CN115697375A - 预防或治疗放疗、化疗或其组合引发的粘膜炎的包含glp-2衍生物或其长效缀合物的药物组合物 - Google Patents

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Abstract

公开了GLP‑2及其长效缀合物用于由放疗、化疗或其组合引发的粘膜炎的预防或治疗用途。本发明的GLP‑2、其长效缀合物或包含其的组合物可用于制备、治疗和改善由放疗和/或化疗引发的粘膜炎。

Description

预防或治疗放疗、化疗或其组合引发的粘膜炎的包含GLP-2衍 生物或其长效缀合物的药物组合物
技术领域
本发明涉及GLP-2衍生物及其长效缀合物用于由放疗、化疗或其组合引发的粘膜炎的预防或治疗用途。
背景技术
胰高血糖素样肽2(GLP-2)是一种由33个氨基酸组成的肽激素，并响应于所摄取的营养物，由小肠L细胞产生。GLP-2引发小肠和大肠的粘膜生长、促进肠细胞和隐窝细胞的生长以及抑制细胞凋亡。另外，GLP-2增加小肠内营养物的吸收并且降低肠渗透性。此外，GLP-2抑制胃排空和胃酸分泌、提高肠血流速以及放松肠平滑肌。
由于能量吸收、保护和激活肠细胞功能的特性，GLP-2在各种肠病和肠损伤的实验模型中显示出作为治疗剂的潜力。作为一种调节营养物吸收的激素，GLP-2有潜力作为短肠综合征(short bowel syndrome)(SBS)的治疗剂。SBS是一种先天性障碍或是由肠切除手术引发的获得性障碍，由于小肠吸收面积减少而导致营养物缺乏。证实GLP-2在患有SBS的啮齿动物的实验模型中增强了营养物吸收和消化道吸收(Ljungmann K et al.,Am.J.Physiol.Gastrointest Liver Physiol.,2001,281(3):G779–85)。
同时，在放疗和/或化疗期间，由于粘膜等——其中细胞快速生长——受到损伤以及还有靶细胞(例如，癌细胞)，因此会出现副作用，如粘膜炎。因此，需要开发能够预防或治疗由放疗和/或化疗引发的粘膜炎的药物。
发明内容
[技术问题]
本发明的目的是提供用于预防、改善或治疗由放疗、化疗或其组合引发的粘膜炎的组合物，所述组合物包含胰高血糖素样肽-2(GLP-2)衍生物和/或其长效缀合物。
本发明的另一个目的是提供用于预防、改善或治疗由放疗、化疗或其组合引发的粘膜炎的方法，所述方法包括向有需要的对象施用GLP-2衍生物、其长效缀合物和/或包含其的组合物。
本发明的另一个目的是提供GLP-2衍生物、其长效缀合物和/或包含其的组合物在制备用于预防或治疗由放疗、化疗或其组合引发的粘膜炎的药物中的用途。
[技术解决方案]
本发明的一个方面提供了用于预防、改善或治疗由放疗、化疗或其组合引发的粘膜炎的组合物，所述组合物包含胰高血糖素样肽-2(GLP-2)衍生物和/或其长效缀合物。
在一个具体实施方式中，本发明提供了用于预防或治疗由放疗、化疗或其组合引发的粘膜炎的药物组合物，所述药物组合物包含GLP-2衍生物和/或其长效缀合物。
在另一个具体实施方式中，本发明提供了用于预防或改善由放疗、化疗或其组合引发的粘膜炎的食品组合物，所述食品组合物包含GLP-2衍生物和/或其长效缀合物。
根据本发明具体实施方式的组合物是用于预防或治疗由放疗、化疗或其组合引发的粘膜炎的药物组合物，所述药物组合物包含：药学上可接受的赋形剂；和药学有效量的胰高血糖素样肽-2(GLP-2)衍生物，其中GLP-2衍生物包含由以下通式1表示的氨基酸序列：
[通式1]
X1X2DGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTX30ITDX34(SEQ ID NO:10)
其中
X1是组氨酸、咪唑并乙酰基去组氨酸、去氨基组氨酸、β-羟基咪唑并丙酰基去组氨酸、N-二甲基组氨酸或β-羧基咪唑并丙酰基去组氨酸；
X2是丙氨酸、甘氨酸或2-氨基异丁酸(Aib)；
X30是赖氨酸或精氨酸；
X34是至少一个氨基酸或至少一个变异的氨基酸；以及
条件是从通式1的氨基酸序列中排除与SEQ ID NO:1相同的序列。
根据具体实施方式中任一项的组合物的特征在于所述变异是在一个或多个氨基酸处发生的取代、添加、缺失、修饰或其组合。
根据具体实施方式中任一项的组合物的特征在于GLP-2衍生物包括由以下通式2表示的氨基酸序列：
[通式2]
X1X2DGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTX30ITDX34(SEQ ID NO:9)
其中
X1是组氨酸、咪唑并乙酰基去组氨酸、去氨基组氨酸、β-羟基咪唑并丙酰基去组氨酸、N-二甲基组氨酸或β-羧基咪唑并丙酰基去组氨酸；
X2是丙氨酸、甘氨酸或2-氨基异丁酸(Aib)；
X30是赖氨酸或精氨酸；
X34不存在，或是赖氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、6-叠氮基赖氨酸或半胱氨酸；以及
条件是从通式2的氨基酸序列中排除与SEQ ID NO:1相同的序列。
根据具体实施方式中任一项的组合物的特征在于GLP-2衍生物具有以下结构，其中：
(1)X1是咪唑并乙酰基去组氨酸，X2是甘氨酸，X30是赖氨酸，并且X34是半胱氨酸，
(2)X1是咪唑并乙酰基去组氨酸，X2是甘氨酸，X30是赖氨酸，并且X34是赖氨酰，
(3)X1是咪唑并乙酰基去组氨酸，X2是甘氨酸，X30是精氨酸，并且X34是赖氨酸，
(4)X1是咪唑并乙酰基去组氨酸，X2是甘氨酸，X30是赖氨酸，并且X34是6-叠氮基赖氨酸，
(5)X1是咪唑并乙酰基去组氨酸，X2是甘氨酸，X30是精氨酸，并且X34是半胱氨酸，
(6)X1是咪唑并乙酰基去组氨酸，X2是Aib，X30是赖氨酸，并且X34是半胱氨酸，或
(7)X1是组氨酸，X2是Aib，X30是赖氨酸，并且X34是半胱氨酸。
根据具体实施方式中任一项的组合物的特征在于GLP-2衍生物包含选自SEQ IDNO:2至8的氨基酸序列。
根据具体实施方式中任一项的组合物的特征在于GLP-2衍生物的C-末端是未变异的或是酰胺化的。
根据具体实施方式中任一项的组合物的特征在于粘膜炎是口腔粘膜炎、胃肠粘膜炎或其组合。
根据具体实施方式中任一项的组合物的特征在于化疗是使用抗癌药物的化疗。
根据具体实施方式中任一项的组合物的特征在于抗癌药物是细胞毒性抗癌剂、靶向抗癌剂、免疫肿瘤剂或其组合。
根据具体实施方式中任一项的组合物的特征在于细胞毒性抗癌剂是核苷类似物、抗叶酸剂、抗代谢物、拓扑异构酶I抑制剂、蒽环类、鬼臼脂素、紫杉烷、长春碱、烷化剂、铂化合物或其组合。
根据具体实施方式中任一项的组合物的特征在于抗癌药物是5-氟尿嘧啶(5-FU)、环磷酰胺(CPA)、多西紫杉醇(Docetaxel)、多柔比星、长春新碱、强的松、依托泊苷、异环磷酰胺、甲氨蝶呤、紫杉醇、吉西他滨(Glemcitabine)、长春瑞滨、亚叶酸、伊立替康、奥沙利铂(Oxaliplatin)或其组合。
根据具体实施方式中任一项的组合物的特征在于在进行放疗或化疗前1天内施用组合物；或在进行放疗或化疗后1天内施用组合物。
根据具体实施方式中任一项的组合物的特征在于组合物导致施用组合物的对象中小肠质量(small intestine mass)增加、小肠质量减少水平降低、炎症抑制、单核细胞向巨噬细胞分化抑制和单核细胞迁移抑制中的至少一种。
根据具体实施方式中任一项的组合物的特征在于GLP-2衍生物是长效缀合物的形式，其中GLP-2衍生物与能够增加GLP-2衍生物的体内半衰期的生物相容性材料连接。
根据具体实施方式中任一项的组合物的特征在于其中缀合物由以下化学式1表示：
[化学式1]
X–La–F
其中，
X是GLP-2衍生物；
L是包含乙二醇重复单元的连接体；
a是0或自然数，条件是当a是2或更大时，每个L彼此独立；
F是免疫球蛋白Fc区；以及
“–”是共价键。
根据具体实施方式中任一项的组合物的特征在于免疫球蛋白Fc区是非糖基化IgG4 Fc区。
根据具体实施方式中任一项的组合物的特征在于免疫球蛋白Fc区包括铰链区。
根据具体实施方式中任一项的组合物的特征在于免疫球蛋白Fc区是IgG4 Fc区。
根据具体实施方式中任一项的组合物的特征在于F是由两条多肽链组成的二聚体，并且L的一端仅与所述两条多肽链中的一条多肽链连接。
根据具体实施方式中任一项的组合物的特征在于L是聚乙二醇。
根据具体实施方式中任一项的组合物的特征在于L中的乙二醇重复单元部分的式量在1kDa至100kDa的范围内。
本发明的另一个方面提供了用于预防、改善或治疗由放疗、化疗或其组合引发的粘膜炎的方法，所述方法包括向有需要的对象施用GLP-2衍生物、其长效缀合物和/或包含其的组合物，其中GLP-2衍生物包含由上述通式1表示的氨基酸序列(其中从通式1的氨基酸序列中排除与SEQ ID NO:1相同的序列)。
本发明的另一方面提供了GLP-2衍生物、其长效缀合物或包含其的组合物用于由放疗、化疗或其组合引发的粘膜炎的预防、改善或治疗用途，其中GLP-2衍生物包含由上述通式1表示的氨基酸序列(其中从通式1的氨基酸序列中排除与SEQ ID NO:1相同的序列)。
本发明的另一方面提供GLP-2衍生物、其长效缀合物或包含其的药物组合物在制备用于预防或治疗由放疗、化疗或其组合引发的粘膜炎的药物中的用途，其中GLP-2衍生物包含由上述通式1表示的氨基酸序列(其中从通式1的氨基酸序列中排除与SEQ ID NO:1相同的序列)。
【有利效果】
根据本发明的GLP-2衍生物、其长效缀合物或包括其的组合物可用于预防、治疗和改善由放疗和/或化疗引发的粘膜炎。
附图说明
图1显示了对化疗(多西紫杉醇和环磷酰胺，TC)引发粘膜炎的大鼠模型施用GLP-2衍生物长效缀合物后小肠质量变化的比较分析结果。
图2显示了在化疗(TC)引发粘膜炎的大鼠模型中通过与化疗同时地施用GLP-2衍生物(替度鲁肽(Teduglutide))和GLP-2衍生物长效缀合物(A)；以及通过化疗前一天施用GLP-2衍生物长效缀合物对小肠质量变化的比较分析结果。
图3显示了GLP-2衍生物长效缀合物在THP-1细胞(单核细胞)中抑制M1极化(A)、抑制巨噬细胞分化(B)和抑制单核细胞迁移(C)方面的作用。
具体实施方式
下面将详细描述本发明。
同时，本文公开的各个描述和实施方式都可在本文中适用于对其它描述和实施方式进行描述。即，本文公开的各种要素的所有组合都属于本公开的范围。此外，本发明的范围不应受下文提供的具体描述的限制。
本领域技术人员将认识到或能够使用不超过常规实验来确定本公开具体实施方式的多种等效物。此类等同物旨在涵盖在以下权利要求的范围内。
在整个说明书中，不仅使用了天然存在的氨基酸的传统的一个字母和三个字母代码，而且还使用了其它氨基酸通常允许的三个字母的代码，如α-氨基异丁酸(Aib)和6-叠氮基赖氨酸(AZK)。另外，本文提及的氨基酸根据IUPAC-IUB的命名规则缩写如下。
丙氨酸Ala、A 精氨酸Arg、R
天冬酰胺Asn、N 天冬氨酸Asp、D
半胱氨酸Cys、C 谷氨酸Glu、E
谷氨酰胺Gln、Q 甘氨酸Gly、G
组氨酸His、H 异亮氨酸Ile、I
亮氨酸Leu、L 赖氨酸Lys、K
甲硫氨酸Met、M 苯丙氨酸Phe、F
脯氨酸Pro、P 丝氨酸Ser、S
苏氨酸Thr、T 色氨酸Trp、W
酪氨酸Tyr、Y 缬氨酸Val、V
本发明的一个方面提供了用于预防、治疗或改善由放疗、化疗或其组合引发的粘膜炎的组合物，所述组合物包含胰高血糖素样肽-2(GLP-2)衍生物。具体地，组合物可以是用于预防或治疗由放疗、化疗或其组合引发的粘膜炎的药物组合物。
本发明的具体实例可包括用于预防或治疗由放疗、化疗或其组合引发的粘膜炎的药物组合物，所述药物组合物包含药学上可接受的赋形剂；和药学有效量的GLP-2衍生物，但不限于此。
如本文所用，术语“粘膜炎”是指发生在口腔和/或消化道粘膜中的炎症和溃疡，而“由放疗、化疗或其组合引发的粘膜炎”是指作为单独进行放疗或化疗或者进行放疗与化疗的组合(而不管顺序或次数如何)的副作用而引发的粘炎，具体是口腔粘膜炎、胃肠粘膜炎或其组合，但不限于此。胃肠粘膜炎可以是肠炎性疾病和/或肠溃疡疾病，但不限于此。胃肠粘膜炎可能会引起营养缺乏或体重减轻等症状，原因是腹泻、肛门溃疡、直肠溃疡、直肠出血、腹痛、吞咽困难、呕吐、腹胀或小肠绒毛高度和隐窝深度降低导致营养吸收减少。
放疗是指使用辐射束来预防或治疗疾病的疗法，并且本文包括所有类型的放疗——单独使用或与化疗组合使用并引起粘膜炎的。另外，化疗是指用于使用化学药物预防或治疗疾病的疗法，并且本文包括所有类型的化疗——利用药物单独执行或与放疗组合使用并引发粘膜炎的。
