JP2023523727A - 3色以上の蛍光光源を備えた光学モジュールおよびその使用のための方法 - Google Patents
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Abstract
3色(または、それ以上)チャネルの落射蛍光イメージングを促進させるための、ならびに、イメージング装置の手動の調節なしにサンプルの位相コントラストおよび/または明視野イメージングを実施するための、イメージング装置が提供される。これは、装置を手動で調節するためにインキュベーター環境を乱すことなく、インキュベーターの内側に位置付けされているデバイスによって、複数のサンプルの自動化されたイメージングを長期間にわたって可能にする。また、イメージング装置を使用してイメージングされ得る実験および/または蛍光色素の種類を増加させるために、イメージング装置がアッセイおよび/または蛍光インジケーターの異なる組み合わせに適合されることを可能にするように、除去可能な光学モジュールおよび/または透過照明モジュールのユーザースワッピングを促進させるための実施形態も提供される。
Description
関連出願の相互参照
本出願は、2020年4月21日に出願された米国非仮特許出願第16/854,756号の優先権を主張し、その内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
本出願は、2020年4月21日に出願された米国非仮特許出願第16/854,756号の優先権を主張し、その内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
生細胞生物学的サンプルは、1つまたは複数の時点におけるサンプルの成長、代謝、形態学、または他の特性を評価するために、さまざまな方式で顕微鏡的にイメージングされ得る。この顕微鏡イメージングは、蛍光イメージングを含むことが可能であり、サンプルの中のフルオロフォアは、フルオロフォアの励起波長における光によって励起され、それらがフルオロフォアの放出波長において光を蛍光的に放出することを引き起こす。落射蛍光イメージング(epifluorescence imaging)において、励起光は、放出光を収集するために使用される同じ対物レンズを介して提供される。
マルチチャネル蛍光イメージングを実現することは、蛍光イメージが特定の放出波長に関して獲得されるたびに、異なるフィルターセット(および、場合によっては、励起光源)を適切な位置に移動させることを必要とすることが多い。しかし、そのような配置は、コンポーネントを物理的に移動させる必要性に起因して、より大きく、より遅く、よりコストがかかり、より信頼性の低いシステムを結果として生じさせる。
第1の態様において、生細胞生物学的サンプルの中のフルオロフォアをイメージングするための例示的な光学モジュールが開示されている。光学モジュールは、(a)第1の帯域の励起波長において第1の光を放出するように構成されている第1の光源と、(b)第1の光源の第1の光学経路の中に配置されている第1のフィルターであって、第1のフィルターは、1つまたは複数の波長における光を通し、1つまたは複数の波長における光を反射するように構成されている、第1のフィルターと、(c)第2の帯域の励起波長において第2の光を放出するように構成されている第2の光源と、(d)第2の光源の第2の光学経路の中に配置されている第2のフィルターであって、第2のフィルターは、1つまたは複数の波長における光を通し、1つまたは複数の波長における光を反射するように構成されている、第2のフィルターと、(e)第3の帯域の励起波長において第3の光を放出するように構成されている第3の光源と、(f)第3の光源の第3の光学経路の中に配置されている第3のフィルターであって、第3のフィルターは、1つまたは複数の波長における光を通し、1つまたは複数の波長における光を反射するように構成されており、第1の光学経路、第2の光学経路、および、第3の光学経路は、生細胞生物学的サンプルに向けて方向付けられるように構成されている一次的透過光学経路に沿って収束している、第3のフィルターと、(g)生細胞生物学的サンプルの中のフルオロフォアによって放出される光のための一次的放出光学経路の中に配置されている放出フィルターであって、一次的放出光学経路は、イメージングセンサーにおいて終端するように構成されており、放出フィルターは、第1の帯域、第2の帯域、および第3の帯域の放出波長における光を通すように構成されており、第1の帯域、第2の帯域、および第3の帯域の励起波長における光を反射するように構成されている、放出フィルターとを含む。
第2の態様において、生細胞生物学的サンプルをアッセイするための例示的なシステムが開示されている。システムは、(a)本開示の第1の態様による光学モジュールと、(b)光学モジュールに除去可能に連結されている蛍光顕微鏡であって、蛍光顕微鏡は、少なくとも1つの対物レンズを有している、蛍光顕微鏡と、(c)対物レンズから生細胞生物学的サンプルの中のフルオロフォアによって放出される光のための放出経路の中に配置されているイメージングセンサーと、(d)蛍光顕微鏡に除去可能に連結されている位相ランプ(phase lamp)であって、位相ランプは、一次的透過光学経路の終端端部に配置されている、位相ランプとを含む。
第3の態様において、生細胞生物学的サンプルの中のフルオロフォアをイメージングするための例示的な方法が開示されている。方法は、(i)第1の生物学的サンプルおよび蛍光顕微鏡を整合させるステップであって、第1の生物学的サンプルが蛍光顕微鏡の視野の中に位置付けされるようになっており、第1の生物学的サンプルは、(a)第1の帯域の励起波長の光による照射に応答して第1の帯域の放出波長の光を放出する第1のフルオロフォア、(b)第2の帯域の励起波長の光による照射に応答して第2の帯域の放出波長の光を放出する第2のフルオロフォア、および、(c)第3の帯域の励起波長の光による照射に応答して第3の帯域の放出波長の光を放出する第3のフルオロフォアを含む、ステップと、(ii)蛍光顕微鏡を使用して第1の生物学的サンプルの1セットのイメージを取得するステップであって、1セットのイメージのイメージ同士は、フォーカス設定に関して異なっている、ステップと、(iii)1セットのイメージに基づいて、第1の、第2の、および第3の帯域の放出波長に関する第1の、第2の、および第3のインフォーカス設定(in-focus setting)をそれぞれ決定するステップと、(iv)第1の時間の期間の間に、第1の光源を使用し、第1の帯域の励起波長の光によって第1の生物学的サンプルを照射するステップと、第1のインフォーカス設定に従って蛍光顕微鏡を動作させ、蛍光顕微鏡のイメージセンサーを介して、第1の帯域の放出波長の光の第1のイメージを取得するステップと、(v)第2の時間の期間の間に、第2の光源を使用し、第2の帯域の励起波長の光によって第1の生物学的サンプルを照射するステップと、第2のインフォーカス設定に従って蛍光顕微鏡を動作させ、イメージセンサーを介して、第2の帯域の放出波長の光の第2のイメージを取得するステップと、(vi)第3の時間の期間の間に、第3の光源を使用し、第3の帯域の励起波長の光によって第1の生物学的サンプルを照射するステップと、第3のインフォーカス設定に従って蛍光顕微鏡を動作させ、イメージセンサーを介して、第3の帯域の放出波長の光の第3のイメージを取得するステップとを含む。
第4の態様において、例示的な非一時的なコンピューター可読媒体が開示されている。コンピューター可読媒体は、プログラム命令をその上に記憶しており、プログラム命令は、プロセッサーによって実行されると、第3の態様の方法の実施を引き起こす。
議論されてきた特徴、機能、および利点は、さまざまな例において独立して実現され得、または、さらなる他の例において組み合わせられ得、そのさらなる詳細は、以下の説明および図面を参照して見られ得る。
図面は、例を図示する目的のためのものであるが、本発明は、図面に示されている配置および手段に限定されないということが理解される。
I.概観
生細胞サンプルの顕微鏡イメージングは、さまざまな実験的な条件の下での細胞の母集団の健康状態、成長、および活性についての情報を提供することが可能である。この情報は、サンプルの中の細胞の経時的な数、細胞の形態学もしくは他の構造的特性、細胞の内部内容もしくは構造(たとえば、細胞の有糸分裂または他の代謝プロセスの局面に関係付けられる内容)についての情報、または、細胞についての他の情報を含むことが可能である。この情報は、「正常な」条件の下での、および/または、さまざまな適用された実験的な条件の下での、細胞の挙動を評価するために使用され得る。たとえば、細胞の顕微鏡イメージングは、実験的な医薬品または他の添加された物質に対する細胞の応答、細胞の遺伝子組み換えの効果、添加された癌細胞、他の添加された細胞タイプ、および/または、添加された細菌、真菌、ウィルス、もしくは、他の微生物の、細胞に対する効果、または、生細胞のサンプルに対するいくつかの他の適用された実験的な条件の効果を評価するために使用され得る。
生細胞サンプルの顕微鏡イメージングは、さまざまな実験的な条件の下での細胞の母集団の健康状態、成長、および活性についての情報を提供することが可能である。この情報は、サンプルの中の細胞の経時的な数、細胞の形態学もしくは他の構造的特性、細胞の内部内容もしくは構造(たとえば、細胞の有糸分裂または他の代謝プロセスの局面に関係付けられる内容)についての情報、または、細胞についての他の情報を含むことが可能である。この情報は、「正常な」条件の下での、および/または、さまざまな適用された実験的な条件の下での、細胞の挙動を評価するために使用され得る。たとえば、細胞の顕微鏡イメージングは、実験的な医薬品または他の添加された物質に対する細胞の応答、細胞の遺伝子組み換えの効果、添加された癌細胞、他の添加された細胞タイプ、および/または、添加された細菌、真菌、ウィルス、もしくは、他の微生物の、細胞に対する効果、または、生細胞のサンプルに対するいくつかの他の適用された実験的な条件の効果を評価するために使用され得る。
そのようなイメージングのコストを低減させるために、イメージングを実施するために使用される装置(たとえば、インキュベーター、イメージング装置)のサイズを低減させるために、細胞サンプルに適用される条件の安定性に対する影響を低減させるために、および/または、他の利益を提供するために、複数の生細胞サンプルの顕微鏡イメージングは、インキュベーターの内側の生細胞サンプルとともに存在するように構成されている自動化されたイメージング装置によって実施され得る。そのような自動化されたイメージング装置は、ガントリーまたは他のアクチュエーターを含むことが可能であり、それは、イメージング装置および/または生細胞サンプル(たとえば、マルチウェルプレートもしくは他のマルチサンプルコンテナ)を移動させ、インキュベーターの中の複数の生細胞サンプルの自動化されたイメージングを促進させるように構成されている。そのような生細胞サンプルは、生細胞内容物のアイデンティティーもしくはミックス、添加された医薬品、微生物、癌細胞、もしくは、他の添加された物質のアイデンティティーもしくは量、生細胞内容物に適用される遺伝子組み換えのタイプ、または、いくつかの他の実験的な条件に関して異なる可能性のある複数の生細胞サンプルを含むことが可能である。
そのようなシステムの顕微鏡イメージング装置は、イメージング装置の光学経路を折り曲げるために、ミラー、フィルター、または、他の要素を含むことが可能であり、イメージング装置のサイズを低減させるようになっており、イメージング装置がインキュベーターの中にフィットすることができるようになっている。追加的にまたは代替的に、イメージング装置の要素は、個別のサブアッセンブリへと分離され、さまざまな顕微鏡イメージングモダリティを促進させることが可能である。たとえば、位相ランプおよび/または他の透過照明光源は、モジュールで提供され得、そのモジュールは、イメージセンサー内蔵モジュールとは別個になっており、イメージセンサー内蔵モジュールから生細胞サンプルコンテナの反対側にあり、明視野イメージング、位相コントラストイメージング、または、他の顕微鏡イメージングモードを促進させる。
蛍光色素、非蛍光色素もしくは顔料、適当な波長において表面プラズモン共鳴を示すナノロッドもしくは他の導電性要素、Raman色素、または、他の光学的に区別可能な物質が、生細胞サンプルに添加され、サンプルの内容および/またはそのプロセスもしくは内容をイメージングすることを促進させることが可能である。光学的に区別可能な物質は、サンプルの中の関心の物質に特異的に結合するかまたはその他の方法でそれと相互作用するように(たとえば、抗体によって)機能化され得る。たとえば、造影剤は、タンパク質、特定の細胞の表面マーカー、DNA/RNAなどの特定の配列、または、生物学的サンプルの中の何らかの他の関心の物質もしくは要素に特異的に結合するかまたはその他の方法でそれと相互作用するように機能化され得る。そのような機能化は、サンプルの中の特定の物質をイメージングすること、たとえば、サンプルの中の関心のタンパク質または他の物質についての存在、量、分布、または他の情報をイメージングすることを促進させることが可能である。光学的に区別可能な物質は、外来物質として生細胞サンプルの中へ導入されることによって(たとえば、特定のタイプの細胞またはレセプターに特有の抗体に接合されている特定の量のフルオロフォアをマルチウェルサンプルプレートのそれぞれのウェルの中へ添加することによって)添加され得る。追加的にまたは代替的に、光学的に区別可能な物質は、光学的に区別可能な物質を発現するようにサンプルの中の生細胞を遺伝的に組み換えることによって(たとえば、緑色蛍光タンパク質のための遺伝子をサンプルの中の生細胞に添加することによって)添加され得る。追加的にまたは代替的に、そのような光学的に区別可能な物質は、生細胞の中に、および/または、それによって分泌される物質(たとえば、生細胞の母集団によって自然に発現される自家蛍光タンパク質)の中に、自然に存在することが可能である。
放出帯域とは異なる励起帯域における光による励起に応答して放出帯域における光を放出するフルオロフォアまたは他の物質(たとえば、Raman色素)は、サンプルの内容物をイメージングする際に特に有用である。これは、応答的に放出された放出光から励起光を区別するための能力、ならびに、励起光を制御することによって放出光の大きさおよびタイミングを制御するための能力に、部分的に起因している。これらの特性は、他の物質(たとえば、散乱された光の波長が照射光の波長と実質的に同じとなるように、所定の波長の範囲の中の光を散乱させる色素)よりも高い忠実性を伴って蛍光色素がイメージングされることを可能にする。追加的に、光学的に区別可能である異なるフルオロフォアが、複数の異なるフルオロフォアを独立してイメージングすることを促進させるために使用され得る。これらの異なるフルオロフォアは、励起スペクトル、放出スペクトル、または他の特性(たとえば、蛍光寿命)に関して異なっており、そのような独立したイメージングを促進させることが可能である。そのようなイメージングは、それぞれの異なる時点において、異なるフルオロフォアのそれぞれの異なる励起波長における光を提供することによって実現され得る。サンプルからの放出光を収集およびイメージングするために使用されるものと同じ対物レンズ(または、対物レンズシステム)を介して、励起光がサンプルに送達されるときに、プロセスは、「落射蛍光イメージング」と称され得る。
異なる時点において異なるフルオロフォア(または、他の光学的に区別可能なサンプル内容物)をイメージングするために、蛍光イメージャー(たとえば、落射蛍光イメージャー)は、1つまたは複数の波長選択的なフィルター、ミラー、または、他の波長選択的な光学要素を、イメージャーの光学経路の中へおよびその外へ機械的に移動させ、異なる励起波長帯域における光によるサンプルの照射を促進させ、ならびに/または、異なる放出波長帯域における光の選択的な受け取りおよびイメージングを促進させることが可能である。しかし、そのようなイメージャーは、より機械的に複雑であり、よりコストがかかり、より大きく、より信頼性が低い可能性があり、または、いくつかの他の望まれない性能特性を示す可能性がある。その代わりに、イメージャーは、ダイクロイックミラー、光学フィルター、または他の要素の静的なセットを含むことが可能であり、それは、それぞれの異なるフルオロフォアのそれぞれの異なる励起帯域における光を異なる光源が放出することを可能にし、一方では、異なるフルオロフォアのそれぞれの放出帯域における光がイメージセンサーに通されてイメージセンサーによってイメージングされることを可能にするように構成されている。
たとえば、蛍光顕微鏡システムの中の落射蛍光能力を使用して生細胞生物学的サンプルをアッセイするための光学モジュールは、2つの光源および関連のフィルター(たとえば、ダイクロイックミラー)を含むことが可能である。これらの光源に関連付けられる波長、および、オプティクスモジュールの中のフィルターのパス/ストップ/反射帯域に関連付けられる波長は、光の色(フルオロフォアが、それによってそれぞれ励起され、それにおいて応答的に放出する)に従って、1つまたは複数のセットのフルオロフォアとともに働くように選択される。
そのようなイメージングシステムは、少なくともそれらのそれぞれの励起帯域に関して異なっている2つの異なるフルオロフォアを独立して励起する(および、そこから応答的に蛍光的に放出された光を検出する)ように構成および動作され得る。たとえば、そのようなシステムは、第1の構成において、緑色フルオロフォアおよび赤色フルオロフォアを検出し、第2の構成(たとえば、光源、ダイクロイックミラー、フィルター、または、他の光学コンポーネントを含む光学モジュールをスワップすることによって実現される)において、オレンジ色フルオロフォアおよび近赤外線(「NIR」)フルオロフォアを検出することが可能である。そのような2色イメージングシステムの異なる構成(たとえば、システムの異なるスワップ可能な光学モジュール)は、特定のアッセイ(たとえば、細胞母集団の中の細胞分裂の観察を可能にする、遺伝子的にコード化された2色(赤色および緑色)インジケーターである蛍光ユビキチン化細胞周期インジケーター(「FUCCI(fluorescence ubiquitination cell cycle indicator)」)アッセイ)に関連付けられるフルオロフォアの対を励起するように構成され得る。システムが特定の構成に設定されているときに、独立したイメージは、特定の構成と互換性があるフルオロフォアに関してのみ収集され得る。
