滤光器、或被配置为允许不同光源发射相应不同荧光团的相应不同激发带中的光同时还允许不同荧光团的相应发射带中的光通过图像传感器并由图像传感器成像的其他元件。

例如，用于在荧光显微镜系统中使用落射荧光能力测定活细胞生物样品的光学模块可以包括：两个光源和相关联的滤光器(例如，二向色镜)。选择与这些光源以及与光学器件模块内的滤光器的通带/阻带/反射带相关联的波长，以根据它们各自被激发并响应地发射的光的颜色与一组或更多组荧光团一起工作。

这种成像系统可以被配置为和操作以独立地激发至少它们相应的激发带不同的两个不同的荧光团，并且检测从至少它们相应的激发带不同的两个不同的荧光团响应地发射的光。例如，这样的系统可以在第一配置中检测绿色荧光团和红色荧光团，在第二配置中(例如，通过更换包含光源、二向色镜、滤光器或其他光学部件的光学模块来实现)检测橙色荧光团和近红外(“NIR”)荧光团。此类双色成像系统的不同配置(例如，该系统的不同可更换光学模块)可以被配置为激发与特定测定(例如，荧光泛素化细胞周期指示剂(“fluorescence ubiquitination cell cycle indicator，FUCCI”)测定，该测定是允许观察细胞群内的细胞分裂的基因编码的双色(红色和绿色)指示剂)相关联的荧光团对。当系统以特定配置设置时，仅可针对与特定配置兼容的荧光团收集独立的图像。

这种双荧光团光学系统在能够独立地成像的不同荧光团的数量方面受到限制。因此，在自动成像场景中(例如，其中多孔样品容器的不同孔在孔中存在的荧光团方面不同)，在能够在单个样品中生成的信息的类型或跨不同样品群生成的信息的类型方面受到限制。这可以包括可以在单个样品中执行的荧光测定的种类(即，包括两个或更少荧光指示剂的测定)方面受到限制。这种测定的一个示例是基于荧光泛素化细胞周期指示剂(“FUCCI”)，该基于荧光泛素化细胞周期指示剂(“FUCCI”)是允许观察细胞群内的细胞分裂的基因编码的双色(红色和绿色)指示剂。然而，用于进行该测定的双色光学模块不能区分S期(即，当细胞在其细胞核中合成DNA的完整副本时)、G2期(即，第二间隙期，当细胞生长更多、制造蛋白质和细胞器并开始重组其内含物以准备有丝分裂时)和有丝分裂(M)期(即，细胞将其DNA分成两组并将其细胞质分开，形成两个新细胞)。在M/G1转换中还存在无色期(colorlessphase)，使得细胞与非表达细胞无法区分。TagGFP2是拥有亮绿色荧光的蛋白质，其中，激发/发射最大值分别在483nm和506nm。在S期、G2期和M期期间，细胞各自经由TagGFP2的表达发射绿色荧光，可以使用双色光学模块成像绿色荧光。mKate是远红色荧光蛋白，远红色荧光蛋白具有分别在588nm和633nm处激发/发射最大值的荧光。在G1期(即，第一间隙期，当细胞在物理上生长得更大时，复制细胞器，并产生分子结构单元用于随后的生长阶段)和转换成S期期间，细胞经由mKate的表达发射远红色荧光，也可以使用双色光学模块成像远红色荧光。然而，这种双色光学模块不能使用附加荧光指示剂来识别细胞分裂过程中的附加阶段或子阶段。

可以通过更换出光学模块来扩展这种双荧光团成像系统的能力，该光学模块包括光源、滤光器、反射镜、或与这两个荧光团的激发带和发射带相关的其他光学元件。然而，这样的手动更换可能难以在自动成像实验完成时执行，并且需要通过打开培养箱来严重扰乱活细胞样品的环境使得模块可以被更换。

在各种应用中有益的是：能够使用荧光成像装置来独立地对三个(或更多个)荧光通道进行成像(而不更换光学模块或执行可能导致培养环境的扰动的一些其他手动过程)。这样的系统可以允许更多地使用更复杂的测定(例如，包括三种或更多种荧光指示剂的测定，像观察完整细胞周期的三色FUCCI测定)，识别单个样品中更多类型的细胞，同时还评估代谢或其他荧光指示剂(例如，标记相应不同细胞类型的两种或更多种荧光指示剂，而样品中第三种荧光指示剂代表代谢、细胞死亡或一些其他感兴趣的过程)，使用在培养箱中的单独样品中更多类型的测定/单独荧光指示剂和/或在培养箱中的不同样品中更多类型的测定/单独荧光指示剂。这些益处可以通过减少进行指定数量的实验/测定所需的时间和培养箱空间来降低成本，这是通过允许单个样品中的单个实验的多个不同测定的复用和/或通过允许在单个培养箱中的样品板的不同孔中进行不同实验的不同测定实现的。

本文的实施例提供了以与培养箱内的自动多样品成像兼容的方式涉及这样的三个(或更多个)通道显微荧光成像过程的方法和系统。这些实施例提供了增加的复杂性的解决方案，增加的复杂性伴随着将三个(或更多个)通道荧光成像装置适配到有限的体积/尺寸中，同时还允许该成像装置还用于明场和/或相位衬度显微术。这些实施例还提供了对于指定分支光路的复杂问题的解决方案，该分支光路将在三个(或更多个)激发带中的激发光路由到样品，同时还将在三个(或更多个)发射带中的光从样品路由到图像传感器，同时还拒绝激发带中的光。这些实施例中的一些包括：提供相位灯(或其他透照光源)，该相位灯是与对应的三个(或更多个)通道荧光成像模块配对的可拆卸模块的一部分。这样的配对可能是必要的，以确保来自相位灯的光包括能够穿过配对的荧光成像模块的波长。这样的照射模块和配对的光学滤光器模块可以包括条形码、机载存储器、或其他特征以促进自动模块检测和识别，以便在运行实验之前警告用户这些模块是否不匹配。

本文所提供的实施例还包括：对用于手动更换光学模块(例如，相位灯模块、光源和滤光器模块)的装置的改进，该改进改进了此类模块在成像装置内的就座和对准并且增加了用户可以执行这种手动更换的容易性。在现有系统中，需要单独的工具将各种光学模块与系统耦接和解接。该工具很难通过光学模块中的小孔与对应的螺钉对准。此外，耦接或解耦光学模块所需的力对于许多终端用户来说难以生成，这部分地由于用于将模块内的光源电耦接到系统的剩余部分的控制器和电源的电连接器的布置和配置。因此，许多终端用户需要帮助以更换光学模块。

光学模块的灵活的可互换性使得该系统能够被配置为允许用于检测荧光团的方法的不同组合，包括但不限于：(i)激活在三个不同激发波长带中的三个光源以将激发光引导到样品，并且检测来自三个不同的荧光团(例如，绿色、橙色、以及近红外(“NIR”))的响应地发射的发射光；(ii)激活在三个不同的激发波长带中的三个光源，用针对基于福斯特共振能量转移(Forster resonance energy transfer，“FRET”)的测量(例如，ATP)的激发波长中的两个和第三激发波长带识别独立的荧光团(例如，核标记)；以及(iii)仅使用光学模块的两个不同激发波长带中的两个光源，并检测来自两个不同荧光团(例如，(a)绿色和红色，或(b)橙色和NIR)的响应地发射的发射光。

此外，与三个(或更多个)带光学模块中的滤光器相匹配的相位灯也可以包括在系统中以有利地允许进行相位和明场成像(例如，以便增强荧光成像信息和/或提供独立的图像信息、进一步处理和细化图像以识别荧光团、测量FRET、或提供一些其他益处)。本公开的相位灯模块(或其他透照光源模块)的一个优点是：该系统能够直接识别已经安装的特定相位灯模块。检测相位灯的身份有益地允许系统确定何时存在无效配置，在该无效配置中，相位灯对于给定的光学模块不是正确匹配(这可能导致例如来自相位灯的光被完全地或部分地阻挡以免传输通过光学模块以被成像)并且在运行实验(例如，包括执行一个或更多个测定的实验)之前警告用户。

II.示例架构

图1是示出操作环境100的框图，例如，该操作环境100包括或涉及用于测定活细胞生物样品的系统105，该系统105包括与计算设备200a电通信的荧光显微镜115。荧光显微镜115位于培养箱108内，该培养箱108被配置为控制温度、湿度、和/或其他环境参数以促进培养可以通过荧光显微镜115以自动方式成像的活细胞样品。通过将荧光显微镜115放置在培养箱180内，荧光显微镜115可以对样品进行成像而不需要从培养箱180中移除样品，这个过程可能会扰乱样品并且改变他们对所施加的实验条件的生长/响应。下文描述的图16中的方法300示出了可以在该操作环境100内实施的方法的实施方式。

荧光显微镜115包括光学模块110，该光学模块110可以与成像传感器120组合使用以使用落射荧光成像对培养箱180中的样品成像。光学模块110包括三个(或更多个)光源，三个(或更多个)光源被配置为在与样品中的相应荧光团(例如，荧光指示剂，该荧光指示剂包括与抗体或其他结构缀合的荧光团以促进选择性地结合至感兴趣的蛋白质或其他物质)相对应的三个(或更多个)相应激发波长带中提供照射。光学模块110还包括：二向色镜、滤光器、和/或被配置为提供分支光路的其他元件，使得来自三个(或更多个)光源的光经由物镜被递送至样品。物镜可以是光学模块110的一部分或者可以与光学模块110分开。光学模块110还被配置为将通过物镜收集的三个(或更多个)相应发射波长带中的响应地发射的荧光递送到成像传感器120，以促进样品中的三种不同荧光团的落射荧光成像。