在具体实施方式中，放疗和化疗可用于预防或治疗癌症，并且癌症可以是肺癌(例如，非小细胞肺癌、小细胞肺癌或恶性间皮瘤)、间皮瘤、胰腺癌(例如，胰腺导管癌或胰腺内分泌肿瘤)、咽癌、喉癌、食管癌、胃癌(例如，乳头状腺癌、粘液腺癌或腺鳞癌(adenosquamous carcinoma))、十二指肠癌、小肠癌、结直肠癌(例如，结肠癌、直肠癌、肛门癌、家族性结直肠癌、遗传性非息肉病结直肠癌或胃肠间质瘤)、乳腺癌(例如，浸润性导管癌、非浸润性导管癌症或炎性乳腺癌)、卵巢癌(例如，上皮性卵巢癌、睾丸外生殖细胞肿瘤(extra-testicular germ cell tumor)、卵巢生殖细胞肿瘤或卵巢低级严重肿瘤)、睾丸癌、前列腺癌(例如，激素依赖性前列腺癌或激素非依赖性前列腺癌)、肝癌(例如，肝细胞癌、原发性肝癌或肝外胆管癌)、甲状腺癌(例如，甲状腺髓样癌)、肾癌(例如，肾盂和输尿管的肾细胞癌或移行细胞癌)、子宫癌(例如，宫颈癌、子宫体癌或子宫肉瘤)、脑肿瘤(例如，髓母细胞瘤、胶质瘤、松果体星形细胞瘤、毛细胞性星形细胞瘤、弥漫性星形细胞瘤、多形性成胶质细胞瘤或垂体腺瘤)、视网膜母细胞瘤、皮肤癌(例如，基底细胞癌或恶性黑色素瘤)、肉瘤(例如，横纹肌肉瘤、平滑肌肉瘤或软组织肉瘤)、恶性骨肿瘤、膀胱癌、血癌(例如，多发性骨髓瘤、白血病、恶性淋巴瘤、霍奇金病或慢性骨髓增生性疾病)或未知原发性癌症，但不限于此。
用于预防或治疗的化疗可以是使用抗癌药物的化疗，并且粘膜炎可以作为其副作用被引发。“使用抗癌药物”包括单独或联合使用抗癌药物并且同时、依次或以逆序与抗癌药物一起使用任何其它物质(例如，除抗癌药物以外的药物和抑制抗癌药物副作用的药物)，从而诱发粘膜炎。
在具体实施方式中，引发粘膜炎的抗癌药物可以是细胞毒性抗癌剂、靶向抗癌剂或免疫肿瘤剂或其组合，但不限于此。
细胞毒性抗癌剂是一种攻击快速分化细胞的药物，具体是核苷类似物(例如，阿扎胞苷、卡培他滨(Capecitabine)、卡莫氟、克拉屈滨(Cladribine)、氯法拉宾(Clofarabine)、阿糖胞苷、地西他滨(Decitabine)、氟尿苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、吉西他宾、巯基嘌呤、奈拉滨(Nelarabine)、喷司他丁、替加氟和硫鸟嘌呤)、抗叶酸剂(例如，甲氨蝶呤、培美曲塞(Pemetrexed)和雷替曲塞(Raltitrexed))、抗代谢物(例如，羟基脲(羟基尿素))、拓扑异构酶I抑制剂(例如，伊立替康和拓泊特坎)、蒽环类(例如，柔红霉素、多柔比星、表柔比星和依达比星)、鬼臼脂素(例如，依托泊苷和替尼泊苷)、紫杉烷(例如，卡巴他赛(Cabazitaxel)、多西紫杉醇和紫杉醇)、长春碱(例如，长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春氟宁(Vinflunine)和长春瑞滨)、烷化剂(例如，苯达莫司汀、百消安、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、氮芥、环磷酰胺、达卡巴嗪(Dacarbazine)、福莫司汀(Fotemustine)、异环磷酰胺、洛莫司汀、美法仑、链佐星和替莫唑胺(Temozolomide))、铂化合物(例如，卡铂、顺铂、奈达铂(Nedaplatin)和奥沙利铂)或任意其它药物(例如，六甲蜜胺、博莱霉素、硼替佐米(Bortezomib)、更生霉素、雌莫司汀、伊沙匹隆(Ixabepilone)、丝裂霉素和甲基苄阱)，但不限于此。
另外，靶向抗癌剂是选择性地攻击具有某些部分的癌细胞的药物——通过靶向与其它细胞(例如，正常细胞)不同的所述某些部分——具体是单克隆抗体(例如，阿仑单抗(Alemtuzumab)、贝伐单抗(Bevacizumab)、西妥昔单抗(Cetuximab)、地诺单抗(Denosumab)、吉妥珠单抗(Gemtuzumab ozogamicin)、替伊莫单抗(Ibritumomabtiuxetan)、伊匹单抗(Ipilimumab)、纳物单抗(Nivolumab)、奥法木单抗(Ofatumumab)、帕尼单抗(Panitumumab)、派姆单抗(Pembrolizumab)、帕妥珠(Pertuzumab)、利妥昔单抗(Rituximab)、托西莫单抗(Tositumomab)和曲妥珠单抗(Trastuzumab))、酪氨酸激酶抑制剂(例如，阿法替尼(Afatinib)、阿柏西普(Aflibercept)、阿昔替尼(Axitinib)、博舒替尼(Bosutinib)、克唑替尼(Crizotinib)、埃罗替尼(Erlotinib)、吉非替尼(Gefitinib)、伊马替尼(Imatinib)、拉帕替尼(Lapatinib)、尼洛替尼(Nilotinib)、帕唑帕尼(Pazopanib)、普纳替尼(Ponatinib)、瑞戈非尼(Regorafenib)、鲁索利替尼(Ruxolitinib)、索拉非尼(Sorafenib)、舒尼替尼(Sunitinib)和凡德他尼(Vandetanib))、mTOR抑制剂(例如，依维莫司(Everolimus)和西罗莫司(Temsirolimus))、类视色素(例如，阿利维A酸(Alitretinoin)、蓓萨罗丁(Bexarotene)、异维甲酸、他米巴罗汀(Tamibarotene)和维甲酸)、免疫调节剂(例如，来那度胺、泊马度胺(Pomalidomide)和沙利度胺)、组蛋白去乙酰酶抑制剂(帕比司他(Panobinostat)、罗米地辛(Romidepsin)、丙戊酸盐(Valproate)和伏立诺他(Vorinostat))或任意其它药物(阿那格雷(Anagrelide)、三氧化二砷、天冬酰胺酶、卡介苗、地尼白介素(Denileukin diftitox)和维莫非尼(Vemurafenib))，但不限于此。
另外，免疫肿瘤剂是利用人免疫系统攻击癌细胞的药物，具体是防止癌细胞逃避免疫系统或帮助免疫细胞更容易识别和攻击癌细胞的药物，更具体地是免疫检查点抑制剂(例如，阿特珠单抗(Atezolizumab)、伊匹单抗、阿维鲁单抗(Avelumab)、纳物单抗、派姆单抗和德瓦鲁单抗(Durvalumab))、免疫细胞作用增强剂(例如，博纳吐单抗(blinatumomab))或任意其它药物(例如，阿仑单抗、奥法木单抗和埃罗妥珠单抗(Elotuzumab))，但不限于此。
另外，一种药物可以充当靶向抗癌剂和免疫肿瘤剂。
此外，在具体实施方式中，可引起粘膜炎的抗癌药物可以是5-氟尿嘧啶(5-FU)、环磷酰胺(CPA)、多西紫杉醇、多柔比星、长春新碱、强的松、依托泊苷、异环磷酰胺、甲氨蝶呤、紫杉醇、吉西他滨、长春瑞滨、亚叶酸、伊立替康、奥沙利铂或其组合，但不限于此。
在具体实施方式中，本发明的组合物可以在施用组合物的对象中通过导致小肠质量增加、抑制小肠质量减少(即小肠质量减少水平降低)、炎症抑制、单核细胞向巨噬细胞分化抑制和单核细胞迁移抑制中的至少一种来预防或治疗由放疗、化疗或其组合引发的粘膜炎，但不限于此。
如本文所用，术语“胰高血糖素样肽-2”或“GLP-2”可以是多肽或长效缀合物的形式，其中能够增加其体内半衰期的生物相容性材料作为胰高血糖激素样肽-2受体激动剂与其连接，但不限于此。在本发明中，GLP-2不仅包括天然(例如，人)GLP-2，还包括其衍生物及其缀合物。GLP-2——作为包含在本发明药物组合物中的活性成分——可以以药学有效量包含在药物组合物内。
在本发明中，“GLP-2受体激动剂”是指体内或分离的与人胰高血糖素样肽-2受体结合以引发与天然GLP-2相同或相似的生理活性的物质。例如，GLP-2激动剂可包括天然GLP-2或GLP-2衍生物。
天然GLP-2的氨基酸序列如下。
GLP-2(1–33)
HADGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITD(SEQ ID NO:1)
在本发明中，“GLP-2衍生物”包括具有与天然GLP-2的氨基酸序列不同的至少一个氨基酸的肽和通过修饰来变异天然GLP-2的氨基酸序列而获得的同时具有预防、治疗或改善由放疗、化疗或其组合引发的粘膜炎的功能的肽；和/或天然GLP-2的模拟物，其具有预防、治疗和/或改善由放疗、化疗或其组合引发的粘膜炎的功能，如天然GLP-2。
具体地，本发明的GLP-2衍生物可以通过使天然GLP-2的至少一个氨基酸变异而获得，所述变异选自取代、添加、缺失、修饰及任意组合，而不限于此。在这种情况下，添加的氨基酸也可以是非天然氨基酸(例如，D-氨基酸)，并且该氨基酸可以被非天然氨基酸以及天然氨基酸取代。添加了氨基酸的氨基酸序列可以衍生自天然GLP-2，但不限于此。此外，在本发明中，氨基酸的变异可意味着氨基酸残基的某些基团被独立地化学取代(例如，α-甲基化、α-羟基化或被叠氮基取代)、缺失(例如，去氨基)和/或修饰(例如，N-甲基化)，或与对至少一个氨基酸取代、添加、缺失或其组合一起，但不限于此。
在具体实施方式中，本发明的GLP-2衍生物可以与天然GLP-2的氨基酸序列具有80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的同源性(或同一性)，和/或GLP-2衍生物的一个氨基酸残基的某些基团可以被化学取代(例如，α-甲基化、α-羟基化或被叠氮基取代)、缺失(例如，去氨基)和/或修饰(例如，N-甲基化)，但不限于此。
在具体实施方式中，GLP-2衍生物的N-末端氨基可以被取代、缺失或修饰，而不限于此。本发明的GLP-2衍生物可以通过以下方法制备：去除N-末端组氨酸的α-氨基的方法、用羟基或羧基取代N-末端氨基的方法、通过缺失N-末端组氨酸的α-碳和与该α-碳连接的N-末端氨基而保留咪唑并乙酰基官能团的方法、用两个甲基修饰N-末端氨基的方法等，以抑制与N-末端连接，N-末端是长效缀合物的制备中GLP-2衍生物体内活性的重要位点。
具体地说，GLP-2衍生物可以是：咪唑并乙酰基-去组氨酰GLP-2(CA-GLP-2)衍生物，其中作为N-末端第一个氨基酸的组氨酸残基的α-碳和与该α-碳连接的N-末端氨基被缺失；去氨基组氨酰GLP-2(DA-GLP-2)衍生物，其中GLP-2的N-末端氨基酸基团被缺失；β-羟基咪唑并丙酰基去组氨酰GLP-2(HY-GLP-2)衍生物，其中GLP-2的N-末端氨基酸被羟基取代；N-二甲基组氨酰GLP-2(DM-GLP-2)衍生物，其中GLP-2的N-末端氨基被2个甲基修饰；或β-羧基咪唑并丙酰基-去组氨酰GLP-2(CX-GLP-2)衍生物，其中GLP-2的N-末端氨基被羧基取代，但不限于此。作为非限制性示例，用于制备GLP-2衍生物的物质的结构如下。
Figure BDA0003952641620000091
在具体实施方式中，GLP-2衍生物可包括SEQ ID NO:1中第1个、第2个、第30个和第33个氨基酸中的至少一个的变异，但不限于此。具体地，在本发明中，氨基酸的变异可以是至少一个氨基酸的选自取代、添加、缺失、修饰及其组合的变异。对此，添加的氨基酸可以是非天然氨基酸(例如，D-氨基酸)，并且所述至少一个氨基酸可以被非天然氨基酸以及天然氨基酸取代。包括了添加的氨基酸的氨基酸序列可衍生自天然GLP-2，但不限于此。另外，本发明的变异可意味着氨基酸残基的某些基团被独立地化学取代(例如，α-甲基化、α-羟基化或被叠氮基取代)、缺失(例如，去氨基)和/或修饰(例如，N-甲基化)，或与对至少一个氨基酸取代、添加、缺失或其组合一起，但不限于此。
在具体实施方式中，GLP-2衍生物可以包括以下通式1的氨基酸序列，但不限于此：
[通式1]
X1X2DGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTX30ITDX34(SEQ ID NO:10)
这里，
X1是组氨酸、咪唑并乙酰基去组氨酸、去氨基组氨酸、β-羟基咪唑并丙酰基去组氨酸、N-二甲基组氨酸或β-羧基咪唑并丙酰基去组氨酸；
X2是丙氨酸、甘氨酸或2-氨基异丁酸(Aib)；
X30是赖氨酸或精氨酸；
X34是至少一个氨基酸或至少一个变异的氨基酸；以及
条件是从通式1的氨基酸序列中排除与SEQ ID NO:1相同的序列。
具体地，氨基酸可以是天然氨基酸或非天然氨基酸，并且变异如上所述。
在具体实施方式中，GLP-2衍生物可包括以下通式2的氨基酸序列，但不限于此：
[通式2]
X1X2DGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTX30ITDX34(SEQ ID NO:9)
这里，
X1是组氨酸、咪唑并乙酰基去组氨酸、去氨基组氨酸、β-羟基咪唑并丙酰基去组氨酸、N-二甲基组氨酸或β-羧基咪唑并丙酰基去组氨酸；
X2是丙氨酸、甘氨酸或2-氨基异丁酸(Aib)；
X30是赖氨酸或精氨酸；
X34不存在，或是赖氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、6-叠氮基赖氨酸或半胱氨酸；以及
条件是从通式2的氨基酸序列中排除与SEQ ID NO:1相同的序列。
具体地，本发明的GLP-2衍生物可以包括用甘氨酸或2-氨基异丁酸(Aib)对天然GLP-2的第2个氨基酸即丙氨酸的取代、用精氨酸对天然GLP-2的第30个氨基酸即赖氨酸的取代或其组合，但不限于此。另外，GLP-2衍生物可以包括引入C-末端(例如，第33个氨基酸)的巯基(例如，半胱氨酸)、氨基(例如，赖氨酸、精氨酸、谷氨酰胺或组氨酸)或叠氮基(例如，6-叠氮基赖氨酸)，但不限于此。
