JP2023523727A - ３色以上の蛍光光源を備えた光学モジュールおよびその使用のための方法 - Google Patents

Abstract

３色（または、それ以上）チャネルの落射蛍光イメージングを促進させるための、ならびに、イメージング装置の手動の調節なしにサンプルの位相コントラストおよび／または明視野イメージングを実施するための、イメージング装置が提供される。これは、装置を手動で調節するためにインキュベーター環境を乱すことなく、インキュベーターの内側に位置付けされているデバイスによって、複数のサンプルの自動化されたイメージングを長期間にわたって可能にする。また、イメージング装置を使用してイメージングされ得る実験および／または蛍光色素の種類を増加させるために、イメージング装置がアッセイおよび／または蛍光インジケーターの異なる組み合わせに適合されることを可能にするように、除去可能な光学モジュールおよび／または透過照明モジュールのユーザースワッピングを促進させるための実施形態も提供される。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年４月２１日に出願された米国非仮特許出願第１６／８５４，７５６号の優先権を主張し、その内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。

生細胞生物学的サンプルは、１つまたは複数の時点におけるサンプルの成長、代謝、形態学、または他の特性を評価するために、さまざまな方式で顕微鏡的にイメージングされ得る。この顕微鏡イメージングは、蛍光イメージングを含むことが可能であり、サンプルの中のフルオロフォアは、フルオロフォアの励起波長における光によって励起され、それらがフルオロフォアの放出波長において光を蛍光的に放出することを引き起こす。落射蛍光イメージング（ｅｐｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｍａｇｉｎｇ）において、励起光は、放出光を収集するために使用される同じ対物レンズを介して提供される。

マルチチャネル蛍光イメージングを実現することは、蛍光イメージが特定の放出波長に関して獲得されるたびに、異なるフィルターセット（および、場合によっては、励起光源）を適切な位置に移動させることを必要とすることが多い。しかし、そのような配置は、コンポーネントを物理的に移動させる必要性に起因して、より大きく、より遅く、よりコストがかかり、より信頼性の低いシステムを結果として生じさせる。

ＰＣＴ／ＵＳ１９／２１１７１

第１の態様において、生細胞生物学的サンプルの中のフルオロフォアをイメージングするための例示的な光学モジュールが開示されている。光学モジュールは、（ａ）第１の帯域の励起波長において第１の光を放出するように構成されている第１の光源と、（ｂ）第１の光源の第１の光学経路の中に配置されている第１のフィルターであって、第１のフィルターは、１つまたは複数の波長における光を通し、１つまたは複数の波長における光を反射するように構成されている、第１のフィルターと、（ｃ）第２の帯域の励起波長において第２の光を放出するように構成されている第２の光源と、（ｄ）第２の光源の第２の光学経路の中に配置されている第２のフィルターであって、第２のフィルターは、１つまたは複数の波長における光を通し、１つまたは複数の波長における光を反射するように構成されている、第２のフィルターと、（ｅ）第３の帯域の励起波長において第３の光を放出するように構成されている第３の光源と、（ｆ）第３の光源の第３の光学経路の中に配置されている第３のフィルターであって、第３のフィルターは、１つまたは複数の波長における光を通し、１つまたは複数の波長における光を反射するように構成されており、第１の光学経路、第２の光学経路、および、第３の光学経路は、生細胞生物学的サンプルに向けて方向付けられるように構成されている一次的透過光学経路に沿って収束している、第３のフィルターと、（ｇ）生細胞生物学的サンプルの中のフルオロフォアによって放出される光のための一次的放出光学経路の中に配置されている放出フィルターであって、一次的放出光学経路は、イメージングセンサーにおいて終端するように構成されており、放出フィルターは、第１の帯域、第２の帯域、および第３の帯域の放出波長における光を通すように構成されており、第１の帯域、第２の帯域、および第３の帯域の励起波長における光を反射するように構成されている、放出フィルターとを含む。

第２の態様において、生細胞生物学的サンプルをアッセイするための例示的なシステムが開示されている。システムは、（ａ）本開示の第１の態様による光学モジュールと、（ｂ）光学モジュールに除去可能に連結されている蛍光顕微鏡であって、蛍光顕微鏡は、少なくとも１つの対物レンズを有している、蛍光顕微鏡と、（ｃ）対物レンズから生細胞生物学的サンプルの中のフルオロフォアによって放出される光のための放出経路の中に配置されているイメージングセンサーと、（ｄ）蛍光顕微鏡に除去可能に連結されている位相ランプ（ｐｈａｓｅ ｌａｍｐ）であって、位相ランプは、一次的透過光学経路の終端端部に配置されている、位相ランプとを含む。

第３の態様において、生細胞生物学的サンプルの中のフルオロフォアをイメージングするための例示的な方法が開示されている。方法は、（ｉ）第１の生物学的サンプルおよび蛍光顕微鏡を整合させるステップであって、第１の生物学的サンプルが蛍光顕微鏡の視野の中に位置付けされるようになっており、第１の生物学的サンプルは、（ａ）第１の帯域の励起波長の光による照射に応答して第１の帯域の放出波長の光を放出する第１のフルオロフォア、（ｂ）第２の帯域の励起波長の光による照射に応答して第２の帯域の放出波長の光を放出する第２のフルオロフォア、および、（ｃ）第３の帯域の励起波長の光による照射に応答して第３の帯域の放出波長の光を放出する第３のフルオロフォアを含む、ステップと、（ｉｉ）蛍光顕微鏡を使用して第１の生物学的サンプルの１セットのイメージを取得するステップであって、１セットのイメージのイメージ同士は、フォーカス設定に関して異なっている、ステップと、（ｉｉｉ）１セットのイメージに基づいて、第１の、第２の、および第３の帯域の放出波長に関する第１の、第２の、および第３のインフォーカス設定（ｉｎ－ｆｏｃｕｓ ｓｅｔｔｉｎｇ）をそれぞれ決定するステップと、（ｉｖ）第１の時間の期間の間に、第１の光源を使用し、第１の帯域の励起波長の光によって第１の生物学的サンプルを照射するステップと、第１のインフォーカス設定に従って蛍光顕微鏡を動作させ、蛍光顕微鏡のイメージセンサーを介して、第１の帯域の放出波長の光の第１のイメージを取得するステップと、（ｖ）第２の時間の期間の間に、第２の光源を使用し、第２の帯域の励起波長の光によって第１の生物学的サンプルを照射するステップと、第２のインフォーカス設定に従って蛍光顕微鏡を動作させ、イメージセンサーを介して、第２の帯域の放出波長の光の第２のイメージを取得するステップと、（ｖｉ）第３の時間の期間の間に、第３の光源を使用し、第３の帯域の励起波長の光によって第１の生物学的サンプルを照射するステップと、第３のインフォーカス設定に従って蛍光顕微鏡を動作させ、イメージセンサーを介して、第３の帯域の放出波長の光の第３のイメージを取得するステップとを含む。

第４の態様において、例示的な非一時的なコンピューター可読媒体が開示されている。コンピューター可読媒体は、プログラム命令をその上に記憶しており、プログラム命令は、プロセッサーによって実行されると、第３の態様の方法の実施を引き起こす。

議論されてきた特徴、機能、および利点は、さまざまな例において独立して実現され得、または、さらなる他の例において組み合わせられ得、そのさらなる詳細は、以下の説明および図面を参照して見られ得る。

１つの例示的な実装形態による、システムの機能的なブロック図である。 例示的な実装形態による、コンピューティングデバイスおよびコンピューターネットワークのブロック図である。 例示的な実装形態による、光学モジュールを含む、生細胞生物学的サンプルをアッセイするためのシステムの機能的なブロック図である。 例示的な実装形態による、光学モジュールを含む、生細胞生物学的サンプルをアッセイするためのシステムの機能的なブロック図である。 例示的な実装形態による、光学モジュールを含む、生細胞生物学的サンプルをアッセイするためのシステムの機能的なブロック図である。 例示的な実装形態による、光学モジュールの正面図である。 図６の例示的な実装形態による、光学モジュールの背面図である。 図６の例示的な実装形態による、光学モジュールの側面図である。 図６の例示的な実装形態による、光学モジュールの正面断面図である。 図６の例示的な実装形態による、光学モジュールの側断面図である。 図６の例示的な実装形態による、光学モジュールの側断面図である。 図１１の例示的な実装形態による、光学モジュールのシャフトの詳細図である。 例示的な実装形態による、光学モジュールを含む、生細胞生物学的サンプルをアッセイするためのシステムの機能的なブロック図である。 例示的な実装形態による、位相ランプの斜視図である。 例示的な実装形態による、蛍光顕微鏡に連結されている位相ランプの断面図である。 例示的な実装形態による方法のフローチャートを示す図である。

図面は、例を図示する目的のためのものであるが、本発明は、図面に示されている配置および手段に限定されないということが理解される。

Ｉ．概観
生細胞サンプルの顕微鏡イメージングは、さまざまな実験的な条件の下での細胞の母集団の健康状態、成長、および活性についての情報を提供することが可能である。この情報は、サンプルの中の細胞の経時的な数、細胞の形態学もしくは他の構造的特性、細胞の内部内容もしくは構造（たとえば、細胞の有糸分裂または他の代謝プロセスの局面に関係付けられる内容）についての情報、または、細胞についての他の情報を含むことが可能である。この情報は、「正常な」条件の下での、および／または、さまざまな適用された実験的な条件の下での、細胞の挙動を評価するために使用され得る。たとえば、細胞の顕微鏡イメージングは、実験的な医薬品または他の添加された物質に対する細胞の応答、細胞の遺伝子組み換えの効果、添加された癌細胞、他の添加された細胞タイプ、および／または、添加された細菌、真菌、ウィルス、もしくは、他の微生物の、細胞に対する効果、または、生細胞のサンプルに対するいくつかの他の適用された実験的な条件の効果を評価するために使用され得る。

そのようなイメージングのコストを低減させるために、イメージングを実施するために使用される装置（たとえば、インキュベーター、イメージング装置）のサイズを低減させるために、細胞サンプルに適用される条件の安定性に対する影響を低減させるために、および／または、他の利益を提供するために、複数の生細胞サンプルの顕微鏡イメージングは、インキュベーターの内側の生細胞サンプルとともに存在するように構成されている自動化されたイメージング装置によって実施され得る。そのような自動化されたイメージング装置は、ガントリーまたは他のアクチュエーターを含むことが可能であり、それは、イメージング装置および／または生細胞サンプル（たとえば、マルチウェルプレートもしくは他のマルチサンプルコンテナ）を移動させ、インキュベーターの中の複数の生細胞サンプルの自動化されたイメージングを促進させるように構成されている。そのような生細胞サンプルは、生細胞内容物のアイデンティティーもしくはミックス、添加された医薬品、微生物、癌細胞、もしくは、他の添加された物質のアイデンティティーもしくは量、生細胞内容物に適用される遺伝子組み換えのタイプ、または、いくつかの他の実験的な条件に関して異なる可能性のある複数の生細胞サンプルを含むことが可能である。

そのようなシステムの顕微鏡イメージング装置は、イメージング装置の光学経路を折り曲げるために、ミラー、フィルター、または、他の要素を含むことが可能であり、イメージング装置のサイズを低減させるようになっており、イメージング装置がインキュベーターの中にフィットすることができるようになっている。追加的にまたは代替的に、イメージング装置の要素は、個別のサブアッセンブリへと分離され、さまざまな顕微鏡イメージングモダリティを促進させることが可能である。たとえば、位相ランプおよび／または他の透過照明光源は、モジュールで提供され得、そのモジュールは、イメージセンサー内蔵モジュールとは別個になっており、イメージセンサー内蔵モジュールから生細胞サンプルコンテナの反対側にあり、明視野イメージング、位相コントラストイメージング、または、他の顕微鏡イメージングモードを促進させる。

蛍光色素、非蛍光色素もしくは顔料、適当な波長において表面プラズモン共鳴を示すナノロッドもしくは他の導電性要素、Ｒａｍａｎ色素、または、他の光学的に区別可能な物質が、生細胞サンプルに添加され、サンプルの内容および／またはそのプロセスもしくは内容をイメージングすることを促進させることが可能である。光学的に区別可能な物質は、サンプルの中の関心の物質に特異的に結合するかまたはその他の方法でそれと相互作用するように（たとえば、抗体によって）機能化され得る。たとえば、造影剤は、タンパク質、特定の細胞の表面マーカー、ＤＮＡ／ＲＮＡなどの特定の配列、または、生物学的サンプルの中の何らかの他の関心の物質もしくは要素に特異的に結合するかまたはその他の方法でそれと相互作用するように機能化され得る。そのような機能化は、サンプルの中の特定の物質をイメージングすること、たとえば、サンプルの中の関心のタンパク質または他の物質についての存在、量、分布、または他の情報をイメージングすることを促進させることが可能である。光学的に区別可能な物質は、外来物質として生細胞サンプルの中へ導入されることによって（たとえば、特定のタイプの細胞またはレセプターに特有の抗体に接合されている特定の量のフルオロフォアをマルチウェルサンプルプレートのそれぞれのウェルの中へ添加することによって）添加され得る。追加的にまたは代替的に、光学的に区別可能な物質は、光学的に区別可能な物質を発現するようにサンプルの中の生細胞を遺伝的に組み換えることによって（たとえば、緑色蛍光タンパク質のための遺伝子をサンプルの中の生細胞に添加することによって）添加され得る。追加的にまたは代替的に、そのような光学的に区別可能な物質は、生細胞の中に、および／または、それによって分泌される物質（たとえば、生細胞の母集団によって自然に発現される自家蛍光タンパク質）の中に、自然に存在することが可能である。

放出帯域とは異なる励起帯域における光による励起に応答して放出帯域における光を放出するフルオロフォアまたは他の物質（たとえば、Ｒａｍａｎ色素）は、サンプルの内容物をイメージングする際に特に有用である。これは、応答的に放出された放出光から励起光を区別するための能力、ならびに、励起光を制御することによって放出光の大きさおよびタイミングを制御するための能力に、部分的に起因している。これらの特性は、他の物質（たとえば、散乱された光の波長が照射光の波長と実質的に同じとなるように、所定の波長の範囲の中の光を散乱させる色素）よりも高い忠実性を伴って蛍光色素がイメージングされることを可能にする。追加的に、光学的に区別可能である異なるフルオロフォアが、複数の異なるフルオロフォアを独立してイメージングすることを促進させるために使用され得る。これらの異なるフルオロフォアは、励起スペクトル、放出スペクトル、または他の特性（たとえば、蛍光寿命）に関して異なっており、そのような独立したイメージングを促進させることが可能である。そのようなイメージングは、それぞれの異なる時点において、異なるフルオロフォアのそれぞれの異なる励起波長における光を提供することによって実現され得る。サンプルからの放出光を収集およびイメージングするために使用されるものと同じ対物レンズ（または、対物レンズシステム）を介して、励起光がサンプルに送達されるときに、プロセスは、「落射蛍光イメージング」と称され得る。

異なる時点において異なるフルオロフォア（または、他の光学的に区別可能なサンプル内容物）をイメージングするために、蛍光イメージャー（たとえば、落射蛍光イメージャー）は、１つまたは複数の波長選択的なフィルター、ミラー、または、他の波長選択的な光学要素を、イメージャーの光学経路の中へおよびその外へ機械的に移動させ、異なる励起波長帯域における光によるサンプルの照射を促進させ、ならびに／または、異なる放出波長帯域における光の選択的な受け取りおよびイメージングを促進させることが可能である。しかし、そのようなイメージャーは、より機械的に複雑であり、よりコストがかかり、より大きく、より信頼性が低い可能性があり、または、いくつかの他の望まれない性能特性を示す可能性がある。その代わりに、イメージャーは、ダイクロイックミラー、光学フィルター、または他の要素の静的なセットを含むことが可能であり、それは、それぞれの異なるフルオロフォアのそれぞれの異なる励起帯域における光を異なる光源が放出することを可能にし、一方では、異なるフルオロフォアのそれぞれの放出帯域における光がイメージセンサーに通されてイメージセンサーによってイメージングされることを可能にするように構成されている。