能够使用单个光学模块110独立地对三个不同的荧光团进行落射荧光成像提供了多种益处。它可以有助于使用更复杂的三种(或更多种)颜色测定。它可以有助于对单个样品中的多个测定或其他荧光指示剂(例如，双色FUCCI测定和独立的荧光指示剂，该荧光指示剂选择性地结合至特定类型的细胞，从而允许确定该样品中细胞的身份和细胞分裂期两者)进行成像。它可以通过放宽所有指示剂/测定仅符合两组激发/发射带的要求(例如，可以选择更优化的荧光指示剂用于特定用途而不是选择与双色光学模块的两个可用激发/发射带之一匹配的较不优化的指示剂)，来促进荧光团/测定选择。它可以通过允许更有效地使用单个仪器/培养箱内的空间，来促进对包含在同一培养箱中的不同样品中的不同组的测定/荧光指示剂进行成像，以节省时间和其他成本。例如，(可能相对于发射/激发波长重叠的)具有相应的第一组荧光指示剂/测定和第二组荧光指示剂/测定的第一和第二不同实验可以在同一培养箱中的相应组的孔中进行。附加地或可替代地，可以用在用于进行单个实验的孔的子集中存在的多个不同组的测定/荧光指示剂进行单个实验，从而允许使用相同的培养箱同时生成关于该实验的附加数据。能够使用单个光学模块110独立地落射荧光成像三个(或更多个)不同的荧光团可以提供附加的或替代的益处或益处组合。

荧光显微镜115还包括：相位灯(phase lamp)125(或其他透照光源)，该相位灯125被配置为提供光以用于相位衬度、明场、或其他形式的成像。光学模块110被配置为使从相位灯125发射的光中的至少一些光通过。在一些示例中，这可包括相位灯125是窄带光源(例如，激光器、LED)，光学模块被配置为使光穿过由窄带光源发射的窄带波长。光学模块110和相位灯125的细节在本文其他地方(例如，关于图3-图15)提供。

(例如，根据本文其他地方描述的实施例)光学模块110可以是由用户可更换的，以便使用荧光显微镜115在不同的时间段期间对不同的荧光指示剂/测定进行成像。这可以包括具有针、槽或其他对准特征的光学模块，以促进光学模块110与荧光显微镜115的其他成像部件(例如，与成像传感器120)对准。这还可以包括具有一个或更多个电连接器的光学模块110，以促进供电和控制三个(或更多个)光源或提供一些其他功能性。例如，光学模块110可以包括存储器或其他电部件，以允许计算设备(例如，200、200a)识别光学模块110和/或确定可以从光学模块110发射的光的波长带和/或使用光学模块110成像的光的波长带。

相位灯125(或其他透照光源)还可以是由用户可更换的。这可能是由于不同的可更换光学模块110具有不同通带(即，来自样品的光的波长可以穿过光学模块110到成像传感器120的带)，该不同通带可能不与每个可能的相位灯125兼容。例如，第一相位灯125在某种意义上(例如，相对于对特定类型的样品进行相位衬度成像)可以是“最佳的”，但可以产生波长带中的光，该波长带不与已被选择以进行实验(例如，促进对感兴趣的特定测定进行成像)的光学模块110的任何通带显著重叠。因而，第一相位灯125模块可以与第二相位灯125模块更换，该第二相位灯125模块以全部或基本上在选定的光学模块110的通带内的波长发射光。

此类可更换相位灯125模块可以包括：存储器或其他电部件，以允许计算设备(例如，200、200a)识别相位灯125模块和/或确定可以从相位灯125模块发射的光的波长带。该身份/信息可以自动地与安装在荧光显微镜115中的光学模块110的类似信息/身份进行比较，以确保所安装的模块是兼容的(例如，以确保所安装的光学模块110可以通过从所安装的相位灯125模块发射的光的波长，这样使得该组合可以用于使用相位灯125模块经由相位衬度、明场、或一些其他成像模态对样品成像)。如果检测到不兼容，则可以在开始使用系统105的自动成像试验或其他实验之前警告用户。

图2是示出根据示例实施方式的被配置为直接或间接地与操作环境100接口连接的计算设备200的示例的框图。计算设备200可用于执行图16中所示和下文描述的方法的功能。具体地，计算设备200可以被配置为执行一个或更多个功能，包括但不限于，使用单个光学模块来在单个器皿或多个器皿中的单个生物样品中获得三种或更多种荧光颜色的图像。然后，获得的图像可用于执行关于成像的生物样品的附加分析，该成像的生物样品与对应于三种或更多种荧光颜色的荧光团和/或与其缀合的物质的性质相关。功能还可包括使用不是单个光学模块的一部分的光源(例如，相位灯)来使用信号光学模块和其他光源获得样品的明场图像、相位衬度图像或一些其他图像。

在单个样品中成像的三种或更多种颜色的可用性促进更复杂的多色分析或测定(例如，观察完整细胞周期的三色FUCCI测定)，在单个样品中或在不同样品中进行多种不同测定(例如，双色FUCCI测定(绿色/橙色)连同用于细胞凋亡的膜联蛋白NIR测定)，一种或更多种荧光指示剂彼此组合和/或与一种或更多种多色测定(例如，用于识别相应细胞类型的两种荧光报告子(reporter)和用于细胞凋亡的膜联蛋白NIR测定，该膜联蛋白NIR测定可以用作三色免疫细胞杀伤测定的一部分)组合的使用、促进在位于同一培养箱中的不同样品中的不同组指示剂/测定的使用，或其他示例。三种或更多种颜色的可用性还可以放宽对所选择的指示剂/测定的要求，从而允许更大的灵活性。例如，如果特定测定仅以特定颜色可用，则该颜色可被保留用于测定，而其他颜色可用于细胞类型特异性指示剂或其他应用(例如，更多颜色选项可用的测定的颜色通道)。

计算设备200具有连接至通信总线212的处理器202、通信接口204、数据存储设备206、输出接口208和显示器210。计算设备200还可以包括：硬件，以实现计算设备200内和计算设备200与其他设备(例如，未示出)之间的通信。硬件可包括例如发射机、接收机和天线。

通信接口204可以是无线接口和/或一个或更多个有线接口，无线接口和/或一个或更多个有线接口允许与一个或更多个网络214或与一个或更多个远程计算设备216(例如，平板设备216a、个人计算机216b、膝上型计算机216c和移动计算设备216d)的短程通信和远程通信两者。此类无线接口可提供在一个或更多个无线通信协议(诸如蓝牙、Wi-Fi(例如，电气和电子工程师协会(IEEE)802.11协议)、长期演进(Long-Term Evolution，LTE)、蜂窝通信、近场通信(NFC)和/或其他无线通信协议)下的通信。这样的有线接口可以包括以太网接口、通用串行总线(USB)接口或用于经由线缆、双绞线、同轴电缆、光链路、光纤链路或与有线网络的其他物理连接进行通信的类似接口。因此，通信接口204可以被配置为从一个或更多个设备接收输入数据，还可以被配置为将输出数据发送到其他设备。

通信接口204还可以包括用户输入设备，例如键盘、小键盘、触摸屏、触摸板、计算机鼠标、跟踪球和/或其他类似设备。

数据存储设备206可以包括或采取可由处理器202读取或访问的一个或更多个计算机可读存储介质的形式。计算机可读存储介质可包括：可与处理器202整体或部分集成的易失性和/或非易失性存储部件，诸如光学、磁性、有机或其他存储器或盘存储设备。数据存储设备206被视为非暂时性计算机可读介质。在一些示例中，数据存储设备206可以使用单个物理设备(例如，一个光学、磁性、有机或其他存储器或盘存储单元)来实现，而在其他示例中，数据存储设备206可以使用两个或更多个物理设备来实现。

因此，数据存储设备206是非暂时性计算机可读存储介质，可执行指令218存储在数据存储设备206上。指令218包括计算机可执行代码。当指令218由处理器202执行时，使处理器202执行功能。此类功能包括但不限于：使用单个光学模块来在单个器皿或多个器皿中的单个生物样品中获得三种或更多种荧光颜色的图像，使用除该单个光学模块之外的相位灯或其他光源来与该单个光学模块组合来获得该生物样品的明场图像、相位衬度图像、或一些其他图像，和/或基于所获得的图像进行分析。

处理器202可以是通用处理器或专用处理器(例如，数字信号处理器、专用集成电路等)。处理器202可以接收来自通信接口204的输入，并且处理该输入以生成被存储在数据存储设备206中并且被输出到显示器210的输出。处理器202可以被配置为执行可执行指令218(例如，计算机可读程序指令)，该可执行指令218被存储在数据存储设备206中并且可以被执行以提供本文所描述的计算设备200的功能。

输出接口208向显示器210或其他部件输出信息。由此，输出接口208可类似于通信接口204、也可为无线接口(例如，发射机)或有线接口。例如，输出接口208可以向一个或更多个可控设备发送命令。

图2中所示的计算设备200还可以表示例如与系统105通信的操作环境100中的本地计算设备200a(图1)。该本地计算设备200a可以执行下文描述的方法300的步骤中的一个或更多个，可以从用户接收输入和/或可以将图像数据和用户输入发送到计算设备200以执行方法300的步骤中的全部或一些。