そのような2フルオロフォア光学システムは、それが独立してイメージングすることができる個別のフルオロフォアの数に関して制限される。したがって、それは、単一のサンプルの中において、または、自動化されたイメージングシナリオにおいて異なるサンプルの母集団にわたって(たとえば、マルチウェルサンプルコンテナの異なるウェルは、ウェルの中に存在しているフルオロフォアに関して異なっている)、それが発生させることができる情報のタイプに関して制限される。これは、単一のサンプルの中で実行され得る蛍光アッセイの種類に関して(すなわち、2つ以下の蛍光インジケーターを含むアッセイに関して)制限されることを含むことが可能である。そのようなアッセイの1つの例は、蛍光ユビキチン化ベースの細胞周期インジケーター(「FUCCI」)であり、それは、細胞母集団の中の細胞分裂の観察を可能にする、遺伝子的にコード化された2色(赤色および緑色)インジケーターである。しかし、このアッセイを実施するために使用される2色光学モジュールは、S期(すなわち、細胞がその核の中でDNAの完全なコピーを合成するとき)、G2期(すなわち、第2のギャップ期;細胞がより成長し、タンパク質およびオルガネラを作製し、有糸分裂の準備のためにその内容を再編成し始めるとき)、および有糸分裂(M)期(すなわち、細胞がそのDNAを2つのセットへと分離し、その細胞質を分割し、2つの新しい細胞を形成する)の間を区別することができない。また、M/G1移行において無色期が存在しており、それは、細胞を非発現体から区別不可能にする。TagGFP2は、483nmおよび506nmにおいて励起/放出極大をそれぞれ有する明るい緑色蛍光を持つタンパク質である。S期、G2期、およびM期の間に、細胞は、TagGFP2の発現を介して緑色蛍光をそれぞれ放出し、それは、2色光学モジュールを使用してイメージングされ得る。mKateは、588nmおよび633nmにおいて励起/放出極大をそれぞれ有する蛍光を持つ遠赤色蛍光タンパク質である。G1期(すなわち、第1のギャップ期;細胞が物理的により大きくなり、オルガネラをコピーし、後の成長の段階のために分子ビルディングブロックを作製するとき)の間におよびS期への移行期の間に、細胞は、mKateの発現を介して遠赤色蛍光を放出し、それは、また、2色光学モジュールを使用してイメージングされ得る。しかし、そのような2色光学モジュールは、細胞分裂プロセスの中の追加的な期またはサブ期を識別するために追加的な蛍光インジケーターを使用することができないこととなる。
そのような2フルオロフォアイメージングシステムの能力は、2つのフルオロフォアの励起帯域および放出帯域に関係付けられる光源、フィルター、ミラー、または、他の光学要素を含む光学モジュールをスワップすることによって拡張され得る。しかし、そのような手動のスワッピングは、自動化されたイメージング実験が行われている状態で実施することが困難である可能性があり、モジュールがスワップされ得るようにインキュベーターを開けることによって、生細胞サンプルの環境が激しく摂動されることを必要とすることとなる。
さまざまな用途において、(光学モジュールをスワップすることなく、または、インキュベーション環境の摂動を結果として生じさせる可能性のある何らかの他の手動のプロセスを実施することなく)3つの(または、それ以上の)蛍光チャネルを独立してイメージングするために、蛍光イメージング装置を使用することができることは有益である。そのようなシステムは、より複雑なアッセイ(たとえば、完全な細胞周期を観察する3色FUCCIアッセイのような3つ以上の蛍光インジケーターを含むアッセイ)のより多くの使用、代謝インジケーターまたは他の蛍光インジケーター(たとえば、それぞれの異なる細胞タイプをタグ付けするための2つ以上の蛍光インジケーターであり、一方では、サンプルの中の第3の蛍光インジケーターは、代謝、細胞死、または、関心の何らかの他のプロセスを表す)も評価しながら単一のサンプルの中のより多くのタイプの細胞を識別すること、インキュベーターの中の個々のサンプルの中のより多くのタイプのアッセイ/個々の蛍光インジケーターの使用、および/または、インキュベーターの中の異なるサンプルの中のより多くのタイプのアッセイ/個々の蛍光インジケーターの使用を可能にすることができる。これらの利益は、単一のサンプルの中の単一の実験の複数の異なるアッセイの多重化を可能にすることによって、および/または、異なる実験の異なるアッセイが単一のインキュベーターの中のサンプルプレートの異なるウェルの中で実施されることを可能にすることによって、特定の数の実験/アッセイを実施するために必要とされる時間およびインキュベータースペースを低減させることによって、コストを低減させることが可能である。
本明細書における実施形態は、インキュベーターの中の自動化されたマルチサンプルイメージングと互換性がある様式で、そのような3つの(または、それ以上の)チャネルの顕微鏡的な蛍光イメージングプロセスに関係する方法およびシステムを提供する。これらの実施形態は、イメージング装置が明視野顕微鏡法および/または位相コントラスト顕微鏡法にも使用されることも可能にしながら、3つの(または、それ以上の)チャネルの蛍光イメージング装置を限られた体積/寸法の中へフィットさせることに伴う複雑さの増加に対する解決策を提供する。また、これらの実施形態は、3つの(または、それ以上の)励起帯域における励起光をサンプルにルーティングする分岐した光学経路を特定し、一方では、3つの(または、それ以上の)放出帯域におけるサンプルからの光をイメージセンサーにルーティングし、一方では、励起帯域における光を拒絶するという複雑な問題に対する解決策を提供する。これらの実施形態のうちのいくつかは、対応する3つの(または、それ以上の)チャネルの蛍光イメージングモジュールとペアにされる除去可能なモジュールの一部である位相ランプ(または、他の透過照明光源)を提供することを含む。そのようなペアリングは、位相ランプからの光が、ペアにされた蛍光イメージングモジュールを通過することができる波長を含むことを保証するために必要である可能性がある。そのような照射モジュールおよびペアにされた光学フィルターモジュールは、自動化されたモジュール検出および識別を促進させるためのバーコード、オンボードメモリー、または、他の特徴を含むことが可能であり、モジュールがミスマッチされる場合に、実験を実行する前にユーザーに警告するようになっている。
また、本明細書において提供されている実施形態は、光学モジュール(たとえば、位相ランプモジュール、光源、およびフィルターモジュール)を手動でスワップするために使用される装置に対する改善を含み、その光学モジュールは、イメージング装置の中でのそのようなモジュールの着座およびアライメントを改善し、また、ユーザーがそのような手動のスワッピングを実施することができる容易さを高める。さまざまな光学モジュールをシステムに連結するためにおよびシステムから解除するために、以前のシステムでは、別個のツールが必要とされた。ツールは、光学モジュールの中の小さな孔部を通して、対応するスクリューと整合することが困難であった。加えて、モジュールの中の光源をシステムの残りの部分のコントローラーおよび電源に電気的に連結するために使用される電気コネクターの配置および構成に部分的に起因して、光学モジュールを連結または解除するために必要とされる力は、多くのエンドユーザーが発生させるには困難であった。結果として、多くのエンドユーザーは、光学モジュールをスワップするための支援を必要としていた。
光学モジュールのフレキシブルな交換可能性は、それに限定されないが、(i)励起光をサンプルに方向付けるために、3つの異なる帯域の励起波長において3つの光源を活性化させること、および、3つの個別のフルオロフォア(たとえば、緑色、オレンジ色、および近赤外線(「NIR」))からの応答的に放出された放出光を検出すること、(ii)励起波長のうちの2つがForster共鳴エネルギー移動(「FRET」)ベースの測定(たとえば、ATP)に方向付けられた状態で、および、第3の帯域の励起波長が独立したフルオロフォア(たとえば、核ラベル)を識別する状態で、3つの異なる帯域の励起波長において3つの光源を活性化させること、ならびに、(iii)2つの異なる帯域の励起波長において光学モジュールの2つの光源のみを使用すること、および、2つの個別のフルオロフォア(たとえば、(a)緑色および赤色、または、(b)オレンジ色およびNIR)からの応答的に放出された放出光を検出することを含む、フルオロフォアを検出する方法の異なる組み合わせを可能にするように、システムが構成されることを可能にする。
加えて、3つの(または、それ以上の)帯域の光学モジュールの中のフィルターにマッチされた位相ランプは、また、位相および明視野イメージングが実施されることを有利に可能にするために(たとえば、蛍光イメージング情報を増強するために、および/または、独立したイメージ情報を提供するために、フルオロフォアを識別するためにイメージをさらに処理して洗練させるために、FRETを測定するために、または、何らかの他の利益を提供するために)、システムの中に含まれ得る。本開示の位相ランプモジュール(または、他の透過照明光源モジュール)の1つの利点は、特定の位相ランプモジュールが据え付けられたということを直接的に識別するというシステムの能力である。位相ランプのアイデンティティーを検出することは、有益には、無効な構成が存在しているとき(無効な構成では、位相ランプが所与の光学モジュールに関して正しくマッチしていない(それは、たとえば、位相ランプからの光が、イメージングされることとなる光学モジュールを通して透過されることを全体的にまたは部分的に阻止されることを結果として生じさせる可能性がある))をシステムが決定すること、および、実験(たとえば、1つまたは複数のアッセイを実施することを含む実験)が行われる前にユーザーに警告することを可能にする。
II.例示的なアーキテクチャー
図1は、動作環境100を示すブロック図であり、動作環境100は、たとえば、生細胞生物学的サンプルをアッセイするためのシステム105を含むかまたは必要とし、それは、コンピューティングデバイス200aと電気的に通信している蛍光顕微鏡115を含む。蛍光顕微鏡115は、インキュベーター108の中に位置付けされており、インキュベーター108は、温度、湿度、および/または他の環境パラメーターを制御し、生細胞サンプルの培養を促進させるように構成されており、それは、自動化された方式で蛍光顕微鏡115によってイメージングされ得る。インキュベーター180の中に位置決めされることによって、蛍光顕微鏡115は、サンプルがインキュベーター180から除去されることを必要とすることなく(そのプロセスは、サンプルを摂動させ、適用される実験的な条件に対するその成長/反応を修正する可能性がある)、サンプルをイメージングすることが可能である。下記に説明されている図16の方法300は、この動作環境100の中で実装され得る方法の実装形態を示している。
図1は、動作環境100を示すブロック図であり、動作環境100は、たとえば、生細胞生物学的サンプルをアッセイするためのシステム105を含むかまたは必要とし、それは、コンピューティングデバイス200aと電気的に通信している蛍光顕微鏡115を含む。蛍光顕微鏡115は、インキュベーター108の中に位置付けされており、インキュベーター108は、温度、湿度、および/または他の環境パラメーターを制御し、生細胞サンプルの培養を促進させるように構成されており、それは、自動化された方式で蛍光顕微鏡115によってイメージングされ得る。インキュベーター180の中に位置決めされることによって、蛍光顕微鏡115は、サンプルがインキュベーター180から除去されることを必要とすることなく(そのプロセスは、サンプルを摂動させ、適用される実験的な条件に対するその成長/反応を修正する可能性がある)、サンプルをイメージングすることが可能である。下記に説明されている図16の方法300は、この動作環境100の中で実装され得る方法の実装形態を示している。
蛍光顕微鏡115は、光学モジュール110を含み、光学モジュール110は、イメージングセンサー120と組み合わせて、落射蛍光イメージングを使用してインキュベーター180の中のサンプルをイメージングするために使用され得る。光学モジュール110は、3つの(または、それ以上の)光源を含み、3つの(または、それ以上の)光源は、サンプルの中のそれぞれのフルオロフォア(たとえば、関心のタンパク質または他の物質に選択的に結合することを促進させるための抗体または他の構造体に接合されたフルオロフォアを含む蛍光インジケーター)に対応する3つの(または、それ以上の)それぞれの帯域の励起波長において照射を提供するように構成されている。光学モジュール110は、3つの(または、それ以上の)光源からの光が対物レンズを介してサンプルに送達されるように、分岐された光学経路を提供するように構成されているダイクロイックミラー、フィルター、および/または、他の要素を追加的に含む。対物レンズは、光学モジュール110の一部であることが可能であり、または、それとは別個になっていることが可能である。また、光学モジュール110は、3つの(または、それ以上の)それぞれの帯域の放出波長において、対物レンズを通して収集された応答的に放出された蛍光光をイメージングセンサー120に送達し、サンプルの中の3つの異なるフルオロフォアの落射蛍光イメージングを促進させるように構成されている。
単一の光学モジュール110を使用して3つの異なるフルオロフォアを独立して落射蛍光的にイメージングすることができることは、さまざまな利益を提供する。それは、より複雑な3色(または、それ以上)アッセイを使用することを促進させることが可能である。それは、単一のサンプルの中の複数のアッセイまたは他の蛍光インジケーターをイメージングすることを促進させることが可能である(たとえば、特定のタイプの細胞に選択的に結合し、サンプルの中の細胞のアイデンティティーおよび細胞分裂局面の両方が決定されることを可能にする2色FUCCIアッセイおよび独立した蛍光インジケーター)。それは、すべてのインジケーター/アッセイが2セットの励起/放出帯域のみに一致するという要件を緩和することによって、フルオロフォア/アッセイ選択を促進させることが可能である(たとえば、2色光学モジュールの2つの利用可能な励起/放出帯域のうちの1つにマッチする最適でないインジケーターを選択する代わりに、より最適な蛍光インジケーターが、特定の使用のために選択され得る)。それは、単一の器具/インキュベーターの中のスペースがより効率的に使用されることを可能にすることによって、時間および他のコストを節約するために、同じインキュベーターの中に含まれる異なるサンプルの中の異なるセットのアッセイ/蛍光インジケーターをイメージングすることを促進させることが可能である。たとえば、第1および第2の異なる実験(それぞれの第1および第2のセットの蛍光インジケーター/アッセイ(それは、放出/励起波長に関してオーバーラップする可能性がある)を有している)は、同じインキュベーターの中のそれぞれのセットのウェルの中で実行され得る。追加的にまたは代替的に、単一の実験を実施するために使用されるウェルのサブセットの中に複数の異なるセットのアッセイ/蛍光インジケーターが存在している状態で、単一の実験が実行され、実験についての追加的なデータが同時に同じインキュベーターを使用して発生されることを可能にすることができる。単一の光学モジュール110を使用して3つの(または、それ以上の)異なるフルオロフォアを独立して落射蛍光的にイメージングすることができることは、追加的なもしくは代替的な利益、または、利益の組み合わせを提供することが可能である。
また、蛍光顕微鏡115は、位相コントラスト、明視野、または、他の形態のイメージングのために光を提供するように構成されている位相ランプ125(または、他の透過照明光源)を含む。光学モジュール110は、位相ランプ125から放出される光の少なくともいくらかを通すように構成されている。いくつかの例において、これは、位相ランプ125が狭帯域光源(たとえば、レーザー、LED)であること、および、光学モジュールが、狭帯域光源によって放出される狭帯域の波長にわたって光を通すように構成されていることを含むことが可能である。光学モジュール110および位相ランプ125の詳細は、(たとえば、図3~図15に関する)本明細書の他の場所で提供されている。
光学モジュール110は、異なる時間の期間の間に異なる蛍光インジケーター/アッセイをイメージングするために蛍光顕微鏡115を使用するために、(たとえば、本明細書の他の場所に説明されている実施形態に従って)ユーザースワップ可能にされ得る。これは、光学モジュール110を蛍光顕微鏡115の他のイメージングコンポーネントと(たとえば、イメージングセンサー120と)整合させることを促進させるために、ピン、スロット、または、他のアライメント特徴を有する光学モジュールを含むことが可能である。また、これは、3つの(または、それ以上の)光源に給電および制御することまたは何らかの他の機能性を提供することを促進させるために、1つまたは複数の電気コネクターを有する光学モジュール110を含むことが可能である。たとえば、光学モジュール110は、コンピューティングデバイス(たとえば、200、200a)が光学モジュール110を識別すること、ならびに/または、光学モジュール110から放出され得る、および/もしくは、光学モジュール110を使用してイメージングされ得る、光の波長の帯域を決定することを可能にするために、メモリーまたは他の電気コンポーネントを含むことが可能である。