由于在制备GLP-2衍生物的长效缀合物时，连接发生在引入基团处，因此可使用其制备GLP-2缀合物，其中的结合位点是选择性调整的。具体地，非肽基连接体的一端可连接至GLP-2衍生物的羟基、巯基、氨基或叠氮基，而非肽基连接体的另一端可连接至能够增加体内半衰期的材料(例如，免疫球蛋白Fc区)。可通过向GLP-2添加氨基酸引入巯基、氨基或叠氮基，但不限于此。可通过向GLP-2添加半胱氨酸(C)引入巯基；可通过向GLP-2添加赖氨酸(K)、精氨酸(R)、谷氨酰胺(Q)或组氨酸(H)引入氨基；以及可通过向GLP-2添加6-叠氮基赖氨酸(AZK)引入叠氮基，但不限于此。
具体地，GLP-2衍生物的至少一个残基可以是半胱氨酸、赖氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、组氨酸或6-叠氮基赖氨酸，但不限于此。
具体地，本发明的GLP-2衍生物可包括用甘氨酸对天然GLP-2的第2个氨基酸即丙氨酸的取代和将巯基(例如，半胱氨酸)引入到C-末端，更具体地包括咪唑并乙酰基去组氨酸，其中N-末端第一个氨基酸即组氨酸残基的α-碳和与该α-碳连接的N-末端氨基被缺失，从而具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列，但不限于此。
具体地，本发明的GLP-2衍生物可包括用甘氨酸对天然GLP-2的第2个氨基酸即丙氨酸的取代和将氨基(例如，赖氨酸)引入到C-末端，更具体地包括咪唑并乙酰基去组氨酸，其中N-末端第一个氨基酸即组氨酸残基的α-碳和与该α-碳连接的N-末端氨基被缺失，从而具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列，但不限于此。
具体地，本发明的GLP-2衍生物可包括用甘氨酸对天然GLP-2的第2个氨基酸即丙氨酸的取代、用精氨酸对天然GLP-2的第30个氨基酸即赖氨酸的取代和将氨基(例如，赖氨酸)引入到C-末端，更具体地包括咪唑并乙酰基去组氨酸，其中N-末端第一个氨基酸即组氨酸残基的α-碳和与该α-碳连接的N-末端氨基被缺失，从而具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列，但不限于此。
具体地，本发明的GLP-2衍生物可包括用甘氨酸对天然GLP-2的第2个氨基酸即丙氨酸的取代和将叠氮基(例如，6-叠氮基赖氨酸)引入到C-末端，更具体地包括咪唑并乙酰基去组氨酸，其中N-末端第一个氨基酸即组氨酸残基的α-碳和与该α-碳连接的N-末端氨基被缺失，从而具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列，但不限于此。
具体地，本发明的GLP-2衍生物可包括用甘氨酸对天然GLP-2的第2个氨基酸即丙氨酸的取代、用精氨酸对天然GLP-2的第30个氨基酸即赖氨酸的取代和将巯基(例如，半胱氨酸)引入到C-末端，更具体地包括咪唑并乙酰基去组氨酸，其中N-末端第一个氨基酸即组氨酸残基的α-碳和与该α-碳连接的N-末端氨基被缺失，从而具有SEQ ID NO：6的氨基酸序列，但不限于此。
具体地，本发明的GLP-2衍生物可包括用2-氨基异丁酸对天然GLP-2的第2个氨基酸即丙氨酸的取代和将巯基(例如，半胱氨酸)引入到C-末端，从而具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列，更具体地包括咪唑并乙酰基去组氨酸，其中N-末端第一个氨基酸即组氨酸残基的α-碳和与该α-碳连接的N-末端氨基被缺失，从而具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列，但不限于此。
下表1中显示了具有SEQ ID NO：2至8的GLP-2衍生物。
表1
名称 序列 SEQ ID NO
CA GLp-2 KC <sub>ca</sub>HGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITDC 2
CA GLP-2 KK <sub>ca</sub>HGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITDK 3
CA GLP-2 RK <sub>ca</sub>HGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTRITDK 4
CA GLP-2 K<sub>AZ</sub>K <sub>ca</sub>HGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITD<sub>AZ</sub>K 5
CA GLP-2 RC <sub>ca</sub>HGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTRITDC 6
CA GLP-2 Aib <sub>ca</sub>HAibDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITDC 7
GLP-2 Aib HAibDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITDC 8
在表1中，caH表示咪唑并乙酰基去组氨酸代替组氨酸所取代的；Aib表示2-氨基异丁酸；以及AZK表示6-叠氮基-L-赖氨酸。
根据本发明的GLP-2衍生物可以是包括上述序列的肽，或者是(主要)由上述序列组成的肽，但不限于此。
尽管在本发明中描述为肽或GLP-2衍生物“由具体SEQ ID NO组成”，但是这种表达不排除可天然发生的或通过该SEQ ID NO的氨基酸序列上游或下游无意义序列的添加发生的突变或其沉默突变，只要该肽或GLP-2衍生物具有与由该氨基酸序列组成的肽或GLP-2衍生物相同的或等同的活性即可，并且即使当存在此类序列添加或突变时，它显然也属于本发明的范围。
具体地，GLP-2衍生物可以是通式1或2的化合物，其中(1)X2是甘氨酸或Aib，(2)X30是赖氨酸或精氨酸，或(3)X2是甘氨酸或Aib，并且X30是赖氨酸或精氨酸，但不限于此。
具体地，GLP-2衍生物可以是通式1或通式2的化合物，其中
(1)X1是咪唑并乙酰基去组氨酸，X2是甘氨酸，X30是赖氨酸，并且X34是半胱氨酸，
(2)X1是咪唑并乙酰基去组氨酸，X2是甘氨酸，X30是赖氨酸，并且X34是赖氨酰，
(3)X1是咪唑并乙酰基去组氨酸，X2是甘氨酸，X30是精氨酸，并且X34是赖氨酸，
(4)X1是咪唑并乙酰基去组氨酸，X2是甘氨酸，X30是赖氨酸，并且X34是6-叠氮基赖氨酸，
(5)X1是咪唑并乙酰基去组氨酸，X2是甘氨酸，X30是精氨酸，并且X34是半胱氨酸，
(6)X1是咪唑并乙酰基去组氨酸，X2是Aib，X30是赖氨酸，并且X34是半胱氨酸，或
(7)X1是组氨酸，X2是Aib，X30是赖氨酸，并且X34是半胱氨酸，但不限于此。
在本发明中，用于制备天然GLP-2的激动剂、片段、变体和衍生物的修饰包括使用L-氨基酸或D-氨基酸和/或非天然氨基酸的变异；和/或对天然序列的修饰或翻译后变异(例如，甲基化、乙酰化、泛素化和分子内共价结合)。
在本发明中，GLP-2衍生物可以是变异的形式，其中N-末端和/或C-末端经过化学修饰或由有机基团保护，或者可向GLP-2衍生物的末端添加氨基酸，以使其在体内免受蛋白酶的影响，同时增加其稳定性。
特别地，由于化学合成的肽的N-末端和C-末端是带电的，所以为了去除电荷，N-末端可被乙酰化和/或C-末端可被酰胺化，但实施方式不限于此。具体地，在本发明中，GLP-2衍生物可以具有未变异或酰胺化的C-末端，但不限于此。
本发明的GLP-2衍生物可经由固相合成、重组来合成，或者可商业购买。
在本发明中，GLP-2可以是其长效缀合物的形式，其中能够增加其体内半衰期的生物相容性材料与GLP-2衍生物连接，但不限于此。相比于未与生物相容性材料(例如，免疫球蛋白Fc区)连接的GLP-2衍生物，长效缀合物可具有长持续性功效。在本发明中，包括了与GLP-2衍生物连接的生物相容性材料并且GLP-2衍生物的半衰期增加的缀合物被称为“GLP-2衍生物长效缀合物”或“GLP-2衍生物的长效缀合物”。在本发明中，长效缀合物可与缀合物互换使用。
同时，缀合物可以是非天然存在的缀合物。
另外，在GLP-2衍生物长效缀合物中，GLP-2衍生物与生物相容性材料(例如，免疫球蛋白Fc区)之间的键合可通过物理键或化学键或者共价键或非共价键形成，但不限于此。
另外，尽管在GLP-2衍生物长效缀合物中将GLP-2衍生物与生物相容性材料(例如，免疫球蛋白Fc区)连接的方法不受特别限制，但GLP-2衍生物可经由连接体与生物相容性材料(例如，免疫球蛋白Fc区)连接。
另外，公开GLP-2衍生物长效缀合物的韩国专利申请Laid-open公开号10-2019-0037181通过引用并入本文。
在具体实施方式中，本发明的GLP-2衍生物的长效缀合物可以具有由以下化学式1表示的结构，而不限于此。
[化学式1]
X–La–F
这里，
X是本发明中公开的GLP-2衍生物；
L是连接体(例如，包括乙二醇重复单元的连接体)；
a是0或自然数，条件是当a是2或更大时，每个L彼此独立；
F是能够增加X的体内半衰期的生物相容性材料(例如，免疫球蛋白Fc区)；以及
“–”是化学键(例如，共价键)。
更具体地，X和L以及L和F可通过共价键相互连接。在这种情况下，缀合物可以是X、L和F各自按照化学式1的顺序通过共价键连接的缀合物。
另外，F可直接连接至X(即，在化学式1中a是0)或可经由连接体(L)连接。
在根据本发明的缀合物中，F——能够增加X(根据本发明的GLP-2衍生物)的半衰期的材料——是构成本发明的缀合物的部分的组分。
F可通过共价化学键或非共价化学键与X键合。F可经由共价化学键、非共价化学键或其组合，经由L与X键合。
F——作为能够增加X的半衰期的生物相容性材料——可例如选自聚合物、脂肪酸、胆固醇、白蛋白及其片段、白蛋白结合物质、某氨基酸序列的重复单元的聚合物、抗体、抗体片段、FcRn结合物质、体内结缔组织、核苷酸、纤连蛋白、转铁蛋白、糖、肝素和弹性蛋白，但不特别限于此。
弹性蛋白可以是人原弹性蛋白——其为水溶性前体，部分序列或重复单元的聚合物，例如，所有弹性蛋白样多肽，但不特别限于此。
聚合物的示例可以是选自以下的聚合物：聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、乙二醇-丙二醇共聚物、聚氧乙基化多元醇、聚乙烯醇、多糖(例如，葡聚糖)、聚乙烯基乙醚、生物可降解的聚合物、脂质聚合物、几丁质、透明质酸、寡核苷酸及其组合。多糖可包括葡聚糖，但不特别限于此。
聚乙二醇是包括所有乙二醇均聚物、PEG共聚物或单甲基取代的PEG聚合物(mPEG)的术语，但不限于此。
此外，生物相容性材料包括聚氨基酸如聚赖氨酸、聚天冬氨酸和聚谷氨酸，但不限于此。
另外，脂肪酸在活体内可对白蛋白具有结合亲和力，但不限于此。
作为F的示例，F可以是FcRn结合物质。具体地，FcRn结合物质可以是免疫球蛋白Fc区，更具体地是IgG Fc区，甚至更具体地是非糖基化IgG4 Fc区，但不特别限于此。
在本发明的示例性实施方式中，F(例如，免疫球蛋白Fc区)是由两条多肽链组成的二聚体并且可具有L的一端仅与这两条多肽链中的一条多肽链连接的结构，但不限于此。
另外，L可以是肽基连接体或非肽基连接体(例如，包括乙二醇重复单元的连接体)。
当L是肽基连接体时，肽基连接体可以包括一个或多个氨基酸，例如1至1000个氨基酸，但不限于此。在本发明中可以使用各种已知的肽连接体将F连接至X，并且可以包括例如[GS]x连接体、[GGGS]x连接体和[GGGGS]x连接体，其中x是1或更大的自然数。然而，本发明不限于此。
在本发明中，“非肽基连接体”包括由两个或更多个相互连接的重复单元组成的生物相容性聚合物。重复单元经由肽键以外的任意共价键相互连接。在本发明中，非肽基连接体在一端包括反应基团并且可经由与构成缀合物的其它组分反应而形成缀合物。非肽基连接体可以是构成本发明的缀合物的部分的组分。
本发明中可用的非肽基连接体不受限制，只要其对蛋白酶具有体内抗性即可。
在本发明中，非肽基连接体可以与非肽基聚合物互换使用。
具体而言，非肽基连接体可选自脂肪酸、糖、聚合物、低分子量化合物、核苷酸及其组合。
聚合物可选自聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇-丙二醇共聚物、聚氧乙基化多元醇、聚乙烯醇、多糖、聚乙烯基乙醚、生物可降解的聚合物、脂质聚合物、几丁质、透明质酸、寡核苷酸及其组合，而多糖可以是葡聚糖，但不限于此。
此外，尽管不特别限于此，但本发明的聚合物的分子量可以大于0kDa且小于约100kDa，在约1kDa至约100kDa的范围内，具体约1kDa至约20kDa的范围，但不限于此。