たとえば、蛍光顕微鏡システムの中の落射蛍光能力を使用して生細胞生物学的サンプルをアッセイするための光学モジュールは、２つの光源および関連のフィルター（たとえば、ダイクロイックミラー）を含むことが可能である。これらの光源に関連付けられる波長、および、オプティクスモジュールの中のフィルターのパス／ストップ／反射帯域に関連付けられる波長は、光の色（フルオロフォアが、それによってそれぞれ励起され、それにおいて応答的に放出する）に従って、１つまたは複数のセットのフルオロフォアとともに働くように選択される。

そのようなイメージングシステムは、少なくともそれらのそれぞれの励起帯域に関して異なっている２つの異なるフルオロフォアを独立して励起する（および、そこから応答的に蛍光的に放出された光を検出する）ように構成および動作され得る。たとえば、そのようなシステムは、第１の構成において、緑色フルオロフォアおよび赤色フルオロフォアを検出し、第２の構成（たとえば、光源、ダイクロイックミラー、フィルター、または、他の光学コンポーネントを含む光学モジュールをスワップすることによって実現される）において、オレンジ色フルオロフォアおよび近赤外線（「ＮＩＲ」）フルオロフォアを検出することが可能である。そのような２色イメージングシステムの異なる構成（たとえば、システムの異なるスワップ可能な光学モジュール）は、特定のアッセイ（たとえば、細胞母集団の中の細胞分裂の観察を可能にする、遺伝子的にコード化された２色（赤色および緑色）インジケーターである蛍光ユビキチン化細胞周期インジケーター（「ＦＵＣＣＩ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ｉｎｄｉｃａｔｏｒ）」）アッセイ）に関連付けられるフルオロフォアの対を励起するように構成され得る。システムが特定の構成に設定されているときに、独立したイメージは、特定の構成と互換性があるフルオロフォアに関してのみ収集され得る。

そのような２フルオロフォア光学システムは、それが独立してイメージングすることができる個別のフルオロフォアの数に関して制限される。したがって、それは、単一のサンプルの中において、または、自動化されたイメージングシナリオにおいて異なるサンプルの母集団にわたって（たとえば、マルチウェルサンプルコンテナの異なるウェルは、ウェルの中に存在しているフルオロフォアに関して異なっている）、それが発生させることができる情報のタイプに関して制限される。これは、単一のサンプルの中で実行され得る蛍光アッセイの種類に関して（すなわち、２つ以下の蛍光インジケーターを含むアッセイに関して）制限されることを含むことが可能である。そのようなアッセイの１つの例は、蛍光ユビキチン化ベースの細胞周期インジケーター（「ＦＵＣＣＩ」）であり、それは、細胞母集団の中の細胞分裂の観察を可能にする、遺伝子的にコード化された２色（赤色および緑色）インジケーターである。しかし、このアッセイを実施するために使用される２色光学モジュールは、Ｓ期（すなわち、細胞がその核の中でＤＮＡの完全なコピーを合成するとき）、Ｇ２期（すなわち、第２のギャップ期；細胞がより成長し、タンパク質およびオルガネラを作製し、有糸分裂の準備のためにその内容を再編成し始めるとき）、および有糸分裂（Ｍ）期（すなわち、細胞がそのＤＮＡを２つのセットへと分離し、その細胞質を分割し、２つの新しい細胞を形成する）の間を区別することができない。また、Ｍ／Ｇ１移行において無色期が存在しており、それは、細胞を非発現体から区別不可能にする。ＴａｇＧＦＰ２は、４８３ｎｍおよび５０６ｎｍにおいて励起／放出極大をそれぞれ有する明るい緑色蛍光を持つタンパク質である。Ｓ期、Ｇ２期、およびＭ期の間に、細胞は、ＴａｇＧＦＰ２の発現を介して緑色蛍光をそれぞれ放出し、それは、２色光学モジュールを使用してイメージングされ得る。ｍＫａｔｅは、５８８ｎｍおよび６３３ｎｍにおいて励起／放出極大をそれぞれ有する蛍光を持つ遠赤色蛍光タンパク質である。Ｇ１期（すなわち、第１のギャップ期；細胞が物理的により大きくなり、オルガネラをコピーし、後の成長の段階のために分子ビルディングブロックを作製するとき）の間におよびＳ期への移行期の間に、細胞は、ｍＫａｔｅの発現を介して遠赤色蛍光を放出し、それは、また、２色光学モジュールを使用してイメージングされ得る。しかし、そのような２色光学モジュールは、細胞分裂プロセスの中の追加的な期またはサブ期を識別するために追加的な蛍光インジケーターを使用することができないこととなる。

そのような２フルオロフォアイメージングシステムの能力は、２つのフルオロフォアの励起帯域および放出帯域に関係付けられる光源、フィルター、ミラー、または、他の光学要素を含む光学モジュールをスワップすることによって拡張され得る。しかし、そのような手動のスワッピングは、自動化されたイメージング実験が行われている状態で実施することが困難である可能性があり、モジュールがスワップされ得るようにインキュベーターを開けることによって、生細胞サンプルの環境が激しく摂動されることを必要とすることとなる。

さまざまな用途において、（光学モジュールをスワップすることなく、または、インキュベーション環境の摂動を結果として生じさせる可能性のある何らかの他の手動のプロセスを実施することなく）３つの（または、それ以上の）蛍光チャネルを独立してイメージングするために、蛍光イメージング装置を使用することができることは有益である。そのようなシステムは、より複雑なアッセイ（たとえば、完全な細胞周期を観察する３色ＦＵＣＣＩアッセイのような３つ以上の蛍光インジケーターを含むアッセイ）のより多くの使用、代謝インジケーターまたは他の蛍光インジケーター（たとえば、それぞれの異なる細胞タイプをタグ付けするための２つ以上の蛍光インジケーターであり、一方では、サンプルの中の第３の蛍光インジケーターは、代謝、細胞死、または、関心の何らかの他のプロセスを表す）も評価しながら単一のサンプルの中のより多くのタイプの細胞を識別すること、インキュベーターの中の個々のサンプルの中のより多くのタイプのアッセイ／個々の蛍光インジケーターの使用、および／または、インキュベーターの中の異なるサンプルの中のより多くのタイプのアッセイ／個々の蛍光インジケーターの使用を可能にすることができる。これらの利益は、単一のサンプルの中の単一の実験の複数の異なるアッセイの多重化を可能にすることによって、および／または、異なる実験の異なるアッセイが単一のインキュベーターの中のサンプルプレートの異なるウェルの中で実施されることを可能にすることによって、特定の数の実験／アッセイを実施するために必要とされる時間およびインキュベータースペースを低減させることによって、コストを低減させることが可能である。

本明細書における実施形態は、インキュベーターの中の自動化されたマルチサンプルイメージングと互換性がある様式で、そのような３つの（または、それ以上の）チャネルの顕微鏡的な蛍光イメージングプロセスに関係する方法およびシステムを提供する。これらの実施形態は、イメージング装置が明視野顕微鏡法および／または位相コントラスト顕微鏡法にも使用されることも可能にしながら、３つの（または、それ以上の）チャネルの蛍光イメージング装置を限られた体積／寸法の中へフィットさせることに伴う複雑さの増加に対する解決策を提供する。また、これらの実施形態は、３つの（または、それ以上の）励起帯域における励起光をサンプルにルーティングする分岐した光学経路を特定し、一方では、３つの（または、それ以上の）放出帯域におけるサンプルからの光をイメージセンサーにルーティングし、一方では、励起帯域における光を拒絶するという複雑な問題に対する解決策を提供する。これらの実施形態のうちのいくつかは、対応する３つの（または、それ以上の）チャネルの蛍光イメージングモジュールとペアにされる除去可能なモジュールの一部である位相ランプ（または、他の透過照明光源）を提供することを含む。そのようなペアリングは、位相ランプからの光が、ペアにされた蛍光イメージングモジュールを通過することができる波長を含むことを保証するために必要である可能性がある。そのような照射モジュールおよびペアにされた光学フィルターモジュールは、自動化されたモジュール検出および識別を促進させるためのバーコード、オンボードメモリー、または、他の特徴を含むことが可能であり、モジュールがミスマッチされる場合に、実験を実行する前にユーザーに警告するようになっている。

また、本明細書において提供されている実施形態は、光学モジュール（たとえば、位相ランプモジュール、光源、およびフィルターモジュール）を手動でスワップするために使用される装置に対する改善を含み、その光学モジュールは、イメージング装置の中でのそのようなモジュールの着座およびアライメントを改善し、また、ユーザーがそのような手動のスワッピングを実施することができる容易さを高める。さまざまな光学モジュールをシステムに連結するためにおよびシステムから解除するために、以前のシステムでは、別個のツールが必要とされた。ツールは、光学モジュールの中の小さな孔部を通して、対応するスクリューと整合することが困難であった。加えて、モジュールの中の光源をシステムの残りの部分のコントローラーおよび電源に電気的に連結するために使用される電気コネクターの配置および構成に部分的に起因して、光学モジュールを連結または解除するために必要とされる力は、多くのエンドユーザーが発生させるには困難であった。結果として、多くのエンドユーザーは、光学モジュールをスワップするための支援を必要としていた。

光学モジュールのフレキシブルな交換可能性は、それに限定されないが、（ｉ）励起光をサンプルに方向付けるために、３つの異なる帯域の励起波長において３つの光源を活性化させること、および、３つの個別のフルオロフォア（たとえば、緑色、オレンジ色、および近赤外線（「ＮＩＲ」））からの応答的に放出された放出光を検出すること、（ｉｉ）励起波長のうちの２つがＦｏｒｓｔｅｒ共鳴エネルギー移動（「ＦＲＥＴ」）ベースの測定（たとえば、ＡＴＰ）に方向付けられた状態で、および、第３の帯域の励起波長が独立したフルオロフォア（たとえば、核ラベル）を識別する状態で、３つの異なる帯域の励起波長において３つの光源を活性化させること、ならびに、（ｉｉｉ）２つの異なる帯域の励起波長において光学モジュールの２つの光源のみを使用すること、および、２つの個別のフルオロフォア（たとえば、（ａ）緑色および赤色、または、（ｂ）オレンジ色およびＮＩＲ）からの応答的に放出された放出光を検出することを含む、フルオロフォアを検出する方法の異なる組み合わせを可能にするように、システムが構成されることを可能にする。

加えて、３つの（または、それ以上の）帯域の光学モジュールの中のフィルターにマッチされた位相ランプは、また、位相および明視野イメージングが実施されることを有利に可能にするために（たとえば、蛍光イメージング情報を増強するために、および／または、独立したイメージ情報を提供するために、フルオロフォアを識別するためにイメージをさらに処理して洗練させるために、ＦＲＥＴを測定するために、または、何らかの他の利益を提供するために）、システムの中に含まれ得る。本開示の位相ランプモジュール（または、他の透過照明光源モジュール）の１つの利点は、特定の位相ランプモジュールが据え付けられたということを直接的に識別するというシステムの能力である。位相ランプのアイデンティティーを検出することは、有益には、無効な構成が存在しているとき（無効な構成では、位相ランプが所与の光学モジュールに関して正しくマッチしていない（それは、たとえば、位相ランプからの光が、イメージングされることとなる光学モジュールを通して透過されることを全体的にまたは部分的に阻止されることを結果として生じさせる可能性がある））をシステムが決定すること、および、実験（たとえば、１つまたは複数のアッセイを実施することを含む実験）が行われる前にユーザーに警告することを可能にする。

ＩＩ．例示的なアーキテクチャー
図１は、動作環境１００を示すブロック図であり、動作環境１００は、たとえば、生細胞生物学的サンプルをアッセイするためのシステム１０５を含むかまたは必要とし、それは、コンピューティングデバイス２００ａと電気的に通信している蛍光顕微鏡１１５を含む。蛍光顕微鏡１１５は、インキュベーター１０８の中に位置付けされており、インキュベーター１０８は、温度、湿度、および／または他の環境パラメーターを制御し、生細胞サンプルの培養を促進させるように構成されており、それは、自動化された方式で蛍光顕微鏡１１５によってイメージングされ得る。インキュベーター１８０の中に位置決めされることによって、蛍光顕微鏡１１５は、サンプルがインキュベーター１８０から除去されることを必要とすることなく（そのプロセスは、サンプルを摂動させ、適用される実験的な条件に対するその成長／反応を修正する可能性がある）、サンプルをイメージングすることが可能である。下記に説明されている図１６の方法３００は、この動作環境１００の中で実装され得る方法の実装形態を示している。

蛍光顕微鏡１１５は、光学モジュール１１０を含み、光学モジュール１１０は、イメージングセンサー１２０と組み合わせて、落射蛍光イメージングを使用してインキュベーター１８０の中のサンプルをイメージングするために使用され得る。光学モジュール１１０は、３つの（または、それ以上の）光源を含み、３つの（または、それ以上の）光源は、サンプルの中のそれぞれのフルオロフォア（たとえば、関心のタンパク質または他の物質に選択的に結合することを促進させるための抗体または他の構造体に接合されたフルオロフォアを含む蛍光インジケーター）に対応する３つの（または、それ以上の）それぞれの帯域の励起波長において照射を提供するように構成されている。光学モジュール１１０は、３つの（または、それ以上の）光源からの光が対物レンズを介してサンプルに送達されるように、分岐された光学経路を提供するように構成されているダイクロイックミラー、フィルター、および／または、他の要素を追加的に含む。対物レンズは、光学モジュール１１０の一部であることが可能であり、または、それとは別個になっていることが可能である。また、光学モジュール１１０は、３つの（または、それ以上の）それぞれの帯域の放出波長において、対物レンズを通して収集された応答的に放出された蛍光光をイメージングセンサー１２０に送達し、サンプルの中の３つの異なるフルオロフォアの落射蛍光イメージングを促進させるように構成されている。

単一の光学モジュール１１０を使用して３つの異なるフルオロフォアを独立して落射蛍光的にイメージングすることができることは、さまざまな利益を提供する。それは、より複雑な３色（または、それ以上）アッセイを使用することを促進させることが可能である。それは、単一のサンプルの中の複数のアッセイまたは他の蛍光インジケーターをイメージングすることを促進させることが可能である（たとえば、特定のタイプの細胞に選択的に結合し、サンプルの中の細胞のアイデンティティーおよび細胞分裂局面の両方が決定されることを可能にする２色ＦＵＣＣＩアッセイおよび独立した蛍光インジケーター）。それは、すべてのインジケーター／アッセイが２セットの励起／放出帯域のみに一致するという要件を緩和することによって、フルオロフォア／アッセイ選択を促進させることが可能である（たとえば、２色光学モジュールの２つの利用可能な励起／放出帯域のうちの１つにマッチする最適でないインジケーターを選択する代わりに、より最適な蛍光インジケーターが、特定の使用のために選択され得る）。それは、単一の器具／インキュベーターの中のスペースがより効率的に使用されることを可能にすることによって、時間および他のコストを節約するために、同じインキュベーターの中に含まれる異なるサンプルの中の異なるセットのアッセイ／蛍光インジケーターをイメージングすることを促進させることが可能である。たとえば、第１および第２の異なる実験（それぞれの第１および第２のセットの蛍光インジケーター／アッセイ（それは、放出／励起波長に関してオーバーラップする可能性がある）を有している）は、同じインキュベーターの中のそれぞれのセットのウェルの中で実行され得る。追加的にまたは代替的に、単一の実験を実施するために使用されるウェルのサブセットの中に複数の異なるセットのアッセイ／蛍光インジケーターが存在している状態で、単一の実験が実行され、実験についての追加的なデータが同時に同じインキュベーターを使用して発生されることを可能にすることができる。単一の光学モジュール１１０を使用して３つの（または、それ以上の）異なるフルオロフォアを独立して落射蛍光的にイメージングすることができることは、追加的なもしくは代替的な利益、または、利益の組み合わせを提供することが可能である。