また、位相ランプ125(または、他の透過照明光源)も、ユーザースワップ可能にされ得る。これは、すべての可能な位相ランプ125と互換性があるわけではない可能性のある、異なるパス帯域(すなわち、サンプルからの、その帯域の波長の光は、光学モジュール110を通過され、イメージングセンサー120へ至ることが可能である)を有する異なるスワップ可能な光学モジュール110に起因する可能性がある。たとえば、第1の位相ランプ125は、ある意味で「最適」であるかもしれないが(たとえば、特定のタイプのサンプルを位相コントラストイメージングすることに関して)、実験を実施するために(たとえば、関心の特定のアッセイをイメージングすることを促進させるために)選択された光学モジュール110の任意のパス帯域とそれほどオーバーラップしない帯域の波長の光を作り出すことが可能である。したがって、第1の位相ランプ125モジュールは、選択された光学モジュール110の完全にまたは実質的にパス帯域の中の波長において光を放出する第2の位相ランプ125モジュールとスワップされ得る。
そのようなスワップ可能な位相ランプ125モジュールは、コンピューティングデバイス(たとえば、200、200a)が位相ランプ125モジュールを識別すること、および/または、位相ランプ125モジュールから放出され得る光の波長の帯域を決定することを可能にするために、メモリーまたは他の電気コンポーネントを含むことが可能である。このアイデンティティー/情報は、蛍光顕微鏡115の中に据え付けられている光学モジュール110の同様の情報/アイデンティティーと自動的に比較され、据え付けられたモジュールが互換性があるということを保証する(たとえば、据え付けられた光学モジュール110が、据え付けられた位相ランプ125モジュールから放出された光の波長を通すことが可能であり、その組み合わせが、位相ランプ125モジュールを使用して、位相コントラスト、明視野、または、何らかの他のイメージングモダリティを介して、サンプルをイメージングするために使用され得るようになっているということを保証する)ことが可能である。非互換性が検出される場合には、システム105を使用して自動化されたイメージング検査または他の実験を開始する前に、ユーザーが警告され得る。
図2は、例示的な実装形態によるコンピューティングデバイス200の例を図示するブロック図であり、それは、直接的または間接的のいずれかで、動作環境100とインターフェースするように構成されている。コンピューティングデバイス200は、図16に示されて下記に説明されている方法の機能を果たすために使用され得る。とりわけ、コンピューティングデバイス200は、それに限定されないが、単一の容器の中のまたは複数の容器の中の単一の生物学的サンプルの中の3つ以上の蛍光色のイメージを取得するために単一の光学モジュールを使用することを含む、1つまたは複数の機能を果たすように構成され得る。次いで、取得されるイメージは、3つ以上の蛍光色に対応するフルオロフォアおよび/またはそれに接合された物質の特性に関係付けられるイメージングされる生物学的サンプルについて追加的な分析を実施するために使用され得る。また、機能は、信号光学モジュールおよび他の光源を使用して、サンプルの明視野イメージ、位相コントラストイメージ、または、何らかの他のイメージを取得するために、単一の光学モジュール(たとえば、位相ランプ)の一部ではない光源を使用することを含むことも可能である。
単一のサンプルの中でイメージングされた3つ以上の色の利用可能性は、より複雑な多色分析またはアッセイ(たとえば、完全な細胞周期を観察する3色FUCCIアッセイ)、単一のサンプルの中でのまたは異なるサンプルの中での複数の異なるアッセイの実施(たとえば、細胞アポトーシスのためにAnnexin NIRアッセイと併用した2色FUCCIアッセイ(緑色/オレンジ色))、互いに組み合わせた、および/または、1つもしくは複数の多色アッセイ(たとえば、それぞれの細胞タイプを識別するための2つの蛍光レポーター、および、3色免疫細胞キリングアッセイの一部として使用され得る、細胞アポトーシスのためのAnnexin NIRアッセイ)と組み合わせた、1つまたは複数の蛍光インジケーターの使用、同じインキュベーターの中に位置付けされている異なるサンプルの中のインジケーター/アッセイの異なるセットの使用、または、他の例を促進させる。また、3つ以上の色の利用可能性は、選択されたインジケーター/アッセイに関する要件を緩和し、より大きいフレキシビリティーを可能にすることができる。たとえば、特定のアッセイが特定の色にのみ利用可能である場合には、その色は、アッセイのために予約され得、一方では、他の色は、細胞タイプ特有インジケーターまたは他の用途(たとえば、より多くの色オプションが利用可能であるアッセイの色チャネル)のために使用され得る。
コンピューティングデバイス200は、プロセッサー202を有しており、また、通信インターフェース204、データストレージ206、出力インターフェース208、およびディスプレイ210を有しており、それぞれが、通信バス212に接続されている。また、コンピューティングデバイス200は、コンピューティングデバイス200の中の通信、および、コンピューティングデバイス200と他のデバイス(たとえば、図示せず)との間の通信を可能にするためのハードウェアを含むことが可能である。ハードウェアは、たとえば、トランスミッター、レシーバー、およびアンテナを含むことが可能である。
通信インターフェース204は、ワイヤレスインターフェースおよび/または1つもしくは複数のワイヤードインターフェースであることが可能であり、それは、1つもしくは複数のネットワーク214への、または、1つもしくは複数のリモートコンピューティングデバイス216(たとえば、タブレット216a、パーソナルコンピューター216b、ラップトップコンピューター216c、およびモバイルコンピューティングデバイス216d)への短距離通信および長距離通信の両方を可能にする。そのようなワイヤレスインターフェースは、1つまたは複数のワイヤレス通信プロトコル(たとえば、Bluetooth、Wi-Fi(たとえば、電気電子技術者協会(IEEE) 802.11プロトコル)、Long-Term Evolution(LTE)、セルラー通信、近距離無線通信(NFC)など、および/または他のワイヤレス通信プロトコル)の下での通信を提供することが可能である。そのようなワイヤードインターフェースは、イーサネットインターフェース、ユニバーサルシリアルバス(USB)インターフェース、または、同様のインターフェースを含み、ワイヤー、ツイストペアのワイヤー、同軸のケーブル、光学リンク、光ファイバーリンク、または、他の物理的な接続を介してワイヤードネットワークに通信することが可能である。したがって、通信インターフェース204は、1つまたは複数のデバイスから入力データを受信するように構成され得、また、出力データを他のデバイスに送るように構成され得る。
また、通信インターフェース204は、ユーザー入力デバイス、たとえば、キーボード、キーパッド、タッチスクリーン、タッチパッド、コンピューターマウス、トラックボール、および/または、他の同様のデバイスなどを含むことが可能である。
データストレージ206は、プロセッサー202によって読み取られるかまたはアクセスされ得る1つまたは複数のコンピューター可読のストレージ媒体を含むか、または、その形態をとることが可能である。コンピューター可読のストレージ媒体は、揮発性のおよび/または不揮発性のストレージコンポーネント(たとえば、光学的な、磁気的な、有機の、または、他のメモリーまたはディスクストレージなど)を含むことが可能であり、それは、全体的にまたは部分的にプロセッサー202と一体化され得る。データストレージ206は、非一時的なコンピューター可読媒体と考えられる。いくつかの例において、データストレージ206は、単一の物理的なデバイス(たとえば、1つの光学的な、磁気的な、有機の、または、他のメモリーまたはディスクストレージユニット)を使用して実装され得、一方では、他の例では、データストレージ206は、2つ以上の物理的なデバイスを使用して実装され得る。
したがって、データストレージ206は、非一時的なコンピューター可読のストレージ媒体であり、実行可能な命令218が、その上に記憶されている。命令218は、コンピューター実行可能なコードを含む。命令218がプロセッサー202によって実行されるときに、プロセッサー202は、機能を果たすことを引き起こされる。そのような機能は、それに限定されないが、単一の光学モジュールを使用し、単一の容器の中のもしくは複数の容器の中の単一の生物学的サンプルの中の3つ以上の蛍光色のイメージを取得すること、単一の光学モジュールに加えて位相ランプもしくは他の光源を使用し、単一の光学モジュールと組み合わせて、生物学的サンプルの明視野イメージ、位相コントラストイメージ、もしくは、何らかの他のイメージを取得すること、および/または、取得されたイメージに基づいて分析を実施することを含む。
プロセッサー202は、汎用プロセッサーまたは専用プロセッサー(たとえば、デジタル信号プロセッサー、特定用途向け集積回路など)であることが可能である。プロセッサー202は、通信インターフェース204から入力を受信し、入力を処理し、出力を発生させることが可能であり、出力は、データストレージ206の中に記憶され、ディスプレイ210に出力される。プロセッサー202は、実行可能な命令218(たとえば、コンピューター可読のプログラム命令)を実行するように構成され得、実行可能な命令218は、データストレージ206の中に記憶されており、本明細書で説明されているコンピューティングデバイス200の機能性を提供するように実行可能である。
出力インターフェース208は、ディスプレイ210に、または、同様に他のコンポーネントに情報を出力する。したがって、出力インターフェース208は、通信インターフェース204と同様であることが可能であり、同様に、ワイヤレスインターフェース(たとえば、トランスミッター)またはワイヤードインターフェースであることが可能である。出力インターフェース208は、たとえば、1つまたは複数の制御可能なデバイスにコマンドを送ることが可能である。
また、図2に示されているコンピューティングデバイス200は、たとえば、システム105と通信している、動作環境100の中のローカルコンピューティングデバイス200a(図1)を表している可能性がある。このローカルコンピューティングデバイス200aは、下記に説明されている方法300のステップのうちの1つもしくは複数を実施することが可能であり、ユーザーから入力を受信することが可能であり、ならびに/または、イメージデータおよびユーザー入力をコンピューティングデバイス200に送り、方法300のステップのうちのすべてもしくはいくつかを実施することが可能である。
図16は、生細胞生物学的サンプルの中のフルオロフォアをイメージングするための例示的な方法300のフローチャートを示している。方法300は、第1の生物学的サンプルおよび蛍光顕微鏡を整合させるステップ(305)であって、第1の生物学的サンプルが蛍光顕微鏡の視野の中に位置付けされるようになっており、第1の生物学的サンプルは、(i)第1の帯域の励起波長の光による照射に応答して第1の帯域の放出波長の光を放出する第1のフルオロフォア、(ii)第2の帯域の励起波長の光による照射に応答して第2の帯域の放出波長の光を放出する第2のフルオロフォア、および、(iii)第3の帯域の励起波長の光による照射に応答して第3の帯域の放出波長の光を放出する第3のフルオロフォアを含む、ステップ(305)と、蛍光顕微鏡を使用して第1の生物学的サンプルの1セットのイメージを取得するステップ(310)であって、1セットのイメージのイメージ同士は、フォーカス設定に関して異なっている、ステップ(310)と、1セットのイメージに基づいて、第1の、第2の、および第3の帯域の放出波長に関する第1の、第2の、および第3のインフォーカス設定をそれぞれ決定するステップ(315)と、第1の時間の期間の間に、第1の光源を使用し、第1の帯域の励起波長の光によって第1の生物学的サンプルを照射するステップと、第1のインフォーカス設定に従って蛍光顕微鏡を動作させ、蛍光顕微鏡のイメージセンサーを介して、第1の帯域の放出波長の光の第1のイメージを取得するステップ(320)と、第2の時間の期間の間に、第2の光源を使用し、第2の帯域の励起波長の光によって第1の生物学的サンプルを照射するステップと、第2のインフォーカス設定に従って蛍光顕微鏡を動作させ、イメージセンサーを介して、第2の帯域の放出波長の光の第2のイメージを取得するステップ(325)と、第3の時間の期間の間に、第3の光源を使用し、第3の帯域の励起波長の光によって第1の生物学的サンプルを照射するステップと、第3のインフォーカス設定に従って蛍光顕微鏡を動作させ、イメージセンサーを介して、第3の帯域の放出波長の光の第3のイメージを取得するステップ(330)とを含む。図16に示されている方法300は、たとえば、図2のコンピューティングデバイス200とともに使用され得る方法の例を表している。いくつかの場合において、システムのコンポーネントは、機能を実施するように構成され得、コンポーネントが、そのような実施を可能にするためのハードウェアおよび/またはソフトウェアを備えて構成および構造化されるようになっている。システムのコンポーネントは、たとえば、特定の様式で動作されるときなどに、機能を実施するために適合されるように、機能を実施することができるように、または、機能を実施するのに適した状態になるように配置され得る。方法300は、ブロック305~330のうちの1つまたは複数によって図示されているような1つまたは複数の動作、機能、または作用を含むことが可能である。ブロックはシーケンシャルな順序で図示されているが、これらのブロックのうちのいくつかは、並列に、および/または、本明細書で説明されているものとは異なる順序でも実施され得る。また、さまざまなブロックが、所望の実装形態に基づいて、より少ないブロックへと組み合わせられ、追加的なブロックへと分割され、および/または、除去され得る。
本明細書で開示されているこのおよび他のプロセスおよび方法に関して、フローチャートは、本例の1つの可能な実装形態の機能性および動作を示しているということが理解されるべきである。この点において、それぞれのブロックは、プログラムコードのモジュール、セグメント、または一部分を表すことが可能であり、それは、プロセスにおける特定の論理機能またはステップを実装するためにプロセッサーによって実行可能な1つまたは複数の命令を含む。プログラムコードは、任意のタイプのコンピューター可読媒体またはデータストレージ(たとえば、ディスクまたはハードドライブを含むストレージデバイスなど)の上に記憶され得る。さらに、プログラムコードは、機械可読フォーマットでコンピューター可読のストレージ媒体の上にコード化され得、または、他の非一時的な媒体もしくは製造の物品の上にコード化され得る。コンピューター可読媒体は、非一時的なコンピューター可読媒体またはメモリー、たとえば、短い時間の期間にわたってデータを記憶するコンピューター可読媒体など、たとえば、レジスターメモリー、プロセッサーキャッシュ、およびランダムアクセスメモリー(RAM)などを含むことが可能である。また、コンピューター可読媒体は、非一時的な媒体、たとえば、リードオンリーメモリー(ROM)、光学ディスクまたは磁気ディスク、コンパクトディスクリードオンリーメモリー(CD-ROM)のような、二次的なまたは永続的な長期ストレージなどを含むことが可能である。また、コンピューター可読媒体は、任意の他の揮発性のまたは不揮発性のストレージシステムであることが可能である。コンピューター可読媒体は、たとえば、有形のコンピューター可読のストレージ媒体であると考えられ得る。
加えて、図16の中の、ならびに、本明細書で開示されている他のプロセスおよび方法の中のそれぞれのブロックは、プロセスにおける特定の論理機能を果たすようにワイヤー接続されている回路を表すことが可能である。当業者によって合理的に理解されることとなるように、関与する機能性に応じて、実質的に同時のまたは逆の順序を含む、示されているかまたは議論されているものから異なる順序で機能が実行され得る、代替的な実装形態は、本開示の例の範囲の中に含まれる。
III.例示的な光学モジュール
図3~図5および図13は、イメージセンサー120を使用して生細胞生物学的サンプル130の中のフルオロフォアをイメージングするための光学モジュール110のさまざまな構成および実施形態を簡略図で示している。光学モジュール110は、フィルター、発光体、および、他の要素を含み、それらは、少なくとも3つの異なる帯域の励起波長で、独立して制御可能な励起光を提供し、少なくとも3つの対応する帯域の放出波長で光を通過させるように構成されている(図3、図4、および図5は、3色構成を示しており、図13は、4色の構成を示している)。また、光学モジュール110は、イメージセンサー120によってイメージングされることとなるサンプル130を通過した、および/または、サンプル130によって散乱された、位相ランプ125(または、他の透過照明光源)からの光を通すように構成されている。
図3~図5および図13は、イメージセンサー120を使用して生細胞生物学的サンプル130の中のフルオロフォアをイメージングするための光学モジュール110のさまざまな構成および実施形態を簡略図で示している。光学モジュール110は、フィルター、発光体、および、他の要素を含み、それらは、少なくとも3つの異なる帯域の励起波長で、独立して制御可能な励起光を提供し、少なくとも3つの対応する帯域の放出波長で光を通過させるように構成されている(図3、図4、および図5は、3色構成を示しており、図13は、4色の構成を示している)。また、光学モジュール110は、イメージセンサー120によってイメージングされることとなるサンプル130を通過した、および/または、サンプル130によって散乱された、位相ランプ125(または、他の透過照明光源)からの光を通すように構成されている。