尽管不特别限于此，但非肽基连接体可选自聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇-丙二醇共聚物、聚氧乙基化多元醇、聚乙烯醇、多糖(例如，葡聚糖)、聚乙烯基乙醚、生物可降解的聚合物如聚乳酸(PLA)和聚乳酸-乙醇酸(PLGA)、脂质聚合物、几丁质、透明质酸、寡核苷酸及其组合。
尽管不特别限于此，但非肽连接体可以是包含乙二醇重复单元如聚乙二醇的连接体，并且本领域公知且在本领域技术水平上容易制备的其任意衍生物都属于本发明的范围。
非肽基连接体的重复单元可以是乙二醇重复单元，具体地，非肽基连接体可以包括乙二醇重复单位和用于制备缀合物的官能团两者。在根据本发明的长效缀合物中，X可经由官能团连接至F，但不限于此。在本发明中，非肽基连接体可以包括两个、三个或更多个官能团，它们可以相同或不同，但不限于此。
具体地，连接体可以是由以下化学式2表示的聚乙二醇(PEG)，但不限于此：
[公式2]
Figure BDA0003952641620000141
在化学式2中，n＝10至2400、n＝10至480或n＝50至250，但不限于此。
在长效缀合物中，PEG部分不仅可包括–(CH2CH2O)n–结构，还可包括插在连接元件与–(CH2CH2O)n–结构之间的氧原子，但不限于此。
此外，在具体实施方式中，缀合物可具有GLP-2经由包括乙二醇重复单元的连接体，通过共价键与免疫球蛋白Fc区(F)连接的结构，但不限于此。
聚乙二醇是包括所有形式的乙二醇同聚物、PEG共聚物和单甲基取代的PEG聚合物(mPEG)的术语，但不特别限于此。
本发明中可用的非肽基连接体可以是在体内抗蛋白酶的任意聚合物。非肽基聚合物的分子量可大于0kDa且小于约200kDa，具体地在约1kDa至约100kDa的范围内，更具体地在约1kDa至约50kDa的范围内，再更具体地在约1kDa至约20kDa的范围内，更具体地在约3.4kDa至10kDa的范围内，甚至更具体地约3.4kDa，但不限于此。
如本文所用，术语“约”是指包括±0.5、±0.4、±0.3、±0.2、±0.1等所有的范围并且包括与紧跟在术语“约”之后的数值相等或处于近似范围内的所有数值，但不限于此。
另外，作为与免疫球蛋白Fc区连接的本发明的非肽基连接体，不仅可以使用一种聚合物，还可以使用不同类型的聚合物的组合。
在具体实施方式中，非肽基连接体的两端可与免疫球蛋白Fc区的巯基、氨基或羟基连接，并且可与GLP-2的巯基、氨基、叠氮基或羟基连接，但不限于此。
具体地，非肽基连接体可包括在两端分别与免疫球蛋白Fc区和GLP-2或其衍生物连接的反应基团，具体地，与半胱氨酸的巯基连接的反应基团；N-末端——赖氨酸、精氨酸、谷氨酰胺和/或组氨酸——的氨基；和/或免疫球蛋白Fc区的C-末端的羟基，和与半胱氨酸的巯基连接的反应基团；赖氨酸、精氨酸、谷氨酰胺和/或组氨酸的氨基；叠氮基赖氨酸的叠氮基；和/或GLP-2的羟基，但不限于此。
更具体地，非肽基聚合物的反应基团可包括选自醛基、马来酰亚胺基和琥珀酰亚胺衍生物中的至少一种，但不限于此。
在上述描述中，醛基可以是丙醛基或丁醛基，但不限于此。
在上述描述中，琥珀酰亚胺衍生物可以是琥珀酰亚胺基羧甲基、琥珀酰亚胺戊酸酯、琥珀酰亚胺甲基丁酸酯、琥珀酰亚胺甲基丙酸酯、琥珀酰亚胺丁酸酯、琥珀酰亚胺丙酸酯、N-羟基琥珀酰亚胺、羟基琥珀酰亚胺或碳酸琥珀酰亚胺酯，但不限于此。
非肽基连接体可经由上述反应基团连接至免疫球蛋白Fc和GLP-2衍生物，以转化为非肽基聚合物连接体。
另外，通过经由醛键的还原胺化产生的终产物比通过酰胺键形成的终产物更稳定。醛反应基团在低pH下与N-末端选择性地反应，同时其可在高pH(例如，pH 9.0)下与赖氨酸残基形成共价键。
非肽基连接体两端的反应基团可以相同或不同。非肽基连接体可在末端均包括醛反应基团。此外，非肽基连接体可在末端包括醛基和马来酰亚胺反应基团，或者在末端包括醛基和琥珀酰亚胺反应基团，但不限于此。
例如，非肽基连接体在一个末端可具有马来酰亚胺基，而在另一个末端可具有醛基、丙醛基或丁醛基作为反应基团。作为另一个示例，非肽基连接体在一个末端可具有琥珀酰亚胺基，而在另一个末端可具有丙醛基或丁醛基。
在使用在含丙醛基端(propion-containing end)具有羟基反应基团的聚乙二醇作为非肽基连接体的情况下，可通过已知的化学反应利用各种反应基团将羟基激活，或使用商业上可获得的具有修饰的反应基团的聚乙二醇来制备本发明的缀合物。
在具体实施方式中，可将非肽基连接体的反应基团连接至GLP-2的半胱氨酸残基，更具体地连接至半胱氨酸的–SH基团，但不限于此。
在使用马来酰亚胺-PEG-醛的情况下，可以经由硫醚键将马来酰亚胺基团连接至GLP-2衍生物的–SH基团，并且可以经由还原烷基化将醛基连接至免疫球蛋白Fc的–NH2基团，但该实施方式不限于此，而这只是一个示例。
通过具有–CH2CH2CH2–结构的连接体官能团，经由还原烷基化将免疫球蛋白Fc区的N-末端氨基与位于PEG一端的氧原子连接形成–PEG–O–CH2CH2CH2NH–免疫球蛋白Fc结构，并且可经由硫醚键将PEG的另一端与位于GLP-2的半胱氨酸处的硫原子连接。上述硫醚键可以包括以下结构：
Figure BDA0003952641620000161
然而，该实施方式不限于此，而这只是一个示例。
另外，在缀合物中，非肽基连接体的反应基团可与免疫球蛋白Fc的N-末端的–NH2基团连接，但这只是一个示例。
此外，在缀合物中，GLP-2衍生物可经由C-末端与具有反应基团的非肽基连接体连接，但这只是一个示例。
在本发明中，“C-末端”是指肽的羧基末端，指示出于本发明的目的用于与非肽基聚合物连接的位点。例如，“C-末端”可以不仅包括C-末端的最后一个氨基酸残基，还包括C-末端附近的氨基酸残基，具体地包括从最后一个氨基酸起上至第20个氨基酸残基的氨基酸残基。
在具体实施方式中，在本发明的长效缀合物中，GLP-2衍生物可以连接至免疫球蛋白Fc区，但不限于此。
如本文所用，术语“免疫球蛋白Fc区”是指包括重链恒定结构域2(CH2)和/或重链恒定结构域3(CH3)的区域，不包括免疫球蛋白的重链和轻链可变结构域。免疫球蛋白Fc区可以是构成本发明缀合物的部分的组分。具体地，免疫球蛋白Fc区对应于上述化学式1中的F。
在整个说明书中，Fc区不仅包括通过木瓜蛋白酶消化免疫球蛋白获得的天然序列，还包括其衍生物，例如，不同于天然序列并且通过缺失、添加、非保守或保守取代或其组合修饰一个或多个氨基酸残基而获得的序列。
F(例如，免疫球蛋白Fc区)具有两条多肽链通过二硫键相互连接的结构，其中该键合仅由这两条链中的一条的氮原子形成，但不限于此。经由氮原子的键合可以通过赖氨酸的ε-氨基或N-末端氨基的还原胺化形成。
还原胺化是指一个反应物的胺基或氨基与另一反应物的醛基(能够参与还原胺化的官能团)反应生成胺，然后通过还原形成胺键的反应，这是本领域公知的有机合成反应。
作为本发明的GLP-2长效缀合物的具体示例，免疫球蛋白Fc区可以经由长效缀合物中其N-末端的氮原子与连接体连接。
免疫球蛋白Fc区可以包括重链恒定结构域中的铰链区，但不限于此。
在本发明中，免疫球蛋白Fc区可包括在N-末端的特定铰链序列。
如本文所用，术语“铰链序列”是指位于重链处并经由间二硫键(inter disulfidebond)形成免疫球蛋白Fc区的二聚体的位点。
在本发明中，铰链序列可以通过缺失包括以下氨基酸序列的铰链序列的一部分而突变为具有一个半胱氨酸残基，但不限于此。
Glu–Ser–Lys–Tyr–Gly–Pro–Pro–Cys–Pro–Ser–Cys–Pro(SEQ ID NO:11)。
当SEQ ID NO:11的铰链序列的第8个半胱氨酸残基或第11个半胱氨酸残基被缺失时，铰链序列可以仅包括一个半胱氨酸残基。本发明的铰链序列可由3至12个氨基酸组成，仅包括一个半胱氨酸残基，但不限于此。更具体地，本发明的铰链序列可具有以下序列：Glu–Ser–Lys–Tyr–Gly–Pro–Pro–Pro–Ser–Cys–Pro(SEQ ID NO:12)、Glu–Ser–Lys–Tyr–Gly–Pro–Pro–Cys–Pro–Ser–Pro(SEQ ID NO:13)、Glu–Ser–Lys–Tyr–Gly–Pro–Pro–Cys–Pro–Ser(SEQ ID NO:14)、Glu–Ser–Lys–Tyr–Gly–Pro–Pro–Cys–Pro–Pro(SEQ ID NO:15)、Lys–Tyr–Gly–Pro–Pro–Cys–Pro–Ser(SEQ ID NO:16)、Glu–Ser–Lys–Tyr–Gly–Pro–Pro–Cys(SEQ ID NO:17)、Glu–Lys–Tyr–Gly–Pro–Pro–Cys(SEQ ID NO:18)、Glu–Ser–Pro–Ser–Cys–Pro(SEQ ID NO:19)、Glu–Pro–Ser–Cys–Pro(SEQ ID NO:20)、Pro–Ser–Cys–Pro(SEQ IDNO:21)、Glu–Ser–Lys–Tyr–Gly–Pro–Pro–Ser–Cys–Pro(SEQ ID NO:22)、Lys–Tyr–Gly–Pro–Pro–Pro–Ser–Cys–Pro(SEQ ID NO:23)、Glu–Ser–Lys–Tyr–Gly–Pro–Ser–Cys–Pro(SEQ IDNO:24)、Glu–Ser–Lys–Tyr–Gly–Pro–Pro–Cys(SEQ ID NO:25)、Lys–Tyr–Gly–Pro–Pro–Cys–Pro(SEQ ID NO:26)、Glu–Ser–Lys–Pro–Ser–Cys–Pro(SEQ ID NO:27)、Glu–Ser–Pro–Ser–Cys–Pro(SEQ ID NO:28)、Glu–Pro–Ser–Cys(SEQ ID NO:29)或Ser–Cys–Pro(SEQ ID NO:30)。
更具体地，铰链序列可包括SEQ ID NO:21(Pro–Ser–Cys–Pro)或SEQ ID NO:30(Ser–Cys–Pro)的氨基酸序列，但不限于此。
在本发明GLP-2衍生物长效缀合物的更具体的实施方式中，缀合物中免疫球蛋白Fc区的N-末端是脯氨酸，并且在该缀合物中，免疫球蛋白Fc区通过脯氨酸的氮原子与连接体连接。
在本发明GLP-2衍生物长效缀合物的实施方式中，免疫球蛋白Fc区可以是二聚体的形式，其中两条免疫球蛋白Fc区链通过铰链序列形成同型二聚体或异型二聚体。本发明的化学式1的缀合物可以是连接体的一端连接至这两条免疫球蛋白Fc区链中的一条的形式，但不限于此。
如本文所用，术语“N-末端”是指蛋白质或多肽的氨基末端，并且可以包括位于氨基末端最末的最后一个氨基酸残基或自氨基末端最末起的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个氨基酸。本发明的免疫球蛋白Fc区可以包括N末端的铰链序列，但不限于此。
此外，本发明的免疫球蛋白Fc区可以是扩展的Fc区，其包括部分或全部重链恒定结构域1(CH1)和/或轻链恒定结构域1(CL1)，不包括免疫球蛋白的重链和轻链可变结构域，只要免疫球蛋白Fc区具有与天然型相比基本上相同或增强的效果。此外，免疫球蛋白Fc区可以是去除了与CH2和/或CH3相对应的氨基酸序列的相当长部分的区域。
例如，本发明的免疫球蛋白Fc区可包括1)CH1结构域、CH2结构域、CH3结构域和CH4结构域；2)CH1结构域和CH2结构域；3)CH1结构域和CH3结构域；4)CH2结构域和CH3结构域；5)选自CH1结构域、CH2结构域、CH3结构域和CH4结构域中的一个或多个结构域与免疫球蛋白铰链区(或铰链区的一部分)的组合；或6)重链恒定结构域和轻链恒定结构域的各结构域的二聚体，但不限于此。
此外，作为一个具体示例，免疫球蛋白Fc区可以是二聚体形式，并且一个X分子以二聚体的形式与一个免疫球蛋白Fc区共价连接。在这种情况下，免疫球蛋白Fc可以经由非肽基聚合物与X连接。同时，两个X分子也可以以二聚体形式对称连接至一个免疫球蛋白Fc区。在这种情况下，免疫球蛋白Fc区可经由非肽基连接体连接至X。然而，该实施方式不限于上述示例。
另外，本发明的免疫球蛋白Fc区不仅包括天然氨基酸序列，还包括其氨基酸序列衍生物。氨基酸序列衍生物是指通过缺失、添加、非保守或保守取代或其组合在至少一个氨基酸残基上具有差异的氨基酸序列。
例如，在IgG Fc的情况下，已知对键合重要的214至238、297至299、318至322或327至331位置处的氨基酸残基可用作适于变异的位点。
此外，各种其它类型的衍生物可例如通过去除能够形成二硫键的区域、从天然Fc的N-末端去除若干氨基酸或将甲硫氨酸残基添加到天然Fc的N-末端来制备。此外，为了消除效应子功能，可以去除补体结合位点(例如，C1q结合位点)或可以去除抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)位点。国际专利公开号WO 97/34631和WO 96/32478等中公开了制备免疫球蛋白Fc区的序列衍生物的技术。