また、蛍光顕微鏡１１５は、位相コントラスト、明視野、または、他の形態のイメージングのために光を提供するように構成されている位相ランプ１２５（または、他の透過照明光源）を含む。光学モジュール１１０は、位相ランプ１２５から放出される光の少なくともいくらかを通すように構成されている。いくつかの例において、これは、位相ランプ１２５が狭帯域光源（たとえば、レーザー、ＬＥＤ）であること、および、光学モジュールが、狭帯域光源によって放出される狭帯域の波長にわたって光を通すように構成されていることを含むことが可能である。光学モジュール１１０および位相ランプ１２５の詳細は、（たとえば、図３～図１５に関する）本明細書の他の場所で提供されている。

光学モジュール１１０は、異なる時間の期間の間に異なる蛍光インジケーター／アッセイをイメージングするために蛍光顕微鏡１１５を使用するために、（たとえば、本明細書の他の場所に説明されている実施形態に従って）ユーザースワップ可能にされ得る。これは、光学モジュール１１０を蛍光顕微鏡１１５の他のイメージングコンポーネントと（たとえば、イメージングセンサー１２０と）整合させることを促進させるために、ピン、スロット、または、他のアライメント特徴を有する光学モジュールを含むことが可能である。また、これは、３つの（または、それ以上の）光源に給電および制御することまたは何らかの他の機能性を提供することを促進させるために、１つまたは複数の電気コネクターを有する光学モジュール１１０を含むことが可能である。たとえば、光学モジュール１１０は、コンピューティングデバイス（たとえば、２００、２００ａ）が光学モジュール１１０を識別すること、ならびに／または、光学モジュール１１０から放出され得る、および／もしくは、光学モジュール１１０を使用してイメージングされ得る、光の波長の帯域を決定することを可能にするために、メモリーまたは他の電気コンポーネントを含むことが可能である。

また、位相ランプ１２５（または、他の透過照明光源）も、ユーザースワップ可能にされ得る。これは、すべての可能な位相ランプ１２５と互換性があるわけではない可能性のある、異なるパス帯域（すなわち、サンプルからの、その帯域の波長の光は、光学モジュール１１０を通過され、イメージングセンサー１２０へ至ることが可能である）を有する異なるスワップ可能な光学モジュール１１０に起因する可能性がある。たとえば、第１の位相ランプ１２５は、ある意味で「最適」であるかもしれないが（たとえば、特定のタイプのサンプルを位相コントラストイメージングすることに関して）、実験を実施するために（たとえば、関心の特定のアッセイをイメージングすることを促進させるために）選択された光学モジュール１１０の任意のパス帯域とそれほどオーバーラップしない帯域の波長の光を作り出すことが可能である。したがって、第１の位相ランプ１２５モジュールは、選択された光学モジュール１１０の完全にまたは実質的にパス帯域の中の波長において光を放出する第２の位相ランプ１２５モジュールとスワップされ得る。

そのようなスワップ可能な位相ランプ１２５モジュールは、コンピューティングデバイス（たとえば、２００、２００ａ）が位相ランプ１２５モジュールを識別すること、および／または、位相ランプ１２５モジュールから放出され得る光の波長の帯域を決定することを可能にするために、メモリーまたは他の電気コンポーネントを含むことが可能である。このアイデンティティー／情報は、蛍光顕微鏡１１５の中に据え付けられている光学モジュール１１０の同様の情報／アイデンティティーと自動的に比較され、据え付けられたモジュールが互換性があるということを保証する（たとえば、据え付けられた光学モジュール１１０が、据え付けられた位相ランプ１２５モジュールから放出された光の波長を通すことが可能であり、その組み合わせが、位相ランプ１２５モジュールを使用して、位相コントラスト、明視野、または、何らかの他のイメージングモダリティを介して、サンプルをイメージングするために使用され得るようになっているということを保証する）ことが可能である。非互換性が検出される場合には、システム１０５を使用して自動化されたイメージング検査または他の実験を開始する前に、ユーザーが警告され得る。

図２は、例示的な実装形態によるコンピューティングデバイス２００の例を図示するブロック図であり、それは、直接的または間接的のいずれかで、動作環境１００とインターフェースするように構成されている。コンピューティングデバイス２００は、図１６に示されて下記に説明されている方法の機能を果たすために使用され得る。とりわけ、コンピューティングデバイス２００は、それに限定されないが、単一の容器の中のまたは複数の容器の中の単一の生物学的サンプルの中の３つ以上の蛍光色のイメージを取得するために単一の光学モジュールを使用することを含む、１つまたは複数の機能を果たすように構成され得る。次いで、取得されるイメージは、３つ以上の蛍光色に対応するフルオロフォアおよび／またはそれに接合された物質の特性に関係付けられるイメージングされる生物学的サンプルについて追加的な分析を実施するために使用され得る。また、機能は、信号光学モジュールおよび他の光源を使用して、サンプルの明視野イメージ、位相コントラストイメージ、または、何らかの他のイメージを取得するために、単一の光学モジュール（たとえば、位相ランプ）の一部ではない光源を使用することを含むことも可能である。

単一のサンプルの中でイメージングされた３つ以上の色の利用可能性は、より複雑な多色分析またはアッセイ（たとえば、完全な細胞周期を観察する３色ＦＵＣＣＩアッセイ）、単一のサンプルの中でのまたは異なるサンプルの中での複数の異なるアッセイの実施（たとえば、細胞アポトーシスのためにＡｎｎｅｘｉｎ ＮＩＲアッセイと併用した２色ＦＵＣＣＩアッセイ（緑色／オレンジ色））、互いに組み合わせた、および／または、１つもしくは複数の多色アッセイ（たとえば、それぞれの細胞タイプを識別するための２つの蛍光レポーター、および、３色免疫細胞キリングアッセイの一部として使用され得る、細胞アポトーシスのためのＡｎｎｅｘｉｎ ＮＩＲアッセイ）と組み合わせた、１つまたは複数の蛍光インジケーターの使用、同じインキュベーターの中に位置付けされている異なるサンプルの中のインジケーター／アッセイの異なるセットの使用、または、他の例を促進させる。また、３つ以上の色の利用可能性は、選択されたインジケーター／アッセイに関する要件を緩和し、より大きいフレキシビリティーを可能にすることができる。たとえば、特定のアッセイが特定の色にのみ利用可能である場合には、その色は、アッセイのために予約され得、一方では、他の色は、細胞タイプ特有インジケーターまたは他の用途（たとえば、より多くの色オプションが利用可能であるアッセイの色チャネル）のために使用され得る。

コンピューティングデバイス２００は、プロセッサー２０２を有しており、また、通信インターフェース２０４、データストレージ２０６、出力インターフェース２０８、およびディスプレイ２１０を有しており、それぞれが、通信バス２１２に接続されている。また、コンピューティングデバイス２００は、コンピューティングデバイス２００の中の通信、および、コンピューティングデバイス２００と他のデバイス（たとえば、図示せず）との間の通信を可能にするためのハードウェアを含むことが可能である。ハードウェアは、たとえば、トランスミッター、レシーバー、およびアンテナを含むことが可能である。

通信インターフェース２０４は、ワイヤレスインターフェースおよび／または１つもしくは複数のワイヤードインターフェースであることが可能であり、それは、１つもしくは複数のネットワーク２１４への、または、１つもしくは複数のリモートコンピューティングデバイス２１６（たとえば、タブレット２１６ａ、パーソナルコンピューター２１６ｂ、ラップトップコンピューター２１６ｃ、およびモバイルコンピューティングデバイス２１６ｄ）への短距離通信および長距離通信の両方を可能にする。そのようなワイヤレスインターフェースは、１つまたは複数のワイヤレス通信プロトコル（たとえば、Ｂｌｕｅｔｏｏｔｈ、Ｗｉ－Ｆｉ（たとえば、電気電子技術者協会（ＩＥＥＥ） ８０２．１１プロトコル）、Ｌｏｎｇ－Ｔｅｒｍ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ（ＬＴＥ）、セルラー通信、近距離無線通信（ＮＦＣ）など、および／または他のワイヤレス通信プロトコル）の下での通信を提供することが可能である。そのようなワイヤードインターフェースは、イーサネットインターフェース、ユニバーサルシリアルバス（ＵＳＢ）インターフェース、または、同様のインターフェースを含み、ワイヤー、ツイストペアのワイヤー、同軸のケーブル、光学リンク、光ファイバーリンク、または、他の物理的な接続を介してワイヤードネットワークに通信することが可能である。したがって、通信インターフェース２０４は、１つまたは複数のデバイスから入力データを受信するように構成され得、また、出力データを他のデバイスに送るように構成され得る。

また、通信インターフェース２０４は、ユーザー入力デバイス、たとえば、キーボード、キーパッド、タッチスクリーン、タッチパッド、コンピューターマウス、トラックボール、および／または、他の同様のデバイスなどを含むことが可能である。

データストレージ２０６は、プロセッサー２０２によって読み取られるかまたはアクセスされ得る１つまたは複数のコンピューター可読のストレージ媒体を含むか、または、その形態をとることが可能である。コンピューター可読のストレージ媒体は、揮発性のおよび／または不揮発性のストレージコンポーネント（たとえば、光学的な、磁気的な、有機の、または、他のメモリーまたはディスクストレージなど）を含むことが可能であり、それは、全体的にまたは部分的にプロセッサー２０２と一体化され得る。データストレージ２０６は、非一時的なコンピューター可読媒体と考えられる。いくつかの例において、データストレージ２０６は、単一の物理的なデバイス（たとえば、１つの光学的な、磁気的な、有機の、または、他のメモリーまたはディスクストレージユニット）を使用して実装され得、一方では、他の例では、データストレージ２０６は、２つ以上の物理的なデバイスを使用して実装され得る。

したがって、データストレージ２０６は、非一時的なコンピューター可読のストレージ媒体であり、実行可能な命令２１８が、その上に記憶されている。命令２１８は、コンピューター実行可能なコードを含む。命令２１８がプロセッサー２０２によって実行されるときに、プロセッサー２０２は、機能を果たすことを引き起こされる。そのような機能は、それに限定されないが、単一の光学モジュールを使用し、単一の容器の中のもしくは複数の容器の中の単一の生物学的サンプルの中の３つ以上の蛍光色のイメージを取得すること、単一の光学モジュールに加えて位相ランプもしくは他の光源を使用し、単一の光学モジュールと組み合わせて、生物学的サンプルの明視野イメージ、位相コントラストイメージ、もしくは、何らかの他のイメージを取得すること、および／または、取得されたイメージに基づいて分析を実施することを含む。

プロセッサー２０２は、汎用プロセッサーまたは専用プロセッサー（たとえば、デジタル信号プロセッサー、特定用途向け集積回路など）であることが可能である。プロセッサー２０２は、通信インターフェース２０４から入力を受信し、入力を処理し、出力を発生させることが可能であり、出力は、データストレージ２０６の中に記憶され、ディスプレイ２１０に出力される。プロセッサー２０２は、実行可能な命令２１８（たとえば、コンピューター可読のプログラム命令）を実行するように構成され得、実行可能な命令２１８は、データストレージ２０６の中に記憶されており、本明細書で説明されているコンピューティングデバイス２００の機能性を提供するように実行可能である。

出力インターフェース２０８は、ディスプレイ２１０に、または、同様に他のコンポーネントに情報を出力する。したがって、出力インターフェース２０８は、通信インターフェース２０４と同様であることが可能であり、同様に、ワイヤレスインターフェース（たとえば、トランスミッター）またはワイヤードインターフェースであることが可能である。出力インターフェース２０８は、たとえば、１つまたは複数の制御可能なデバイスにコマンドを送ることが可能である。

また、図２に示されているコンピューティングデバイス２００は、たとえば、システム１０５と通信している、動作環境１００の中のローカルコンピューティングデバイス２００ａ（図１）を表している可能性がある。このローカルコンピューティングデバイス２００ａは、下記に説明されている方法３００のステップのうちの１つもしくは複数を実施することが可能であり、ユーザーから入力を受信することが可能であり、ならびに／または、イメージデータおよびユーザー入力をコンピューティングデバイス２００に送り、方法３００のステップのうちのすべてもしくはいくつかを実施することが可能である。

図１６は、生細胞生物学的サンプルの中のフルオロフォアをイメージングするための例示的な方法３００のフローチャートを示している。方法３００は、第１の生物学的サンプルおよび蛍光顕微鏡を整合させるステップ（３０５）であって、第１の生物学的サンプルが蛍光顕微鏡の視野の中に位置付けされるようになっており、第１の生物学的サンプルは、（ｉ）第１の帯域の励起波長の光による照射に応答して第１の帯域の放出波長の光を放出する第１のフルオロフォア、（ｉｉ）第２の帯域の励起波長の光による照射に応答して第２の帯域の放出波長の光を放出する第２のフルオロフォア、および、（ｉｉｉ）第３の帯域の励起波長の光による照射に応答して第３の帯域の放出波長の光を放出する第３のフルオロフォアを含む、ステップ（３０５）と、蛍光顕微鏡を使用して第１の生物学的サンプルの１セットのイメージを取得するステップ（３１０）であって、１セットのイメージのイメージ同士は、フォーカス設定に関して異なっている、ステップ（３１０）と、１セットのイメージに基づいて、第１の、第２の、および第３の帯域の放出波長に関する第１の、第２の、および第３のインフォーカス設定をそれぞれ決定するステップ（３１５）と、第１の時間の期間の間に、第１の光源を使用し、第１の帯域の励起波長の光によって第１の生物学的サンプルを照射するステップと、第１のインフォーカス設定に従って蛍光顕微鏡を動作させ、蛍光顕微鏡のイメージセンサーを介して、第１の帯域の放出波長の光の第１のイメージを取得するステップ（３２０）と、第２の時間の期間の間に、第２の光源を使用し、第２の帯域の励起波長の光によって第１の生物学的サンプルを照射するステップと、第２のインフォーカス設定に従って蛍光顕微鏡を動作させ、イメージセンサーを介して、第２の帯域の放出波長の光の第２のイメージを取得するステップ（３２５）と、第３の時間の期間の間に、第３の光源を使用し、第３の帯域の励起波長の光によって第１の生物学的サンプルを照射するステップと、第３のインフォーカス設定に従って蛍光顕微鏡を動作させ、イメージセンサーを介して、第３の帯域の放出波長の光の第３のイメージを取得するステップ（３３０）とを含む。図１６に示されている方法３００は、たとえば、図２のコンピューティングデバイス２００とともに使用され得る方法の例を表している。いくつかの場合において、システムのコンポーネントは、機能を実施するように構成され得、コンポーネントが、そのような実施を可能にするためのハードウェアおよび／またはソフトウェアを備えて構成および構造化されるようになっている。システムのコンポーネントは、たとえば、特定の様式で動作されるときなどに、機能を実施するために適合されるように、機能を実施することができるように、または、機能を実施するのに適した状態になるように配置され得る。方法３００は、ブロック３０５～３３０のうちの１つまたは複数によって図示されているような１つまたは複数の動作、機能、または作用を含むことが可能である。ブロックはシーケンシャルな順序で図示されているが、これらのブロックのうちのいくつかは、並列に、および／または、本明細書で説明されているものとは異なる順序でも実施され得る。また、さまざまなブロックが、所望の実装形態に基づいて、より少ないブロックへと組み合わせられ、追加的なブロックへと分割され、および／または、除去され得る。

本明細書で開示されているこのおよび他のプロセスおよび方法に関して、フローチャートは、本例の１つの可能な実装形態の機能性および動作を示しているということが理解されるべきである。この点において、それぞれのブロックは、プログラムコードのモジュール、セグメント、または一部分を表すことが可能であり、それは、プロセスにおける特定の論理機能またはステップを実装するためにプロセッサーによって実行可能な１つまたは複数の命令を含む。プログラムコードは、任意のタイプのコンピューター可読媒体またはデータストレージ（たとえば、ディスクまたはハードドライブを含むストレージデバイスなど）の上に記憶され得る。さらに、プログラムコードは、機械可読フォーマットでコンピューター可読のストレージ媒体の上にコード化され得、または、他の非一時的な媒体もしくは製造の物品の上にコード化され得る。コンピューター可読媒体は、非一時的なコンピューター可読媒体またはメモリー、たとえば、短い時間の期間にわたってデータを記憶するコンピューター可読媒体など、たとえば、レジスターメモリー、プロセッサーキャッシュ、およびランダムアクセスメモリー（ＲＡＭ）などを含むことが可能である。また、コンピューター可読媒体は、非一時的な媒体、たとえば、リードオンリーメモリー（ＲＯＭ）、光学ディスクまたは磁気ディスク、コンパクトディスクリードオンリーメモリー（ＣＤ－ＲＯＭ）のような、二次的なまたは永続的な長期ストレージなどを含むことが可能である。また、コンピューター可読媒体は、任意の他の揮発性のまたは不揮発性のストレージシステムであることが可能である。コンピューター可読媒体は、たとえば、有形のコンピューター可読のストレージ媒体であると考えられ得る。