光学モジュール110は、第1の光源135を含み、第1の光源135は、第1の帯域の励起波長で第1の光を放出するように構成されている。第1のフィルター136が、第1の光源135の第1の光学経路137の中に配置されている。第1のフィルター136は、1つまたは複数の波長の光を通し、1つまたは複数の他の波長の光を反射するように構成されている。光学モジュール110は、第2の光源140をさらに含み、第2の光源140は、第2の帯域の励起波長で第2の光を放出するように構成されている。第2のフィルター141が、第2の光源140の第2の光学経路142の中に配置されている。第2のフィルター141は、1つまたは複数の波長の光を通し、1つまたは複数の他の波長の光を反射するように構成されている。また、光学モジュール110は、第3の光源145を含み、第3の光源145は、第3の帯域の励起波長で第3の光を放出するように構成されている。第3のフィルター146は、第3の光源145の第3の光学経路147の中に配置されている。第3のフィルター146は、1つまたは複数の波長の光を通し、1つまたは複数の他の波長の光を反射するように構成されている。サンプル130に透過される励起光の方向、および/または、光学モジュール110を通してイメージセンサー120へ通されるイメージ光(たとえば、蛍光放出光、明視野、位相コントラスト、または、他の散乱および/もしくは透過されたイメージ光)の方向が、光学経路の上の矢印によって図の中に示されている。
フィルター136、141、146は、特定の帯域の波長の反射および/または吸収ならびに特定の他の帯域の波長の透過を促進させるようにさまざまな方式で構成されているさまざまな材料またはコンポーネントを含むことが可能である。たとえば、136、141、146は、ダイクロイックミラーであることが可能であり、ダイクロイックミラーは、多くの交互になった材料の層から構成されており、その組成、厚さ、および順序は、所望のパス帯域、ストップ帯域、反射帯域、または、他の波長選択的な光学的挙動を提供するために特定され得る。
光学モジュール110において、第1の光学経路137、第2の光学経路142、および、第3の光学経路147は、一次的透過光学経路150に沿って収束し、一次的透過光学経路150は、対物レンズ165を介して、生細胞生物学的サンプル130に向けて方向付けられるように構成されている。また、モジュールは、放出フィルター155を含み、放出フィルター155は、一次的放出光学経路156の中に位置付けされており、放出フィルター155は、光源134、140、145によって照射されることに応答して、生細胞生物学的サンプル130の中のフルオロフォアによって放出された光を通すように構成されており、また、位相ランプ125から放出される光の少なくともいくらかを通すように構成されている。一次的放出光学経路156は、イメージングセンサー120において終端する。放出フィルター155は、サンプル130の中のそれぞれの第1の、第2の、および第3のフルオロフォアを介して、光源134、140、145によって放出される第1の、第2の、および第3の励起波長に対応する、少なくとも第1の帯域、第2の帯域、および第3の帯域の放出波長の光を通すように構成されている。また、放出フィルター155は、位相ランプ125から放出される光の波長の少なくともいくらかを通すように構成されている。実際には、これは、位相ランプの光源の波長を、第1の、第2の、または第3の帯域の放出波長のうちの1つまたは複数にマッチさせることを含むことが可能である。
また、放出フィルター155は、第1の帯域、第2の帯域、および第3の帯域の励起波長の光を拒絶する(たとえば、反射する、吸収する)ように構成され得る。代替的に、他のフィルター136、141、146の反射作用は、光源135、140、145からの励起光がイメージセンサー120によって受け取られることを防止するために依存され得る。さらに、放出フィルター155は、また、生物学的サンプル130からの人工的な自家発光を反射するかもしくはその他の方法で拒絶し、および/または、生物学的サンプル130の中に存在し得る他の蛍光色素からの光を反射するように構成され得る。
光学モジュール110は、対物レンズ165またはイメージセンサー120のうちの一方または両方を含むことが可能であるということに留意されたい。代替的に、光学モジュール110は、対物レンズ165またはイメージセンサー120のうちの一方または両方に除去可能な連結されるように構成され得る。これは、たとえば、個々のスワップ可能な光学モジュールのコストを低減させるために行われ得る。
図3に示されている例示的な実装形態において、第1のフィルター136は、第1の帯域の励起波長の光を通し、第2の帯域および第3の帯域の励起波長の光、ならびに、第1の帯域、第2の帯域、および第3の帯域の放出波長の光、ならびに、位相ランプ125によって放出される所定の帯域の波長(それは、第1の、第2の、または第3の帯域の放出波長のうちの1つまたは複数とオーバーラップする可能性がある)の光を反射するように構成されている。第2のフィルター141は、第3の帯域の励起波長、ならびに、第1の帯域、第2の帯域、および第3の帯域の放出波長、ならびに、位相ランプ波長の光を通し、第2の帯域の励起波長の光を反射するように構成されている。第3のフィルター146は、第1の帯域、第2の帯域、および第3の帯域の放出波長、ならびに、位相ランプ波長の光を通し、第3の帯域の励起波長の光を反射するように構成されている。
図3に示されているように、第1の光源135、第2の光源140、および第3の光源145は、同じ平面の中に直列に配置されている。図3の中の要素の配置は、他の2つの寸法において(垂直方向において、ならびに、図3の平面の中および外へ)より小さい寸法を有しながら、1つの寸法において(図3の中の水平方向において)かなり長い光学モジュール110を結果として生じさせる。これは、いくつかの用途では望ましい可能性がある。しかし、いくつかの用途では、光学モジュール110の最大寸法を低減させること、ならびに/または、光学モジュール110の形状およびサイズを特定の形状および/もしくはサイズと一致させること(たとえば、インキュベーターの中に、または、自動化されたイメージングシステムのガントリーの上に、モジュールをフィットさせること)が有益である可能性がある。したがって、光学モジュール110の要素の配置は、たとえば、さまざまな光学経路を折り曲げ、入れ子にし、および/もしくは分岐させるために、ならびに/または、さまざまな光学経路の方向および/もしくは順序を変化させるために修正され得る。
図4に示されている別の例示的な実装形態において、第1のフィルター136は、第1の帯域および第2の帯域の励起波長の光を通し、第3の帯域の励起波長の光、ならびに、第1の帯域、第2の帯域、および第3の帯域の放出波長の光を反射するように構成されている。第2のフィルター141は、第2の帯域の励起波長の光を通し、第1の帯域の励起波長の光を反射するように構成されている。そして、第3のフィルター146は、第1の帯域、第2の帯域、および第3の帯域の放出波長の光を通し、第3の帯域の励起波長の光を反射するように構成されている。したがって、図4に示されている実装形態では、第1の光源135は、第1の光学経路137が第1の光源135において開始し、第2のフィルター141において反射し、第1のフィルター136を通過し、一次的透過光学経路150に沿って光学モジュール110を退出するように配置されている。第2の光源140は、第2の光学経路142が第2の光源140において開始し、第2のフィルター141を通過し、次いで、第1のフィルター136を通過し、一次的透過光学経路150に沿って光学モジュール110を退出するように配置されている。第3の光源145は、第3の光学経路147が第3の光源145において開始し、第3のフィルター146において第1のフィルター136へ反射し、第1のフィルター136において反射し、一次的透過光学経路150に沿って光学モジュール110を退出するように配置されている。生細胞生物学的サンプル130の中のフルオロフォアによって放出される光のための一次的放出光学経路156は、第1のフィルター136において反射し、第3のフィルター146を通過し、放出フィルター155を通過し、光学モジュール110を退出する。
図4の例示的な実装形態では、第2の光源140および第3の光源145は、互いに平行に配置されており、第1の光源135は、第2の光源140および第3の光源145に対して90度の角度で配置されている。この配置は、ハウジング111の中に3つの光源を含む、よりコンパクトな光学モジュール110を可能にする。
図5に示されているさらに別の随意的な実装形態において、第1のフィルター136は、第1の帯域の励起波長の光を通すように構成されている。また、第1のフィルター136は、第2の帯域および第3の帯域の励起波長の光、ならびに、第1の帯域、第2の帯域、および第3の帯域の放出波長の光を反射するように構成されている。第2のフィルター141は、第1の帯域、第2の帯域、および第3の帯域の放出波長の光を通すように構成されている。また、第2のフィルター141は、第2の帯域および第3の帯域の励起波長の光を反射するように構成されている。そして、第3のフィルター146は、第3の帯域の励起波長の光を通すように構成されている。また、第3のフィルター146は、第2の帯域の励起波長の光を反射するように構成されている。
したがって、図5に示されている実装形態では、第1の光源135は、第1の光学経路137が第1の光源135において開始し、第1のフィルター136を通過し、一次的透過光学経路150に沿って光学モジュール110を退出するように配置されている。第2の光源140は、第2の光学経路142が第2の光源140において開始し、第3のフィルター146において第2のフィルター141へ反射し、第2のフィルター141において第1のフィルター136へ反射し、第1のフィルター136において反射し、一次的透過光学経路150に沿って光学モジュール110を退出するように配置されている。第3の光源145は、第3の光学経路147が第3の光源145において開始し、第3のフィルター146を通過して第2のフィルター141に向かい、第2のフィルター141において第1のフィルター136へ反射し、第1のフィルター136において反射し、一次的透過光学経路150に沿って光学モジュール110を退出するように配置されている。さらに、生細胞生物学的サンプル130の中のフルオロフォアによって光が放出される一次的放出光学経路156は、第1のフィルター136において反射し、第2のフィルター141を通過し、放出フィルター155を通過し、光学モジュール110を退出する。
図5に示されているように、第1の光源135および第3の光源145は、平行に配置されており、第2の光源140は、第1の光源135および第3の光源145に対して90度の角度で配置されている。この配置は、ハウジング111の中に3つの光源を含む、よりコンパクトな光学モジュール110を可能にする。
図3~図5および本明細書の他の場所に示されている例示的な実装形態は、すべてが完全に同じ平面(すなわち、図の平面)の中にある光源光学経路を有する光学モジュールを示しているが、たとえば、光学モジュールの全体的なサイズを低減させるために、ならびに/または、光学モジュールの形状およびサイズを利用可能なスペースに(たとえば、ガントリーおよび/もしくは自動化されたインキュベーター内イメージング装置の中に)一致させるために、他の実施形態も可能であるということに留意されたい。
たとえば、図5に示されている実装形態の第2の光源140および第3のフィルター146は、図5の平面の中へ(または、そこから外へ)90度(または、何らかの他の角度)回転させられ得る。そのような実装形態、および、その追加的な詳細が、図6~図11にさらに図示されている。図6~図11に図示されているように、第1の、第2の、および第3の光源135、140、145、第1の、第2の、および第3のフィルター136、141、146、ならびに、放出フィルター155は、すべてハウジング111の中に含まれている。ハウジング111は、第1の開口部112を含み、第1の開口部112は、生物学的サンプル130を照射するために一次的透過光学経路150が通過することを可能にするように配置されている。また、ハウジング111は、第2の開口部113を含み、第2の開口部113は、イメージングセンサー120に向けて一次的放出光学経路156が通過することを可能にするように配置されている。第1および第2の開口部112、113は、光学デバイス(たとえば、レンズ、フィルター、ミラーなど)および/またはセンサー表面を含むことが可能である。1つの随意的な例において、放出フィルター155が、第2の開口部113の中に配設され得る。図3~図8に示されている例示的な光学モジュール110では、ハウジング111は、垂直方向に延在する主本体部111aと、そこから水平方向に延在する片持ち梁式の延長部111bとを含む。ハウジング111の主本体部111aは、第1の光源135および第3の光源145を同じ平面の中に含む。そして、ハウジング111の片持ち梁式の延長部111bは、第2の光源140を含み、第2の光源140は、第1の光源135および第3の光源145に対して90度の角度で配置されている。
換言すれば、第2の光源140および第3のフィルター146は、第3の光源145の中心を通る垂直方向軸線の周りに90度回転されている。この配置は、第1および第3の光源135、145の平面の後ろに第2の光源140を設置し、第2の光学経路142が第3のフィルター146に方向付けられるようになっており、第3のフィルター146において、光が上向きに反射される。そのような配置は、スペースの限られた用途において特に有益である可能性がある。たとえば、先述の配置は、下記に説明されているような自動化されたインキュベーター内の組み合わされた落射蛍光および明視野/位相コントラストイメージングシステムの中への一体化のために、光学モジュールがコンパクトなままであることを可能にし、一方で、光学モジュールがユーザーによって容易にスワップ可能であることも可能にし、したがって、イメージングシステムの有用性および再構成可能性を拡張させる。
本明細書で議論されている光源135、140、145は、生物学的サンプル130に光を送るかまたは生物学的サンプル130を照射することができる任意のデバイスおよび/またはアッセンブリをそれぞれ含むことが可能である。例示的な光源は、1つまたは複数のランプおよび関連のオプティクスを含むことが可能である。例示的なランプは、なかでも、白熱(たとえば、ハロゲンまたはタングステンフィラメント)ランプ、アーク(たとえば、水銀、水銀-キセノン、またはキセノン)ランプ、発光ダイオード(「LED」)、および/またはレーザーを含むことが可能である。関連のオプティクス(「ソースオプティクス」)は、光ファイバーおよび/または液体光ガイド、1つまたは複数のレンズ、フィルター(たとえば、偏光または波長ベースのフィルターなど)、回折格子、ミラー、および/またはマスクなどを含むことが可能である。関連のオプティクスは、なかでも、サンプルに方向付けられる光の強度、波長、偏光、位相、方向、および/または形状を選択/調節することが可能である。1つの随意的な実装形態において、第1の光源135、第2の光源140、および、第3の光源145は、LED、(たとえば、光源から出力された光をコリメートするための、および/または、出力された光の焦点を対物レンズの無限焦点または他の焦点にマッチさせるための)少なくとも2つのレンズ、および、シングルバンドパスダイクロイックフィルターをそれぞれ含む。
光学モジュールの光源から放出される励起波長の第1の、第2の、第3の、および/または、追加的な帯域の特定の境界線は、用途に従って(たとえば、利用可能なフルオロフォアまたは関心対象の励起スペクトルに従って、適切なLEDもしくは他の発光要素、および/または、関連のフィルター、ミラー、レンズ、対物レンズ、または、他の光学要素の利用可能性に従って)特定され得る。1つの随意的な実装形態において、第1の帯域の励起波長は、453nmから485nmの範囲にあり、対応するフルオロフォアが緑色(または、より長い波長)光を放出することを引き起こす青色光に大部分が対応している。第2の帯域の励起波長は、546nmから568nmの範囲にあり、対応するフルオロフォアがオレンジ色(または、より長い波長)光を放出することを引き起こすライム色光に大部分が対応している。そして、第3の帯域の励起波長は、648nmから674nmの範囲にあり、対応するフルオロフォアが近赤外線(NIR)光を放出することを引き起こす赤色光に大部分が対応している。さらなる実装形態において、この随意的な実施形態の先述の範囲の境界は、+/-3nmだけ変化することが可能である。
別の随意的な実装形態において、第1の帯域の放出波長は、494nmから533nmの範囲にあり、緑色光に大部分が対応している。第2の帯域の放出波長は、576nmから639nmの範囲にあり、オレンジ色光に大部分が対応している。そして、第3の帯域の放出波長は、686nmから756nmの範囲にあり、NIR光に大部分が対応している。さらなる実装形態において、先述の範囲の境界は、+/-3nmだけ変化することが可能である。
いくつかの例において、光学モジュール110は、第4の帯域の励起波長の第4の光を放出するように構成されている第4の光源160を含むことが可能である。そのような光学モジュール110の例示的な実装形態が、図13に示されている。この実装形態における光学モジュール110は、第4の光源160の第4の光学経路162の中に配置されている第4のフィルター161も含む。第4のフィルター161は、1つまたは複数の波長の光を通し、1つまたは複数の波長の光を反射するように構成されている。そして、放出フィルター155は、第4の帯域の放出波長の光を通し、第4の帯域の励起波長の光を反射するようにさらに構成されている。第4の光源160を追加することは、生物学的サンプル130の中の第4のフルオロフォアを見るための能力を向上させ、また、異なる光源およびフィルターならびに対応する構成を備えた別個の光学モジュールに頼ることなく、さらに多くの数のアッセイを実行するための能力を向上させる。
図13に示されている例示的な実装形態において、第1のフィルター136は、第1の帯域の励起波長の光を通し、第4の帯域の励起波長の光を反射するように構成されている。第2のフィルター141は、第1の帯域、第2の帯域、第3の帯域、および第4の帯域の放出波長の光を通し、第2の帯域および第3の帯域の励起波長の光を反射するように構成されている。第3のフィルター146は、第3の帯域の励起波長の光を通し、第2の帯域の励起波長の光を反射するように構成されている。そして、第4のフィルター161は、第1の帯域および第4の帯域の励起波長の光を通し、第2の帯域および第3の帯域の励起波長の光、ならびに、第1の帯域、第2の帯域、第3の帯域、および第4の帯域の放出波長の光を反射するように構成されている。