蛋白质和肽中的氨基酸交换不会改变其活性，这是本领域公知的(H.Neurath,R.L.Hill,The Proteins,Academic Press,New York,1979)。最常发生的交换是在氨基酸残基Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Thy/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly之间的交换。如果需要，Fc区可通过磷酸化、硫酸化、丙烯酸化、糖基化、甲基化、法尼基化、乙酰化、酰胺化等修饰。
上述Fc衍生物可具有与本发明的Fc区相同的生物活性并且提高了对热、pH等的结构稳定性。
另外，Fc区可从分离自人或动物如牛、山羊、猪、小鼠、兔子、仓鼠、大鼠或豚鼠的天然形式获得，或者可以是其重组体或衍生物——从转化的动物细胞或微生物获得。对此，可通过从人或动物的活体中分离出完整的免疫球蛋白并用蛋白酶处理而从天然免疫球蛋白获得Fc区。当用木瓜蛋白酶处理完整的免疫球蛋白时，其被切割成Fab区和Fc区，而当用胃蛋白酶处理完整的免疫球蛋白时，其被切割成pF′c片段和F(ab)2片段。可以采用体积排阻色谱法等从中分离Fc或pF′c。在更具体的实施方式中，源于人的Fc区是从微生物获得的重组免疫球蛋白Fc区。
另外，免疫球蛋白Fc区可具有天然聚糖或与天然型相比增加或减少的聚糖，或者可以是去糖基化形式。免疫球蛋白Fc的聚糖的增加、减少或去除可以通过本领域经常使用的任意方法如化学方法、酶促方法和使用微生物的基因工程方法实现。对此，通过去除聚糖获得的免疫球蛋白Fc区显示出补体c1q的结合亲和力明显降低和抗体依赖性细胞毒性或补体依赖性细胞毒性降低或丧失，因此从而不会在活有机体内引起不必要的免疫反应。基于此，鉴于本发明的目的，去糖基化或非糖基化免疫球蛋白Fc区可能更适合作为药物载体。
如本文所用，术语“去糖基化”是指用酶将聚糖从Fc区去除，而术语“非糖基化”是指未被糖基化的并且在原核生物，更具体地在大肠杆菌(E.coli)中产生的Fc区。
同时，免疫球蛋白Fc区可衍生自人或动物如牛、山羊、猪、小鼠、兔子、仓鼠、大鼠或豚鼠。在更具体的实施方式中，免疫球蛋白Fc区可衍生自人。
另外，免疫球蛋白Fc区可衍生自IgG、IgA、IgD、IgE或IgM或其任意组合或其杂化物(hybrid)。在更具体的实施方式中，其衍生自IgG或IgM，IgG或IgM是人血液中最丰富的蛋白质，并且在甚至更具体的实施方式中，其衍生自IgG，已知IgG提高配体结合蛋白的半衰期。在甚至更具体的实施方式中，免疫球蛋白Fc区是IgG4 Fc区，而在最具体的实施方式中，免疫球蛋白Fc区是衍生自人IgG4的非糖基化Fc区，但不限于此。
另外，在具体实施方式中，作为人IgG4 Fc片段的免疫球蛋白Fc片段可以是两个单体经由半胱氨酸之间形成的二硫键(链间)相互连接的同型二聚体的形式，半胱氨酸是每个单体的第3个氨基酸。对此，同型二聚体具有或可以具有独立的两个内部二硫键(链内)，即在第35位和第95位半胱氨酸之间形成的二硫键以及在第141位和第199位半胱氨酸之间形成的二硫键。每个单体可由221个氨基酸组成，但不限于此。
因为每个单体由221个氨基酸组成，所以构成同型二聚体的氨基酸的数量可以总共为442个，但不限于此。具体地，免疫球蛋白Fc片段可以是同型二聚体的形式，其中各自具有SEQ ID NO:31的氨基酸序列(由221个氨基酸组成)的两个单体经由第3个氨基酸即半胱氨酸之间的二硫键相互连接，其中同型二聚体的单体各自独立地具有在第35位和第95位半胱氨酸之间形成的二硫键以及在第141位和第199位半胱氨酸之间形成二硫键，但不限于此。
同时，如本文所用，术语“组合”是指当形成二聚体或多聚体时，编码相同来源的单链免疫球蛋白Fc区的多肽与不同来源的单链多肽之间形成键合。也就是说，二聚体或多聚体可以使用选自IgG Fc、IgA Fc、IgM Fc、IgD Fc和IgE Fc片段的两个或更多个Fc片段来制备。
如本文所用，术语“杂化物”意为对应于两个或更多个不同来源的免疫球蛋白Fc片段的序列存在于免疫球蛋白恒定区的单链中。在本发明中，各种杂化物形式都是可能的。也就是说，结构域杂化物可由选自IgG Fc、IgM Fc、IgA Fc、IgE Fc和IgD Fc的CH1、CH2、CH3和CH4的1至4个结构域组成，并且还可包括铰链区。
同时，IgG还可以分为IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚类，其在本发明中可以进行组合和杂化。具体地，IgG被分成IgG2和IgG4亚类，更具体地是IgG4的Fc片段，其很少具有效应子功能如补体依赖性细胞毒性(CDC)。
另外，与天然GLP-2相比或与未用F修饰的X相比，上述缀合物可具有提高的长持续性功效，并且缀合物可包括包封在生物可降解纳米颗粒中的形式以及上述形式，但不限于此。
同时，GLP-2衍生物及其长效缀合物可以包括肽或化合物本身、其盐(例如，肽的药学上可接受的盐)或其溶剂化物形式的所有那些。
另外，肽、化合物、GLP-2衍生物或其长效缀合物可以是任意药学上可接受的形式。
盐的类型没有特别限制。然而，盐优选是对对象(例如，哺乳动物)安全且有效的形式，但不限于此。
术语“药学上可接受的”是指可有效用于药物医学决定范围内的预期用途而不会引起过度毒性、刺激、过敏反应等的物质。
如本文所用，术语“药学上可接受的盐”是指衍生自药学上可接受的无机酸、有机酸或碱的盐。合适的酸的示例可以包括盐酸、溴酸、硫酸、硝酸、高氯酸、富马酸、马来酸、磷酸、乙醇酸、乳酸、水杨酸、琥珀酸、对甲苯磺酸、酒石酸、乙酸、柠檬酸、甲磺酸、甲酸、苯甲酸、丙二酸、萘-2-磺酸和苯磺酸。衍生自合适的碱的盐的示例可以包括碱金属如钠和钾、碱土金属如镁以及铵。
另外，如本文所用，术语“溶剂化物”是指根据本发明的肽、化合物或其盐与溶剂分子的复合物。
GLP-2衍生物、长效缀合物及包含其的组合物可用于预防、改善或治疗由放疗、化疗或其组合引发的粘膜炎。
如本文所用，术语“预防”是指通过施用GLP-2衍生物、GLP-2衍生物的长效缀合物和/或包含其的组合物来完全或部分抑制或延迟由放疗、化疗或其组合引发的粘膜炎的进展的所有举动。术语“治疗”是指完全或部分缓解或有益地改变由放疗、化疗或其组合引发的粘膜炎的症状的所有举动，并且包括对粘膜炎症状的减少或缓解、症状疼痛的缓解、粘膜炎发病率的降低、增强治疗效果的患者体内的其它变化等。
如本文所用，术语“施用”是指通过合适的方法将特定物质引入患者中，并且组合物的施用途径可以是能够将组合物递送至活有机体内的目标的任意常规途径，例如经由口服施用途径或肠外施用途径如皮内、静脉内、肌肉内、动脉内、髓内、鞘内、脑室内、肺内、经皮、皮下、腹膜内、鼻内、肠内、局部、舌下、阴道或直肠途径，但不限于此。然而，由于肽在口服施用后被消化，因此口服施用的组合物的活性成分应被包覆或配制以防止在胃中降解。优选地，本组合物可以以注射形式施用。另外，在本发明中，组合物可以使用能够将活性成分递送到靶细胞中的某个装置施用。
在具体实施方式中，本发明的组合物可以与放疗和/或化疗一起同时地、顺序地或以逆序施用。具体地，本发明的组合物可以在进行放疗和/或化疗之前(例如，在进行放疗或化疗之前的1天、2天、3天、4天、5天或6天内；或一周或一个月内)施用，但不限于此。另外，本发明的组合物可以在进行放疗和/或化疗后施用(例如，在进行放疗或化疗后的1天、2天、3天、4天、5天或6天内；一周或一个月；或第1天(24小时))，但不限于此。
本发明的药物组合物可进一步包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂可以是非天然存在的载体、赋形剂或稀释剂。
如本文所用，术语“药学上可接受的”是指足以展现出治疗效果而不引起副作用的量，并且可基于医学领域公知的因素容易确定，如疾病类型、年龄、体重、健康状况、性别和患者对药物的敏感性、施用途径、施用方法、施用次数、治疗持续时间以及联合或同时使用的药物。
本发明的药物组合物可以进一步包含药学上可接受的载体。对于口服施用，药学上可接受的载体可包含粘合剂、润滑剂、崩解剂、赋形剂、增溶剂、分散剂、稳定剂、悬浮剂、着色剂、调味剂等，但不限于此。对于可注射制剂，药学上可接受的载体可包含缓冲剂、防腐剂、镇痛剂、增溶剂、等渗剂、稳定剂等。对于局部施用制剂，药学上可接受的载体可以包含碱、赋形剂、润滑剂、防腐剂等。
可与上述药学上可接受的载体组合将本发明的组合物配制成各种形式。例如，对于口服施用，药物组合物可以配制成片剂、锭剂、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆剂、晶片(wafers)等。对于可注射制剂，药物组合物可以配制成单剂量安瓿或多剂量形式。药物组合物也可以配制成溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊、缓释制剂等。
同时，适用于制剂的载体、赋形剂或稀释剂的示例可包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、非晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油等。此外，药物组合物可进一步包含填料、抗凝剂、润滑剂、保湿剂、调味剂、防腐剂等。
另外，本发明的药物组合物可以以选自片剂、丸剂、粉末、颗粒、胶囊、悬浮液、内用制剂、乳剂、糖浆剂、灭菌水溶液、非水溶剂、冻干制剂和栓剂的制剂配制。
另外，组合物可配制成适于施用到患者体内的单位剂型，具体是可用于根据医学领域常用的方法施用蛋白质药物的形式，并使用本领域常用的施用方法进行施用，但不限于此。
另外，GLP-2衍生物或其长效缀合物可与允许作为药物的各种载体如盐水溶液或有机溶剂组合使用。作为药物，可使用碳水化合物(如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖)、抗氧化剂(如抗坏血酸或谷胱甘肽)、螯合剂、低分子量蛋白质或其它稳定剂来提高稳定性或吸收性。
本发明的药物组合物的施用剂量和次数由作为活性成分的药物的类型连同各种相关因素如待治疗的疾病、施用途径、患者的年龄、性别和体重以及疾病的严重程度等决定。具体地，本发明的组合物可以包括药学有效量的GLP-2衍生物或其长效缀合物，但不限于此。
在本发明中，药物组合物中所含的GLP-2衍生物或其长效缀合物的药学有效量是指通过使用GLP-2衍生物或其长效缀合物获得所期望的药理学活性的水平，或在施用组合物的对象中不引起毒性或副作用或引起不显著的毒性或副作用的药学上可接受的水平，但不限于此。可考虑施用次数、患者、制剂等来确定药学有效量。
采用分级(分次，fractionated)治疗方案，本发明的组合物的总有效量可以以单剂量向患者施用，或者可以以多剂量长期施用。本发明的药物组合物的有效成分的量可根据疾病的严重程度变化。具体地，本发明的GLP-2衍生物或其长效缀合物的优选每日剂量可以是每1kg患者体重约0.0001mg至500mg，约0.001mg至100mg，更优选约0.01mg至10mg，但不限于此。
然而，由于GLP-2衍生物或其长效缀合物的剂量是考虑了各种因素如患者的年龄、体重、健康状况、性别、疾病严重程度、饮食和排泄速率以及药物组合物的施用途径和次数确定的，因此本领域普通技术人员可以容易地确定适用于本发明的组合物的特定用途的有效剂量。药物组合物的配制、施用途径和施用方法并不特别受限，只要获得本发明的效果即可。
本发明的药物组合物具有优异的体内持续性和效力，可显著减少根据本发明的药物制剂的施用次数和频率。
本发明的另一方面提供了用于预防或改善由放疗、化疗或其组合引发的粘膜炎的食品组合物，所述食品组合物包含GLP-2衍生物和/或其长效缀合物。
GLP-2衍生物、其长效缀合物和由放疗、化疗或其组合引发的粘膜炎如上所述。
食品组合物可用作保健功能食品。当本发明的组合物用作食品辅助添加剂时，肽(肽本身或其长效缀合物)可以单独添加或根据任意已知方法适当地与任意其它食品或食品成分一起使用。与之混合的活性成分的量可根据其目的(预防、保健或治疗)适当地确定。
如本文所用，术语“保健功能食品”是指采用作为原料的某种成分制备的食品或出于健康补充的目的通过提取、浓缩、纯化或混合食品中包含的特定成分并采用作为原料的该成分所制造或加工的食品。保健功能食品经设计和加工以通过该成分充分发挥身体调节功能，如生物防御、生物节律控制、疾病预防和疾病康复，并且该保健功能食品组合物可执行疾病预防或疾病康复相关的功能。
本发明的另一方面提供了用于预防、改善或治疗由放疗、化疗或其组合引发的粘膜炎的方法，所述方法包括向有需要的对象施用GLP-2衍生物、其长效缀合物和/或包含其的组合物。
GLP-2衍生物、其长效缀合物、组合物和由放疗、化疗或其组合引发的粘膜炎如上所述。
具体地，GLP-2衍生物可以包含由上述通式1表示的氨基酸序列(其中从通式1的氨基酸序列中排除与SEQ ID NO:1相同的序列)，但不限于此。