加えて、図１６の中の、ならびに、本明細書で開示されている他のプロセスおよび方法の中のそれぞれのブロックは、プロセスにおける特定の論理機能を果たすようにワイヤー接続されている回路を表すことが可能である。当業者によって合理的に理解されることとなるように、関与する機能性に応じて、実質的に同時のまたは逆の順序を含む、示されているかまたは議論されているものから異なる順序で機能が実行され得る、代替的な実装形態は、本開示の例の範囲の中に含まれる。

ＩＩＩ．例示的な光学モジュール
図３～図５および図１３は、イメージセンサー１２０を使用して生細胞生物学的サンプル１３０の中のフルオロフォアをイメージングするための光学モジュール１１０のさまざまな構成および実施形態を簡略図で示している。光学モジュール１１０は、フィルター、発光体、および、他の要素を含み、それらは、少なくとも３つの異なる帯域の励起波長で、独立して制御可能な励起光を提供し、少なくとも３つの対応する帯域の放出波長で光を通過させるように構成されている（図３、図４、および図５は、３色構成を示しており、図１３は、４色の構成を示している）。また、光学モジュール１１０は、イメージセンサー１２０によってイメージングされることとなるサンプル１３０を通過した、および／または、サンプル１３０によって散乱された、位相ランプ１２５（または、他の透過照明光源）からの光を通すように構成されている。

光学モジュール１１０は、第１の光源１３５を含み、第１の光源１３５は、第１の帯域の励起波長で第１の光を放出するように構成されている。第１のフィルター１３６が、第１の光源１３５の第１の光学経路１３７の中に配置されている。第１のフィルター１３６は、１つまたは複数の波長の光を通し、１つまたは複数の他の波長の光を反射するように構成されている。光学モジュール１１０は、第２の光源１４０をさらに含み、第２の光源１４０は、第２の帯域の励起波長で第２の光を放出するように構成されている。第２のフィルター１４１が、第２の光源１４０の第２の光学経路１４２の中に配置されている。第２のフィルター１４１は、１つまたは複数の波長の光を通し、１つまたは複数の他の波長の光を反射するように構成されている。また、光学モジュール１１０は、第３の光源１４５を含み、第３の光源１４５は、第３の帯域の励起波長で第３の光を放出するように構成されている。第３のフィルター１４６は、第３の光源１４５の第３の光学経路１４７の中に配置されている。第３のフィルター１４６は、１つまたは複数の波長の光を通し、１つまたは複数の他の波長の光を反射するように構成されている。サンプル１３０に透過される励起光の方向、および／または、光学モジュール１１０を通してイメージセンサー１２０へ通されるイメージ光（たとえば、蛍光放出光、明視野、位相コントラスト、または、他の散乱および／もしくは透過されたイメージ光）の方向が、光学経路の上の矢印によって図の中に示されている。

フィルター１３６、１４１、１４６は、特定の帯域の波長の反射および／または吸収ならびに特定の他の帯域の波長の透過を促進させるようにさまざまな方式で構成されているさまざまな材料またはコンポーネントを含むことが可能である。たとえば、１３６、１４１、１４６は、ダイクロイックミラーであることが可能であり、ダイクロイックミラーは、多くの交互になった材料の層から構成されており、その組成、厚さ、および順序は、所望のパス帯域、ストップ帯域、反射帯域、または、他の波長選択的な光学的挙動を提供するために特定され得る。

光学モジュール１１０において、第１の光学経路１３７、第２の光学経路１４２、および、第３の光学経路１４７は、一次的透過光学経路１５０に沿って収束し、一次的透過光学経路１５０は、対物レンズ１６５を介して、生細胞生物学的サンプル１３０に向けて方向付けられるように構成されている。また、モジュールは、放出フィルター１５５を含み、放出フィルター１５５は、一次的放出光学経路１５６の中に位置付けされており、放出フィルター１５５は、光源１３４、１４０、１４５によって照射されることに応答して、生細胞生物学的サンプル１３０の中のフルオロフォアによって放出された光を通すように構成されており、また、位相ランプ１２５から放出される光の少なくともいくらかを通すように構成されている。一次的放出光学経路１５６は、イメージングセンサー１２０において終端する。放出フィルター１５５は、サンプル１３０の中のそれぞれの第１の、第２の、および第３のフルオロフォアを介して、光源１３４、１４０、１４５によって放出される第１の、第２の、および第３の励起波長に対応する、少なくとも第１の帯域、第２の帯域、および第３の帯域の放出波長の光を通すように構成されている。また、放出フィルター１５５は、位相ランプ１２５から放出される光の波長の少なくともいくらかを通すように構成されている。実際には、これは、位相ランプの光源の波長を、第１の、第２の、または第３の帯域の放出波長のうちの１つまたは複数にマッチさせることを含むことが可能である。

また、放出フィルター１５５は、第１の帯域、第２の帯域、および第３の帯域の励起波長の光を拒絶する（たとえば、反射する、吸収する）ように構成され得る。代替的に、他のフィルター１３６、１４１、１４６の反射作用は、光源１３５、１４０、１４５からの励起光がイメージセンサー１２０によって受け取られることを防止するために依存され得る。さらに、放出フィルター１５５は、また、生物学的サンプル１３０からの人工的な自家発光を反射するかもしくはその他の方法で拒絶し、および／または、生物学的サンプル１３０の中に存在し得る他の蛍光色素からの光を反射するように構成され得る。

光学モジュール１１０は、対物レンズ１６５またはイメージセンサー１２０のうちの一方または両方を含むことが可能であるということに留意されたい。代替的に、光学モジュール１１０は、対物レンズ１６５またはイメージセンサー１２０のうちの一方または両方に除去可能な連結されるように構成され得る。これは、たとえば、個々のスワップ可能な光学モジュールのコストを低減させるために行われ得る。

図３に示されている例示的な実装形態において、第１のフィルター１３６は、第１の帯域の励起波長の光を通し、第２の帯域および第３の帯域の励起波長の光、ならびに、第１の帯域、第２の帯域、および第３の帯域の放出波長の光、ならびに、位相ランプ１２５によって放出される所定の帯域の波長（それは、第１の、第２の、または第３の帯域の放出波長のうちの１つまたは複数とオーバーラップする可能性がある）の光を反射するように構成されている。第２のフィルター１４１は、第３の帯域の励起波長、ならびに、第１の帯域、第２の帯域、および第３の帯域の放出波長、ならびに、位相ランプ波長の光を通し、第２の帯域の励起波長の光を反射するように構成されている。第３のフィルター１４６は、第１の帯域、第２の帯域、および第３の帯域の放出波長、ならびに、位相ランプ波長の光を通し、第３の帯域の励起波長の光を反射するように構成されている。

図３に示されているように、第１の光源１３５、第２の光源１４０、および第３の光源１４５は、同じ平面の中に直列に配置されている。図３の中の要素の配置は、他の２つの寸法において（垂直方向において、ならびに、図３の平面の中および外へ）より小さい寸法を有しながら、１つの寸法において（図３の中の水平方向において）かなり長い光学モジュール１１０を結果として生じさせる。これは、いくつかの用途では望ましい可能性がある。しかし、いくつかの用途では、光学モジュール１１０の最大寸法を低減させること、ならびに／または、光学モジュール１１０の形状およびサイズを特定の形状および／もしくはサイズと一致させること（たとえば、インキュベーターの中に、または、自動化されたイメージングシステムのガントリーの上に、モジュールをフィットさせること）が有益である可能性がある。したがって、光学モジュール１１０の要素の配置は、たとえば、さまざまな光学経路を折り曲げ、入れ子にし、および／もしくは分岐させるために、ならびに／または、さまざまな光学経路の方向および／もしくは順序を変化させるために修正され得る。

図４に示されている別の例示的な実装形態において、第１のフィルター１３６は、第１の帯域および第２の帯域の励起波長の光を通し、第３の帯域の励起波長の光、ならびに、第１の帯域、第２の帯域、および第３の帯域の放出波長の光を反射するように構成されている。第２のフィルター１４１は、第２の帯域の励起波長の光を通し、第１の帯域の励起波長の光を反射するように構成されている。そして、第３のフィルター１４６は、第１の帯域、第２の帯域、および第３の帯域の放出波長の光を通し、第３の帯域の励起波長の光を反射するように構成されている。したがって、図４に示されている実装形態では、第１の光源１３５は、第１の光学経路１３７が第１の光源１３５において開始し、第２のフィルター１４１において反射し、第１のフィルター１３６を通過し、一次的透過光学経路１５０に沿って光学モジュール１１０を退出するように配置されている。第２の光源１４０は、第２の光学経路１４２が第２の光源１４０において開始し、第２のフィルター１４１を通過し、次いで、第１のフィルター１３６を通過し、一次的透過光学経路１５０に沿って光学モジュール１１０を退出するように配置されている。第３の光源１４５は、第３の光学経路１４７が第３の光源１４５において開始し、第３のフィルター１４６において第１のフィルター１３６へ反射し、第１のフィルター１３６において反射し、一次的透過光学経路１５０に沿って光学モジュール１１０を退出するように配置されている。生細胞生物学的サンプル１３０の中のフルオロフォアによって放出される光のための一次的放出光学経路１５６は、第１のフィルター１３６において反射し、第３のフィルター１４６を通過し、放出フィルター１５５を通過し、光学モジュール１１０を退出する。

図４の例示的な実装形態では、第２の光源１４０および第３の光源１４５は、互いに平行に配置されており、第１の光源１３５は、第２の光源１４０および第３の光源１４５に対して９０度の角度で配置されている。この配置は、ハウジング１１１の中に３つの光源を含む、よりコンパクトな光学モジュール１１０を可能にする。

図５に示されているさらに別の随意的な実装形態において、第１のフィルター１３６は、第１の帯域の励起波長の光を通すように構成されている。また、第１のフィルター１３６は、第２の帯域および第３の帯域の励起波長の光、ならびに、第１の帯域、第２の帯域、および第３の帯域の放出波長の光を反射するように構成されている。第２のフィルター１４１は、第１の帯域、第２の帯域、および第３の帯域の放出波長の光を通すように構成されている。また、第２のフィルター１４１は、第２の帯域および第３の帯域の励起波長の光を反射するように構成されている。そして、第３のフィルター１４６は、第３の帯域の励起波長の光を通すように構成されている。また、第３のフィルター１４６は、第２の帯域の励起波長の光を反射するように構成されている。

したがって、図５に示されている実装形態では、第１の光源１３５は、第１の光学経路１３７が第１の光源１３５において開始し、第１のフィルター１３６を通過し、一次的透過光学経路１５０に沿って光学モジュール１１０を退出するように配置されている。第２の光源１４０は、第２の光学経路１４２が第２の光源１４０において開始し、第３のフィルター１４６において第２のフィルター１４１へ反射し、第２のフィルター１４１において第１のフィルター１３６へ反射し、第１のフィルター１３６において反射し、一次的透過光学経路１５０に沿って光学モジュール１１０を退出するように配置されている。第３の光源１４５は、第３の光学経路１４７が第３の光源１４５において開始し、第３のフィルター１４６を通過して第２のフィルター１４１に向かい、第２のフィルター１４１において第１のフィルター１３６へ反射し、第１のフィルター１３６において反射し、一次的透過光学経路１５０に沿って光学モジュール１１０を退出するように配置されている。さらに、生細胞生物学的サンプル１３０の中のフルオロフォアによって光が放出される一次的放出光学経路１５６は、第１のフィルター１３６において反射し、第２のフィルター１４１を通過し、放出フィルター１５５を通過し、光学モジュール１１０を退出する。

図５に示されているように、第１の光源１３５および第３の光源１４５は、平行に配置されており、第２の光源１４０は、第１の光源１３５および第３の光源１４５に対して９０度の角度で配置されている。この配置は、ハウジング１１１の中に３つの光源を含む、よりコンパクトな光学モジュール１１０を可能にする。

図３～図５および本明細書の他の場所に示されている例示的な実装形態は、すべてが完全に同じ平面（すなわち、図の平面）の中にある光源光学経路を有する光学モジュールを示しているが、たとえば、光学モジュールの全体的なサイズを低減させるために、ならびに／または、光学モジュールの形状およびサイズを利用可能なスペースに（たとえば、ガントリーおよび／もしくは自動化されたインキュベーター内イメージング装置の中に）一致させるために、他の実施形態も可能であるということに留意されたい。

たとえば、図５に示されている実装形態の第２の光源１４０および第３のフィルター１４６は、図５の平面の中へ（または、そこから外へ）９０度（または、何らかの他の角度）回転させられ得る。そのような実装形態、および、その追加的な詳細が、図６～図１１にさらに図示されている。図６～図１１に図示されているように、第１の、第２の、および第３の光源１３５、１４０、１４５、第１の、第２の、および第３のフィルター１３６、１４１、１４６、ならびに、放出フィルター１５５は、すべてハウジング１１１の中に含まれている。ハウジング１１１は、第１の開口部１１２を含み、第１の開口部１１２は、生物学的サンプル１３０を照射するために一次的透過光学経路１５０が通過することを可能にするように配置されている。また、ハウジング１１１は、第２の開口部１１３を含み、第２の開口部１１３は、イメージングセンサー１２０に向けて一次的放出光学経路１５６が通過することを可能にするように配置されている。第１および第２の開口部１１２、１１３は、光学デバイス（たとえば、レンズ、フィルター、ミラーなど）および／またはセンサー表面を含むことが可能である。１つの随意的な例において、放出フィルター１５５が、第２の開口部１１３の中に配設され得る。図３～図８に示されている例示的な光学モジュール１１０では、ハウジング１１１は、垂直方向に延在する主本体部１１１ａと、そこから水平方向に延在する片持ち梁式の延長部１１１ｂとを含む。ハウジング１１１の主本体部１１１ａは、第１の光源１３５および第３の光源１４５を同じ平面の中に含む。そして、ハウジング１１１の片持ち梁式の延長部１１１ｂは、第２の光源１４０を含み、第２の光源１４０は、第１の光源１３５および第３の光源１４５に対して９０度の角度で配置されている。

換言すれば、第２の光源１４０および第３のフィルター１４６は、第３の光源１４５の中心を通る垂直方向軸線の周りに９０度回転されている。この配置は、第１および第３の光源１３５、１４５の平面の後ろに第２の光源１４０を設置し、第２の光学経路１４２が第３のフィルター１４６に方向付けられるようになっており、第３のフィルター１４６において、光が上向きに反射される。そのような配置は、スペースの限られた用途において特に有益である可能性がある。たとえば、先述の配置は、下記に説明されているような自動化されたインキュベーター内の組み合わされた落射蛍光および明視野／位相コントラストイメージングシステムの中への一体化のために、光学モジュールがコンパクトなままであることを可能にし、一方で、光学モジュールがユーザーによって容易にスワップ可能であることも可能にし、したがって、イメージングシステムの有用性および再構成可能性を拡張させる。