図13に示されている例示的な実装形態において、第1の光源135は、第1の光学経路137が第1の光源135において開始し、第1のフィルター136を通過し、次いで、第4のフィルター161を通過し、一次的透過光学経路150に沿って光学モジュール110を退出するように配置されている。第2の光源140は、第2の光学経路142が第2の光源140において開始し、第3のフィルター146において第2のフィルター141へ反射し、第2のフィルター141において第4のフィルター161へ反射し、第4のフィルター161において反射し、一次的透過光学経路150に沿って光学モジュール110を退出するように配置されている。第3の光源145は、第3の光学経路147が第3の光源145において開始し、第3のフィルター146を通過して第2のフィルター141に向かい、第2のフィルター141において第4のフィルター161へ反射し、第4のフィルター161において反射し、一次的透過光学経路150に沿って光学モジュール110を退出するように配置されている。第4の光源160は、第4の光学経路162が第4の光源160において開始し、第1のフィルター136において反射し、第4のフィルター161を通過し、一次的透過光学経路150に沿って光学モジュール110を退出するように配置されている。そして、生細胞生物学的サンプル130の中のフルオロフォアによって放出される光のための一次的放出光学経路156は、第4のフィルター161において反射し、第2のフィルター141を通過し、放出フィルター155を通過し、光学モジュール110を退出する。図13に示されているように、第1の光源135および第3の光源145は、互いに平行に配置されており、第2の光源140および第4の光源160は、第1の光源135および第3の光源145に対して90度の角度でそれぞれ配置されている。この配置は、ハウジング111の中に4つの光源を含むコンパクトな光学モジュール110を可能にする。
そのような第4の帯域の放出波長は、453nmよりも短い波長を含むことが可能であり、紫色光に大部分が対応することが可能であり、対応する第4の帯域の放出波長は、青色光に大部分が対応することが可能である。
IV.例示的なシステム
図1、図3、図4、図5、および図13に示されている本開示の第2の態様において、生細胞生物学的サンプル130をアッセイするためのシステム105が提供される。システム105は、本開示の第1の態様による光学モジュール110を含む。また、システム105は、蛍光顕微鏡115を含み、蛍光顕微鏡115は、光学モジュール110を包含しており、光学モジュール110は蛍光顕微鏡115に除去可能に連結されている。蛍光顕微鏡115は、少なくとも1つの対物レンズ165を有している。システム105は、イメージングセンサー120をさらに含み、イメージングセンサー120は、生細胞生物学的サンプル130の中のフルオロフォアによって放出された光のために、および/または、対物レンズ165からサンプル130を通して透過されたおよび/またはサンプル130によって散乱された位相ランプ125(または、他の透過照明光源、たとえば、位相コントラストイメージングのためではなく明視野イメージングのための照明を提供するように構成されている光源)からの光のために、一次的放出光学経路の中に配置されている。そして、システム105は、位相ランプ125を含み、位相ランプ125は、蛍光顕微鏡115に除去可能に連結されており、一次的透過光学経路150の終端端部に配置されている。
図1、図3、図4、図5、および図13に示されている本開示の第2の態様において、生細胞生物学的サンプル130をアッセイするためのシステム105が提供される。システム105は、本開示の第1の態様による光学モジュール110を含む。また、システム105は、蛍光顕微鏡115を含み、蛍光顕微鏡115は、光学モジュール110を包含しており、光学モジュール110は蛍光顕微鏡115に除去可能に連結されている。蛍光顕微鏡115は、少なくとも1つの対物レンズ165を有している。システム105は、イメージングセンサー120をさらに含み、イメージングセンサー120は、生細胞生物学的サンプル130の中のフルオロフォアによって放出された光のために、および/または、対物レンズ165からサンプル130を通して透過されたおよび/またはサンプル130によって散乱された位相ランプ125(または、他の透過照明光源、たとえば、位相コントラストイメージングのためではなく明視野イメージングのための照明を提供するように構成されている光源)からの光のために、一次的放出光学経路の中に配置されている。そして、システム105は、位相ランプ125を含み、位相ランプ125は、蛍光顕微鏡115に除去可能に連結されており、一次的透過光学経路150の終端端部に配置されている。
本明細書で使用されているように、蛍光顕微鏡115は、小さな物体(たとえば、細胞、オルガネラ、組織、小さな有機体、粒子など)のイメージを拡大する任意の光学デバイスである。検出メカニズムによって実施される顕微鏡法の例示的なモードは、光学的顕微鏡法(たとえば、明視野、暗視野、位相コントラスト、微分干渉コントラスト(たとえば、Nomarski、DIC、およびHoffman Modulation Contrastなど)、蛍光、および/または、他の形態の可視光および/または不可視光(たとえば、IR、NIR、紫外線)の顕微鏡法)を含む。対物レンズ165は、光学モジュール110と生物学的サンプル130との間に配置されており、一次的透過光学経路150および一次的放出光学経路156が対物レンズ165を通過するようになっている。
イメージングセンサー120は、光を検出するように構成されており、カメラ、マルチチャネル光検出器、平面フーリエキャプチャーアレイ、シングルピクセルイメージャー、または、いくつかの他のイメージ発生装置を含むことが可能である。イメージングセンサー120は、所定の範囲の波長における光を検出するように構成または動作され得る。たとえば、イメージングセンサー120は、生物学的サンプル130の中の蛍光色素または他のフルオロフォアの放出スペクトルに対応する複数の波長/波長範囲における光を検出するように構成または動作される。たとえば、これらの波長は、サンプルの中の複数のフルオロフォアの放出スペクトルの中のピークに対応し、および/または、広い波長範囲にわたって延在することが可能である。これは、モノクロイメージングセンサーであるイメージングセンサー120を含むことが可能であり、それは、放出スペクトルのそれぞれにおける光の波長、および/または、位相ランプもしくは他の透過照明源によって放出される光の波長に敏感である。さらに、イメージングセンサー120は、なかでも、蛍光強度(FLINT)、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)、蛍光寿命(FLT)、蛍光相関関係(FCS)、光退色後蛍光回復(FRAP)、ならびに、それらの燐光および他の類似物を含む、任意の適切なフォトルミネッセンスを測定するように構成され得る。
図6~図8および図11~図12に示されている1つの随意的な実装形態において、システム105は、光学モジュール110を通って延在するシャフト170を含む。ここで、蛍光顕微鏡115は、シャフト170を第1の配向で受け入れるように構成されている受容部(図示せず)を有している。そして、シャフト170は、力の印加の下で第2の配向に回転し、それによって、光学モジュール110を蛍光顕微鏡115の残りの部分に(たとえば、蛍光顕微鏡115のハウジングまたは他の要素に)ロックするように構成されている。たとえば、シャフト170は、第1の端部172に連結されているフリップタブ171を有することが可能であり、また、突出部173を有することが可能であり、突出部173は、第2の端部174に連結されており、それによって、T字形状を形成している。蛍光顕微鏡115は、T字形状の突出部173を第1の配向で受け入れるように構成された対応するスロット(図示せず)および受容部を有することが可能である。フリップタブ171への力の印加の下でシャフトが第2の配向に回転するとき、T字形状の突出部173は、受容部の中で回転し、T字形状突出部173がスロットに対立した状態になり、それによって、光学モジュール110を蛍光顕微鏡115にロックするようになっている。光学モジュール110が蛍光顕微鏡115の残りの部分に連結されると、フリップタブ171は、ハウジング111に対して平坦に折り畳まれ得る。
さらなる実装形態において、シャフト170が挿入されると、ロッキング方向へのシャフト170の回転は、突出部173が傾斜部に沿って乗ることを引き起こし、それら、シャフト170および光学モジュール110を、システム105の残りの部分のためのマウントの上に引っ張る。柔軟な要素(たとえば、スプリング189)が、シャフト170とオプティクスモジュール110のハウジング111との間に配置され、オプティクスモジュール110をマウントの上に引っ張る力を制御することが可能である。加えて、戻り止めは、シャフト170がロック位置およびアンロック位置にあるときに、触覚フィードバックを提供することが可能である。
図4に示されている別の随意的な実装形態において、システム105は、光学モジュール110に連結されている第1の電気コネクター175を含む。システム105は、蛍光顕微鏡115の残りの部分に連結されている第2の電気コネクター(図示せず)を含む。第2の電気コネクターは、第1の電気コネクター175と相互的になっている。そして、システム105は、第2の電気コネクターと電気的に通信しているプロセッサー202を含む。プロセッサー202は、蛍光顕微鏡115の残りの部分に連結されている光学モジュール110を識別するように構成されている。第1および第2の電気コネクター175は、たとえば、ユーザーが蛍光顕微鏡115の異なる光学モジュールをスワップすることをより容易にするために、接続および切り離すために特定の力よりも小さい力を必要とするように選択され得る。
スワップ可能な位相ランプモジュール125は、ハウジング126、透過照明光源127(たとえば、ハロゲンランプ、LED)、および、少なくとも1つの集光レンズを含み、集光レンズは、位相ランプモジュール125からの光を生物学的サンプル130の上に上方から集束させる。図14~図15に示されているさらに別の随意的な実装形態において、位相ランプモジュール125は、第3の電気コネクター177を有しており、第3の電気コネクター177は、第4の電気コネクター(図示せず)に対応しており、第4の電気コネクターは、蛍光顕微鏡115の残りの部分に(たとえば、第2の電気コネクターが連結されている同じハウジングに)連結されている。第3の電気コネクター177は、第4の電気コネクターと相互的になっている。プロセッサー202は、光学モジュール110および位相ランプモジュール125が互換性があるかどうかを決定するように構成されており、それらが互換性がないという決定に応答して、警告を表示させるように構成されている。そのような決定は、利用可能な光学モジュール110と利用可能な位相ランプモジュール125との間の有効な対応関係の記録を含むデータベースの中のルックアップを実施することによって行われ得る。追加的にまたは代替的に、そのような決定は、位相ランプモジュール125によって放出される光の波長のセットを、光学モジュール110がサンプル130からイメージングセンサー120へ通すように構成されている光の波長のセットと比較することによって行われ得る。
位相ランプモジュール125のハウジング126は、突出部128を含み、突出部128は、システム105の位相ランプマウント185の中の対応する受容部186の中へ受け入れられるように形状決めされている。突出部128および受容部186は、位相ランプモジュール125が単一の配向でのみ据え付けられ得るように形状決めされている。スクリューによって固定されるのではなく、位相ランプモジュール125は、戻り止め187によって適切な場所に保持される。戻り止め187は、ハウジング126の突出部128の中の溝部129と整合するように構成されている位相ランプマウント185の中のスプリング荷重式のボール188の形態になっている。
図1に示されている1つの随意的な実装形態において、システム105は、インキュベーター180を含み、インキュベーター180は、30℃から42℃の範囲にある温度において、および、80%から100%の範囲にある相対湿度において、生細胞生物学的サンプル130を維持するように構成されている。この実装形態では、本開示の第1の態様による蛍光顕微鏡115は、インキュベーター180のチャンバーに連結されている。別の実装形態では、蛍光顕微鏡115は、部分的にまたは全体的にインキュベーター180の中に含まれ得る。たとえば、蛍光顕微鏡115は、連続的な培養の間に(たとえば、数時間、数日、または数週間の特定の期間にわたって)生物学的サンプル130の微速度撮影試験のための標準的なCO2インキュベーターの中に全体的に配設され得る。インキュベーション時間の長さに起因して、蛍光顕微鏡115は、生物学的サンプル130に悪影響を与えることを回避するために、細胞培養の間にインキュベーターの中に留まることが可能である。加えて、蛍光顕微鏡115のコンパクトなプロファイルは、蛍光顕微鏡115の周りのオープンスペースに他の生物学的サンプル130を設置するために、インキュベーター180の機能性を維持する。また、蛍光顕微鏡115のコンパクトなプロファイルは、蛍光顕微鏡115または生物学的サンプル130に対して結露および不適正な通気の形態の有害な影響を有する可能性のある空気フロー制限を低減させる。
第3の光源145(および、第4の光源160)は、生物学的サンプル130に対する多重化アッセイを可能にし、インキュベーター180の中の個々のサンプル(たとえば、サンプルウェル)の中で、および/または、同じインキュベーター180の中の異なるサンプルのセットの中で、複数のアッセイおよび/または蛍光インジケーターを実行する。
V.例示的な方法
ここで図16を参照すると、生細胞生物学的サンプルの中のフルオロフォアをイメージングするために、図3~図15の光学モジュール110およびシステム105、ならびに、図1~図2のコンピューティングデバイス200を利用することができる方法300が図示されている。方法300は、ブロック305において、第1の生物学的サンプルおよび蛍光顕微鏡を整合させるステップであって、第1の生物学的サンプルが蛍光顕微鏡の視野の中に位置付けされるようになっており、第1の生物学的サンプルは、(i)第1の帯域の励起波長の光による照射に応答して第1の帯域の放出波長の光を放出する第1のフルオロフォア、(ii)第2の帯域の励起波長の光による照射に応答して第2の帯域の放出波長の光を放出する第2のフルオロフォア、および、(iii)第3の帯域の励起波長の光による照射に応答して第3の帯域の放出波長の光を放出する第3のフルオロフォアを含む、ステップを含む。次いで、ブロック310において、方法は、蛍光顕微鏡を使用して第1の生物学的サンプルの1セットのイメージを取得するステップであって、1セットのイメージのイメージ同士は、フォーカス設定に関して異なっている、ステップを含む。次に、ブロック315において、方法300は、1セットのイメージに基づいて、第1の、第2の、および第3の帯域の放出波長に関する第1の、第2の、および第3のインフォーカス設定をそれぞれ決定するステップを含む。そして、ブロック320において、方法は、第1の時間の期間の間に、第1の光源を使用し、第1の帯域の励起波長の光によって第1の生物学的サンプルを照射するステップと、第1のインフォーカス設定に従って蛍光顕微鏡を動作させ、蛍光顕微鏡のイメージセンサーを介して、第1の帯域の放出波長の光の第1のイメージを取得するステップとを含む。また、方法300は、ブロック325において、第2の時間の期間の間に、第2の光源を使用し、第2の帯域の励起波長の光によって第1の生物学的サンプルを照射するステップと、第2のインフォーカス設定に従って蛍光顕微鏡を動作させ、イメージセンサーを介して、第2の帯域の放出波長の光の第2のイメージを取得するステップとを含む。また、方法300は、ブロック330において、第3の時間の期間の間に、第3の光源を使用し、第3の帯域の励起波長の光によって第1の生物学的サンプルを照射するステップと、第3のインフォーカス設定に従って蛍光顕微鏡を動作させ、イメージセンサーを介して、第3の帯域の放出波長の光の第3のイメージを取得するステップとを含む。先述のステップのすべては、プロセッサー202によって自動的に実施され得る。
ここで図16を参照すると、生細胞生物学的サンプルの中のフルオロフォアをイメージングするために、図3~図15の光学モジュール110およびシステム105、ならびに、図1~図2のコンピューティングデバイス200を利用することができる方法300が図示されている。方法300は、ブロック305において、第1の生物学的サンプルおよび蛍光顕微鏡を整合させるステップであって、第1の生物学的サンプルが蛍光顕微鏡の視野の中に位置付けされるようになっており、第1の生物学的サンプルは、(i)第1の帯域の励起波長の光による照射に応答して第1の帯域の放出波長の光を放出する第1のフルオロフォア、(ii)第2の帯域の励起波長の光による照射に応答して第2の帯域の放出波長の光を放出する第2のフルオロフォア、および、(iii)第3の帯域の励起波長の光による照射に応答して第3の帯域の放出波長の光を放出する第3のフルオロフォアを含む、ステップを含む。次いで、ブロック310において、方法は、蛍光顕微鏡を使用して第1の生物学的サンプルの1セットのイメージを取得するステップであって、1セットのイメージのイメージ同士は、フォーカス設定に関して異なっている、ステップを含む。次に、ブロック315において、方法300は、1セットのイメージに基づいて、第1の、第2の、および第3の帯域の放出波長に関する第1の、第2の、および第3のインフォーカス設定をそれぞれ決定するステップを含む。そして、ブロック320において、方法は、第1の時間の期間の間に、第1の光源を使用し、第1の帯域の励起波長の光によって第1の生物学的サンプルを照射するステップと、第1のインフォーカス設定に従って蛍光顕微鏡を動作させ、蛍光顕微鏡のイメージセンサーを介して、第1の帯域の放出波長の光の第1のイメージを取得するステップとを含む。また、方法300は、ブロック325において、第2の時間の期間の間に、第2の光源を使用し、第2の帯域の励起波長の光によって第1の生物学的サンプルを照射するステップと、第2のインフォーカス設定に従って蛍光顕微鏡を動作させ、イメージセンサーを介して、第2の帯域の放出波長の光の第2のイメージを取得するステップとを含む。また、方法300は、ブロック330において、第3の時間の期間の間に、第3の光源を使用し、第3の帯域の励起波長の光によって第1の生物学的サンプルを照射するステップと、第3のインフォーカス設定に従って蛍光顕微鏡を動作させ、イメージセンサーを介して、第3の帯域の放出波長の光の第3のイメージを取得するステップとを含む。先述のステップのすべては、プロセッサー202によって自動的に実施され得る。