在本发明中，作为疑似患有由放疗、化疗或其组合引发的粘膜炎的对象，所述对象可以是哺乳动物如大鼠和家畜，包括患有所述疾病或处于发展所述疾病风险的人，并且不限制地包括可以用本发明的GLP-2衍生物、其长效缀合物和/或包含其的药物组合物治疗的任何对象。另外，人可以被排除在本发明的对象之外，但不限于此。
本发明的方法可包括以药学有效量施用GLP-2衍生物、其长效缀合物和/或包含其的组合物。适当的每日剂量可由医生在对弹丸或多剂量上正确的医学判断的范围内确定。然而，鉴于本发明的目的，优选的是根据各种因素——包括所要达到的响应的种类和程度、具体的组合物是否包含根据患者的病情、年龄、体重、一般健康状态、性别和饮食、施用时间、施用途径、组合物的排泄速率、治疗持续时间使用的其它制剂、与该具体的组合物组合或同时使用的药物以及医学领域公知的类似因素，对特定患者有区别地应用具体的治疗有效量。
本发明的另一方面提供了GLP-2衍生物、其长效缀合物和/或包含其的药物组合物用于由放疗、化疗或其组合引发的粘膜炎的预防、改善或治疗用途。
GLP-2衍生物、其长效缀合物、组合物和由放疗、化疗或其组合引发的粘膜炎如上所述。
具体地，GLP-2衍生物可以包含由上述通式1表示的氨基酸序列(其中从通式1的氨基酸序列中排除与SEQ ID NO:1相同的序列)，但不限于此。
本发明的另一方面提供了GLP-2衍生物、其长效缀合物和/或包含其的药物组合物在制备用于预防或治疗由放疗、化疗或其组合引发的粘膜炎的药物中的用途。
GLP-2衍生物、其长效缀合物和由放疗、化疗或其组合引发的粘膜炎如上所述。
具体地，GLP-2衍生物可以包含由通式1表示的氨基酸序列(其中从通式1的氨基酸序列中排除与SEQ ID NO:1相同的序列)，但不限于此。
在下文中，将参考以下实施例更详细地描述本发明。然而，下面的示例仅仅是为了举例说明本发明而呈现的，并且本发明的范围不限于此。
实施例1：GLP-2衍生物长效缀合物的制备
为了将ALD(2)PEG——经修饰的聚乙二醇(其中两端的氢被丙醛基(3-氧代丙基)取代，并且乙二醇重复单元(部分)的式量是3.4kDa,NOF,日本)——聚乙二醇化到GLP-2衍生物CA GLP-2RK(具有表1的SEQ ID NO:4)中，在2℃至8℃的温度下使GLP-2衍生物与ALD(2)PEG以1:5至1:20的摩尔比(其中GLP-2衍生物的浓度为5mg/mL至10mg/mL)反应4至16小时。此时，在乙醇中pH 7.5的20mM HEPES中，添加20mM氰基硼氢化钠作为还原剂来进行反应。利用Source 15S柱(GE,美国)，使用含柠檬酸钠(pH2.0)和乙醇的缓冲溶液以及氯化钾浓度梯度纯化反应溶液，从而纯化单聚乙二醇化GLP-2衍生物。
随后，在2℃至8℃的温度下使纯化的单聚乙二醇化GLP-2衍生物与SEQ ID NO:32的免疫球蛋白Fc片段以1:2至1:6的摩尔比(其中总蛋白浓度为30mg/mL至35mg/mL)反应12至20小时。此时，反应溶液含有100mM磷酸钙缓冲液(pH 6.0)和异丙醇，添加20mM氰基硼氢化钠作为还原剂。
反应完成后，利用Source 15Q柱(GE,美国)使用bis-Tris缓冲液(pH 6.5)和氯化钠浓度梯度，并利用Source 15ISO(GE,美国)使用硫酸铵和柠檬酸钠浓度梯度(pH 5.0至5.2)纯化反应溶液，从而纯化GLP-2衍生物的长效缀合物，即GLP-2衍生物通过聚乙二醇连接体，经由共价键与免疫球蛋白Fc片段连接的缀合物。
实施例2：通过施用GLP-2衍生物长效缀合物证实化疗引发胃肠粘膜炎大鼠模型中小肠质量增加
为了测量实施例1中制备的GLP-2衍生物长效缀合物对体内改善小肠的效果，使用化疗(多西紫杉醇+环磷酰胺，TC)引发胃肠粘膜炎的大鼠。
具体地，将7周龄雄性大鼠(SD大鼠)分成组(每组3只大鼠)：正常对照(未经化疗处理，G1，(SHarm)媒介物)；患有化疗引发的胃肠粘膜炎的对照(G2，(TC)媒介物)；以及化疗引发胃肠粘膜炎，然后用实施例1中制备的GLP-2衍生物长效缀合物(3.1mg/kg/QW(0.5mg/kg/QM HED))处理的组(G3，(TC)GLP-2衍生物的长效缀合物)(在本发明中，作为GLP-2衍生物长效缀合物剂量的数值是通过从使用的GLP-2衍生物长效缀合物的总质量中减去聚乙二醇连接体的质量而获得的，即多肽区域的质量之和，作为参考)。通过施用多西紫杉醇(36mg/kg)和环磷酰胺(300mg/kg)(D0)，在G2和G3中引发胃肠粘膜炎。次日(D1)，在各组单独皮下施用媒介物或GLP-2衍生物长效缀合物后，在D2、D3和D4测量其小肠质量。
结果，证实了与患有化疗引发的胃肠粘膜炎的对照相比，施用GLP-2衍生物的长效缀合物的组中小肠质量在短时间段内显著恢复(图1)。
这些结果表明，本发明的GLP-2衍生物长效缀合物通过快速恢复小肠，对化疗引发的胃肠粘膜炎具有预防和治疗作用。
实施例3：通过施用GLP-2衍生物和GLP-2衍生物长效缀合物证实化疗引发胃肠粘膜炎大鼠模型中小肠质量改变
为了测量GLP-2衍生物和实施例1中制备的GLP-2衍生物长效缀合物对体内改善小肠的效果，使用化疗(多西紫杉醇+环磷酰胺，TC)引发胃肠粘膜炎的大鼠。替度鲁肽被选为GLP-2衍生物的代表性示例并用于实验。
具体地，将7周龄雄性大鼠(SD大鼠)分成组(每组5只大鼠)：正常对照(未经化疗处理G1，媒介物)；患有化疗引发的胃肠粘膜炎的对照(G2，(TC)媒介物)；施用GLP-2衍生物(替度鲁肽0.1mg/kg/BID，Emax)同时(D0)通过化疗引发胃肠粘膜炎的组(G3，(TC)替度鲁肽(D0))；施用实施例1中制备的GLP-2衍生物长效缀合物(3.1mg/kg/QW(0.5mg/kg/QM HED))同时(D0)通过化疗引发胃肠粘膜炎的组(G4，(TC)GLP-2衍生物长效缀合物的组(D0))；以及在通过化疗引发胃肠粘膜炎一天前(D-1)施用实施例1中制备的GLP-2衍生物长效缀合物(3.1mg/kg/QW(0.5mg/kg/QM HED))的组(G5，(TC)GLP-2衍生物长效缀合物(D-1))。另外，化疗引发胃肠粘膜炎的组施用多西紫杉醇(36mg/kg)和环磷酰胺(300mg/kg)。
结果，证实了与施用GLP-2衍生物的组(G3)相比，施用GLP-2衍生物长效缀合物的组(G4)中化疗引发的胃肠粘膜炎造成的小肠质量减少水平显著降低，而恢复造成的小肠质量增加水平显著升高(图2，A)。另外，在通过化疗引发胃肠粘膜炎前一天(D-1)施用GLP-2衍生物长效缀合物的组(G5，(TC)GLP-2衍生物的长效缀合物(D-1))与施用GLP-2衍生物长效缀合物同时(D0)通过化疗引发胃肠粘膜炎的组(G4，(TC)GLP-2衍生物长效缀合物(D0))之间进行比较后，证实了在通过化疗引发胃肠粘膜炎前一天施用GLP-2衍生物长效缀合物的情况下，化疗导致的小肠质量减少显著降低(图2，B)。
这些结果表明，与施用GLP-2衍生物相比，施用本发明的GLP-2衍生物长效缀合物，通过防止对小肠造成损伤以及快速地使损伤恢复，对化疗引发的胃肠粘膜炎具有优异的预防或治疗效果，表明GLP-2衍生物长效缀合物的施用当在化疗前一天进行施用时具有更高的预防效果。
实施例4：证实GLP-2衍生物长效缀合物在抑制M1极化、抑制巨噬细胞分化和抑制THP-1细胞(单核细胞)中单核细胞迁移方面的作用
为了证实实施例1中制备的GLP-2衍生物长效缀合物在抑制M1极化、抑制巨噬细胞分化和抑制THP-1细胞(单核细胞)中单核细胞迁移方面的作用，进行了如下体外实验。
[抑制M1极化的实验]
用实施例1中制备的GLP-2衍生物长效缀合物(10μM)处理THP-1细胞4小时。然后用浓度为1μg/mL的脂多糖(LPS)处理细胞2小时以引发炎症。然后，提取RNA，并使用qPCR测量促炎细胞因子(M1极化)TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表达水平。
[抑制巨噬细胞分化的实验]
用实施例1中制备的GLP-2衍生物长效缀合物(10μM)同时与佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-醋酸酯(phorbol 12-myristate 13-acetate)(PMA)处理THP-1细胞以引发THP-1细胞分化48小时。然后，对分化成巨噬细胞的粘附细胞进行计数。
[抑制单核细胞迁移的实验]
用实施例1中制备的GLP-2衍生物长效缀合物(10μM)处理THP-1细胞48小时。随后，将用药物处理的THP-1细胞转移到Boyden室的上室，并向其中添加CCL-2(50ng/mL)以引发其迁移到底室，然后将细胞培养4小时。然后，使用迁移测定试剂盒(abcam)测量迁移度。
通过实验，GLP-2衍生物长效缀合物在抑制M1极化(图3，A)、抑制巨噬细胞分化(图3，B)和抑制单核细胞迁移(图3，C)方面的作用。
这些结果表明，本发明的GLP-2衍生物长效缀合物通过抑制炎症、抑制单核细胞分化成引起炎症的巨噬细胞和抑制单细胞向炎症部位迁移，对胃肠粘膜炎具有预防或治疗作用。
本发明的以上描述是出于说明的目的而提供的，并且本领域技术人员将理解，在不改变本发明的技术构思和必要特征的情况下可以进行各种改变和修改。因此，很明显上述实施方式在所有方面都是示例性的而并不限制本发明。因此，本公开的范围不是由详细描述限定的，而是由权利要求及其等同内容限定的，并且权利要求及其等同内容范围内的所有变型都应被解释为包括在本公开内容中。
<110> 韩美药品株式会社
<120> 预防或治疗放疗、化疗或其组合引发的粘膜炎的包含GLP-2衍生物或其长效缀合物的药物组合物
<130> OPA21093-PCT
<150> KR 10-2020-0040944
<151> 2020-04-03
<160> 32
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 33
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
His Ala Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn
1 5 10 15
Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr
20 25 30
Asp
<210> 2
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GLP-2衍生物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)
<223> Xaa是咪唑并乙酰基去组氨酸
<400> 2
Xaa Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn
1 5 10 15
Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr
20 25 30
Asp Cys
<210> 3
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GLP-2衍生物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)
<223> Xaa是咪唑并乙酰基去组氨酸
<400> 3
Xaa Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn
1 5 10 15
Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr
20 25 30
Asp Lys
<210> 4
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GLP-2衍生物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)
<223> Xaa是咪唑并乙酰基去组氨酸
<400> 4
Xaa Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn
1 5 10 15
Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Arg Ile Thr
20 25 30
Asp Lys
<210> 5
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GLP-2衍生物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)
<223> Xaa是咪唑并乙酰基去组氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (34)