本明細書で議論されている光源１３５、１４０、１４５は、生物学的サンプル１３０に光を送るかまたは生物学的サンプル１３０を照射することができる任意のデバイスおよび／またはアッセンブリをそれぞれ含むことが可能である。例示的な光源は、１つまたは複数のランプおよび関連のオプティクスを含むことが可能である。例示的なランプは、なかでも、白熱（たとえば、ハロゲンまたはタングステンフィラメント）ランプ、アーク（たとえば、水銀、水銀－キセノン、またはキセノン）ランプ、発光ダイオード（「ＬＥＤ」）、および／またはレーザーを含むことが可能である。関連のオプティクス（「ソースオプティクス」）は、光ファイバーおよび／または液体光ガイド、１つまたは複数のレンズ、フィルター（たとえば、偏光または波長ベースのフィルターなど）、回折格子、ミラー、および／またはマスクなどを含むことが可能である。関連のオプティクスは、なかでも、サンプルに方向付けられる光の強度、波長、偏光、位相、方向、および／または形状を選択／調節することが可能である。１つの随意的な実装形態において、第１の光源１３５、第２の光源１４０、および、第３の光源１４５は、ＬＥＤ、（たとえば、光源から出力された光をコリメートするための、および／または、出力された光の焦点を対物レンズの無限焦点または他の焦点にマッチさせるための）少なくとも２つのレンズ、および、シングルバンドパスダイクロイックフィルターをそれぞれ含む。

光学モジュールの光源から放出される励起波長の第１の、第２の、第３の、および／または、追加的な帯域の特定の境界線は、用途に従って（たとえば、利用可能なフルオロフォアまたは関心対象の励起スペクトルに従って、適切なＬＥＤもしくは他の発光要素、および／または、関連のフィルター、ミラー、レンズ、対物レンズ、または、他の光学要素の利用可能性に従って）特定され得る。１つの随意的な実装形態において、第１の帯域の励起波長は、４５３ｎｍから４８５ｎｍの範囲にあり、対応するフルオロフォアが緑色（または、より長い波長）光を放出することを引き起こす青色光に大部分が対応している。第２の帯域の励起波長は、５４６ｎｍから５６８ｎｍの範囲にあり、対応するフルオロフォアがオレンジ色（または、より長い波長）光を放出することを引き起こすライム色光に大部分が対応している。そして、第３の帯域の励起波長は、６４８ｎｍから６７４ｎｍの範囲にあり、対応するフルオロフォアが近赤外線（ＮＩＲ）光を放出することを引き起こす赤色光に大部分が対応している。さらなる実装形態において、この随意的な実施形態の先述の範囲の境界は、＋／－３ｎｍだけ変化することが可能である。

別の随意的な実装形態において、第１の帯域の放出波長は、４９４ｎｍから５３３ｎｍの範囲にあり、緑色光に大部分が対応している。第２の帯域の放出波長は、５７６ｎｍから６３９ｎｍの範囲にあり、オレンジ色光に大部分が対応している。そして、第３の帯域の放出波長は、６８６ｎｍから７５６ｎｍの範囲にあり、ＮＩＲ光に大部分が対応している。さらなる実装形態において、先述の範囲の境界は、＋／－３ｎｍだけ変化することが可能である。

いくつかの例において、光学モジュール１１０は、第４の帯域の励起波長の第４の光を放出するように構成されている第４の光源１６０を含むことが可能である。そのような光学モジュール１１０の例示的な実装形態が、図１３に示されている。この実装形態における光学モジュール１１０は、第４の光源１６０の第４の光学経路１６２の中に配置されている第４のフィルター１６１も含む。第４のフィルター１６１は、１つまたは複数の波長の光を通し、１つまたは複数の波長の光を反射するように構成されている。そして、放出フィルター１５５は、第４の帯域の放出波長の光を通し、第４の帯域の励起波長の光を反射するようにさらに構成されている。第４の光源１６０を追加することは、生物学的サンプル１３０の中の第４のフルオロフォアを見るための能力を向上させ、また、異なる光源およびフィルターならびに対応する構成を備えた別個の光学モジュールに頼ることなく、さらに多くの数のアッセイを実行するための能力を向上させる。

図１３に示されている例示的な実装形態において、第１のフィルター１３６は、第１の帯域の励起波長の光を通し、第４の帯域の励起波長の光を反射するように構成されている。第２のフィルター１４１は、第１の帯域、第２の帯域、第３の帯域、および第４の帯域の放出波長の光を通し、第２の帯域および第３の帯域の励起波長の光を反射するように構成されている。第３のフィルター１４６は、第３の帯域の励起波長の光を通し、第２の帯域の励起波長の光を反射するように構成されている。そして、第４のフィルター１６１は、第１の帯域および第４の帯域の励起波長の光を通し、第２の帯域および第３の帯域の励起波長の光、ならびに、第１の帯域、第２の帯域、第３の帯域、および第４の帯域の放出波長の光を反射するように構成されている。

図１３に示されている例示的な実装形態において、第１の光源１３５は、第１の光学経路１３７が第１の光源１３５において開始し、第１のフィルター１３６を通過し、次いで、第４のフィルター１６１を通過し、一次的透過光学経路１５０に沿って光学モジュール１１０を退出するように配置されている。第２の光源１４０は、第２の光学経路１４２が第２の光源１４０において開始し、第３のフィルター１４６において第２のフィルター１４１へ反射し、第２のフィルター１４１において第４のフィルター１６１へ反射し、第４のフィルター１６１において反射し、一次的透過光学経路１５０に沿って光学モジュール１１０を退出するように配置されている。第３の光源１４５は、第３の光学経路１４７が第３の光源１４５において開始し、第３のフィルター１４６を通過して第２のフィルター１４１に向かい、第２のフィルター１４１において第４のフィルター１６１へ反射し、第４のフィルター１６１において反射し、一次的透過光学経路１５０に沿って光学モジュール１１０を退出するように配置されている。第４の光源１６０は、第４の光学経路１６２が第４の光源１６０において開始し、第１のフィルター１３６において反射し、第４のフィルター１６１を通過し、一次的透過光学経路１５０に沿って光学モジュール１１０を退出するように配置されている。そして、生細胞生物学的サンプル１３０の中のフルオロフォアによって放出される光のための一次的放出光学経路１５６は、第４のフィルター１６１において反射し、第２のフィルター１４１を通過し、放出フィルター１５５を通過し、光学モジュール１１０を退出する。図１３に示されているように、第１の光源１３５および第３の光源１４５は、互いに平行に配置されており、第２の光源１４０および第４の光源１６０は、第１の光源１３５および第３の光源１４５に対して９０度の角度でそれぞれ配置されている。この配置は、ハウジング１１１の中に４つの光源を含むコンパクトな光学モジュール１１０を可能にする。

そのような第４の帯域の放出波長は、４５３ｎｍよりも短い波長を含むことが可能であり、紫色光に大部分が対応することが可能であり、対応する第４の帯域の放出波長は、青色光に大部分が対応することが可能である。

ＩＶ．例示的なシステム
図１、図３、図４、図５、および図１３に示されている本開示の第２の態様において、生細胞生物学的サンプル１３０をアッセイするためのシステム１０５が提供される。システム１０５は、本開示の第１の態様による光学モジュール１１０を含む。また、システム１０５は、蛍光顕微鏡１１５を含み、蛍光顕微鏡１１５は、光学モジュール１１０を包含しており、光学モジュール１１０は蛍光顕微鏡１１５に除去可能に連結されている。蛍光顕微鏡１１５は、少なくとも１つの対物レンズ１６５を有している。システム１０５は、イメージングセンサー１２０をさらに含み、イメージングセンサー１２０は、生細胞生物学的サンプル１３０の中のフルオロフォアによって放出された光のために、および／または、対物レンズ１６５からサンプル１３０を通して透過されたおよび／またはサンプル１３０によって散乱された位相ランプ１２５（または、他の透過照明光源、たとえば、位相コントラストイメージングのためではなく明視野イメージングのための照明を提供するように構成されている光源）からの光のために、一次的放出光学経路の中に配置されている。そして、システム１０５は、位相ランプ１２５を含み、位相ランプ１２５は、蛍光顕微鏡１１５に除去可能に連結されており、一次的透過光学経路１５０の終端端部に配置されている。

本明細書で使用されているように、蛍光顕微鏡１１５は、小さな物体（たとえば、細胞、オルガネラ、組織、小さな有機体、粒子など）のイメージを拡大する任意の光学デバイスである。検出メカニズムによって実施される顕微鏡法の例示的なモードは、光学的顕微鏡法（たとえば、明視野、暗視野、位相コントラスト、微分干渉コントラスト（たとえば、Ｎｏｍａｒｓｋｉ、ＤＩＣ、およびＨｏｆｆｍａｎ Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ Ｃｏｎｔｒａｓｔなど）、蛍光、および／または、他の形態の可視光および／または不可視光（たとえば、ＩＲ、ＮＩＲ、紫外線）の顕微鏡法）を含む。対物レンズ１６５は、光学モジュール１１０と生物学的サンプル１３０との間に配置されており、一次的透過光学経路１５０および一次的放出光学経路１５６が対物レンズ１６５を通過するようになっている。

イメージングセンサー１２０は、光を検出するように構成されており、カメラ、マルチチャネル光検出器、平面フーリエキャプチャーアレイ、シングルピクセルイメージャー、または、いくつかの他のイメージ発生装置を含むことが可能である。イメージングセンサー１２０は、所定の範囲の波長における光を検出するように構成または動作され得る。たとえば、イメージングセンサー１２０は、生物学的サンプル１３０の中の蛍光色素または他のフルオロフォアの放出スペクトルに対応する複数の波長／波長範囲における光を検出するように構成または動作される。たとえば、これらの波長は、サンプルの中の複数のフルオロフォアの放出スペクトルの中のピークに対応し、および／または、広い波長範囲にわたって延在することが可能である。これは、モノクロイメージングセンサーであるイメージングセンサー１２０を含むことが可能であり、それは、放出スペクトルのそれぞれにおける光の波長、および／または、位相ランプもしくは他の透過照明源によって放出される光の波長に敏感である。さらに、イメージングセンサー１２０は、なかでも、蛍光強度（ＦＬＩＮＴ）、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、蛍光寿命（ＦＬＴ）、蛍光相関関係（ＦＣＳ）、光退色後蛍光回復（ＦＲＡＰ）、ならびに、それらの燐光および他の類似物を含む、任意の適切なフォトルミネッセンスを測定するように構成され得る。

図６～図８および図１１～図１２に示されている１つの随意的な実装形態において、システム１０５は、光学モジュール１１０を通って延在するシャフト１７０を含む。ここで、蛍光顕微鏡１１５は、シャフト１７０を第１の配向で受け入れるように構成されている受容部（図示せず）を有している。そして、シャフト１７０は、力の印加の下で第２の配向に回転し、それによって、光学モジュール１１０を蛍光顕微鏡１１５の残りの部分に（たとえば、蛍光顕微鏡１１５のハウジングまたは他の要素に）ロックするように構成されている。たとえば、シャフト１７０は、第１の端部１７２に連結されているフリップタブ１７１を有することが可能であり、また、突出部１７３を有することが可能であり、突出部１７３は、第２の端部１７４に連結されており、それによって、Ｔ字形状を形成している。蛍光顕微鏡１１５は、Ｔ字形状の突出部１７３を第１の配向で受け入れるように構成された対応するスロット（図示せず）および受容部を有することが可能である。フリップタブ１７１への力の印加の下でシャフトが第２の配向に回転するとき、Ｔ字形状の突出部１７３は、受容部の中で回転し、Ｔ字形状突出部１７３がスロットに対立した状態になり、それによって、光学モジュール１１０を蛍光顕微鏡１１５にロックするようになっている。光学モジュール１１０が蛍光顕微鏡１１５の残りの部分に連結されると、フリップタブ１７１は、ハウジング１１１に対して平坦に折り畳まれ得る。

さらなる実装形態において、シャフト１７０が挿入されると、ロッキング方向へのシャフト１７０の回転は、突出部１７３が傾斜部に沿って乗ることを引き起こし、それら、シャフト１７０および光学モジュール１１０を、システム１０５の残りの部分のためのマウントの上に引っ張る。柔軟な要素（たとえば、スプリング１８９）が、シャフト１７０とオプティクスモジュール１１０のハウジング１１１との間に配置され、オプティクスモジュール１１０をマウントの上に引っ張る力を制御することが可能である。加えて、戻り止めは、シャフト１７０がロック位置およびアンロック位置にあるときに、触覚フィードバックを提供することが可能である。

図４に示されている別の随意的な実装形態において、システム１０５は、光学モジュール１１０に連結されている第１の電気コネクター１７５を含む。システム１０５は、蛍光顕微鏡１１５の残りの部分に連結されている第２の電気コネクター（図示せず）を含む。第２の電気コネクターは、第１の電気コネクター１７５と相互的になっている。そして、システム１０５は、第２の電気コネクターと電気的に通信しているプロセッサー２０２を含む。プロセッサー２０２は、蛍光顕微鏡１１５の残りの部分に連結されている光学モジュール１１０を識別するように構成されている。第１および第２の電気コネクター１７５は、たとえば、ユーザーが蛍光顕微鏡１１５の異なる光学モジュールをスワップすることをより容易にするために、接続および切り離すために特定の力よりも小さい力を必要とするように選択され得る。

スワップ可能な位相ランプモジュール１２５は、ハウジング１２６、透過照明光源１２７（たとえば、ハロゲンランプ、ＬＥＤ）、および、少なくとも１つの集光レンズを含み、集光レンズは、位相ランプモジュール１２５からの光を生物学的サンプル１３０の上に上方から集束させる。図１４～図１５に示されているさらに別の随意的な実装形態において、位相ランプモジュール１２５は、第３の電気コネクター１７７を有しており、第３の電気コネクター１７７は、第４の電気コネクター（図示せず）に対応しており、第４の電気コネクターは、蛍光顕微鏡１１５の残りの部分に（たとえば、第２の電気コネクターが連結されている同じハウジングに）連結されている。第３の電気コネクター１７７は、第４の電気コネクターと相互的になっている。プロセッサー２０２は、光学モジュール１１０および位相ランプモジュール１２５が互換性があるかどうかを決定するように構成されており、それらが互換性がないという決定に応答して、警告を表示させるように構成されている。そのような決定は、利用可能な光学モジュール１１０と利用可能な位相ランプモジュール１２５との間の有効な対応関係の記録を含むデータベースの中のルックアップを実施することによって行われ得る。追加的にまたは代替的に、そのような決定は、位相ランプモジュール１２５によって放出される光の波長のセットを、光学モジュール１１０がサンプル１３０からイメージングセンサー１２０へ通すように構成されている光の波長のセットと比較することによって行われ得る。

位相ランプモジュール１２５のハウジング１２６は、突出部１２８を含み、突出部１２８は、システム１０５の位相ランプマウント１８５の中の対応する受容部１８６の中へ受け入れられるように形状決めされている。突出部１２８および受容部１８６は、位相ランプモジュール１２５が単一の配向でのみ据え付けられ得るように形状決めされている。スクリューによって固定されるのではなく、位相ランプモジュール１２５は、戻り止め１８７によって適切な場所に保持される。戻り止め１８７は、ハウジング１２６の突出部１２８の中の溝部１２９と整合するように構成されている位相ランプマウント１８５の中のスプリング荷重式のボール１８８の形態になっている。

図１に示されている１つの随意的な実装形態において、システム１０５は、インキュベーター１８０を含み、インキュベーター１８０は、３０℃から４２℃の範囲にある温度において、および、８０％から１００％の範囲にある相対湿度において、生細胞生物学的サンプル１３０を維持するように構成されている。この実装形態では、本開示の第１の態様による蛍光顕微鏡１１５は、インキュベーター１８０のチャンバーに連結されている。別の実装形態では、蛍光顕微鏡１１５は、部分的にまたは全体的にインキュベーター１８０の中に含まれ得る。たとえば、蛍光顕微鏡１１５は、連続的な培養の間に（たとえば、数時間、数日、または数週間の特定の期間にわたって）生物学的サンプル１３０の微速度撮影試験のための標準的なＣＯ_２インキュベーターの中に全体的に配設され得る。インキュベーション時間の長さに起因して、蛍光顕微鏡１１５は、生物学的サンプル１３０に悪影響を与えることを回避するために、細胞培養の間にインキュベーターの中に留まることが可能である。加えて、蛍光顕微鏡１１５のコンパクトなプロファイルは、蛍光顕微鏡１１５の周りのオープンスペースに他の生物学的サンプル１３０を設置するために、インキュベーター１８０の機能性を維持する。また、蛍光顕微鏡１１５のコンパクトなプロファイルは、蛍光顕微鏡１１５または生物学的サンプル１３０に対して結露および不適正な通気の形態の有害な影響を有する可能性のある空気フロー制限を低減させる。