图16示出了用于对活细胞生物样品中的荧光团进行成像的示例方法300的流程图。方法300包括：将第一生物样品和荧光显微镜对准，使得第一生物样品位于荧光显微镜的视场内，其中该第一生物样品包含(i)第一荧光团，该第一荧光团响应于由第一激发波长带中的光的照射而发射第一发射波长带中的光，(ii)第二荧光团，该第二荧光团响应于由第二激发波长带中的光的照射而发射第二发射波长带中的光，和(iii)第三荧光团，该第三荧光团响应于由第三激发波长带中的光的照射而发射第三发射波长带中的光(305)；使用荧光显微镜获得第一生物样品的图像集，其中图像集中的图像在焦点设置方面不同(310)；基于该图像集，分别为第一发射波长带、第二发射波长带和第三发射波长带确定第一对焦设置、第二对焦设置和第三对焦设置(315)；在第一时间段期间，使用第一光源以第一激发波长带中的光照射第一生物样品并且根据第一对焦设置操作荧光显微镜以经由荧光显微镜的图像传感器获得第一发射波长带中的光的第一图像(320)；在第二时间段期间，使用第二光源以第二激发波长带中的光照射第一生物样品并且根据第二对焦设置操作荧光显微镜以经由图像传感器获得第二发射波长带中的光的第二图像(325)；在第三时间段期间，使用第三光源以第三激发波长带中的光照射第一生物样品并且根据第三对焦设置操作荧光显微镜以经由图像传感器获得第三发射波长带中的光的第三图像(330)。图16中示出的方法300呈现了例如可以与图2的计算设备200一起使用的方法的示例。在一些实例中，系统的部件可以被配置为执行功能，使得部件被配置和构造有硬件和/或软件以实现这样的性能。例如当以特定方式操作时，系统的部件可以被布置成适于、能够或适合执行功能。方法300可以包括如由框305-330中的一个或更多个所展示的一个或更多个操作、功能或动作。虽然以顺序次序示出了框，但这些框中的一些还可以并行地执行和/或以与本文所描述的次序不同的次序执行。此外，各个框可以被组合成更少的框、被划分成附加框、和/或基于期望的实施方式被移除。

应理解的是，对于本文公开的这个和其他过程和方法，流程图示出了本示例的一个可能实施方式的功能和操作。就此而言，每个框可表示模块、段或程序代码的一部分，模块、段或程序代码的一部分包括可由处理器执行以实现过程中的特定逻辑功能或步骤的一个或更多个指令。程序代码可以存储在任何类型的计算机可读介质或数据存储设备上，例如包括磁盘或硬盘驱动器的存储设备。进一步，程序代码能够以机器可读格式被编码在计算机可读存储介质上，或者被编码在其他非暂时性介质或制品上。计算机可读介质可以包括非暂时性计算机可读介质或存储器，例如，存储短时间段的数据的计算机可读介质，诸如寄存器存储器、处理器高速缓存和随机存取存储器(RAM)。计算机可读介质还可包括非暂时性介质，诸如次级或持久长期存储设备，例如只读存储器(ROM)、光盘或磁盘、光盘只读存储器(CD-ROM)。计算机可读介质还可以是任何其他易失性或非易失性存储系统。例如，计算机可读介质可以被认为是有形的计算机可读存储介质。

此外，图16中的每个框以及本文公开的其他过程和方法内可以表示连线以执行该过程中的特定逻辑功能的电路。如本领域技术人员将理解的，替代实施方式被包括在本公开的示例的范围内，其中，取决于所涉及的功能，可以以不同于所示出或讨论的顺序(包括基本上同时或以相反的顺序)执行功能。

III.示例光学模块

图3-图5和图13以简化示意图示出了用于使用图像传感器120对活细胞生物样品130中的荧光团进行成像的光学模块110的各种配置和实施例。光学模块110包括滤光器、光发射器、以及其他元件，光学模块110被配置为提供在至少三个不同的激发波长带中可独立控制的激发光并且使至少三个对应的发射波长带中的光穿过(图3、图4和图5示出了三色配置，图13示出了四色配置)。光学模块110还被配置为使来自相位灯125(或其他透照光源)的已经穿过样品130和/或已经被样品130散射的光通过，以由图像传感器120成像。

光学模块110包括：第一光源135，该第一光源135被配置为发射第一激发波长带中的第一光。第一滤光器136被布置在第一光源135的第一光路137中。第一滤光器136被配置为使一个或更多个波长的光通过，以及反射一个或更多个其他波长的光。光学模块110进一步包括第二光源140，该第二光源140被配置为发射第二激发波长带中的第二光。第二滤光器141被布置在第二光源140的第二光路142中。第二滤光器141被配置为使一个或更多个波长的光通过，以及反射一个或更多个其他波长的光。光学模块110还包括第三光源145，该第三光源145被配置为发射第三激发波长带中的第三光。第三滤光器146被布置在第三光源145的第三光路147中。第三滤光器146被配置为使一个或更多个波长的光通过以及反射一个或更多个其他波长的光。传输到样品130的激发光和/或穿过光学模块110到图像传感器120的图像光(例如，荧光发射光、明场、相位衬度或其他散射和/或传输图像光)的方向在图中由光路上的箭头指示。

滤光器136、141、146可以包括以多种方式配置的多种材料或部件，以促进某些波长带的反射和/或吸收以及某些其他波长带的传输。例如，136、141、146可以是包括许多交替材料层的二向色镜，这些材料的组成、厚度和顺序可以被指定，以便提供所希望的通带、阻带、反射带、或其他波长选择性光学行为。

在光学模块110中，第一光路137、第二光路142以及第三光路147沿着主传输光路150会聚，该主传输光路150被配置为经由物镜165朝向活细胞生物样品130引导。该模块还包括发射滤光器155，该发射滤光器155位于主发射光路156中并且被配置为响应于由光源134、140、145照射而使由活细胞生物样品130中的荧光团发射的光通过，以及使从相位灯125发射的光中的至少一些通过。主发射光路156在成像传感器120处终止。发射滤光器155被配置为使至少第一发射波长带、第二发射波长带和第三发射波长带中的光通过，第一发射波长带、第二发射波长带和第三发射波长带经由样品130中的相应的第一荧光团、第二荧光团和第三荧光团对应于由光源134、140、145发射的第一激发波长、第二激发波长和第三激发波长。发射滤光器155还被配置为使从相位灯125发射的光的至少一些波长通过。实际上，这可包括使相位灯的光源的波长与第一发射波长带、第二发射波长带或第三发射波长带中的一个或更多个匹配。

发射滤光器155还可以被配置为抑制(例如，反射、吸收)第一激发波长带、第二激发波长带和第三激发波长带中的光。可替代地，可以依赖于其他滤光器136、141、146的反射作用来防止来自光源135、140、145的激发光被图像传感器120接收。此外，发射滤光器155还可以被配置为反射或以其他方式抑制来自生物样品130的人为自发荧光，和/或反射来自可能存在于生物样品130中的其他荧光染料的光。

注意，光学模块110可以包括物镜165或图像传感器120中的一个或两个。可替代地，光学模块110可以被配置为可拆卸地耦接到物镜165或图像传感器120中的一个或两个上。这可以进行，例如以降低单个可更换光学模块的成本。

在示例实施方式中，如图3所示，第一滤光器136被配置为使第一激发波长带中的光通过，以及反射第二激发波长带和第三激发波长带中的光以及第一发射波长带、第二发射波长带和第三发射波长带以及由相位灯125发射的波长带(由相位灯125发射的波长带可以与第一发射波长带、第二发射波长带或第三发射波长带中的一个或更多个重叠)中的光。第二滤光器141被配置为使第三激发波长带中以及第一发射波长带、第二发射波长带和第三发射波长带以及相位灯波长中的光通过，以及反射第二激发波长带中的光。第三滤光器146被配置为使第一发射波长带、第二发射波长带和第三发射波长带以及相位灯波长中的光通过，以及反射第三激发波长带中的光。

如图3所示，第一光源135、第二光源140以及第三光源145在同一平面中被串联布置。图3中的元件的布置导致光学模块110在一个维度(在图3中水平地)中相当长，而在其他两个维度(垂直地以及进入和离开图3的平面)中具有较小的尺寸。这在一些应用中可能是期望的。然而，在一些应用中，减小光学模块110的最大尺寸和/或使光学模块110的形状和大小符合指定的形状和/或大小(例如，将模块适配在培养箱内或适配在自动成像系统的台架上)可以是有益的。因而，光学模块110的元件的布置可以被修改，例如，以折叠、嵌套和/或分支各个光路和/或改变各个光路的方向和/或顺序。

在另一个示例实施方式中，如图4所示，第一滤光器136被配置为使第一激发波长带和第二激发波长带中的光通过以及反射第三激发波长带中以及第一发射波长带、第二发射波长带和第三发射波长带中的光。第二滤光器141被配置为使第二激发波长带中的光通过以及反射第一激发波长带中的光。第三滤光器146被配置为使第一发射波长带、第二发射波长带和第三发射波长带中的光通过，以及反射第三激发波长带中的光。因此，在图4所示的实施方式中，第一光源135被布置使得第一光路137在第一光源135处开始、从第二滤光器141反射出、穿过第一滤光器136、并且沿着主传输光路150离开光学模块110。第二光源140被布置为使得第二光路142在第二光源140处开始、穿过第二滤光器141、然后通过第一滤光器136、并且沿着主传输光路150离开光学模块110。第三光源145被布置使得第三光路147在第三光源145处开始、从第三滤光器146反射到达第一滤光器136、从第一滤光器136反射出、并且沿着主传输光路150离开光学模块110。由活细胞生物样品130中的荧光团发射的光的主发射光路156从第一滤光器136反射出、穿过第三滤光器146、穿过发射滤光器155、并且离开光学模块110。

在图4中的示例实施方式中，第二光源140和第三光源145被布置成彼此平行，第一光源135相对于第二光源140和第三光源145成90度角布置。这种布置允许更紧凑的光学模块110，该光学模块110包括壳体111内的三个光源。

在图5中示出的又另一个可选的实施方式中，该第一滤光器136被配置为使第一激发波长带中的光通过。第一滤光器136还被配置为反射第二激发波长带和第三激发波长带中以及第一发射波长带、第二发射波长带和第三发射波长带中的光。第二滤光器141被配置为使第一发射波长带、第二发射波长带和第三发射波长带中的光通过。第二滤光器141还被配置为反射第二激发波长带和第三激发波长带中的光。第三滤光器146被配置为使第三激发波长带中的光通过。第三滤光器146还被配置为反射第二激发波长带中的光。