特定の色に関する特定の蛍光イメージを取得することは、異なる露出時間を使用して特定の色の複数の異なるイメージを発生させるように、イメージングシステムを動作させることを含むことが可能である。これは、高ダイナミックレンジイメージの合成発生を可能にするように行われ得る。これは、関心のフルオロフォア濃度/活性の範囲にわたって蛍光放出の強度において非常に高い変動を示すフルオロフォア/サンプル/アッセイに関して行われ得る。
方法300は、位相ランプ(たとえば、125)または他の透過照明光源を動作させることによって、1つもしくは複数の明視野、位相コントラスト、または、他の非蛍光イメージを取得するステップを追加的に含むことが可能である。次いで、そのような非蛍光イメージ情報は、(たとえば、細胞タイプにかかわらず、サンプルの中の細胞の場所、形状、サイズ、および/または範囲を識別するために、位相コントラスト画像を使用して、次いで、位相コントラスト画像を使用して識別された細胞についての細胞タイプ、細胞分裂の局面、細胞健康状態、細胞代謝活性、または他の情報を決定するために、1つまたは複数の蛍光イメージを使用して)蛍光イメージと組み合わせて使用されるか、または、それ自身で使用され得る。
さらに、方法300は、方法300を使用して取得される3つの(または、それ以上の)蛍光イメージのためのインフォーカス設定を決定するために、異なるフォーカス設定の所定の範囲にわたって(たとえば、異なる対物レンズ-サンプル距離の所定の範囲にわたって)明視野、位相コントラスト、または、他の非蛍光イメージのセットを取得するステップを含むことが可能である。これは、非蛍光イメージを発生させるために使用される照射の波長のためのインフォーカス設定を決定し、次いで、そのインフォーカス設定から、イメージングされる蛍光放出波長のそれぞれに関して既知のオフセット(たとえば、距離オフセット)を適用し、それらの放出波長に関するインフォーカス設定を決定するステップを含むことが可能である。非蛍光イメージを発生させるために使用される照射の波長が蛍光放出波長のうちの1つと同じであるかまたは実質的に同じである場合、オフセットはゼロになることが可能である。明視野イメージまたは他の非蛍光イメージは、蛍光イメージと比較したときに、同じ露出時間に関して著しく多いイメージデータを含むことが多く、したがって、インフォーカス設定を決定するこの方法は、有利には、そのようなインフォーカス設定を発生させるために必要とされる時間を低減させることが可能である。また、これは、そのようなインフォーカス設定を発生させるために、サンプルが経験する光退色の量を低減させることが可能である。
実際には、より短い波長によって励起されるフルオロフォアのイメージは、より長い波長によって励起されるフルオロフォアから放出された光に関係付けられるアーチファクトを含むことが可能であり、その逆もまた同様である。また、1つの例として、第1の帯域の波長に対応するフルオロフォアは、(特に、第2および第3の帯域の波長が、第1の帯域の波長よりも短い波長を含む場合には)第2および第3の帯域の波長によってある程度励起され得る。同様に、第2の帯域の波長に対応するフルオロフォアは、また、第1および第3の帯域の波長によってある程度励起され得、一方では、第3の帯域の波長に対応するフルオロフォアは、また、第1および第2の帯域の波長によってある程度励起され得る。
アーチファクト問題に対処するために、1つの随意的な実装形態において、方法300は、第2のフルオロフォアおよび第3のフルオロフォアによって放出される光からのアーチファクトを低減させるために、第1のセットのイメージに基づいて、第1のフルオロフォアによって放出される光の第1のイメージを発生させるイメージングセンサー120(または、いくつかの他のコンピューティングデバイス)と電気的に通信しているプロセッサー202をさらに含む。プロセッサー202は、第1のフルオロフォアおよび第3のフルオロフォアによって放出される光からのアーチファクトを低減させるために、第2のセットのイメージに基づいて、第2のフルオロフォアによって放出される光の第2のイメージを追加的に発生させる。さらに、プロセッサー202は、第1のフルオロフォアおよび第2のフルオロフォアによって放出される光からのアーチファクトを低減させるために、第3のセットのイメージに基づいて、第3のフルオロフォアによって放出される光の第3のイメージを発生させることが可能である。このスペクトル非混合プロセスは、2019年2月1日に出願された米国特許出願第16/264819号に、2つの励起波長に関して、より詳細に説明されており、その文献は、参照により本明細書に組み込まれている。
1つの非限定的な例において、緑色フルオロフォアから放出される光が焦点に合うように、生物学的サンプル130が第1のインフォーカス設定で配置されているときに、第1のイメージは、緑色フルオロフォアに対応する青色の励起波長における光によって生物学的サンプル130を照射することによって、緑色フルオロフォアに関して取得され得る。具体的には、「インフォーカス設定」は、緑色フルオロフォア放出光が焦点の合った状態でイメージングされるように、生物学的サンプル130と蛍光顕微鏡115の対物レンズ165との間の距離を設定することによって起こる。また、この第1のイメージは、生物学的サンプル130の中のオレンジ色フルオロフォア(ライム色励起波長における光によって主に励起されるが、青色光によってもある程度励起される)およびNIRフルオロフォア(赤色励起波長における光によって主に励起されるが、青色光によってもある程度励起される)から放出される光を含むことが可能である。オレンジ色フルオロフォアおよびNIRフルオロフォアから放出される光は、第1のイメージにおいて焦点の合っていない状態になることとなるということに留意されたい。これは、サンプル130とイメージングセンサー120との間の一次的放出光学経路156に沿った要素(たとえば、対物レンズ、チューブレンズ、サンプルの光学的特性、および/または、サンプルを含むコンテナの光学的特性)によって引き起こされる色収差に起因している。
次いで、アーチファクトイメージが、第1のイメージから除去され、オレンジ色フルオロフォアおよびNIRフルオロフォアからのアーチファクト光を除去することが可能である。上記に述べられているように、1つのアーチファクトイメージは、第1のイメージを取得するために使用される第1のインフォーカス設定において、オレンジ色フルオロフォアに対応するライム色励起波長における光によって生物学的サンプル130を照射することによって取得され得る。別のアーチファクトイメージは、第1のイメージを取得するために使用される第1のインフォーカス設定において、赤色フルオロフォアに対応する赤色励起波長における光によって生物学的サンプル130を照射することによって取得され得る。代替的に、アーチファクトイメージは、オレンジ色フルオロフォアおよび赤色フルオロフォアのインフォーカスイメージをぼやけさせることによって取得され得るか、または、そうでなければ、別のフォーカス設定を使用して撮影されるイメージにおいて第1のイメージを取得するために使用されるフォーカス設定の効果をシミュレートするために何らかのイメージ処理技法を適用することによって取得され得る。たとえば、オレンジ色フルオロフォアおよびNIRフルオロフォアから放出された光が焦点の合った状態で別個にイメージングされるように、インフォーカス設定を使用して撮影されたイメージである。
1つの随意的な実装形態において、方法300は、第1のセットのイメージデータ、第2のセットのイメージデータ、および、第3のセットのイメージデータを取得するときに、30℃から42℃の範囲にある温度において、および、80%から100%の範囲にある相対湿度において、少なくとも第1の生物学的サンプルを維持する蛍光顕微鏡を含むかまたはそれにその他の方法で連結されているインキュベーターをさらに含む。このデータは、連続的な培養の間に(たとえば、関心の実験に応じて、数分、数時間、数日、または数週間の期間にわたって)生物学的サンプル130の微速度撮影試験のための標準的なCO2インキュベーターの中で取得され得る。たとえば、イメージは、培養の全体を通して時間の経過とともに撮影され得、培養は、14日よりも長いか、または、30日と同じかもしくはそれよりも長い。
方法300は、システム(たとえば、明視野イメージ、位相コントラストイメージ)を使用して取得される蛍光イメージおよび/または他のイメージに対して何らかの追加的な分析を実施するステップを含むことが可能である。たとえば、イメージのうちの1つ(または、それ以上)が、特定のサンプルにおいて、1つまたは複数の特定のタイプの細胞に特有のフルオロフォアの色に対応している場合、方法300は、イメージを分析し、サンプルの中に存在している1つまたは複数の特定のタイプの細胞について、数、形状、サイズ、分布、相互接続のパターン、または、他の情報を決定するステップを含むことが可能である。そのような識別は、位相コントラストまたは他の非蛍光イメージの使用によって増強され、タイプにかかわらず、サンプルの中の個々の細胞場所、形状、および範囲を識別することが可能である。追加的にまたは代替的に、イメージのうちの1つ(または、それ以上)が、特定のアッセイ(たとえば、Annexin V NIRアッセイ、2色または3色FUCCI細胞分裂局面アッセイ)の蛍光インジケーターに対応している場合、方法300は、イメージを分析し、特定のアッセイの出力を発生させ、たとえば、サンプルの中の1つまたは複数の細胞の健康状態、細胞分裂の局面、または、他の代謝状態もしくはステータスを決定するステップを含むことが可能である。異なる(または、オーバーラップしている)イメージの異なる分析の結果が組み合わせられ得、たとえば、第1のイメージ分析(細胞特有のフルオロフォアに対応する)は、関心の細胞タイプの細胞を識別するために使用され得、組み合わせられた第2および第3のイメージ分析は、識別された細胞に関する2色アッセイ(たとえば、2色FUCCIアッセイ)の出力を決定することが可能である。分析は、(たとえば、同じアッセイ/蛍光インジケーター/色素を含むサンプルのすべてに起因して)インキュベーターの中のイメージングシステムによってイメージングされるすべてのサンプルに関して同じであることが可能であり、または、インキュベーターの中のサンプルごとに異なることが可能である。
1つの随意的な実装形態において、方法300は、第1のセットのイメージに基づいて第1の生物学的サンプルの中の第1の細胞タイプを識別するプロセッサー202をさらに含む。次いで、プロセッサー202は、第2のセットのイメージに基づいて、第1の生物学的サンプルの中の第2の細胞タイプを識別する。次に、プロセッサー202は、第3のセットのイメージに基づいて、第1の生物学的サンプルの中の細胞死または何らかの他の代謝プロセスもしくは特性を識別する。これは、光学モジュール110の構成を変化させることなく、複雑なアッセイおよび/または複数のアッセイがシステム105の中の単一の容器の中で実行されることを可能にする技術的効果を有している。
1つの随意的な実装形態において、位相コントラスト、明視野、または、他の非蛍光イメージは、第1の、第2の、および第3のインフォーカス設定において取得され得る。これらのイメージは、第1の、第2の、および第3のイメージからさらなるアーチファクトを除去するために(たとえば、自家発光に起因するアーチファクトを除去するために)利用され得、または、(たとえば、蛍光イメージを増強するために追加的な高空間周波数イメージデータを提供することによって)第1の、第2の、および第3のイメージをその他の方法で改善するために利用され得る。
1つの随意的な実装形態において、方法300は、また、プロセッサーが光学モジュール110および位相ランプモジュールに関する互換性情報を受け取ることを含む。次いで、プロセッサー202は、互換性情報に基づいて、光学モジュール110および位相ランプ125が互換性があるかどうかを決定する。次に、光学モジュール110および位相ランプ125は互換性がないという決定に応答して、プロセッサー202は、非互換性のインディケーションとともに警告を表示させる。そのような互換性決定は、利用可能な光学モジュール110と利用可能な位相ランプモジュール125との間の有効な対応関係の記録を含むデータベースの中のルックアップを実施することによって行われ得る。追加的にまたは代替的に、そのような決定は、位相ランプモジュール125によって放出される光の波長のセットを、光学モジュール110がサンプル130からイメージングセンサー120へ通すように構成されている光の波長のセットと比較することによって行われ得る。
1つの随意的な実装形態において、方法300は、光学モジュール110を通して蛍光顕微鏡115の中の受容部までシャフト170を第1の配向で延在させるステップを含む。次いで、シャフト170は、力の印加の下で回転され、シャフト170が第2の配向に移動するようになっており、それによって、システム105に関して上記に詳細に説明されているように、光学モジュール110を蛍光顕微鏡115に連結する。
先述の方法300は、光学モジュール110の構成を変化させることなく、システム105の中の個々の容器においてまたは複数の容器にわたって実行され得るアッセイの変動性の増加を可能にする技術的効果を有している。方法300は、本明細書で説明されている蛍光イメージャー、光学モジュール、位相ランプモジュール、インキュベーター、自動化されたイメージングシステム、または、他のシステム、デバイス、もしくはコンポーネントの実施形態のいずれかによって、または、それと組み合わせて実施され得る。したがって、インキュベーターの中の個々のサンプルにおける、および/または、インキュベーターの中の異なるサンプルにわたる、さまざまなアッセイ、蛍光インジケーター、および、それらの組み合わせは、本明細書で説明されている実施形態によって可能にされる。そのような用途の複数の例が、下記に提供されている。これらの用途は、例示目的の実施形態として意図しており、限定するものであることを意図していない。追加的なまたは代替的な用途が、予想され、同様に、そのような用途および/または下記に説明されている用途の追加的なまたは代替的な組み合わせが予想される。
上記に議論されているように、非一時的なコンピューター可読媒体は、プログラム命令をその上に記憶しており、プログラム命令は、プロセッサー202によって実行されるときに、本明細書で説明されている方法のいずれかの実施を引き起こすために利用され得る。
VI.例示的な生物学的な用途
上記に説明されている実施形態は、3つの異なる蛍光チャネルの独立したイメージングを提供することによって、蛍光イメージングにおけるさまざまな用途を可能にする。追加的な蛍光チャネルの利点は、追加的なアッセイが(たとえば、単一のインキュベーターの中で)単一の装置を使用して同時に実施されることを可能にすることによって、異なるサンプルにわたる実験的な読み出しにおけるフレキシビリティーを提供することによって、および/または、追加的なアッセイが個々のサンプルから実施されることを可能にすることによって、単一のイメージング装置のスループットを改善することを含むことが可能である。また、3色(または、それ以上)イメージングの利用可能性は、試薬選択におけるフレキシビリティーの増加を可能にすることができる(たとえば、緑色蛍光タンパク質ベースのレポーターを発現する細胞をモニタリングしながら追加的な情報を得るために複数の試薬を使用する能力)。
上記に説明されている実施形態は、3つの異なる蛍光チャネルの独立したイメージングを提供することによって、蛍光イメージングにおけるさまざまな用途を可能にする。追加的な蛍光チャネルの利点は、追加的なアッセイが(たとえば、単一のインキュベーターの中で)単一の装置を使用して同時に実施されることを可能にすることによって、異なるサンプルにわたる実験的な読み出しにおけるフレキシビリティーを提供することによって、および/または、追加的なアッセイが個々のサンプルから実施されることを可能にすることによって、単一のイメージング装置のスループットを改善することを含むことが可能である。また、3色(または、それ以上)イメージングの利用可能性は、試薬選択におけるフレキシビリティーの増加を可能にすることができる(たとえば、緑色蛍光タンパク質ベースのレポーターを発現する細胞をモニタリングしながら追加的な情報を得るために複数の試薬を使用する能力)。
追加的にまたは代替的に、同時の3色(または、それ以上)イメージングは、2色のみ使用して発生されることができなかった情報が発生されることを可能にすることができる。たとえば、3色レポーター(たとえば、3色FUCCIアッセイ)からの情報が発生され得る。別の例において、複数の細胞タイプの増殖および相互作用についての情報、ならびに、細胞母集団にわたる代謝情報または細胞死情報についての情報が発生させられ得る。そのような情報は、ターゲット細胞を破壊する際のエフェクター細胞の活性に対する実験的な条件の影響、または、たとえば、癌細胞と間質細胞との間の代謝交換への追加的な洞察を可能にすることができる。