第３の光源１４５（および、第４の光源１６０）は、生物学的サンプル１３０に対する多重化アッセイを可能にし、インキュベーター１８０の中の個々のサンプル（たとえば、サンプルウェル）の中で、および／または、同じインキュベーター１８０の中の異なるサンプルのセットの中で、複数のアッセイおよび／または蛍光インジケーターを実行する。

Ｖ．例示的な方法
ここで図１６を参照すると、生細胞生物学的サンプルの中のフルオロフォアをイメージングするために、図３～図１５の光学モジュール１１０およびシステム１０５、ならびに、図１～図２のコンピューティングデバイス２００を利用することができる方法３００が図示されている。方法３００は、ブロック３０５において、第１の生物学的サンプルおよび蛍光顕微鏡を整合させるステップであって、第１の生物学的サンプルが蛍光顕微鏡の視野の中に位置付けされるようになっており、第１の生物学的サンプルは、（ｉ）第１の帯域の励起波長の光による照射に応答して第１の帯域の放出波長の光を放出する第１のフルオロフォア、（ｉｉ）第２の帯域の励起波長の光による照射に応答して第２の帯域の放出波長の光を放出する第２のフルオロフォア、および、（ｉｉｉ）第３の帯域の励起波長の光による照射に応答して第３の帯域の放出波長の光を放出する第３のフルオロフォアを含む、ステップを含む。次いで、ブロック３１０において、方法は、蛍光顕微鏡を使用して第１の生物学的サンプルの１セットのイメージを取得するステップであって、１セットのイメージのイメージ同士は、フォーカス設定に関して異なっている、ステップを含む。次に、ブロック３１５において、方法３００は、１セットのイメージに基づいて、第１の、第２の、および第３の帯域の放出波長に関する第１の、第２の、および第３のインフォーカス設定をそれぞれ決定するステップを含む。そして、ブロック３２０において、方法は、第１の時間の期間の間に、第１の光源を使用し、第１の帯域の励起波長の光によって第１の生物学的サンプルを照射するステップと、第１のインフォーカス設定に従って蛍光顕微鏡を動作させ、蛍光顕微鏡のイメージセンサーを介して、第１の帯域の放出波長の光の第１のイメージを取得するステップとを含む。また、方法３００は、ブロック３２５において、第２の時間の期間の間に、第２の光源を使用し、第２の帯域の励起波長の光によって第１の生物学的サンプルを照射するステップと、第２のインフォーカス設定に従って蛍光顕微鏡を動作させ、イメージセンサーを介して、第２の帯域の放出波長の光の第２のイメージを取得するステップとを含む。また、方法３００は、ブロック３３０において、第３の時間の期間の間に、第３の光源を使用し、第３の帯域の励起波長の光によって第１の生物学的サンプルを照射するステップと、第３のインフォーカス設定に従って蛍光顕微鏡を動作させ、イメージセンサーを介して、第３の帯域の放出波長の光の第３のイメージを取得するステップとを含む。先述のステップのすべては、プロセッサー２０２によって自動的に実施され得る。

特定の色に関する特定の蛍光イメージを取得することは、異なる露出時間を使用して特定の色の複数の異なるイメージを発生させるように、イメージングシステムを動作させることを含むことが可能である。これは、高ダイナミックレンジイメージの合成発生を可能にするように行われ得る。これは、関心のフルオロフォア濃度／活性の範囲にわたって蛍光放出の強度において非常に高い変動を示すフルオロフォア／サンプル／アッセイに関して行われ得る。

方法３００は、位相ランプ（たとえば、１２５）または他の透過照明光源を動作させることによって、１つもしくは複数の明視野、位相コントラスト、または、他の非蛍光イメージを取得するステップを追加的に含むことが可能である。次いで、そのような非蛍光イメージ情報は、（たとえば、細胞タイプにかかわらず、サンプルの中の細胞の場所、形状、サイズ、および／または範囲を識別するために、位相コントラスト画像を使用して、次いで、位相コントラスト画像を使用して識別された細胞についての細胞タイプ、細胞分裂の局面、細胞健康状態、細胞代謝活性、または他の情報を決定するために、１つまたは複数の蛍光イメージを使用して）蛍光イメージと組み合わせて使用されるか、または、それ自身で使用され得る。

さらに、方法３００は、方法３００を使用して取得される３つの（または、それ以上の）蛍光イメージのためのインフォーカス設定を決定するために、異なるフォーカス設定の所定の範囲にわたって（たとえば、異なる対物レンズ－サンプル距離の所定の範囲にわたって）明視野、位相コントラスト、または、他の非蛍光イメージのセットを取得するステップを含むことが可能である。これは、非蛍光イメージを発生させるために使用される照射の波長のためのインフォーカス設定を決定し、次いで、そのインフォーカス設定から、イメージングされる蛍光放出波長のそれぞれに関して既知のオフセット（たとえば、距離オフセット）を適用し、それらの放出波長に関するインフォーカス設定を決定するステップを含むことが可能である。非蛍光イメージを発生させるために使用される照射の波長が蛍光放出波長のうちの１つと同じであるかまたは実質的に同じである場合、オフセットはゼロになることが可能である。明視野イメージまたは他の非蛍光イメージは、蛍光イメージと比較したときに、同じ露出時間に関して著しく多いイメージデータを含むことが多く、したがって、インフォーカス設定を決定するこの方法は、有利には、そのようなインフォーカス設定を発生させるために必要とされる時間を低減させることが可能である。また、これは、そのようなインフォーカス設定を発生させるために、サンプルが経験する光退色の量を低減させることが可能である。

実際には、より短い波長によって励起されるフルオロフォアのイメージは、より長い波長によって励起されるフルオロフォアから放出された光に関係付けられるアーチファクトを含むことが可能であり、その逆もまた同様である。また、１つの例として、第１の帯域の波長に対応するフルオロフォアは、（特に、第２および第３の帯域の波長が、第１の帯域の波長よりも短い波長を含む場合には）第２および第３の帯域の波長によってある程度励起され得る。同様に、第２の帯域の波長に対応するフルオロフォアは、また、第１および第３の帯域の波長によってある程度励起され得、一方では、第３の帯域の波長に対応するフルオロフォアは、また、第１および第２の帯域の波長によってある程度励起され得る。

アーチファクト問題に対処するために、１つの随意的な実装形態において、方法３００は、第２のフルオロフォアおよび第３のフルオロフォアによって放出される光からのアーチファクトを低減させるために、第１のセットのイメージに基づいて、第１のフルオロフォアによって放出される光の第１のイメージを発生させるイメージングセンサー１２０（または、いくつかの他のコンピューティングデバイス）と電気的に通信しているプロセッサー２０２をさらに含む。プロセッサー２０２は、第１のフルオロフォアおよび第３のフルオロフォアによって放出される光からのアーチファクトを低減させるために、第２のセットのイメージに基づいて、第２のフルオロフォアによって放出される光の第２のイメージを追加的に発生させる。さらに、プロセッサー２０２は、第１のフルオロフォアおよび第２のフルオロフォアによって放出される光からのアーチファクトを低減させるために、第３のセットのイメージに基づいて、第３のフルオロフォアによって放出される光の第３のイメージを発生させることが可能である。このスペクトル非混合プロセスは、２０１９年２月１日に出願された米国特許出願第１６／２６４８１９号に、２つの励起波長に関して、より詳細に説明されており、その文献は、参照により本明細書に組み込まれている。

１つの非限定的な例において、緑色フルオロフォアから放出される光が焦点に合うように、生物学的サンプル１３０が第１のインフォーカス設定で配置されているときに、第１のイメージは、緑色フルオロフォアに対応する青色の励起波長における光によって生物学的サンプル１３０を照射することによって、緑色フルオロフォアに関して取得され得る。具体的には、「インフォーカス設定」は、緑色フルオロフォア放出光が焦点の合った状態でイメージングされるように、生物学的サンプル１３０と蛍光顕微鏡１１５の対物レンズ１６５との間の距離を設定することによって起こる。また、この第１のイメージは、生物学的サンプル１３０の中のオレンジ色フルオロフォア（ライム色励起波長における光によって主に励起されるが、青色光によってもある程度励起される）およびＮＩＲフルオロフォア（赤色励起波長における光によって主に励起されるが、青色光によってもある程度励起される）から放出される光を含むことが可能である。オレンジ色フルオロフォアおよびＮＩＲフルオロフォアから放出される光は、第１のイメージにおいて焦点の合っていない状態になることとなるということに留意されたい。これは、サンプル１３０とイメージングセンサー１２０との間の一次的放出光学経路１５６に沿った要素（たとえば、対物レンズ、チューブレンズ、サンプルの光学的特性、および／または、サンプルを含むコンテナの光学的特性）によって引き起こされる色収差に起因している。

次いで、アーチファクトイメージが、第１のイメージから除去され、オレンジ色フルオロフォアおよびＮＩＲフルオロフォアからのアーチファクト光を除去することが可能である。上記に述べられているように、１つのアーチファクトイメージは、第１のイメージを取得するために使用される第１のインフォーカス設定において、オレンジ色フルオロフォアに対応するライム色励起波長における光によって生物学的サンプル１３０を照射することによって取得され得る。別のアーチファクトイメージは、第１のイメージを取得するために使用される第１のインフォーカス設定において、赤色フルオロフォアに対応する赤色励起波長における光によって生物学的サンプル１３０を照射することによって取得され得る。代替的に、アーチファクトイメージは、オレンジ色フルオロフォアおよび赤色フルオロフォアのインフォーカスイメージをぼやけさせることによって取得され得るか、または、そうでなければ、別のフォーカス設定を使用して撮影されるイメージにおいて第１のイメージを取得するために使用されるフォーカス設定の効果をシミュレートするために何らかのイメージ処理技法を適用することによって取得され得る。たとえば、オレンジ色フルオロフォアおよびＮＩＲフルオロフォアから放出された光が焦点の合った状態で別個にイメージングされるように、インフォーカス設定を使用して撮影されたイメージである。

１つの随意的な実装形態において、方法３００は、第１のセットのイメージデータ、第２のセットのイメージデータ、および、第３のセットのイメージデータを取得するときに、３０℃から４２℃の範囲にある温度において、および、８０％から１００％の範囲にある相対湿度において、少なくとも第１の生物学的サンプルを維持する蛍光顕微鏡を含むかまたはそれにその他の方法で連結されているインキュベーターをさらに含む。このデータは、連続的な培養の間に（たとえば、関心の実験に応じて、数分、数時間、数日、または数週間の期間にわたって）生物学的サンプル１３０の微速度撮影試験のための標準的なＣＯ_２インキュベーターの中で取得され得る。たとえば、イメージは、培養の全体を通して時間の経過とともに撮影され得、培養は、１４日よりも長いか、または、３０日と同じかもしくはそれよりも長い。

方法３００は、システム（たとえば、明視野イメージ、位相コントラストイメージ）を使用して取得される蛍光イメージおよび／または他のイメージに対して何らかの追加的な分析を実施するステップを含むことが可能である。たとえば、イメージのうちの１つ（または、それ以上）が、特定のサンプルにおいて、１つまたは複数の特定のタイプの細胞に特有のフルオロフォアの色に対応している場合、方法３００は、イメージを分析し、サンプルの中に存在している１つまたは複数の特定のタイプの細胞について、数、形状、サイズ、分布、相互接続のパターン、または、他の情報を決定するステップを含むことが可能である。そのような識別は、位相コントラストまたは他の非蛍光イメージの使用によって増強され、タイプにかかわらず、サンプルの中の個々の細胞場所、形状、および範囲を識別することが可能である。追加的にまたは代替的に、イメージのうちの１つ（または、それ以上）が、特定のアッセイ（たとえば、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ ＮＩＲアッセイ、２色または３色ＦＵＣＣＩ細胞分裂局面アッセイ）の蛍光インジケーターに対応している場合、方法３００は、イメージを分析し、特定のアッセイの出力を発生させ、たとえば、サンプルの中の１つまたは複数の細胞の健康状態、細胞分裂の局面、または、他の代謝状態もしくはステータスを決定するステップを含むことが可能である。異なる（または、オーバーラップしている）イメージの異なる分析の結果が組み合わせられ得、たとえば、第１のイメージ分析（細胞特有のフルオロフォアに対応する）は、関心の細胞タイプの細胞を識別するために使用され得、組み合わせられた第２および第３のイメージ分析は、識別された細胞に関する２色アッセイ（たとえば、２色ＦＵＣＣＩアッセイ）の出力を決定することが可能である。分析は、（たとえば、同じアッセイ／蛍光インジケーター／色素を含むサンプルのすべてに起因して）インキュベーターの中のイメージングシステムによってイメージングされるすべてのサンプルに関して同じであることが可能であり、または、インキュベーターの中のサンプルごとに異なることが可能である。

１つの随意的な実装形態において、方法３００は、第１のセットのイメージに基づいて第１の生物学的サンプルの中の第１の細胞タイプを識別するプロセッサー２０２をさらに含む。次いで、プロセッサー２０２は、第２のセットのイメージに基づいて、第１の生物学的サンプルの中の第２の細胞タイプを識別する。次に、プロセッサー２０２は、第３のセットのイメージに基づいて、第１の生物学的サンプルの中の細胞死または何らかの他の代謝プロセスもしくは特性を識別する。これは、光学モジュール１１０の構成を変化させることなく、複雑なアッセイおよび／または複数のアッセイがシステム１０５の中の単一の容器の中で実行されることを可能にする技術的効果を有している。

１つの随意的な実装形態において、位相コントラスト、明視野、または、他の非蛍光イメージは、第１の、第２の、および第３のインフォーカス設定において取得され得る。これらのイメージは、第１の、第２の、および第３のイメージからさらなるアーチファクトを除去するために（たとえば、自家発光に起因するアーチファクトを除去するために）利用され得、または、（たとえば、蛍光イメージを増強するために追加的な高空間周波数イメージデータを提供することによって）第１の、第２の、および第３のイメージをその他の方法で改善するために利用され得る。

１つの随意的な実装形態において、方法３００は、また、プロセッサーが光学モジュール１１０および位相ランプモジュールに関する互換性情報を受け取ることを含む。次いで、プロセッサー２０２は、互換性情報に基づいて、光学モジュール１１０および位相ランプ１２５が互換性があるかどうかを決定する。次に、光学モジュール１１０および位相ランプ１２５は互換性がないという決定に応答して、プロセッサー２０２は、非互換性のインディケーションとともに警告を表示させる。そのような互換性決定は、利用可能な光学モジュール１１０と利用可能な位相ランプモジュール１２５との間の有効な対応関係の記録を含むデータベースの中のルックアップを実施することによって行われ得る。追加的にまたは代替的に、そのような決定は、位相ランプモジュール１２５によって放出される光の波長のセットを、光学モジュール１１０がサンプル１３０からイメージングセンサー１２０へ通すように構成されている光の波長のセットと比較することによって行われ得る。

１つの随意的な実装形態において、方法３００は、光学モジュール１１０を通して蛍光顕微鏡１１５の中の受容部までシャフト１７０を第１の配向で延在させるステップを含む。次いで、シャフト１７０は、力の印加の下で回転され、シャフト１７０が第２の配向に移動するようになっており、それによって、システム１０５に関して上記に詳細に説明されているように、光学モジュール１１０を蛍光顕微鏡１１５に連結する。