<223> Xaa是6-叠氮基赖氨酸
<400> 5
Xaa Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn
1 5 10 15
Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr
20 25 30
Asp Xaa
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<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GLP-2衍生物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)
<223> Xaa是咪唑并乙酰基去组氨酸
<400> 6
Xaa Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn
1 5 10 15
Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Arg Ile Thr
20 25 30
Asp Cys
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GLP-2衍生物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)
<223> Xaa是咪唑并乙酰基去组氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)
<223> Xaa是Aib（2-氨基异丁酸）
<400> 7
Xaa Xaa Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn
1 5 10 15
Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr
20 25 30
Asp Cys
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GLP-2衍生物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)
<223> Xaa是Aib（2-氨基异丁酸）
<400> 8
His Xaa Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn
1 5 10 15
Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr
20 25 30
Asp Cys
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<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GLP-2衍生物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)
<223> Xaa = 组氨酸、咪唑并乙酰基去组氨酸、去氨基组氨酸、
β-羟基咪唑并丙酰基去组氨酸、N-二甲基组氨酸或
β-羧基咪唑并丙酰基去组氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)
<223> Xaa是丙氨酸、甘氨酸或Aib（2-氨基异丁酸）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (30)
<223> Xaa是赖氨酸或精氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (34)
<223> Xaa不存在、是赖氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、6-叠氮基赖氨酸或半胱氨酸
<400> 9
Xaa Xaa Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn
1 5 10 15
Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Xaa Ile Thr
20 25 30
Asp Xaa
<210> 10
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GLP-2衍生物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)
<223> Xaa =组氨酸、咪唑并乙酰基去组氨酸、去氨基组氨酸、
β-羟基咪唑并丙酰基去组氨酸、N-二甲基组氨酸或
β-羧基咪唑并丙酰基去组氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)
<223> Xaa是丙氨酸、甘氨酸或Aib（2-氨基异丁酸）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (30)
<223> Xaa是赖氨酸或精氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (34)
<223> Xaa = 任意一个或多个氨基酸或经修饰的任意一个或多个氨基酸
<400> 10
Xaa Xaa Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn
1 5 10 15
Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Xaa Ile Thr
20 25 30
Asp Xaa
<210> 11
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人
<400> 11
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro
1 5 10
<210> 12
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链区的变体
<400> 12
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Pro Ser Cys Pro
1 5 10
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链区的变体
<400> 13
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Pro
1 5 10
<210> 14
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链区的变体
<400> 14
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser
1 5 10
<210> 15
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链区的变体
<400> 15
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro
1 5 10
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链区的变体
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Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser
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<211> 8
<212> PRT
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<220>
<223> 铰链区的变体
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Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys
1 5
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<220>
<223> 铰链区的变体
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Glu Lys Tyr Gly Pro Pro Cys
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<212> PRT
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<220>
<223> 铰链区的变体
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Glu Ser Pro Ser Cys Pro
1 5
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<212> PRT
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<220>
<223> 铰链区的变体
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Glu Pro Ser Cys Pro
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链区的变体
<400> 21
Pro Ser Cys Pro
1
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<212> PRT
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<220>
<223> 铰链区的变体
<400> 22
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Ser Cys Pro
1 5 10
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<211> 9
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<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链区的变体
<400> 23
Lys Tyr Gly Pro Pro Pro Ser Cys Pro
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链区的变体
<400> 24
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Ser Cys Pro
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链区的变体
<400> 25
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链区的变体
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Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro
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<212> PRT
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<220>
<223> 铰链区的变体
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Glu Ser Lys Pro Ser Cys Pro
1 5
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<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链区的变体
<400> 28
Glu Ser Pro Ser Cys Pro
1 5
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<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链区的变体