因此，在图5所示的实施方式中，第一光源135被布置使得第一光路137在第一光源135处开始、穿过第一滤光器136、并且沿着主传输光路150离开光学模块110。第二光源140被布置使得第二光路142在第二光源140处开始、从第三滤光器146反射到第二滤光器141、从第二滤光器141反射到第一滤光器136、从第一滤光器136反射出、并且沿着主传输光路150离开光学模块110。第三光源145被布置使得第三光路147在第三光源145处开始、穿过第三滤光器146到第二滤光器141、从第二滤光器141反射到第一滤光器136、从第一滤光器136反射出、并且沿着主传输光路150离开光学模块110。此外，由活细胞生物样品130中的荧光团发射的光的主发射光路156从第一滤光器136反射出、穿过第二滤光器141、穿过发射滤光器155、并且离开光学模块110。

如图5中所示，第一光源135和第三光源145是平行布置的，第二光源140相对于第一光源135和第三光源145成90度角布置。这种布置允许更紧凑的光学模块110，该光学模块110包括壳体111内的三个光源。

注意，虽然图3-5中和本文中其他地方所示的示例实施方式描绘了具有全部完全在同一平面(即，附图的平面)中的光源光路的光学模块，但是其他实施例是可能的，例如，以便减小光学模块的总大小和/或使光学模块的形状和大小符合可用空间(例如，在台架和/或自动培养箱内的成像装置内)。

例如，图5中所示的实施方式的第二光源140和第三滤光器146可以被旋转90度(或某个其他角度)进入(或离开)图5的平面。图6-图11进一步示出了这种实施方式以及其附加细节。如图6-图11所示，第一光源135、第二光源140和第三光源145，第一滤光器136、第二滤光器141和第三滤光器146，以及发射滤光器155均被包含在壳体111中。壳体111包括第一开口112，该第一开口112被布置成允许主传输光路150穿过以照射生物样品130。壳体111还包括第二开口113，该第二开口113被布置成允许主发射光路156穿过到达成像传感器120。第一开口112和第二开口113均可以包括光学设备(诸如透镜、滤光器、反射镜等)和/或传感器表面。在一个可选的示例中，发射滤光器155可以被设置在第二开口113内。在图3-图8中所示的示例光学模块110中，壳体111包括：垂直延伸的主体111a和从壳体111水平延伸的悬臂式延伸部111b。壳体111的主体111a包括：在相同平面中的第一光源135和第三光源145。壳体111的悬臂式延伸部111b又包括：第二光源140，第二光源140相对于第一光源135和第二光源140以90度的角度布置。

换言之，第二光源140和第三滤光器146已经围绕通过第三光源145的中心的竖直轴旋转90度。该布置将第二光源140放置在第一光源135和第三光源145的平面的后面，使得第二光路142被引导到第三滤光器146，在第三滤光器146中光被向上反射。这样的布置在空间受限的应用中可以是尤其有益的。例如，前述布置允许光学模块保持紧凑，以便集成到自动培养箱内组合的落射荧光和明场/相位衬度成像系统中，如以下所描述的，同时还允许光学模块可由用户容易地更换，因此扩展了成像系统的实用性和可重新配置性。

本文讨论的光源135、140、145均可以包括：可以向生物样品130发送光或照射生物样品130的任何设备和/或组件。示例性光源可以包括：一个或更多个灯和相关联的光学器件。示例性灯可包括：白炽灯(例如，卤素灯或钨丝灯)、弧光灯(例如，汞灯、汞氙灯、或氙灯)、发光二极管(“LED”)、和/或激光器等。相关联的光学器件(“源光学器件”)可以包括：光纤和/或液体光导、一个或更多个透镜、滤光器(诸如基于偏振或波长的滤光器)、衍射光栅、反射镜、掩模等。相关联的光学器件可以选择/调节被引导至样品的光的强度、波长、偏振、相位、方向和/或形状等。在一个可选的实施方式中，第一光源135、第二光源140以及第三光源145均包括：LED、至少两个透镜(例如，以使从光源输出的光准直和/或使输出光的焦点与无限远焦点或物镜的其他焦点匹配)以及单个带通二向色滤光器。

可以根据应用(例如，根据可用的荧光团或感兴趣的激发光谱，根据合适的LED或其他发光元件和/或相关的滤光器、反射镜、透镜、物镜或其他光学元件的可用性)指定从光学模块的光源发射的第一激发波长带、第二激发波长带、第三激发波长带和/或附加的激发波长带的特定边界。在一个可选的实施方式中，第一激发波长带的范围为453nm至485nm，并且大体上对应于蓝光，该蓝光导致对应的荧光团发射绿色(或更长波长)光。第二激发波长带的范围为546nm至568nm，并且大体上对应于黄绿(lime)光，该黄绿光导致对应的荧光团发射橙色(或更长波长)光。第三激发波长带的范围为648nm至674nm，并且大体上对应于红光，该红光导致对应的荧光团发射近红外(NIR)光。在进一步的实施方式中，该可选实施例的上述范围的界限可以变化+/-3nm。

在另一个可选实施方式中，第一发射波长带的范围为494nm至533nm，并且大体上对应于绿光。第二发射波长带的范围为576nm至639nm，并且大体上对应于橙光。第三发射波长带的范围为686nm到756nm，并且大体上对应于NIR光。在进一步的实施方式中，上述范围的界限可以变化+/-3nm。

在一些示例中，光学模块110可以包括：第四光源160，该第四光源160被配置为发射第四激发波长带中的第四光。图13中示出了这种光学模块110的示例实施方式。本实施方式中的光学模块110还包括：布置在第四光源160的第四光路162中的第四滤光器161。第四滤光器161被配置为使一个或更多个波长的光通过以及反射一个或更多个波长的光。发射滤光器155进一步被配置为使第四发射波长带中的光通过，以及反射第四激发波长带中的光。添加第四光源160增加了观看生物样品130中的第四荧光团并且进行甚至更多数量的测定，而无需借助于具有不同光源和滤光器的单独的光学模块以及对应配置的能力。

在图13所示的示例实施方式中，第一滤光器136被配置为使第一激发波长带中的光通过以及反射第四激发波长带中的光。第二滤光器141被配置为使第一发射波长带、第二发射波长带、第三发射波长带和第四发射波长带中的光通过，以及反射第二激发波长带和第三激发波长带中的光。第三滤光器146被配置为使第三激发波长带中的光通过以及反射第二激发波长带中的光。第四滤光器161被配置为使第一激发波长带和第四激发波长带中的光通过，以及反射第二激发波长带和第三激发波长带中以及第一发射波长带、第二发射波长带、第三发射波长带和第四发射波长带中的光。

在图13所示的示例实施方式中，第一光源135被布置使得第一光路137在第一光源135处开始、穿过第一滤光器136、然后通过第四滤光器161、并且沿着主传输光路150离开光学模块110。第二光源140被布置为使得第二光路142在第二光源140处开始、从第三滤光器146反射到第二滤光器141、从第二滤光器141反射到第四滤光器161、从第四滤光器161反射出、并且沿着主传输光路150离开光学模块110。第三光源145被布置使得第三光路147在第三光源145处开始、穿过第三滤光器146到第二滤光器141、从第二滤光器141反射到第四滤光器161、从第四滤光器161反射出、并且沿主传输光路150离开光学模块110。第四光源160被布置使得第四光路162在第四光源160处开始、从第一滤光器136反射出、穿过第四滤光器161、并且沿着主传输光路150离开光学模块110。由活细胞生物样品130中的荧光团发射的光的主发射光路156从第四滤光器161反射出、穿过第二滤光器141、穿过发射滤光器155、并且离开光学模块110。如图13所示，第一光源135和第三光源145被布置成彼此平行，第二光源140和第四光源160各自相对于第一光源135和第三光源145成90度角布置。这种布置允许紧凑的光学模块110，该光学模块110包括壳体111内的四个光源。

这种第四发射波长带可以包括短于453nm的波长，并且大体上可以对应于紫光，对应的第四发射波长带大体上可以对应于蓝光。

IV.示例系统

在本公开的第二方面中，如图1、图3、图4、图5、和图13所示，提供了一种用于测定活细胞生物样品130的系统105。系统105包括根据本公开的第一方面的光学模块110。系统105还包括荧光显微镜115，该荧光显微镜115包围光学模块110，光学模块110可拆卸地耦接至该荧光显微镜115。荧光显微镜115具有至少一个物镜165。系统105进一步包括成像传感器120，该成像传感器120被布置在由活细胞生物样品130中的荧光团发射的光和/或来自相位灯125(或其他透照光源，例如，被配置为提供用于明场成像但不用于相位衬度成像的照射的光源)的由样品130从物镜165透射和/或散射的光的主发射光路中。系统105包括相位灯125，相位灯125可拆卸地耦接至荧光显微镜115并且被布置在主传输光路150的终端处。

如本文使用的荧光显微镜115是放大小物体(诸如，细胞、细胞器、组织、小生物体、颗粒等)的图像的任何光学器件。可以通过检测机构执行的示例性显微术模式包括：光学显微术(例如，明视野、暗视野、相位衬度、微分干涉对比度(诸如，诺马尔斯基(Nomarski)、DIC、以及霍夫曼调制对比度(Hoffman Modulation Contrast))、荧光、和/或其他形式的可见和/或不可见(例如，IR、NIR、紫外线)光显微术。物镜165被布置在光学模块110与生物样品130之间，使得主传输光路150和主发射光路156穿过物镜165。