さらに、3色(または、それ以上)イメージングは、より信頼性の高い様式での実験的なデータの発生を可能にすることができる。たとえば、単一のサンプルにおいて複数の読み出しを多重化することは、読み出し間において観察される差異が科学的に有効であり、並列に実行されるアッセイの間の実験的な変動(たとえば、細胞プレーティング)に起因するものではないということについての信頼性の増加を提供することが可能である。
例1:2色FUCCI+細胞死
本明細書で説明されている光学モジュール110、システム105、および方法300のさまざまな実装形態が、有利には、単一のサンプルにおいて2色の細胞周期(たとえば、緑色/オレンジ色FUCCI)観察および細胞死分析を実行するために使用され得る。細胞周期およびアポトーシスの読み出しは、たとえば、癌細胞の中の化合物の濃度差依存性のおよび時間依存性の効果を実証することが可能である。別の例では、癌細胞に対する、および/または、サンプルの中の細胞のいくつかの他の母集団に対する、ターゲットにされた癌細胞の免疫細胞キリングの影響を観察するために、2色の細胞周期観察および細胞死分析が、免疫細胞および癌細胞を含むサンプルにおいて実施され得る。単一のサンプルにおけるこれらの2つの読み出しを多重化することは、スループットを増加させ、また、2つの読み出しの間の差が科学的に有効であり、並列のアッセイの間の実験的な変動に起因するものではないという信頼性を提供する。
本明細書で説明されている光学モジュール110、システム105、および方法300のさまざまな実装形態が、有利には、単一のサンプルにおいて2色の細胞周期(たとえば、緑色/オレンジ色FUCCI)観察および細胞死分析を実行するために使用され得る。細胞周期およびアポトーシスの読み出しは、たとえば、癌細胞の中の化合物の濃度差依存性のおよび時間依存性の効果を実証することが可能である。別の例では、癌細胞に対する、および/または、サンプルの中の細胞のいくつかの他の母集団に対する、ターゲットにされた癌細胞の免疫細胞キリングの影響を観察するために、2色の細胞周期観察および細胞死分析が、免疫細胞および癌細胞を含むサンプルにおいて実施され得る。単一のサンプルにおけるこれらの2つの読み出しを多重化することは、スループットを増加させ、また、2つの読み出しの間の差が科学的に有効であり、並列のアッセイの間の実験的な変動に起因するものではないという信頼性を提供する。
2色FUCCI分析に関して、本開示の3色光学モジュールは、2つの異なる蛍光タンパク質の位相依存性の発現に基づいて、さまざまな細胞周期局面の間の区別を可能にする。たとえば、S期、G2期、およびM期の間に、細胞は、3色光学モジュールを使用して検出され得るTagGFP2(緑色フルオロフォア)の発現を介して、緑色蛍光を放出することが可能である。G1期の間に、および、S期への移行期の間に、細胞は、3色光学モジュールを使用して検出され得るTagRFP(555nmおよび584nmにおいて励起/放出極大をそれぞれ有する明るい蛍光を持つオレンジ色蛍光タンパク質)の発現を介して、オレンジ色蛍光を放出することが可能である。この2色FUCCIアッセイでは、細胞は、有糸分裂の直後に続く無色期間を通って移行する。結果として、細胞周期局面は、蛍光フットプリント(たとえば、S期、G2期、およびM期:緑色;G1期:オレンジ色、G1/S移行期:オレンジ色および緑色の両方;M/G1移行期:無色(蛍光なし))を有している。次いで、第3の色が、蛍光細胞死読み出し(たとえば、Annexin V NIRアポトーシスインジケーター)をイメージングするために使用され得る。
例2:3色FUCCI
本明細書で説明されている光学モジュール110、システム105、および方法300のさまざまな実装形態が、細胞周期の中の追加的な期を独立して観察する3色FUCCIアッセイを有利に実行するために使用され得る。以前に説明された2色細胞周期アッセイとは異なり、3色アッセイは、S期とG2期との間の区別を可能にし、また、有益には、ターゲットにされたユビキチン化ドメインまたは他の細胞期関係のターゲットに融合された蛍光タンパク質のための遺伝子の適当な遺伝子発現によって、無色期を結果として生じさせない。たとえば、S期、G2期、およびM期の間に、細胞は、3色光学モジュールを使用して検出され得るTagGFP2の発現に基づいて、緑色蛍光をそれぞれ放出することが可能であり、より暗い蛍光が、S期に観察される。そして、異なる蛍光マーカーが、細胞周期の他の段階を識別するために使用され得、それは、TagRFPおよびiRFP713を含むが、それ限定されない。G1期およびS期の間に、TagRFPを発現する細胞は、3色光学モジュールを使用して検出され得るオレンジ色蛍光を放出する。iRFP713は、690nmおよび713nmにおいて励起/放出極大をそれぞれ有する蛍光を持つ近赤外線の蛍光タンパク質である。G2期、M期、およびG1期の間に、iRFP713を発現する細胞は、NIR蛍光を放出し、それは、3色光学モジュールを使用して検出され得る。結果として、細胞周期局面は、蛍光フットプリント(たとえば、G2期およびM期:緑色およびNIR;G1期:オレンジ色およびNIR、S期:オレンジ色および緑色)を有することとなり、無色期は存在しない。
本明細書で説明されている光学モジュール110、システム105、および方法300のさまざまな実装形態が、細胞周期の中の追加的な期を独立して観察する3色FUCCIアッセイを有利に実行するために使用され得る。以前に説明された2色細胞周期アッセイとは異なり、3色アッセイは、S期とG2期との間の区別を可能にし、また、有益には、ターゲットにされたユビキチン化ドメインまたは他の細胞期関係のターゲットに融合された蛍光タンパク質のための遺伝子の適当な遺伝子発現によって、無色期を結果として生じさせない。たとえば、S期、G2期、およびM期の間に、細胞は、3色光学モジュールを使用して検出され得るTagGFP2の発現に基づいて、緑色蛍光をそれぞれ放出することが可能であり、より暗い蛍光が、S期に観察される。そして、異なる蛍光マーカーが、細胞周期の他の段階を識別するために使用され得、それは、TagRFPおよびiRFP713を含むが、それ限定されない。G1期およびS期の間に、TagRFPを発現する細胞は、3色光学モジュールを使用して検出され得るオレンジ色蛍光を放出する。iRFP713は、690nmおよび713nmにおいて励起/放出極大をそれぞれ有する蛍光を持つ近赤外線の蛍光タンパク質である。G2期、M期、およびG1期の間に、iRFP713を発現する細胞は、NIR蛍光を放出し、それは、3色光学モジュールを使用して検出され得る。結果として、細胞周期局面は、蛍光フットプリント(たとえば、G2期およびM期:緑色およびNIR;G1期:オレンジ色およびNIR、S期:オレンジ色および緑色)を有することとなり、無色期は存在しない。
例3:3色免疫細胞キリング
本明細書で説明されている光学モジュール110、システム105、および方法300のさまざまな実装形態は、ラベル付けされたターゲット(癌)細胞およびエフェクター(免疫)細胞を有利にモニタリングするために、ならびに、両方の細胞タイプにわたって細胞死読み出しを提供するために使用され得る。これは、両方の母集団にわたる細胞死と同時に、ターゲット細胞およびエフェクター細胞の増殖および相互作用を独立して測定することができるという利益を提供する。このように、ターゲット細胞の免疫細胞キリングの有効性は、エフェクター母集団の変化(たとえば、活性化に関連付けられる)、ならびに、エフェクター細胞ラベルおよびターゲット細胞ラベルの蛍光の間のオーバーラップを決定することによって測定される同じサンプルの中の2つの細胞母集団の間の相互作用と直接的に相関付けされ得る。
本明細書で説明されている光学モジュール110、システム105、および方法300のさまざまな実装形態は、ラベル付けされたターゲット(癌)細胞およびエフェクター(免疫)細胞を有利にモニタリングするために、ならびに、両方の細胞タイプにわたって細胞死読み出しを提供するために使用され得る。これは、両方の母集団にわたる細胞死と同時に、ターゲット細胞およびエフェクター細胞の増殖および相互作用を独立して測定することができるという利益を提供する。このように、ターゲット細胞の免疫細胞キリングの有効性は、エフェクター母集団の変化(たとえば、活性化に関連付けられる)、ならびに、エフェクター細胞ラベルおよびターゲット細胞ラベルの蛍光の間のオーバーラップを決定することによって測定される同じサンプルの中の2つの細胞母集団の間の相互作用と直接的に相関付けされ得る。
一般的に、望まれないターゲット細胞(たとえば、出現した腫瘍細胞など)の免疫細胞認識および免疫細胞キリングは、人間の宿主防衛メカニズムの重要なコンポーネントである。抗体依存性細胞介在性細胞傷害(ADCC)およびT細胞キリングは、細胞介在性免疫反応の2つのメカニズムである。これらのプロセスのそれぞれは、免疫細胞亜母集団(たとえば、ナチュラルキラー(NK)細胞または細胞傷害性T細胞(CTL)など)の刺激を含み、それは、次いで、ターゲット細胞をアクティブに溶解させる。本開示のシステムおよび方法は、免疫細胞と癌細胞との間の相互作用の観察を可能にし、腫瘍と闘って排除する免疫システムの能力を回復および推進するための診断および療法(「癌免疫療法」または「免疫腫瘍学」)の開発につながる情報を潜在的に提供する。
例4:ATP+細胞死
本明細書で説明されている光学モジュール110、システム105、および方法300のさまざまな実装形態は、癌細胞の代謝および死亡率に対する化合物の時間依存性のおよび濃度依存性の効果の可能な差を調査するために、細胞死分析によって多重化されるATPの2色Forster共鳴エネルギー移動(FRET)ベースの測定を有利に実行するために使用され得る。動作時に、光学モジュールの中の3つの光源は、3つの異なる帯域の励起波長において活性化させられ得、そのうちの2つは、FRETメカニズムを介して、単一の放出帯域を介して代謝情報を測定するために使用され得る。次いで、第3の励起波長は、細胞死に関係付けられる独立した読み出しをモニタリングするために使用され得る(たとえば、Annexin V NIR)。ATP測定プロセスは、2019年3月7日に出願されたPCT/US19/21171「Methods and Compositions for Live Cell Analysis of Intracellular ATP」に、より詳細に説明されており、その文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
本明細書で説明されている光学モジュール110、システム105、および方法300のさまざまな実装形態は、癌細胞の代謝および死亡率に対する化合物の時間依存性のおよび濃度依存性の効果の可能な差を調査するために、細胞死分析によって多重化されるATPの2色Forster共鳴エネルギー移動(FRET)ベースの測定を有利に実行するために使用され得る。動作時に、光学モジュールの中の3つの光源は、3つの異なる帯域の励起波長において活性化させられ得、そのうちの2つは、FRETメカニズムを介して、単一の放出帯域を介して代謝情報を測定するために使用され得る。次いで、第3の励起波長は、細胞死に関係付けられる独立した読み出しをモニタリングするために使用され得る(たとえば、Annexin V NIR)。ATP測定プロセスは、2019年3月7日に出願されたPCT/US19/21171「Methods and Compositions for Live Cell Analysis of Intracellular ATP」に、より詳細に説明されており、その文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
例5:生細胞免疫細胞化学
本明細書で説明されている光学モジュール110、システム105、および方法300のさまざまな実装形態は、IncuCyte(登録商標)FabFluor Antibody Labeling Reagent(または、何らかの他の蛍光的にラベル付けされた抗体試薬)を使用する生細胞免疫細胞化学(ICC)によって、表面タンパク質発現を測定するために使用され得る。この方法は、実験的な処理(たとえば、テスト化合物の添加または免疫細胞活性化)に続く細胞亜母集団の変化を追跡するために、経時的な分化マーカーの変化をモニタリングするために、または、表面タンパク質発現をその他の方法で評価するために使用され得る。3色(または、それ以上)イメージングは、抗体選択のフレキシビリティーにおいて利点を提供し、単一のサンプルの中の関心の追加的なタンパク質または亜母集団のモニタリングを可能にする。
本明細書で説明されている光学モジュール110、システム105、および方法300のさまざまな実装形態は、IncuCyte(登録商標)FabFluor Antibody Labeling Reagent(または、何らかの他の蛍光的にラベル付けされた抗体試薬)を使用する生細胞免疫細胞化学(ICC)によって、表面タンパク質発現を測定するために使用され得る。この方法は、実験的な処理(たとえば、テスト化合物の添加または免疫細胞活性化)に続く細胞亜母集団の変化を追跡するために、経時的な分化マーカーの変化をモニタリングするために、または、表面タンパク質発現をその他の方法で評価するために使用され得る。3色(または、それ以上)イメージングは、抗体選択のフレキシビリティーにおいて利点を提供し、単一のサンプルの中の関心の追加的なタンパク質または亜母集団のモニタリングを可能にする。
異なる有利な配置の説明は、図示および説明の目的のために提示されており、網羅的であるということまたは開示されている形態の例に限定されることを意図していない。多くの修正例および変形例が、当業者に明らかになることとなる。選択された1つまたは複数の例は、例の原理、実用的な用途を最良に説明するために、ならびに、企図された特定の使用に適しているようなさまざまな修正例を伴うさまざまな例に関して、当業者が本開示を理解することを可能にするために、選ばれて説明されている。
100 環境
105 システム
110 光学モジュール
111 ハウジング
111a 主本体部
111b 片持ち梁式の延長部
112 第1の開口部
113 第2の開口部
115 蛍光顕微鏡
120 イメージングセンサー
125 位相ランプ
126 ハウジング
127 透過照明光源
128 突出部
129 溝部
130 サンプル
135 第1の光源
136 第1のフィルター
137 第1の光学経路
140 第2の光源
141 第2のフィルター
142 第2の光学経路
145 第3の光源
146 第3のフィルター
147 第3の光学経路
150 一次的透過光学経路
155 放出フィルター
156 一次的放出光学経路
160 第4の光源
161 第4のフィルター
162 第4の光学経路
165 対物レンズ
170 シャフト
171 フリップタブ
172 第1の端部
173 突出部
174 第2の端部
175 第1の電気コネクター
177 第3の電気コネクター
180 インキュベーター
185 位相ランプマウント
186 受容部
187 戻り止め
188 スプリング荷重式のボール
189 スプリング
200 コンピューティングデバイス
200a コンピューティングデバイス
202 プロセッサー
204 通信インターフェース
206 データストレージ
208 出力インターフェース
210 ディスプレイ
212 通信バス
214 ネットワーク
216a タブレット
216b パーソナルコンピューター
216c ラップトップコンピューター
216d モバイルコンピューティングデバイス
218 実行可能な命令
105 システム
110 光学モジュール
111 ハウジング
111a 主本体部
111b 片持ち梁式の延長部
112 第1の開口部
113 第2の開口部
115 蛍光顕微鏡
120 イメージングセンサー
125 位相ランプ
126 ハウジング
127 透過照明光源
128 突出部
129 溝部
130 サンプル
135 第1の光源
136 第1のフィルター
137 第1の光学経路
140 第2の光源
141 第2のフィルター
142 第2の光学経路
145 第3の光源
146 第3のフィルター
147 第3の光学経路
150 一次的透過光学経路
155 放出フィルター
156 一次的放出光学経路
160 第4の光源
161 第4のフィルター
162 第4の光学経路
165 対物レンズ
170 シャフト
171 フリップタブ
172 第1の端部
173 突出部
174 第2の端部
175 第1の電気コネクター
177 第3の電気コネクター
180 インキュベーター
185 位相ランプマウント
186 受容部
187 戻り止め
188 スプリング荷重式のボール
189 スプリング
200 コンピューティングデバイス
200a コンピューティングデバイス
202 プロセッサー
204 通信インターフェース
206 データストレージ
208 出力インターフェース
210 ディスプレイ
212 通信バス
214 ネットワーク
216a タブレット
216b パーソナルコンピューター
216c ラップトップコンピューター
216d モバイルコンピューティングデバイス
218 実行可能な命令
Claims (25)
- 生細胞生物学的サンプルの中のフルオロフォアをイメージングするための光学モジュールであって、前記光学モジュールは、
第1の帯域の励起波長において第1の光を放出するように構成されている第1の光源と、
前記第1の光源の第1の光学経路の中に配置されている第1のフィルターであって、前記第1のフィルターは、1つまたは複数の波長における光を通し、1つまたは複数の波長における光を反射するように構成されている、第1のフィルターと、
第2の帯域の励起波長において第2の光を放出するように構成されている第2の光源と、
前記第2の光源の第2の光学経路の中に配置されている第2のフィルターであって、前記第2のフィルターは、1つまたは複数の波長における光を通し、1つまたは複数の波長における光を反射するように構成されている、第2のフィルターと、
第3の帯域の励起波長において第3の光を放出するように構成されている第3の光源と、
前記第3の光源の第3の光学経路の中に配置されている第3のフィルターであって、前記第3のフィルターは、1つまたは複数の波長における光を通し、1つまたは複数の波長における光を反射するように構成されており、前記第1の光学経路、前記第2の光学経路、および、前記第3の光学経路は、前記生細胞生物学的サンプルに向けて方向付けられるように構成されている一次的透過光学経路に沿って収束している、第3のフィルターと、