先述の方法３００は、光学モジュール１１０の構成を変化させることなく、システム１０５の中の個々の容器においてまたは複数の容器にわたって実行され得るアッセイの変動性の増加を可能にする技術的効果を有している。方法３００は、本明細書で説明されている蛍光イメージャー、光学モジュール、位相ランプモジュール、インキュベーター、自動化されたイメージングシステム、または、他のシステム、デバイス、もしくはコンポーネントの実施形態のいずれかによって、または、それと組み合わせて実施され得る。したがって、インキュベーターの中の個々のサンプルにおける、および／または、インキュベーターの中の異なるサンプルにわたる、さまざまなアッセイ、蛍光インジケーター、および、それらの組み合わせは、本明細書で説明されている実施形態によって可能にされる。そのような用途の複数の例が、下記に提供されている。これらの用途は、例示目的の実施形態として意図しており、限定するものであることを意図していない。追加的なまたは代替的な用途が、予想され、同様に、そのような用途および／または下記に説明されている用途の追加的なまたは代替的な組み合わせが予想される。

上記に議論されているように、非一時的なコンピューター可読媒体は、プログラム命令をその上に記憶しており、プログラム命令は、プロセッサー２０２によって実行されるときに、本明細書で説明されている方法のいずれかの実施を引き起こすために利用され得る。

ＶＩ．例示的な生物学的な用途
上記に説明されている実施形態は、３つの異なる蛍光チャネルの独立したイメージングを提供することによって、蛍光イメージングにおけるさまざまな用途を可能にする。追加的な蛍光チャネルの利点は、追加的なアッセイが（たとえば、単一のインキュベーターの中で）単一の装置を使用して同時に実施されることを可能にすることによって、異なるサンプルにわたる実験的な読み出しにおけるフレキシビリティーを提供することによって、および／または、追加的なアッセイが個々のサンプルから実施されることを可能にすることによって、単一のイメージング装置のスループットを改善することを含むことが可能である。また、３色（または、それ以上）イメージングの利用可能性は、試薬選択におけるフレキシビリティーの増加を可能にすることができる（たとえば、緑色蛍光タンパク質ベースのレポーターを発現する細胞をモニタリングしながら追加的な情報を得るために複数の試薬を使用する能力）。

追加的にまたは代替的に、同時の３色（または、それ以上）イメージングは、２色のみ使用して発生されることができなかった情報が発生されることを可能にすることができる。たとえば、３色レポーター（たとえば、３色ＦＵＣＣＩアッセイ）からの情報が発生され得る。別の例において、複数の細胞タイプの増殖および相互作用についての情報、ならびに、細胞母集団にわたる代謝情報または細胞死情報についての情報が発生させられ得る。そのような情報は、ターゲット細胞を破壊する際のエフェクター細胞の活性に対する実験的な条件の影響、または、たとえば、癌細胞と間質細胞との間の代謝交換への追加的な洞察を可能にすることができる。

さらに、３色（または、それ以上）イメージングは、より信頼性の高い様式での実験的なデータの発生を可能にすることができる。たとえば、単一のサンプルにおいて複数の読み出しを多重化することは、読み出し間において観察される差異が科学的に有効であり、並列に実行されるアッセイの間の実験的な変動（たとえば、細胞プレーティング）に起因するものではないということについての信頼性の増加を提供することが可能である。

例１：２色ＦＵＣＣＩ＋細胞死
本明細書で説明されている光学モジュール１１０、システム１０５、および方法３００のさまざまな実装形態が、有利には、単一のサンプルにおいて２色の細胞周期（たとえば、緑色／オレンジ色ＦＵＣＣＩ）観察および細胞死分析を実行するために使用され得る。細胞周期およびアポトーシスの読み出しは、たとえば、癌細胞の中の化合物の濃度差依存性のおよび時間依存性の効果を実証することが可能である。別の例では、癌細胞に対する、および／または、サンプルの中の細胞のいくつかの他の母集団に対する、ターゲットにされた癌細胞の免疫細胞キリングの影響を観察するために、２色の細胞周期観察および細胞死分析が、免疫細胞および癌細胞を含むサンプルにおいて実施され得る。単一のサンプルにおけるこれらの２つの読み出しを多重化することは、スループットを増加させ、また、２つの読み出しの間の差が科学的に有効であり、並列のアッセイの間の実験的な変動に起因するものではないという信頼性を提供する。

２色ＦＵＣＣＩ分析に関して、本開示の３色光学モジュールは、２つの異なる蛍光タンパク質の位相依存性の発現に基づいて、さまざまな細胞周期局面の間の区別を可能にする。たとえば、Ｓ期、Ｇ２期、およびＭ期の間に、細胞は、３色光学モジュールを使用して検出され得るＴａｇＧＦＰ２（緑色フルオロフォア）の発現を介して、緑色蛍光を放出することが可能である。Ｇ１期の間に、および、Ｓ期への移行期の間に、細胞は、３色光学モジュールを使用して検出され得るＴａｇＲＦＰ（５５５ｎｍおよび５８４ｎｍにおいて励起／放出極大をそれぞれ有する明るい蛍光を持つオレンジ色蛍光タンパク質）の発現を介して、オレンジ色蛍光を放出することが可能である。この２色ＦＵＣＣＩアッセイでは、細胞は、有糸分裂の直後に続く無色期間を通って移行する。結果として、細胞周期局面は、蛍光フットプリント（たとえば、Ｓ期、Ｇ２期、およびＭ期：緑色；Ｇ１期：オレンジ色、Ｇ１／Ｓ移行期：オレンジ色および緑色の両方；Ｍ／Ｇ１移行期：無色（蛍光なし））を有している。次いで、第３の色が、蛍光細胞死読み出し（たとえば、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ ＮＩＲアポトーシスインジケーター）をイメージングするために使用され得る。

例２：３色ＦＵＣＣＩ
本明細書で説明されている光学モジュール１１０、システム１０５、および方法３００のさまざまな実装形態が、細胞周期の中の追加的な期を独立して観察する３色ＦＵＣＣＩアッセイを有利に実行するために使用され得る。以前に説明された２色細胞周期アッセイとは異なり、３色アッセイは、Ｓ期とＧ２期との間の区別を可能にし、また、有益には、ターゲットにされたユビキチン化ドメインまたは他の細胞期関係のターゲットに融合された蛍光タンパク質のための遺伝子の適当な遺伝子発現によって、無色期を結果として生じさせない。たとえば、Ｓ期、Ｇ２期、およびＭ期の間に、細胞は、３色光学モジュールを使用して検出され得るＴａｇＧＦＰ２の発現に基づいて、緑色蛍光をそれぞれ放出することが可能であり、より暗い蛍光が、Ｓ期に観察される。そして、異なる蛍光マーカーが、細胞周期の他の段階を識別するために使用され得、それは、ＴａｇＲＦＰおよびｉＲＦＰ７１３を含むが、それ限定されない。Ｇ１期およびＳ期の間に、ＴａｇＲＦＰを発現する細胞は、３色光学モジュールを使用して検出され得るオレンジ色蛍光を放出する。ｉＲＦＰ７１３は、６９０ｎｍおよび７１３ｎｍにおいて励起／放出極大をそれぞれ有する蛍光を持つ近赤外線の蛍光タンパク質である。Ｇ２期、Ｍ期、およびＧ１期の間に、ｉＲＦＰ７１３を発現する細胞は、ＮＩＲ蛍光を放出し、それは、３色光学モジュールを使用して検出され得る。結果として、細胞周期局面は、蛍光フットプリント（たとえば、Ｇ２期およびＭ期：緑色およびＮＩＲ；Ｇ１期：オレンジ色およびＮＩＲ、Ｓ期：オレンジ色および緑色）を有することとなり、無色期は存在しない。

例３：３色免疫細胞キリング
本明細書で説明されている光学モジュール１１０、システム１０５、および方法３００のさまざまな実装形態は、ラベル付けされたターゲット（癌）細胞およびエフェクター（免疫）細胞を有利にモニタリングするために、ならびに、両方の細胞タイプにわたって細胞死読み出しを提供するために使用され得る。これは、両方の母集団にわたる細胞死と同時に、ターゲット細胞およびエフェクター細胞の増殖および相互作用を独立して測定することができるという利益を提供する。このように、ターゲット細胞の免疫細胞キリングの有効性は、エフェクター母集団の変化（たとえば、活性化に関連付けられる）、ならびに、エフェクター細胞ラベルおよびターゲット細胞ラベルの蛍光の間のオーバーラップを決定することによって測定される同じサンプルの中の２つの細胞母集団の間の相互作用と直接的に相関付けされ得る。

一般的に、望まれないターゲット細胞（たとえば、出現した腫瘍細胞など）の免疫細胞認識および免疫細胞キリングは、人間の宿主防衛メカニズムの重要なコンポーネントである。抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）およびＴ細胞キリングは、細胞介在性免疫反応の２つのメカニズムである。これらのプロセスのそれぞれは、免疫細胞亜母集団（たとえば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞または細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）など）の刺激を含み、それは、次いで、ターゲット細胞をアクティブに溶解させる。本開示のシステムおよび方法は、免疫細胞と癌細胞との間の相互作用の観察を可能にし、腫瘍と闘って排除する免疫システムの能力を回復および推進するための診断および療法（「癌免疫療法」または「免疫腫瘍学」）の開発につながる情報を潜在的に提供する。

例４：ＡＴＰ＋細胞死
本明細書で説明されている光学モジュール１１０、システム１０５、および方法３００のさまざまな実装形態は、癌細胞の代謝および死亡率に対する化合物の時間依存性のおよび濃度依存性の効果の可能な差を調査するために、細胞死分析によって多重化されるＡＴＰの２色Ｆｏｒｓｔｅｒ共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）ベースの測定を有利に実行するために使用され得る。動作時に、光学モジュールの中の３つの光源は、３つの異なる帯域の励起波長において活性化させられ得、そのうちの２つは、ＦＲＥＴメカニズムを介して、単一の放出帯域を介して代謝情報を測定するために使用され得る。次いで、第３の励起波長は、細胞死に関係付けられる独立した読み出しをモニタリングするために使用され得る（たとえば、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ ＮＩＲ）。ＡＴＰ測定プロセスは、２０１９年３月７日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ１９／２１１７１「Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｌｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ＡＴＰ」に、より詳細に説明されており、その文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。

例５：生細胞免疫細胞化学
本明細書で説明されている光学モジュール１１０、システム１０５、および方法３００のさまざまな実装形態は、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）ＦａｂＦｌｕｏｒ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ（または、何らかの他の蛍光的にラベル付けされた抗体試薬）を使用する生細胞免疫細胞化学（ＩＣＣ）によって、表面タンパク質発現を測定するために使用され得る。この方法は、実験的な処理（たとえば、テスト化合物の添加または免疫細胞活性化）に続く細胞亜母集団の変化を追跡するために、経時的な分化マーカーの変化をモニタリングするために、または、表面タンパク質発現をその他の方法で評価するために使用され得る。３色（または、それ以上）イメージングは、抗体選択のフレキシビリティーにおいて利点を提供し、単一のサンプルの中の関心の追加的なタンパク質または亜母集団のモニタリングを可能にする。

異なる有利な配置の説明は、図示および説明の目的のために提示されており、網羅的であるということまたは開示されている形態の例に限定されることを意図していない。多くの修正例および変形例が、当業者に明らかになることとなる。選択された１つまたは複数の例は、例の原理、実用的な用途を最良に説明するために、ならびに、企図された特定の使用に適しているようなさまざまな修正例を伴うさまざまな例に関して、当業者が本開示を理解することを可能にするために、選ばれて説明されている。

１００ 環境
１０５ システム
１１０ 光学モジュール
１１１ ハウジング
１１１ａ 主本体部
１１１ｂ 片持ち梁式の延長部
１１２ 第１の開口部
１１３ 第２の開口部
１１５ 蛍光顕微鏡
１２０ イメージングセンサー
１２５ 位相ランプ
１２６ ハウジング
１２７ 透過照明光源
１２８ 突出部
１２９ 溝部
１３０ サンプル
１３５ 第１の光源
１３６ 第１のフィルター
１３７ 第１の光学経路
１４０ 第２の光源
１４１ 第２のフィルター
１４２ 第２の光学経路
１４５ 第３の光源
１４６ 第３のフィルター
１４７ 第３の光学経路
１５０ 一次的透過光学経路
１５５ 放出フィルター
１５６ 一次的放出光学経路
１６０ 第４の光源
１６１ 第４のフィルター
１６２ 第４の光学経路
１６５ 対物レンズ
１７０ シャフト
１７１ フリップタブ
１７２ 第１の端部
１７３ 突出部
１７４ 第２の端部
１７５ 第１の電気コネクター
１７７ 第３の電気コネクター
１８０ インキュベーター
１８５ 位相ランプマウント
１８６ 受容部
１８７ 戻り止め
１８８ スプリング荷重式のボール
１８９ スプリング
２００ コンピューティングデバイス
２００ａ コンピューティングデバイス
２０２ プロセッサー
２０４ 通信インターフェース
２０６ データストレージ
２０８ 出力インターフェース
２１０ ディスプレイ
２１２ 通信バス
２１４ ネットワーク
２１６ａ タブレット
２１６ｂ パーソナルコンピューター
２１６ｃ ラップトップコンピューター
２１６ｄ モバイルコンピューティングデバイス
２１８ 実行可能な命令

Claims (25)