成像传感器120被配置为检测光，成像传感器120可以包括：相机、多通道光电检测器、平面傅里叶捕捉阵列、单像素成像仪、或一些其他图像生成装置。成像传感器120可被配置或操作以检测波长范围的光。例如，成像传感器120被配置或操作以在对应于生物样品130中的荧光染料或其他荧光团的发射光谱的多个波长/波长范围检测光。例如，这些波长可以对应于样品中多个荧光团的发射光谱中的峰值和/或延伸跨越宽范围的波长。这可包括成像传感器120是单色成像传感器，该单色成像传感器对由相位灯或其他透照光源发射的每个发射光谱中的光的波长和/或光的波长敏感。更进一步地，成像传感器120可被配置为测量任何合适的光致发光，包括荧光强度(fluorescence intensity，FLINT)、荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer，FRET)、荧光寿命(fluorescencelifetime，FLT)、荧光相关性(fluorescence correlation，FCS)、光漂白后的荧光恢复(fluorescence recovery after photobleaching，FRAP)、以及它们的磷光和其他类似物等。

在图6-图8和图11-图12中所示的一个可选实施方式中，系统105包括：延伸通过光学模块110的轴170。这里，荧光显微镜115具有被配置为在第一取向上容纳轴170的底座(receptacle)(未示出)。轴170被配置为在向第二取向施加力的情况下旋转，从而将光学模块110锁定到荧光显微镜115的剩余部分(例如，锁定到荧光显微镜115的壳体或其他元件)。例如，轴170可以具有耦接到第一端172的翻转接片171以及可以具有耦接到第二端174的突出部173，由此形成T形。荧光显微镜115可以具有对应的狭槽(未示出)和底座，该底座被配置为以第一取向容纳T形突出部173。当轴在对翻转接片171施加力下的情况下旋转至第二取向时，T形突出部173在底座中旋转，使得T形突出部173与狭槽相对，从而将光学模块110锁定至荧光显微镜115。一旦光学模块110耦接到荧光显微镜115的剩余部分，翻转接片171就可以抵靠壳体111平坦折叠。

在另一实施方式中，一旦轴170被插入，轴170在锁定方向上的旋转导致突出部173沿着斜坡行进，从而将突出部173、轴170和光学模块110拉动到系统105的剩余部分的座(mount)上。柔性元件(例如，弹簧189)可被布置在轴170和光学模块110的壳体111之间，以控制将光学模块110拉动到座上的力。此外，当轴170处于锁定位置和解锁位置时，止动件可以提供触觉反馈。

在图4所示的另一可选实施方式中，系统105包括与光学模块110耦接的第一电连接器175。系统105包括耦接至荧光显微镜115的剩余部分的第二电连接器(未示出)。第二电连接器与第一电连接器175互逆。系统105包括与第二电连接器电通信的处理器202。处理器202被配置为识别耦接至荧光显微镜115的剩余部分的光学模块110。第一电连接器175和第二电连接器可以被选择为需要小于指定的力来连接和断开，例如，以便使用户更容易地更换荧光显微镜115的不同光学模块。

可更换相位灯模块125包括壳体126、透照光源127(例如，卤素灯、LED)、以及至少一个聚光透镜，该聚光透镜将来自相位灯模块125的光从上方聚焦到生物样品130上。在又一可选实施方式中，如图14-图15所示，相位灯模块125具有第三电连接器177，该第三电连接器177对应于耦接至荧光显微镜115的剩余部分(例如，耦接至第二电连接器所耦接至的同一壳体)的第四电连接器(未示出)。第三电连接器177与第四电连接器互逆。处理器202被配置为确定光学模块110和相位灯模块125是否兼容，并且响应于确定光学模块110和相位灯模块125不兼容而使警报显示。这种确定可以通过在数据库中进行查找来进行，该数据库包含可用光学模块110和可用相位灯模块125之间的有效对应关系的记录。附加地或替代地，可以通过比较由相位灯模块125发射的一组光的波长与光学模块110被配置为从样品130传递到成像传感器120的一组光的波长来做出这种确定。

相位灯模块125的壳体126包括突出部128，该突出部128成形为被容纳到系统105的相位灯座185中的对应的底座(receptacle)186中。突出部128和底座186成形为使得相位灯模块125仅能够以单一取向安装。相位灯模块125通过止动件187保持在适当位置，而不是用螺钉固定。止动件187是相位灯座185中的弹簧加载球188的形式，弹簧加载球188被配置为与壳体126的突出部128中的凹槽129对准。

在一个可选的实施方式中，如图1所示，系统105包括培养箱180，培养箱180被配置为将活细胞生物样品130保持在30℃至42℃的温度范围和80％至100％的相对湿度范围下。在此实施方式中，根据本公开的第一方面的荧光显微镜115被耦接至培养箱180的腔室。在另一个实施方式中，荧光显微镜115可以部分地或完全地包含在培养箱180内。例如，荧光显微镜115可以完全地设置在标准CO₂培养箱内，用于在连续培养期间(例如，在几个小时、几天、或几周的指定时间段内)对生物样品130的定时的检查。由于培养时间的长短，荧光显微镜115可以在细胞培养期间保持在培养箱中，以避免对生物样品130产生不利地影响。此外，荧光显微镜115的紧凑轮廓保持了培养箱180的用于将其他生物样品130放置在荧光显微镜115周围的开放空间中的功能。荧光显微镜115的紧凑轮廓还减少了气流限制，气流限制可能以冷凝和不适当通气的形式对荧光显微镜115或生物样品130产生有害影响。

第三光源145(和第四光源160)使得能够在生物样品130上进行复用测定，以在培养箱180中的单个样品(例如，样品孔)中和/或在同一培养箱180中的不同样品的组中进行多种测定和/或荧光指示剂。

V.示例方法

现在参考图16，示出了可以利用图3-图15的光学模块110和系统105以及图1-图2的计算设备200用于对活细胞生物样品中的荧光团进行成像的方法300。在框305中，方法300包括：将第一生物样品和荧光显微镜对准，使得该第一生物样品位于该荧光显微镜的视场内，其中该第一生物样品包含：(i)第一荧光团，该第一荧光团响应于由第一激发波长带中的光的照射而发射第一发射波长带中的光；(ii)第二荧光团，该第二荧光团响应于由第二激发波长带中的光的照射而发射第二发射波长带中的光；以及(iii)第三荧光团，该第三荧光团响应于由第三激发波长带中的光的照射而发射第三发射波长带中的光。然后，在框310中，该方法包括：使用荧光显微镜获得第一生物样品的图像集，其中该图像集中的图像在焦点设置方面不同。接下来，在框315中，方法300包括：基于该图像集，分别为第一发射波长带、第二发射波长带和第三发射波长带确定第一对焦设置、第二对焦设置和第三对焦设置。在框320中，该方法包括：在第一时间段期间，使用第一光源以第一激发波长带中的光照射第一生物样品，并且根据第一对焦设置操作荧光显微镜以经由荧光显微镜的图像传感器获得第一发射波长带中的光的第一图像。在框325中，方法300还包括：在第二时间段期间，使用第二光源以第二激发波长带中的光照射第一生物样品，并且根据第二对焦设置操作荧光显微镜以经由图像传感器获得第二发射波长带中的光的第二图像。在框330中，方法300还包括：在第三时间段期间，使用第三光源以第三激发波长带中的光照射第一生物样品，并且根据第三对焦设置操作荧光显微镜以经由图像传感器获得第三发射波长带中的光的第三图像。可由处理器202自动执行所有前述步骤。

获得特定颜色的特定荧光图像可以包括：操作成像系统以使用不同的曝光时间生成特定颜色的多个不同图像。这可被完成以允许合成生成高动态范围图像。这可以针对荧光团/样品/测定来进行，荧光团/样品/测定在感兴趣的荧光团浓度/活性范围内展现出荧光发射强度的非常高的变化。

方法300可以另外包括：通过操作相位灯(例如，125)或其他透照光源获得一个或更多个明场、相位衬度或其他非荧光图像。这样的非荧光图像信息然后可以与荧光图像组合(例如，使用相位衬度图像来识别样品中细胞的位置、形状、大小和/或范围，而不考虑细胞类型，然后使用一个或更多个荧光图像来确定细胞类型、细胞分裂期、细胞健康、细胞代谢活性、或关于使用相位衬度图像识别的细胞的其他信息)或自身使用。

此外，方法300可包括：获得一组跨不同焦点设置的范围(例如，跨不同物镜-样品距离的范围)的明场、相位衬度或其他非荧光图像，以便确定使用方法300获得的三个(或更多个)荧光图像的对焦设置。这可包括：确定用于生成非荧光图像的照射波长的对焦设置，然后对于成像的荧光发射波长中的每个应用来自该对焦设置的已知偏移(例如，距离偏移)以确定那些发射波长的对焦设置。在用于生成非荧光图像的照射的波长的波长与荧光发射波长中的一个相同或基本上相同的情况下，偏移可能是零。当与荧光图像相比较时，明场图像或其他非荧光图像在相同的曝光时间内通常包含显著更多的图像数据，因此这种确定对焦设置的方法可以有利地减少生成这种对焦设置所需的时间。这还可以减少样品经历的光漂白的量以便生成此类对焦设置。

实际上，由较短波长激发的荧光团的图像可能包括：与从由较长波长激发的荧光团发射的光相关的伪影，反之亦然。作为一个示例，对应于第一波长带的荧光团也可以在某种程度上被第二波长带和第三波长带(尤其是如果第二波长带和第三波长带均包括比第一波长带更短的波长)激发。同样地，对应于第二波长带的荧光团也可以在某种程度上被第一波长带和第三波长带激发，而对应于第三波长带的荧光团也可以在某种程度上被第一波长带和第二波长带激发。

为了解决伪影问题，在一个可选实施方式中，方法300进一步包括处理器202，该处理器202与成像传感器120(或一些其他计算设备)电通信，基于第一图像集生成由第一荧光团发射的光的第一图像，以便减少由第二荧光团和第三荧光团发射的光的伪影。处理器202附加地基于第二图像集生成由第二荧光团发射的光的第二图像，以便减少来自由第一荧光团和第三荧光团发射的光的伪影。此外，处理器202可基于第三图像集生成由第三荧光团发射的光的第三图像，以减少来自由第一荧光团和第二荧光团发射的光的伪影。此光谱解混过程在于2019年2月1日提交的美国专利申请No.16/264819中关于两个激发波长进行了更详细地描述，并且通过引用合并于本文。