前記生細胞生物学的サンプルの中の前記フルオロフォアによって放出される光のための一次的放出光学経路の中に配置されている放出フィルターであって、前記一次的放出光学経路は、イメージングセンサーにおいて終端するように構成されており、前記放出フィルターは、第1の帯域、第2の帯域、および第3の帯域の放出波長における光を通すように構成されており、前記第1の帯域、前記第2の帯域、および、前記第3の帯域の励起波長における光を反射するように構成されている、放出フィルターと
を含む、光学モジュール。 - 前記第1のフィルター、前記第2のフィルター、および、前記第3のフィルターは、それぞれダイクロイックフィルターである、請求項1に記載の光学モジュール。
- 前記第1の光源、前記第2の光源、および、前記第3の光源は、LED、少なくとも1つのレンズ、および、シングルバンドパスダイクロイックフィルターをそれぞれ含む、請求項1または2に記載の光学モジュール。
- 前記第1のフィルターは、前記第1の帯域の励起波長における光を通し、前記第2の帯域および前記第3の帯域の励起波長における光、ならびに、前記第1の帯域、前記第2の帯域、および、前記第3の帯域の放出波長における光を反射するように構成されており、
前記第2のフィルターは、前記第1の帯域、前記第2の帯域、および、前記第3の帯域の放出波長における光を通し、前記第2の帯域および前記第3の帯域の励起波長における光を反射するように構成されており、
前記第3のフィルターは、前記第3の帯域の励起波長における光を通し、前記第2の帯域の励起波長における光を反射するように構成されている、請求項1から3のいずれか一項に記載の光学モジュール。 - 前記第1の光源は、前記第1の光学経路が前記第1の光源において開始し、前記第1のフィルターを通過し、前記一次的透過光学経路に沿って前記光学モジュールを退出するように配置されており、
前記第2の光源は、前記第2の光学経路が前記第2の光源において開始し、前記第3のフィルターにおいて前記第2のフィルターへ反射し、前記第2のフィルターにおいて前記第1のフィルターへ反射し、前記第1のフィルターにおいて反射し、前記一次的透過光学経路に沿って前記光学モジュールを退出するように配置されており、
前記第3の光源は、前記第3の光学経路が前記第3の光源において開始し、前記第3のフィルターを通過して前記第2のフィルターに向かい、前記第2のフィルターにおいて前記第1のフィルターへ反射し、前記第1のフィルターにおいて反射し、前記一次的透過光学経路に沿って前記光学モジュールを退出するように配置されており、
前記生細胞生物学的サンプルの中の前記フルオロフォアによって放出される光のための前記一次的放出光学経路は、前記第1のフィルターにおいて反射し、前記第2のフィルターを通過し、前記放出フィルターを通過し、前記光学モジュールを退出する、請求項4に記載の光学モジュール。 - 前記第1のフィルターは、前記第1の帯域および前記第2の帯域の励起波長の光を通し、前記第3の帯域の励起波長の光、ならびに、前記第1の帯域、前記第2の帯域、および前記第3の帯域の放出波長の光を反射するように構成されており、
前記第2のフィルターは、前記第2の帯域の放出波長の光を通し、前記第1の帯域の励起波長の光を反射するように構成されており、
前記第3のフィルターは、前記第1の帯域、前記第2の帯域、および前記第3の帯域の放出波長の光を通し、前記第3の帯域の励起波長の光を反射するように構成されている、請求項1から5のいずれか一項に記載の光学モジュール。 - 前記第1の光源は、前記第1の光学経路が前記第1の光源において開始し、前記第2のフィルターにおいて反射し、前記第1のフィルターを通過し、前記一次的透過光学経路に沿って前記光学モジュールを退出するように配置されており、
前記第2の光源は、前記第2の光学経路が前記第2の光源において開始し、前記第2のフィルターを通過し、次いで、前記第1のフィルターを通過し、前記一次的透過光学経路に沿って前記光学モジュールを退出するように配置されており、
前記第3の光源は、前記第3の光学経路が前記第3の光源において開始し、前記第3のフィルターにおいて前記第1のフィルターへ反射し、前記第1のフィルターにおいて反射し、前記一次的透過光学経路に沿って前記光学モジュールを退出するように配置されており、
前記生細胞生物学的サンプルの中の前記フルオロフォアによって放出される光のための前記一次的放出光学経路は、前記第1のフィルターにおいて反射し、前記第3のフィルターを通過し、前記放出フィルターを通過し、前記光学モジュールを退出する、請求項6に記載の光学モジュール。 - 前記第1の帯域の励起波長は、453nmから485nmの範囲にあり、前記第2の帯域の励起波長は、546nmから568nmの範囲にあり、前記第3の帯域の励起波長は、648nmから674nmの範囲にある、請求項1から7のいずれか一項に記載の光学モジュール。
- 前記第1の帯域の放出波長は、494nmから533nmの範囲にあり、前記第2の帯域の放出波長は、576nmから639nmの範囲にあり、前記第3の帯域の放出波長は、686nmから756nmの範囲にある、請求項1から7のいずれか一項に記載の光学モジュール。
- 第4の帯域の励起波長において第4の光を放出するように構成されている第4の光源と、
前記第4の光源の第4の光学経路の中に配置されている第4のフィルターであって、前記第4のフィルターは、1つまたは複数の波長における光を通し、1つまたは複数の波長における光を反射するように構成されており、前記放出フィルターは、第4の帯域の放出波長の光を通し、前記第4の帯域の励起波長の光を反射するようにさらに構成されている、第4のフィルターと
をさらに含む、請求項1から9のいずれか一項に記載の光学モジュール。 - 前記第1のフィルターは、前記第1の帯域の励起波長の光を通し、前記第4の帯域の励起波長の光を反射するように構成されており、
前記第2のフィルターは、前記第1の帯域、前記第2の帯域、および前記第3の帯域の放出波長の光を通し、前記第2の帯域および前記第3の帯域の励起波長の光を反射するように構成されており、
前記第3のフィルターは、前記第3の帯域の励起波長の光を通し、前記第2の帯域の励起波長の光を反射するように構成されており、
前記第4のフィルターは、前記第1の帯域および前記第4の帯域の励起波長の光を通し、前記第2の帯域および前記第3の帯域の励起波長の光、ならびに、前記第1の帯域、前記第2の帯域、前記第3の帯域、および前記第4の帯域の放出波長の光を反射するように構成されている、請求項10に記載の光学モジュール。 - 前記第4の帯域の放出波長は、453nmよりも小さく、前記第4の帯域の励起波長は、前記第4の帯域の放出波長よりも小さい、請求項10または11に記載の光学モジュール。
- 前記第1の光源は、前記第1の光学経路が前記第1の光源において開始し、前記第1のフィルターを通過し、次いで、第4のフィルターを通過し、前記一次的透過光学経路に沿って前記光学モジュールを退出するように配置されており、
前記第2の光源は、前記第2の光学経路が前記第2の光源において開始し、前記第3のフィルターにおいて前記第2のフィルターへ反射し、前記第2のフィルターにおいて前記第4のフィルターへ反射し、前記第4のフィルターにおいて反射し、前記一次的透過光学経路に沿って前記光学モジュールを退出するように配置されており、
前記第3の光源は、前記第3の光学経路が前記第3の光源において開始し、前記第3のフィルターを通過して前記第2のフィルターに向かい、前記第2のフィルターにおいて前記第4のフィルターへ反射し、前記第4のフィルターにおいて反射し、前記一次的透過光学経路に沿って前記光学モジュールを退出するように配置されており、
第4の光源は、第4の光学経路が前記第4の光源において開始し、前記第1のフィルターにおいて反射し、前記第4のフィルターを通過し、前記一次的透過光学経路に沿って前記光学モジュールを退出するように配置されており、
前記生細胞生物学的サンプルの中の前記フルオロフォアによって放出される光のための前記一次的放出光学経路は、前記第4のフィルターにおいて反射し、前記第2のフィルターを通過し、前記放出フィルターを通過し、前記光学モジュールを退出する、請求項1から12のいずれか一項に記載の光学モジュール。 - 生細胞生物学的サンプルをアッセイするためのシステムであって、前記システムは、
請求項1から13のいずれか一項に記載の光学モジュールと、
前記光学モジュールに除去可能に連結されている蛍光顕微鏡であって、前記蛍光顕微鏡は、少なくとも1つの対物レンズを有している、蛍光顕微鏡と、
前記対物レンズから前記生細胞生物学的サンプルの中の前記フルオロフォアによって放出される光のための放出経路の中に配置されている前記イメージングセンサーと、
前記蛍光顕微鏡に除去可能に連結されている位相ランプであって、前記位相ランプは、前記一次的透過光学経路の終端端部に配置されている、位相ランプと
を含む、システム。 - 前記光学モジュールを通って延在するシャフトであって、前記蛍光顕微鏡は、前記シャフトを第1の配向で受け入れるように構成されている受容部を有しており、前記シャフトは、力の印加の下で第2の配向に回転し、それによって、前記光学モジュールを前記蛍光顕微鏡にロックするように構成されている、シャフト
をさらに含む、請求項14に記載のシステム。 - 前記光学モジュールに連結されている第1の電気コネクターと、
前記蛍光顕微鏡に連結されている第2の電気コネクターであって、前記第2の電気コネクターは、前記第1の電気コネクターと相互的になっている、第2の電気コネクターと、
前記第1の電気コネクターおよび前記第2の電気コネクターのうちの少なくとも1つと電気的に通信しているプロセッサーであって、前記プロセッサーは、前記蛍光顕微鏡に連結されている前記光学モジュールを識別するように構成されている、プロセッサーと
をさらに含む、請求項14または15に記載のシステム。 - 第3の電気コネクターを有する前記位相ランプと、
前記蛍光顕微鏡に連結されている第4の電気コネクターであって、前記第3の電気コネクターは、前記第4の電気コネクターと相互的になっており、前記プロセッサーは、前記光学モジュールおよび前記位相ランプが互換性があるかどうかを決定し、その決定に応答して警告を表示させるように構成されている、第4の電気コネクターと
をさらに含む、請求項16に記載のシステム。 - 30℃から42℃の範囲にある温度において、および、80%から100%の範囲にある相対湿度において、前記生細胞生物学的サンプルを維持するように構成されているインキュベーターであって、前記光学モジュールは、前記インキュベーターのチャンバーに連結されている、インキュベーター
をさらに含む、請求項14から17のいずれか一項に記載のシステム。 - 生細胞生物学的サンプルの中のフルオロフォアをイメージングするための方法であって、前記方法は、
第1の生物学的サンプルおよび蛍光顕微鏡を整合させるステップであって、前記第1の生物学的サンプルが前記蛍光顕微鏡の視野の中に位置付けされるようになっており、前記第1の生物学的サンプルは、(i)第1の帯域の励起波長の光による照射に応答して第1の帯域の放出波長の光を放出する第1のフルオロフォア、(ii)第2の帯域の励起波長の光による照射に応答して第2の帯域の放出波長の光を放出する第2のフルオロフォア、および、(iii)第3の帯域の励起波長の光による照射に応答して第3の帯域の放出波長の光を放出する第3のフルオロフォアを含む、ステップと、
前記蛍光顕微鏡を使用して前記第1の生物学的サンプルの1セットのイメージを取得するステップであって、前記1セットのイメージのイメージ同士は、フォーカス設定に関して異なっている、ステップと、
前記1セットのイメージに基づいて、前記第1の、第2の、および第3の帯域の放出波長に関する第1の、第2の、および第3のインフォーカス設定をそれぞれ決定するステップと、
第1の時間の期間の間に、第1の光源を使用し、前記第1の帯域の励起波長の光によって前記第1の生物学的サンプルを照射するステップと、前記第1のインフォーカス設定に従って前記蛍光顕微鏡を動作させ、前記蛍光顕微鏡のイメージセンサーを介して、前記第1の帯域の放出波長の光の第1のイメージを取得するステップと、
第2の時間の期間の間に、第2の光源を使用し、前記第2の帯域の励起波長の光によって前記第1の生物学的サンプルを照射するステップと、前記第2のインフォーカス設定に従って前記蛍光顕微鏡を動作させ、前記イメージセンサーを介して、前記第2の帯域の放出波長の光の第2のイメージを取得するステップと、
第3の時間の期間の間に、第3の光源を使用し、前記第3の帯域の励起波長の光によって前記第1の生物学的サンプルを照射するステップと、前記第3のインフォーカス設定に従って前記蛍光顕微鏡を動作させ、前記イメージセンサーを介して、前記第3の帯域の放出波長の光の第3のイメージを取得するステップと
を含む、方法。 - 前記第2のフルオロフォアおよび前記第3のフルオロフォアによって放出される光からのアーチファクトを低減させるために、前記第1の、第2の、および第3のイメージに基づいて、イメージングセンサーと電気的に通信しているプロセッサーを介して、前記第1のフルオロフォアによって放出される光の第1の補正されたイメージを発生させるステップと、
前記第1のフルオロフォアおよび前記第3のフルオロフォアによって放出される光からのアーチファクトを低減させるために、前記第1の、第2の、および第3のイメージに基づいて、前記プロセッサーを介して、前記第2のフルオロフォアによって放出される光の第2の補正されたイメージを発生させるステップと、
前記第1のフルオロフォアおよび前記第2のフルオロフォアによって放出される光からのアーチファクトを低減させるために、前記第1の、第2の、および第3のイメージに基づいて、前記プロセッサーを介して、前記第3のフルオロフォアによって放出される光の第3の補正されたイメージを発生させるステップと
をさらに含む、請求項19に記載の方法。 - 前記第1の、第2の、および第3のイメージを取得するときに、前記蛍光顕微鏡に連結されているインキュベーターを介して、30℃から42℃の範囲にある温度において、および、80%から100%の範囲にある相対湿度において、少なくとも前記第1の生物学的サンプルを維持するステップ
をさらに含む、請求項19または20に記載の方法。 - 前記第1の生物学的サンプルが前記第1のインフォーカス設定にあるときに取得される位相または明視野イメージならびに前記第1のイメージに基づいて、第1の補正されたイメージを発生させるステップをさらに含む、請求項19から21のいずれか一項に記載の方法。
- プロセッサーを介して、前記蛍光顕微鏡の光学モジュールおよび位相ランプモジュールに関する互換性情報を受信するステップと、
前記プロセッサーを介して、前記互換性情報に基づいて、前記光学モジュールおよび前記位相ランプが互換性があるかどうかを決定するステップと、
前記光学モジュールおよび前記位相ランプが互換性がないという決定に応答して、前記プロセッサーを介して、非互換性のインディケーションとともに警告を表示させるステップと
をさらに含む、請求項19から22のいずれか一項に記載の方法。 - 前記蛍光顕微鏡の光学モジュールを通して前記蛍光顕微鏡の受容部へシャフトを第1の配向で延在させるステップと、
力の印加の下で前記シャフトを回転させるステップであって、シャフトが、第2の配向に移動し、それによって、前記光学モジュールを前記蛍光顕微鏡に連結するようになっている、ステップと
をさらに含む、請求項19から23のいずれか一項に記載の方法。 - 非一時的なコンピューター可読媒体であって、前記非一時的なコンピューター可読媒体は、プログラム命令をその上に記憶しており、前記プログラム命令は、請求項1から13のいずれか一項に記載の光学モジュールと電気機械的に通信しているプロセッサーによって実行されると、1セットの行為の実施を引き起こし、前記行為は、
第1の生物学的サンプルおよび蛍光顕微鏡を整合させるステップであって、前記第1の生物学的サンプルが前記蛍光顕微鏡の視野の中に位置付けされるようになっており、前記第1の生物学的サンプルは、(i)第1の帯域の励起波長の光による照射に応答して第1の帯域の放出波長の光を放出する第1のフルオロフォア、(ii)第2の帯域の励起波長の光による照射に応答して第2の帯域の放出波長の光を放出する第2のフルオロフォア、および、(iii)第3の帯域の励起波長の光による照射に応答して第3の帯域の放出波長の光を放出する第3のフルオロフォアを含む、ステップと、
前記イメージングセンサーが、前記蛍光顕微鏡を使用して前記第1の生物学的サンプルの第1のセットのイメージを取得するステップであって、前記1セットのイメージのイメージ同士は、フォーカス設定に関して異なっている、ステップと、
前記1セットのイメージに基づいて、前記第1の、第2の、および第3の帯域の放出波長に関する第1の、第2の、および第3のインフォーカス設定をそれぞれ決定するステップと、
第1の時間の期間の間に、第1の光源を使用し、前記第1の帯域の励起波長の光によって前記第1の生物学的サンプルを照射するステップと、前記第1のインフォーカス設定に従って前記蛍光顕微鏡を動作させ、前記蛍光顕微鏡のイメージセンサーを介して、前記第1の帯域の放出波長の光の第1のイメージを取得するステップと、
第2の時間の期間の間に、第2の光源を使用し、前記第2の帯域の励起波長の光によって前記第1の生物学的サンプルを照射するステップと、前記第2のインフォーカス設定に従って前記蛍光顕微鏡を動作させ、前記イメージセンサーを介して、前記第2の帯域の放出波長の光の第2のイメージを取得するステップと、
第3の時間の期間の間に、第3の光源を使用し、前記第3の帯域の励起波長の光によって前記第1の生物学的サンプルを照射するステップと、前記第3のインフォーカス設定に従って前記蛍光顕微鏡を動作させ、前記イメージセンサーを介して、前記第3の帯域の放出波長の光の第3のイメージを取得するステップと
を含む、非一時的なコンピューター可読媒体。
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