1. 生細胞生物学的サンプルの中のフルオロフォアをイメージングするための光学モジュールであって、前記光学モジュールは、
   第１の帯域の励起波長において第１の光を放出するように構成されている第１の光源と、
   前記第１の光源の第１の光学経路の中に配置されている第１のフィルターであって、前記第１のフィルターは、１つまたは複数の波長における光を通し、１つまたは複数の波長における光を反射するように構成されている、第１のフィルターと、
   第２の帯域の励起波長において第２の光を放出するように構成されている第２の光源と、
   前記第２の光源の第２の光学経路の中に配置されている第２のフィルターであって、前記第２のフィルターは、１つまたは複数の波長における光を通し、１つまたは複数の波長における光を反射するように構成されている、第２のフィルターと、
   第３の帯域の励起波長において第３の光を放出するように構成されている第３の光源と、
   前記第３の光源の第３の光学経路の中に配置されている第３のフィルターであって、前記第３のフィルターは、１つまたは複数の波長における光を通し、１つまたは複数の波長における光を反射するように構成されており、前記第１の光学経路、前記第２の光学経路、および、前記第３の光学経路は、前記生細胞生物学的サンプルに向けて方向付けられるように構成されている一次的透過光学経路に沿って収束している、第３のフィルターと、
   前記生細胞生物学的サンプルの中の前記フルオロフォアによって放出される光のための一次的放出光学経路の中に配置されている放出フィルターであって、前記一次的放出光学経路は、イメージングセンサーにおいて終端するように構成されており、前記放出フィルターは、第１の帯域、第２の帯域、および第３の帯域の放出波長における光を通すように構成されており、前記第１の帯域、前記第２の帯域、および、前記第３の帯域の励起波長における光を反射するように構成されている、放出フィルターと
   を含む、光学モジュール。
2. 前記第１のフィルター、前記第２のフィルター、および、前記第３のフィルターは、それぞれダイクロイックフィルターである、請求項１に記載の光学モジュール。
3. 前記第１の光源、前記第２の光源、および、前記第３の光源は、ＬＥＤ、少なくとも１つのレンズ、および、シングルバンドパスダイクロイックフィルターをそれぞれ含む、請求項１または２に記載の光学モジュール。
4. 前記第１のフィルターは、前記第１の帯域の励起波長における光を通し、前記第２の帯域および前記第３の帯域の励起波長における光、ならびに、前記第１の帯域、前記第２の帯域、および、前記第３の帯域の放出波長における光を反射するように構成されており、
   前記第２のフィルターは、前記第１の帯域、前記第２の帯域、および、前記第３の帯域の放出波長における光を通し、前記第２の帯域および前記第３の帯域の励起波長における光を反射するように構成されており、
   前記第３のフィルターは、前記第３の帯域の励起波長における光を通し、前記第２の帯域の励起波長における光を反射するように構成されている、請求項１から３のいずれか一項に記載の光学モジュール。
5. 前記第１の光源は、前記第１の光学経路が前記第１の光源において開始し、前記第１のフィルターを通過し、前記一次的透過光学経路に沿って前記光学モジュールを退出するように配置されており、
   前記第２の光源は、前記第２の光学経路が前記第２の光源において開始し、前記第３のフィルターにおいて前記第２のフィルターへ反射し、前記第２のフィルターにおいて前記第１のフィルターへ反射し、前記第１のフィルターにおいて反射し、前記一次的透過光学経路に沿って前記光学モジュールを退出するように配置されており、
   前記第３の光源は、前記第３の光学経路が前記第３の光源において開始し、前記第３のフィルターを通過して前記第２のフィルターに向かい、前記第２のフィルターにおいて前記第１のフィルターへ反射し、前記第１のフィルターにおいて反射し、前記一次的透過光学経路に沿って前記光学モジュールを退出するように配置されており、
   前記生細胞生物学的サンプルの中の前記フルオロフォアによって放出される光のための前記一次的放出光学経路は、前記第１のフィルターにおいて反射し、前記第２のフィルターを通過し、前記放出フィルターを通過し、前記光学モジュールを退出する、請求項４に記載の光学モジュール。
6. 前記第１のフィルターは、前記第１の帯域および前記第２の帯域の励起波長の光を通し、前記第３の帯域の励起波長の光、ならびに、前記第１の帯域、前記第２の帯域、および前記第３の帯域の放出波長の光を反射するように構成されており、
   前記第２のフィルターは、前記第２の帯域の放出波長の光を通し、前記第１の帯域の励起波長の光を反射するように構成されており、
   前記第３のフィルターは、前記第１の帯域、前記第２の帯域、および前記第３の帯域の放出波長の光を通し、前記第３の帯域の励起波長の光を反射するように構成されている、請求項１から５のいずれか一項に記載の光学モジュール。
7. 前記第１の光源は、前記第１の光学経路が前記第１の光源において開始し、前記第２のフィルターにおいて反射し、前記第１のフィルターを通過し、前記一次的透過光学経路に沿って前記光学モジュールを退出するように配置されており、
   前記第２の光源は、前記第２の光学経路が前記第２の光源において開始し、前記第２のフィルターを通過し、次いで、前記第１のフィルターを通過し、前記一次的透過光学経路に沿って前記光学モジュールを退出するように配置されており、
   前記第３の光源は、前記第３の光学経路が前記第３の光源において開始し、前記第３のフィルターにおいて前記第１のフィルターへ反射し、前記第１のフィルターにおいて反射し、前記一次的透過光学経路に沿って前記光学モジュールを退出するように配置されており、
   前記生細胞生物学的サンプルの中の前記フルオロフォアによって放出される光のための前記一次的放出光学経路は、前記第１のフィルターにおいて反射し、前記第３のフィルターを通過し、前記放出フィルターを通過し、前記光学モジュールを退出する、請求項６に記載の光学モジュール。
8. 前記第１の帯域の励起波長は、４５３ｎｍから４８５ｎｍの範囲にあり、前記第２の帯域の励起波長は、５４６ｎｍから５６８ｎｍの範囲にあり、前記第３の帯域の励起波長は、６４８ｎｍから６７４ｎｍの範囲にある、請求項１から７のいずれか一項に記載の光学モジュール。
9. 前記第１の帯域の放出波長は、４９４ｎｍから５３３ｎｍの範囲にあり、前記第２の帯域の放出波長は、５７６ｎｍから６３９ｎｍの範囲にあり、前記第３の帯域の放出波長は、６８６ｎｍから７５６ｎｍの範囲にある、請求項１から７のいずれか一項に記載の光学モジュール。
10. 第４の帯域の励起波長において第４の光を放出するように構成されている第４の光源と、
    前記第４の光源の第４の光学経路の中に配置されている第４のフィルターであって、前記第４のフィルターは、１つまたは複数の波長における光を通し、１つまたは複数の波長における光を反射するように構成されており、前記放出フィルターは、第４の帯域の放出波長の光を通し、前記第４の帯域の励起波長の光を反射するようにさらに構成されている、第４のフィルターと
    をさらに含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の光学モジュール。
11. 前記第１のフィルターは、前記第１の帯域の励起波長の光を通し、前記第４の帯域の励起波長の光を反射するように構成されており、
    前記第２のフィルターは、前記第１の帯域、前記第２の帯域、および前記第３の帯域の放出波長の光を通し、前記第２の帯域および前記第３の帯域の励起波長の光を反射するように構成されており、
    前記第３のフィルターは、前記第３の帯域の励起波長の光を通し、前記第２の帯域の励起波長の光を反射するように構成されており、
    前記第４のフィルターは、前記第１の帯域および前記第４の帯域の励起波長の光を通し、前記第２の帯域および前記第３の帯域の励起波長の光、ならびに、前記第１の帯域、前記第２の帯域、前記第３の帯域、および前記第４の帯域の放出波長の光を反射するように構成されている、請求項１０に記載の光学モジュール。
12. 前記第４の帯域の放出波長は、４５３ｎｍよりも小さく、前記第４の帯域の励起波長は、前記第４の帯域の放出波長よりも小さい、請求項１０または１１に記載の光学モジュール。
13. 前記第１の光源は、前記第１の光学経路が前記第１の光源において開始し、前記第１のフィルターを通過し、次いで、第４のフィルターを通過し、前記一次的透過光学経路に沿って前記光学モジュールを退出するように配置されており、
    前記第２の光源は、前記第２の光学経路が前記第２の光源において開始し、前記第３のフィルターにおいて前記第２のフィルターへ反射し、前記第２のフィルターにおいて前記第４のフィルターへ反射し、前記第４のフィルターにおいて反射し、前記一次的透過光学経路に沿って前記光学モジュールを退出するように配置されており、
    前記第３の光源は、前記第３の光学経路が前記第３の光源において開始し、前記第３のフィルターを通過して前記第２のフィルターに向かい、前記第２のフィルターにおいて前記第４のフィルターへ反射し、前記第４のフィルターにおいて反射し、前記一次的透過光学経路に沿って前記光学モジュールを退出するように配置されており、
    第４の光源は、第４の光学経路が前記第４の光源において開始し、前記第１のフィルターにおいて反射し、前記第４のフィルターを通過し、前記一次的透過光学経路に沿って前記光学モジュールを退出するように配置されており、
    前記生細胞生物学的サンプルの中の前記フルオロフォアによって放出される光のための前記一次的放出光学経路は、前記第４のフィルターにおいて反射し、前記第２のフィルターを通過し、前記放出フィルターを通過し、前記光学モジュールを退出する、請求項１から１２のいずれか一項に記載の光学モジュール。
14. 生細胞生物学的サンプルをアッセイするためのシステムであって、前記システムは、
    請求項１から１３のいずれか一項に記載の光学モジュールと、
    前記光学モジュールに除去可能に連結されている蛍光顕微鏡であって、前記蛍光顕微鏡は、少なくとも１つの対物レンズを有している、蛍光顕微鏡と、
    前記対物レンズから前記生細胞生物学的サンプルの中の前記フルオロフォアによって放出される光のための放出経路の中に配置されている前記イメージングセンサーと、
    前記蛍光顕微鏡に除去可能に連結されている位相ランプであって、前記位相ランプは、前記一次的透過光学経路の終端端部に配置されている、位相ランプと
    を含む、システム。
15. 前記光学モジュールを通って延在するシャフトであって、前記蛍光顕微鏡は、前記シャフトを第１の配向で受け入れるように構成されている受容部を有しており、前記シャフトは、力の印加の下で第２の配向に回転し、それによって、前記光学モジュールを前記蛍光顕微鏡にロックするように構成されている、シャフト
    をさらに含む、請求項１４に記載のシステム。
16. 前記光学モジュールに連結されている第１の電気コネクターと、
    前記蛍光顕微鏡に連結されている第２の電気コネクターであって、前記第２の電気コネクターは、前記第１の電気コネクターと相互的になっている、第２の電気コネクターと、
    前記第１の電気コネクターおよび前記第２の電気コネクターのうちの少なくとも１つと電気的に通信しているプロセッサーであって、前記プロセッサーは、前記蛍光顕微鏡に連結されている前記光学モジュールを識別するように構成されている、プロセッサーと
    をさらに含む、請求項１４または１５に記載のシステム。
17. 第３の電気コネクターを有する前記位相ランプと、
    前記蛍光顕微鏡に連結されている第４の電気コネクターであって、前記第３の電気コネクターは、前記第４の電気コネクターと相互的になっており、前記プロセッサーは、前記光学モジュールおよび前記位相ランプが互換性があるかどうかを決定し、その決定に応答して警告を表示させるように構成されている、第４の電気コネクターと
    をさらに含む、請求項１６に記載のシステム。
18. ３０℃から４２℃の範囲にある温度において、および、８０％から１００％の範囲にある相対湿度において、前記生細胞生物学的サンプルを維持するように構成されているインキュベーターであって、前記光学モジュールは、前記インキュベーターのチャンバーに連結されている、インキュベーター
    をさらに含む、請求項１４から１７のいずれか一項に記載のシステム。
19. 生細胞生物学的サンプルの中のフルオロフォアをイメージングするための方法であって、前記方法は、
    第１の生物学的サンプルおよび蛍光顕微鏡を整合させるステップであって、前記第１の生物学的サンプルが前記蛍光顕微鏡の視野の中に位置付けされるようになっており、前記第１の生物学的サンプルは、（ｉ）第１の帯域の励起波長の光による照射に応答して第１の帯域の放出波長の光を放出する第１のフルオロフォア、（ｉｉ）第２の帯域の励起波長の光による照射に応答して第２の帯域の放出波長の光を放出する第２のフルオロフォア、および、（ｉｉｉ）第３の帯域の励起波長の光による照射に応答して第３の帯域の放出波長の光を放出する第３のフルオロフォアを含む、ステップと、
    前記蛍光顕微鏡を使用して前記第１の生物学的サンプルの１セットのイメージを取得するステップであって、前記１セットのイメージのイメージ同士は、フォーカス設定に関して異なっている、ステップと、
    前記１セットのイメージに基づいて、前記第１の、第２の、および第３の帯域の放出波長に関する第１の、第２の、および第３のインフォーカス設定をそれぞれ決定するステップと、
    第１の時間の期間の間に、第１の光源を使用し、前記第１の帯域の励起波長の光によって前記第１の生物学的サンプルを照射するステップと、前記第１のインフォーカス設定に従って前記蛍光顕微鏡を動作させ、前記蛍光顕微鏡のイメージセンサーを介して、前記第１の帯域の放出波長の光の第１のイメージを取得するステップと、
    第２の時間の期間の間に、第２の光源を使用し、前記第２の帯域の励起波長の光によって前記第１の生物学的サンプルを照射するステップと、前記第２のインフォーカス設定に従って前記蛍光顕微鏡を動作させ、前記イメージセンサーを介して、前記第２の帯域の放出波長の光の第２のイメージを取得するステップと、
    第３の時間の期間の間に、第３の光源を使用し、前記第３の帯域の励起波長の光によって前記第１の生物学的サンプルを照射するステップと、前記第３のインフォーカス設定に従って前記蛍光顕微鏡を動作させ、前記イメージセンサーを介して、前記第３の帯域の放出波長の光の第３のイメージを取得するステップと
    を含む、方法。
20. 前記第２のフルオロフォアおよび前記第３のフルオロフォアによって放出される光からのアーチファクトを低減させるために、前記第１の、第２の、および第３のイメージに基づいて、イメージングセンサーと電気的に通信しているプロセッサーを介して、前記第１のフルオロフォアによって放出される光の第１の補正されたイメージを発生させるステップと、
    前記第１のフルオロフォアおよび前記第３のフルオロフォアによって放出される光からのアーチファクトを低減させるために、前記第１の、第２の、および第３のイメージに基づいて、前記プロセッサーを介して、前記第２のフルオロフォアによって放出される光の第２の補正されたイメージを発生させるステップと、
    前記第１のフルオロフォアおよび前記第２のフルオロフォアによって放出される光からのアーチファクトを低減させるために、前記第１の、第２の、および第３のイメージに基づいて、前記プロセッサーを介して、前記第３のフルオロフォアによって放出される光の第３の補正されたイメージを発生させるステップと
    をさらに含む、請求項１９に記載の方法。
21. 前記第１の、第２の、および第３のイメージを取得するときに、前記蛍光顕微鏡に連結されているインキュベーターを介して、３０℃から４２℃の範囲にある温度において、および、８０％から１００％の範囲にある相対湿度において、少なくとも前記第１の生物学的サンプルを維持するステップ
    をさらに含む、請求項１９または２０に記載の方法。
22. 前記第１の生物学的サンプルが前記第１のインフォーカス設定にあるときに取得される位相または明視野イメージならびに前記第１のイメージに基づいて、第１の補正されたイメージを発生させるステップをさらに含む、請求項１９から２１のいずれか一項に記載の方法。
23. プロセッサーを介して、前記蛍光顕微鏡の光学モジュールおよび位相ランプモジュールに関する互換性情報を受信するステップと、
    前記プロセッサーを介して、前記互換性情報に基づいて、前記光学モジュールおよび前記位相ランプが互換性があるかどうかを決定するステップと、
    前記光学モジュールおよび前記位相ランプが互換性がないという決定に応答して、前記プロセッサーを介して、非互換性のインディケーションとともに警告を表示させるステップと
    をさらに含む、請求項１９から２２のいずれか一項に記載の方法。
24. 前記蛍光顕微鏡の光学モジュールを通して前記蛍光顕微鏡の受容部へシャフトを第１の配向で延在させるステップと、
    力の印加の下で前記シャフトを回転させるステップであって、シャフトが、第２の配向に移動し、それによって、前記光学モジュールを前記蛍光顕微鏡に連結するようになっている、ステップと
    をさらに含む、請求項１９から２３のいずれか一項に記載の方法。
25. 非一時的なコンピューター可読媒体であって、前記非一時的なコンピューター可読媒体は、プログラム命令をその上に記憶しており、前記プログラム命令は、請求項１から１３のいずれか一項に記載の光学モジュールと電気機械的に通信しているプロセッサーによって実行されると、１セットの行為の実施を引き起こし、前記行為は、
    第１の生物学的サンプルおよび蛍光顕微鏡を整合させるステップであって、前記第１の生物学的サンプルが前記蛍光顕微鏡の視野の中に位置付けされるようになっており、前記第１の生物学的サンプルは、（ｉ）第１の帯域の励起波長の光による照射に応答して第１の帯域の放出波長の光を放出する第１のフルオロフォア、（ｉｉ）第２の帯域の励起波長の光による照射に応答して第２の帯域の放出波長の光を放出する第２のフルオロフォア、および、（ｉｉｉ）第３の帯域の励起波長の光による照射に応答して第３の帯域の放出波長の光を放出する第３のフルオロフォアを含む、ステップと、
    前記イメージングセンサーが、前記蛍光顕微鏡を使用して前記第１の生物学的サンプルの第１のセットのイメージを取得するステップであって、前記１セットのイメージのイメージ同士は、フォーカス設定に関して異なっている、ステップと、
    前記１セットのイメージに基づいて、前記第１の、第２の、および第３の帯域の放出波長に関する第１の、第２の、および第３のインフォーカス設定をそれぞれ決定するステップと、
    第１の時間の期間の間に、第１の光源を使用し、前記第１の帯域の励起波長の光によって前記第１の生物学的サンプルを照射するステップと、前記第１のインフォーカス設定に従って前記蛍光顕微鏡を動作させ、前記蛍光顕微鏡のイメージセンサーを介して、前記第１の帯域の放出波長の光の第１のイメージを取得するステップと、
    第２の時間の期間の間に、第２の光源を使用し、前記第２の帯域の励起波長の光によって前記第１の生物学的サンプルを照射するステップと、前記第２のインフォーカス設定に従って前記蛍光顕微鏡を動作させ、前記イメージセンサーを介して、前記第２の帯域の放出波長の光の第２のイメージを取得するステップと、
    第３の時間の期間の間に、第３の光源を使用し、前記第３の帯域の励起波長の光によって前記第１の生物学的サンプルを照射するステップと、前記第３のインフォーカス設定に従って前記蛍光顕微鏡を動作させ、前記イメージセンサーを介して、前記第３の帯域の放出波長の光の第３のイメージを取得するステップと
    を含む、非一時的なコンピューター可読媒体。

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