在一个非限制性示例中，当生物样品130被布置在第一对焦设置处使得从绿色荧光团发射的光对焦时，通过用对应于绿色荧光团的蓝色激发波长的光照射生物样品130可获得绿色荧光团的第一图像。具体地，“对焦设置”通过设置生物样品130与荧光显微镜115的物镜165之间的距离而发生，使得绿色荧光团发射光对焦成像。此第一图像还可以包括：从生物样品130中的橙色荧光团(主要由处于黄绿色激发波长的光激发，但在某种程度上也由蓝光激发)和NIR荧光团(主要由处于红色激发波长的光激发，但在某种程度上也由蓝光激发)发射的光。注意，从橙色荧光团和NIR荧光团发射的光将在第一图像中不对焦。这是由于由沿着样品130和成像传感器120之间的主发射光路156的元件(例如，物镜、管透镜、样品和/或容纳样品的容器的光学特性)引起的色差。

然后可以从第一图像中去除伪影图像，以便从橙色荧光团和NIR荧光团中去除伪影光。如上所述，可以通过用对应于用于获得第一图像的第一对焦设置处的橙色荧光团的黄绿色激发波长的光照射生物样品130来获得一个伪影图像。可以通过用对应于用于获得第一图像的第一对焦设置处的红色荧光团的红色激发波长的光照射生物样品130来获得另一伪影图像。或者，可通过使橙色荧光团和红色荧光团的对焦图像模糊或以其他方式应用一些图像处理技术来模拟用于获得使用另一对焦设置拍摄的图像中的第一图像的焦点设置的效果来获得伪影图像。例如，使用对焦设置拍摄的图像使得从橙色荧光团和NIR荧光团发射的光被单独地对焦成像。

在一个可选的实施方式中，方法300进一步包括培养箱，该培养箱包含或以其他方式耦接至荧光显微镜，当获得第一图像集数据、第二图像集数据和第三图像集数据时，该培养箱至少将第一生物样品保持在30℃至42℃的温度范围和80％至100％的相对湿度范围下。可以在标准CO₂培养箱内获得该数据，用于在连续培养期间(例如，取决于感兴趣的实验，在几分钟、几小时、几天或几周的时段内)对生物样品130的定时的检查。例如，可以在整个培养中随时间拍摄图像，该培养超过14天、或长达30天或超过30天。

方法300可以包括：对荧光图像和/或使用该系统获得的其他图像(例如，明场图像、相位衬度图像)进行一些附加分析。例如，在特定样品中，当图像中的一个(或更多个)对应于特定于一种或更多种特定类型的细胞的荧光团的颜色的情况下，则方法300可以包括：分析图像以确定数量、形状、大小、分布、互连图案或关于样品中存在的一种或更多种特定类型的细胞的其他信息。可以通过使用相位衬度或其他非荧光图像来增强这样的识别，以识别样品中单个细胞的位置、形状和范围，而不考虑类型。附加地或可替代地，当图像中的一个(或更多个)对应于特定测定(例如，膜联蛋白VNIR测定、双色或三色FUCCI细胞分裂期测定)的荧光指示剂的情况下，则方法300可以包括：分析图像以生成该特定测定的输出，例如，以确定样品中一个或更多个细胞的健康、细胞分裂期、或其他代谢状况或状态。可以对不同的(或重叠的)图像的不同分析的结果进行组合，例如，对应于细胞特异性荧光团的第一图像分析可以用于识别感兴趣的细胞类型的细胞，并且组合的第二和第三图像分析可以确定对于所识别的细胞的双色测定(例如，双色FUCCI测定)的输出。对于通过培养箱中的成像系统成像的每个样品，(例如，由于所有样品包含相同的测定/荧光指示剂/染料)分析可以是相同的，或者在培养箱内的样品与样品之间可以不同。

在一个可选实施方式中，方法300进一步包括：处理器202基于第一图像集识别第一生物样品中的第一细胞类型。然后，处理器202基于第二图像集识别第一生物样品中的第二细胞类型。接下来，处理器202基于第三图像集识别第一生物样品中的细胞死亡或一些其他代谢过程或特性。这具有允许在系统105中的单个器皿中运行复杂的测定和/或多个测定而不改变光学模块110的配置的技术效果。

在一个可选实施方式中，可以在第一对焦设置、第二对焦设置和第三对焦设置处获得相位衬度、明场或其他非荧光图像。这些图像可用于从第一图像、第二图像和第三图像移除进一步的伪影(例如，移除由于自发荧光引起的伪影)或以其他方式改进第一图像、第二图像和第三图像(例如，通过提供附加的高空间频率图像数据来增强荧光图像)。

在一个可选实施方式中，方法300还包括：处理器接收光学模块110和相位灯模块的兼容性信息。然后，处理器202基于兼容性信息确定光学模块110和相位灯125是否兼容。接下来，响应于确定光学模块110和相位灯125不兼容，处理器202使具有不兼容性的指示的警报显示。这种兼容性确定可以通过在数据库中进行查找来进行，该数据库包含可用光学模块110和可用相位灯模块125之间的有效对应关系的记录。附加地或可替代地，可通过比较由相位灯模块125发射的一组光的波长与光学模块110被配置为从样品130传递到成像传感器120的一组光的波长来进行这种确定。

在一个可选实施方式中，方法300包括：将轴170在第一取向上延伸通过光学模块110到荧光显微镜115中的底座。然后，在施加力的情况下旋转轴170，使得轴170移动到第二取向，从而将光学模块110耦接到荧光显微镜115，如上面关于系统105详细描述的。

前述方法300具有以下技术效果：在不改变光学模块110的配置的情况下，允许测定中增加的可变性，该测定可以在系统105中的单独器皿中或跨多个器皿运行。可以通过荧光成像仪、光学模块、相位灯模块、培养箱、自动成像系统或本文所述的其他系统、设备或部件的任何实施例来执行方法300或可以与通过荧光成像仪、光学模块、相位灯模块、培养箱、自动成像系统或本文所述的其他系统、设备或部件结合来执行方法300。因此，通过本文所述的实施例，培养箱内的单个样品中和/或培养箱内不同样品之间的多种测定、荧光指示剂以及它们的组合成为可能。以下提供了此类应用的多个示例。这些应用旨在作为说明性实施例，并不旨在是限制性的。预期会有附加的或替代的应用，这样的应用和/或下文描述的应用的附加的或替代的组合也是如此。

如以上所讨论的，一种非暂时性计算机可读介质，该非暂时性计算机可读介质上存储有程序指令，程序指令在由处理器202执行时可以用于执行本文描述的任何方法。

VI.示例生物应用

通过提供三个不同荧光通道的独立成像，以上描述的实施例能够实现荧光成像中的多种应用。附加的荧光通道的优点可以包括：通过允许使用单个装置(例如，在单个培养箱中)同时进行附加测定、通过在跨不同样品的实验读数中提供灵活性和/或通过允许从单独的样品进行附加测定，来改进单个成像装置的吞吐量。三种(或更多种)颜色成像的可用性还可以允许在试剂选择中的增加的灵活性，例如，在监测表达基于绿色荧光蛋白的报告子的细胞的同时使用多种试剂来获得附加信息的能力。

附加地或可替代地，同时的三种(或更多种)颜色成像可以允许生成不能仅使用两种颜色生成的信息。例如，可以生成来自三色报告子(例如，三色FUCCI测定)的信息。在另一个示例中，可以生成关于多种细胞类型的增殖和相互作用的信息以及跨细胞群的代谢或细胞死亡信息。此类信息可以使得能够附加洞察实验条件对效应细胞在破坏靶细胞或例如癌症和基质细胞之间的代谢交换中的活性的影响。

再进一步，三种(或更多种)颜色成像可以允许以更高置信度的方式生成实验数据。例如，在单个样品中复用多个读数可以提供增加的置信度，即在读数之间观察到的差异是科学上有效的，而不是由于平行运行的测定之间的实验变化(例如，细胞平面培养)。

示例1：双色FUCCI+细胞死亡

本文所描述的光学模块110、系统105和方法300的不同实施方式可以有利地用于在单个样品中进行双色细胞周期(例如，绿色/橙色FUCCI)观察和细胞死亡分析。例如，细胞周期和细胞凋亡读数可以证明化合物在癌细胞中的浓度依赖性和时间依赖性作用的差异。在另一示例中，可以在含有免疫细胞和癌细胞的样品中进行双色细胞周期观察和细胞死亡分析，以便观察癌细胞的靶向免疫细胞杀伤对癌细胞和/或对样品中的一些其他细胞群的影响。在单个样品中复用这两个读数增加了吞吐量并且提供了这两个读数之间的差异在科学上有效而不是由于平行测定之间的实验变化的置信度。

关于双色FUCCI分析，本公开的三色光学模块允许基于两种不同荧光蛋白的时期依赖性表达在不同细胞周期时期之间进行区分。例如，在S期、G2期和M期，细胞可以经由TagGFP2的表达(绿色荧光团)来发射绿色荧光，可以使用该三色光学模块检测绿色荧光。在G1期和转换成S期期间，细胞可以经由TagRFP的表达(具有分别在55nm和584nm处激发/发射最大值的亮荧光的橙色荧光蛋白)来发射橙色荧光，可以使用该三色光学模块检测橙色荧光。在该双色FUCCI测定中，细胞立即在有丝分裂后转换经过无色期。因此，细胞周期时期具有荧光足迹(例如，S期、G2期和M期：绿色；G1期：橙色；G1/S转换：橙色和绿色两者；M/G1转换：无色(无荧光))。然后，第三颜色可以用于对荧光细胞死亡读数(例如，膜联蛋白VNIR凋亡指示剂)成像。

示例2：三色FUCCI

本文所描述的光学模块110、系统105和方法300的不同实施方式可以用于有利地进行三色FUCCI测定，该三色FUCCI测定独立地观察细胞周期内的另外的期。与先前描述的双色细胞周期测定不同，三色测定允许S期和G2期之间的差异，并且还通过对与靶向的泛素酰化结构域或其他细胞期相关的靶标融合的荧光蛋白的基因的适当基因表达有益地导致没有无色期。例如，在S期、G2期和M期过程中，基于可以使用三色光学模块检测的TagGFP2的表达，细胞可以各自发射绿色荧光，在S期中观察到更暗的荧光。不同的荧光标记物可以用于识别细胞周期的其他期，包括但不限于TagRFP和iRFP713。在G1期和S期期间，表达TagRFP的细胞发射橙色荧光，可以使用三色光学模块检测该橙色荧光。iRFP713是近红外荧光蛋白，具有分别在690nm和713nm激发/发射最大值的荧光。在G2期、M期和G1期期间，表达iRFP713的细胞发射NIR荧光，可以使用三色光学模块检测NIR荧光。因此，细胞周期时期将具有荧光足迹(例如，G2期和M期：绿色和NIR；G1期：橙色和NIR，S期：橙色和绿色)，不存在无色期。

示例3：三色免疫细胞杀伤

本文所描述的光学模块110、系统105和方法300的不同实施方式可以用于有利地监测标记的靶(癌症)细胞和效应(免疫)细胞并且提供跨两种细胞类型的细胞死亡读数。这提供了以下益处：能够在跨两个群体的细胞死亡的同时独立地测量靶细胞和效应细胞的增殖和相互作用。以这种方式，免疫细胞杀死靶细胞的功效可以与(例如，与激活相关联的)效应细胞群的变化和同一样品中两个细胞群之间的相互作用直接相关，免疫细胞杀死靶细胞的功效通过确定效应和靶细胞标记的荧光之间的重叠来测量。

通常，免疫细胞识别并杀死不希望的靶细胞(诸如，紧急肿瘤细胞)是人类宿主防御机制的关键组分。抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)和T细胞杀伤是细胞介导的免疫应答的两种机制。这些过程中的每一个涉及免疫细胞亚群(sub-population)(诸如，天然杀伤(naturalkiller，NK)细胞或细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes，CTL))的刺激，然后免疫细胞亚群主动裂解靶细胞。本公开的系统和方法允许观察免疫细胞和癌细胞之间的相互作用，潜在地提供导致用于恢复和促进免疫系统对抗和消除肿瘤的能力(“癌症免疫疗法”或“免疫肿瘤学”)的诊断和疗法的开发的信息。

示例4：ATP+细胞死亡

本文所描述的光学模块110、系统105和方法300的不同实施方式可以用于有利地进行基于双色福斯特共振能量转移(Forster resonance energy transfer，FRET)的ATP测量，该测量与细胞死亡分析进行复用以研究化合物对癌细胞的代谢和死亡率的时间依赖性和浓度依赖性作用的可能差异。在操作中，光学模块中的三个光源可以在三个不同激发波长带中激活，三个光源中的两个光源用于经由FRET机制经由单个发射带测量代谢信息。然后可以使用该第三激发波长来监测与细胞死亡相关的独立读数(例如，膜联蛋白VNIR)。ATP测量过程在于2019年3月7日提交的名称为“Methods and Compositions for Live CellAnalysis of Intracellular ATP(细胞内ATP活细胞分析的方法和组成)”的PCT/US19/21171中详细地描述，该PCT/US19/21171的内容通过引用全部并入本文。

示例5：活细胞免疫细胞化学

本文所描述的光学模块110、系统105和方法300的不同实施方式可以用于通过使用

FabFluor抗体标记试剂(或一些其他荧光标记的抗体试剂)的活细胞免疫细胞化学(live cell immunocytochemistry，ICC)来测量表面蛋白表达。这种方法可以用来追踪在实验处理(例如，添加测试化合物或免疫细胞激活)之后细胞亚群的变化，监测分化标记随时间的变化，或以其他方式评估表面蛋白表达。三种(或更多种)颜色成像在抗体选择的灵活性上提供优点，并且使得能够在单个样品中监测另外的感兴趣的蛋白质或亚群。

为了说明和描述的目的，已经呈现了对不同的有利布置的描述，并且不旨在是详尽的或限于所公开的形式的示例。对于本领域普通技术人员而言，许多修改和变型将是显而易见的。选择和描述所选择的一个或更多个示例，以便最好地解释示例的原理、实际应用，以及使本领域的其他普通技术人员能够理解用于具有适合于所设想的特定用途的各种修改的各种示例的本公开。

Claims (25)

1.一种用于对活细胞生物样品中的荧光团进行成像的光学模块，包括：

第一光源，所述第一光源被配置为发射第一激发波长带中的第一光；

第一滤光器，所述第一滤光器被布置在所述第一光源的第一光路中，所述第一滤光器被配置为使一个或更多个波长的光通过以及反射一个或更多个波长的光；

第二光源，所述第二光源被配置为发射第二激发波长带中的第二光；

第二滤光器，所述第二滤光器被布置在所述第二光源的第二光路中，所述第二滤光器被配置为使一个或更多个波长的光通过以及反射一个或更多个波长的光；

第三光源，所述第三光源被配置为发射第三激发波长带中的第三光；

第三滤光器，所述第三滤光器被布置在所述第三光源的第三光路中，所述第三滤光器被配置为使一个或更多个波长的光通过以及反射一个或更多个波长的光，其中，所述第一光路、所述第二光路以及所述第三光路沿着主传输光路会聚，所述主传输光路被配置为朝向所述活细胞生物样品引导；以及

发射滤光器，所述发射滤光器被布置在用于由所述活细胞生物样品中的所述荧光团发射的光的主发射光路中，其中，所述主发射光路被配置为在成像传感器处终止，其中，所述发射滤光器被配置为使第一发射波长带、第二发射波长带和第三发射波长带中的光通过，以及所述发射滤光器被配置为反射所述第一激发波长带、所述第二激发波长带和所述第三激发波长带中的光。

2.根据权利要求1所述的光学模块，其中，所述第一滤光器、所述第二滤光器和所述第三滤光器均是二向色滤光器。

3.根据权利要求1-2中任一项所述的光学模块，其中，所述第一光源、所述第二光源和所述第三光源均包括：LED、至少一个透镜和单带通二向色滤光器。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的光学模块，其中，所述第一滤光器被配置为使所述第一激发波长带中的光通过，以及反射所述第二激发波长带和所述第三激发波长带中以及所述第一发射波长带、所述第二发射波长带和所述第三发射波长带中的光；

其中，所述第二滤光器被配置为使所述第一发射波长带、所述第二发射波长带和所述第三发射波长带中的光通过，以及反射所述第二激发波长带和所述第三激发波长带中的光；以及

其中，所述第三滤光器被配置为使所述第三激发波长带中的光通过，以及反射所述第二激发波长带中的光。

5.根据权利要求4所述的光学模块，其中，所述第一光源被布置为使得所述第一光路在所述第一光源处开始、穿过所述第一滤光器、并沿着所述主传输光路离开所述光学模块；

其中，所述第二光源被布置为使得所述第二光路在所述第二光源处开始、从所述第三滤光器反射到所述第二滤光器、从所述第二滤光器反射到所述第一滤光器、从所述第一滤光器反射出、并沿着所述主传输光路离开所述光学模块；

其中，所述第三光源被布置为使得所述第三光路在所述第三光源处开始、穿过所述第三滤光器到达所述第二滤光器、从所述第二滤光器反射到所述第一滤光器、从所述第一滤光器反射出、并沿着所述主传输光路离开所述光学模块；以及

其中，由所述活细胞生物样品中的所述荧光团发射的光的所述主发射光路从所述第一滤光器反射出、穿过所述第二滤光器、穿过所述发射滤光器、并离开所述光学模块。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的光学模块，其中，所述第一滤光器被配置为使所述第一激发波长带和所述第二激发波长带中的光通过，以及反射所述第三激发波长带中以及所述第一发射波长带、所述第二发射波长带和所述第三发射波长带中的光；

其中，所述第二滤光器被配置为使所述第二发射波长带中的光通过，以及反射所述第一激发波长带中的光；以及

其中，所述第三滤光器被配置为使所述第一发射波长带、所述第二发射波长带和所述第三发射波长带中的光通过，以及反射所述第三激发波长带中的光。

7.根据权利要求6所述的光学模块，其中，所述第一光源被布置为使得所述第一光路在所述第一光源处开始、从所述第二滤光器反射出、穿过所述第一滤光器、并沿着所述主传输光路离开所述光学模块；

其中，所述第二光源被布置为使得所述第二光路在所述第二光源处开始、穿过所述第二滤光器、然后穿过所述第一滤光器、并沿着所述主传输光路离开所述光学模块；

其中，所述第三光源被布置为使得所述第三光路在所述第三光源处开始、从所述第三滤光器反射到所述第一滤光器、从所述第一滤光器反射出、并沿着所述主传输光路离开所述光学模块；以及

其中，由所述活细胞生物样品中的所述荧光团发射的光的所述主发射光路从所述第一滤光器反射出、穿过所述第三滤光器、穿过所述发射滤光器、并离开所述光学模块。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的光学模块，其中，所述第一激发波长带的范围为453nm至485nm，其中，所述第二激发波长带的范围为546nm至568nm，其中，所述第三激发波长带的范围为648nm至674nm。

9.根据权利要求1-7中任一项所述的光学模块，其中，所述第一发射波长带的范围为494nm至533nm，所述第二发射波长带的范围为576nm至639nm，所述第三发射波长带的范围为686nm至756nm。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的光学模块，还包括：

第四光源，所述第四光源被配置为发射第四激发波长带中的第四光；以及

第四滤光器，所述第四滤光器被布置在所述第四光源的第四光路中，所述第四滤光器被配置为使一个或更多个波长的光通过以及反射一个或更多个波长的光，其中，所述发射滤光器还被配置为使第四发射波长带中的光通过以及反射所述第四激发波长带中的光。

11.根据权利要求10所述的光学模块，其中，所述第一滤光器被配置为使所述第一激发波长带中的光通过，以及反射所述第四激发波长带中的光；

其中，所述第二滤光器被配置为使所述第一发射波长带、所述第二发射波长带以及所述第三发射波长带中的光通过，以及反射所述第二激发波长带和所述第三激发波长带中的光；

其中，所述第三滤光器被配置为使所述第三激发波长带中的光通过，以及反射所述第二激发波长带中的光；以及

其中，所述第四滤光器被配置为使所述第一激发波长带和所述第四激发波长带中的光通过，以及反射所述第二激发波长带和所述第三激发波长带中以及所述第一发射波长带、所述第二发射波长带、所述第三发射波长带和所述第四发射波长带中的光。

12.根据权利要求10-11中任一项所述的光学模块，其中，所述第四发射波长带小于453nm，所述第四激发波长带小于所述第四发射波长带。

13.根据权利要求1-12中任一项所述的光学模块，其中，所述第一光源被布置为使得所述第一光路在所述第一光源处开始、穿过所述第一滤光器、然后穿过所述第四滤光器、并沿着所述主传输光路离开所述光学模块；

其中，所述第二光源被布置为使得所述第二光路在所述第二光源处开始、从所述第三滤光器反射到所述第二滤光器、从所述第二滤光器反射到所述第四滤光器、从所述第四滤光器反射出、并沿着所述主传输光路离开所述光学模块；

其中，所述第三光源被布置为使得所述第三光路在所述第三光源处开始、穿过所述第三滤光器到所述第二滤光器、从所述第二滤光器反射到所述第四滤光器、从所述第四滤光器反射出、并沿着所述主传输光路离开所述光学模块；

其中，所述第四光源被布置为使得所述第四光路在所述第四光源处开始、从所述第一滤光器反射出、穿过所述第四滤光器、并沿着所述主传输光路离开所述光学模块；以及

其中，由所述活细胞生物样品中的所述荧光团发射的光的所述主发射光路从所述第四滤光器反射出、穿过所述第二滤光器、穿过所述发射滤光器、并离开所述光学模块。

14.一种用于测定活细胞生物样品的系统，所述系统包括：

根据权利要求1-13中任一项所述的光学模块；

荧光显微镜，所述荧光显微镜可拆卸地耦接至所述光学模块，其中，所述荧光显微镜具有至少一个物镜；

成像传感器，所述成像传感器被布置在用于由来自所述物镜的所述活细胞生物样品中的荧光团发射的光的发射路径中；以及

相位灯，所述相位灯可拆卸地耦接至所述荧光显微镜并且被布置在主传输光路的终端处。

15.根据权利要求14所述的系统，还包括：

延伸通过所述光学模块的轴，其中，所述荧光显微镜具有被配置为在第一取向上容纳所述轴的底座，其中，所述轴被配置为在向第二取向施加力的情况下旋转，从而将所述光学模块锁定至所述荧光显微镜。

16.根据权利要求14-15中任一项所述的系统，还包括：

第一电连接器，所述第一电连接器耦接至所述光学模块；

第二电连接器，所述第二电连接器耦接至所述荧光显微镜，其中，所述第二电连接器与所述第一电连接器互逆；以及

处理器，所述处理器与所述第一电连接器和所述第二电连接器中的至少一个电通信，所述处理器被配置为识别耦接到所述荧光显微镜的所述光学模块。

17.根据权利要求16所述的系统，还包括：

具有第三电连接器的所述相位灯；以及

第四电连接器，所述第四电连接器耦接至所述荧光显微镜，其中，所述第三电连接器与所述第四电连接器互逆，其中，所述处理器被配置为确定所述光学模块和所述相位灯是否兼容并且响应于所述确定而使警报显示。

18.根据权利要求14-17中任一项所述的系统，还包括：

培养箱，所述培养箱被配置为将所述活细胞生物样品保持在30℃至42℃的温度范围和80％至100％的相对湿度范围下，其中，所述光学模块被耦接至所述培养箱的腔室。

19.一种用于对活细胞生物样品中的荧光团进行成像的方法，包括：

将第一生物样品和荧光显微镜对准，使得所述第一生物样品位于所述荧光显微镜的视场内，其中，所述第一生物样品包含：(i)第一荧光团，所述第一荧光团响应于由第一激发波长带中的光的照射而发射第一发射波长带中的光；(ii)第二荧光团，所述第二荧光团响应于由第二激发波长带中的光的照射而发射第二发射波长带中的光；以及(iii)第三荧光团，所述第三荧光团响应于由第三激发波长带中的光的照射而发射第三发射波长带中的光；

使用所述荧光显微镜获得所述第一生物样品的图像集，其中所述图像集中的图像在焦点设置方面不同；

基于所述图像集，分别为所述第一发射波长带、所述第二发射波长带和所述第三发射波长带确定第一对焦设置、第二对焦设置和第三对焦设置；

在第一时间段期间，使用第一光源以所述第一激发波长带中的光照射所述第一生物样品，并且根据所述第一对焦设置操作所述荧光显微镜以经由所述荧光显微镜的图像传感器获得所述第一发射波长带中的光的第一图像；

在第二时间段期间，使用第二光源以所述第二激发波长带中的光照射所述第一生物样品，并且根据所述第二对焦设置操作所述荧光显微镜以经由所述图像传感器获得所述第二发射波长带中的光的第二图像；以及

在第三时间段期间，使用第三光源以所述第三激发波长带中的光照射所述第一生物样品，并且根据所述第三对焦设置操作所述荧光显微镜以经由所述图像传感器获得所述第三发射波长带中的光的第三图像。

20.根据权利要求19所述的方法，还包括：

经由与所述成像传感器电通信的处理器，基于所述第一图像、所述第二图像和所述第三图像，生成由所述第一荧光团发射的光的第一校正图像，以减少来自由所述第二荧光团和所述第三荧光团发射的光的伪影；

经由所述处理器基于所述第一图像、所述第二图像和所述第三图像，生成由所述第二荧光团发射的光的第二校正图像，以减少来自由所述第一荧光团和所述第三荧光团发射的光的伪影；以及

经由所述处理器基于所述第一图像、所述第二图像和所述第三图像，生成由所述第三荧光团发射的光的第三校正图像，以减少来自由所述第一荧光团和所述第二荧光团发射的光的伪影。

21.根据权利要求19-20中任一项所述的方法，还包括：

当获得所述第一图像、所述第二图像和所述第三图像时，经由耦接至所述荧光显微镜的培养箱，将所述第一生物样品至少保持在30℃至42℃的温度范围和80％至100％的相对湿度范围下。

22.根据权利要求19-21中任一项所述的方法，还包括：基于当所述第一生物样品在所述第一对焦设置处时获得的相位图像或明场图像以及所述第一图像，生成第一校正图像。

23.根据权利要求19-22中任一项所述的方法，还包括：

经由处理器，接收所述荧光显微镜的光学模块和相位灯模块的兼容性信息；

经由所述处理器基于所述兼容性信息，确定所述光学模块与所述相位灯是否兼容；以及

响应于所述光学模块和所述相位灯不兼容的确定，经由所述处理器使具有不兼容性的指示的警报显示。

24.根据权利要求19-23中任一项所述的方法，还包括：

将轴在第一取向上延伸通过所述荧光显微镜的光学模块到所述荧光显微镜中的底座；以及

在施加力下的情况下旋转所述轴，使得轴移动至第二取向，从而将所述光学模块耦接至所述荧光显微镜。

25.一种非暂时性计算机可读介质，所述非暂时性计算机可读介质上存储有程序指令，所述程序指令在由与权利要求1-13中任一项所述的光学模块进行机电通信的处理器执行时使一组动作执行，所述一组动作包括：

将第一生物样品和荧光显微镜对准，使得所述第一生物样品位于所述荧光显微镜的视场内，其中，所述第一生物样品包含：(i)第一荧光团，所述第一荧光团响应于由第一激发波长带中的光的照射而发射第一发射波长带中的光；(ii)第二荧光团，所述第二荧光团响应于由第二激发波长带中的光的照射而发射第二发射波长带中的光；以及(iii)第三荧光团，所述第三荧光团响应于由第三激发波长带中的光的照射而发射第三发射波长带中的光；

成像传感器使用所述荧光显微镜获得所述第一生物样品的第一图像集，其中所述图像集中的图像在焦点设置方面不同；

基于所述图像集，分别为所述第一发射波长带、所述第二发射波长带和所述第三发射波长带确定第一对焦设置、第二对焦设置和第三对焦设置；

在第一时间段期间，使用第一光源以所述第一激发波长带中的光照射所述第一生物样品，并且根据所述第一对焦设置操作所述荧光显微镜以经由所述荧光显微镜的图像传感器获得所述第一发射波长带中的光的第一图像；

在第二时间段期间，使用第二光源以所述第二激发波长带中的光照射所述第一生物样品，并且根据所述第二对焦设置操作所述荧光显微镜以经由所述图像传感器获得所述第二发射波长带中的光的第二图像；以及

在第三时间段期间，使用第三光源以所述第三激发波长带中的光照射所述第一生物样品，并且根据所述第三对焦设置操作所述荧光显微镜以经由所述图像传感器获得所述第三发射波长带中的光的第三图像。

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