<400> 29
Glu Pro Ser Cys
1
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<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链区的变体
<400> 30
Ser Cys Pro
1
<210> 31
<211> 221
<212> PRT
<213> 智人
<400> 31
Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
1 5 10 15
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
20 25 30
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln
35 40 45
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
50 55 60
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
65 70 75 80
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
85 90 95
Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
100 105 110
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
115 120 125
Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
130 135 140
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
145 150 155 160
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
165 170 175
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
180 185 190
Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
195 200 205
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
210 215 220
<210> 32
<211> 442
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> 人免疫球蛋白G4 Fc片段（同型二聚体）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(221)
<223> 第1至221位的氨基酸形成一个单体.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (222)..(442)
<223> 第222至442位的氨基酸形成一个单体.
<220>
<221> 二硫化物
<222> (3)..(224)
<223> 第3位和第224位的氨基酸形成间二硫键.
<220>
<221> 二硫化物
<222> (35)..(95)
<223> 第35位和第95位的氨基酸形成链内二硫键.
<220>
<221> 二硫化物
<222> (141)..(199)
<223> 第141位和第199位的氨基酸形成链内二硫键.
<220>
<221> 二硫化物
<222> (256)..(316)
<223> 第256位和第316位的氨基酸形成链内二硫键.
<220>
<221> 二硫化物
<222> (362)..(420)
<223> 第362位和第420位的氨基酸形成链内二硫键
<400> 32
Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
1 5 10 15
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
20 25 30
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln
35 40 45
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
50 55 60
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
65 70 75 80
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
85 90 95
Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
100 105 110
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
115 120 125
Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
130 135 140
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
145 150 155 160
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
165 170 175
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
180 185 190
Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
195 200 205
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Pro Ser Cys
210 215 220
Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
225 230 235 240
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
245 250 255
Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp
260 265 270
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
275 280 285
Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
290 295 300
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
305 310 315 320
Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
325 330 335
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu
340 345 350
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
355 360 365
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
370 375 380
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
385 390 395 400
Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn
405 410 415
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
420 425 430
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440

Claims (18)

1.用于预防或治疗由放疗、化疗或其组合引发的粘膜炎的药物组合物，所述药物组合物包含：
药学上可接受的赋形剂；和
药学有效量的胰高血糖素样肽-2(GLP-2)衍生物，其中所述GLP-2衍生物包含由以下通式1表示的氨基酸序列：
[通式1]
X1X2DGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTX30ITDX34(SEQ ID NO:10)
其中
X1是组氨酸、咪唑并乙酰基去组氨酸、去氨基组氨酸、β-羟基咪唑并丙酰基去组氨酸、N-二甲基组氨酸或β-羧基咪唑并丙酰基去组氨酸；
X2是丙氨酸、甘氨酸或2-氨基异丁酸(Aib)；
X30是赖氨酸或精氨酸；
X34是至少一个氨基酸或至少一个变异的氨基酸；以及
条件是从通式1的氨基酸序列中排除与SEQ ID NO:1相同的序列。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述GLP-2衍生物包含由以下通式2表示的氨基酸序列：
[通式2]
X1X2DGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTX30ITDX34(SEQ ID NO:9)
其中
X1是组氨酸、咪唑并乙酰基去组氨酸、去氨基组氨酸、β-羟基咪唑并丙酰基去组氨酸、N-二甲基组氨酸或β-羧基咪唑并丙酰基去组氨酸；
X2是丙氨酸、甘氨酸或2-氨基异丁酸(Aib)；
X30是赖氨酸或精氨酸；
X34不存在，或是赖氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、6-叠氮基赖氨酸或半胱氨酸；以及
条件是从通式2的氨基酸序列中排除与SEQ ID NO:1相同的序列。
3.根据权利要求2所述的药物组合物，其中在所述GLP-2衍生物中，
(1)X1是咪唑并乙酰基去组氨酸，X2是甘氨酸，X30是赖氨酸，并且X34是半胱氨酸，(2)X1是咪唑并乙酰基去组氨酸，X2是甘氨酸，X30是赖氨酸，并且X34是赖氨酰，
(3)X1是咪唑并乙酰基去组氨酸，X2是甘氨酸，X30是精氨酸，并且X34是赖氨酸，
(4)X1是咪唑并乙酰基去组氨酸，X2是甘氨酸，X30是赖氨酸，并且X34是6-叠氮基赖氨酸，
(5)X1是咪唑并乙酰基去组氨酸，X2是甘氨酸，X30是精氨酸，并且X34是半胱氨酸，
(6)X1是咪唑并乙酰基去组氨酸，X2是Aib，X30是赖氨酸，并且X34是半胱氨酸，或
(7)X1是组氨酸，X2是Aib，X30是赖氨酸，并且X34是半胱氨酸。
4.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述GLP-2衍生物包含选自SEQ ID NO:2至8的氨基酸序列。
5.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述GLP-2衍生物的C-末端是未变异的或是酰胺化的。
6.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述粘膜炎是口腔粘膜炎、胃肠粘膜炎或其组合。
7.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述化疗是使用抗癌药物的化疗。
8.根据权利要求7所述的药物组合物，其中所述抗癌药物是细胞毒性抗癌剂、靶向抗癌剂、免疫肿瘤剂或其组合。
9.根据权利要求8所述的药物组合物，其中所述细胞毒性抗癌剂是核苷类似物、抗叶酸剂、抗代谢物、拓扑异构酶I抑制剂、蒽环类、鬼臼脂素、紫杉烷、长春碱、烷化剂、铂化合物或其组合。
10.根据权利要求7所述的药物组合物，其中所述抗癌药物是5-氟尿嘧啶(5-FU)、环磷酰胺(CPA)、多西紫杉醇、多柔比星、长春新碱、强的松、依托泊苷、异环磷酰胺、甲氨蝶呤、紫杉醇、吉西他滨、长春瑞滨、亚叶酸、伊立替康、奥沙利铂或其组合。
11.根据权利要求1所述的药物组合物，其中在进行放疗或化疗前1天内施用所述组合物；或在进行放疗或化疗后1天内施用所述组合物。
12.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述组合物导致施用所述组合物的对象中小肠质量增加、小肠质量减少水平降低、炎症抑制、单核细胞向巨噬细胞分化抑制和单核细胞迁移抑制中的至少一种。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的药物组合物，其中所述GLP-2衍生物是长效缀合物的形式，其中所述GLP-2衍生物与能够增加所述GLP-2衍生物的体内半衰期的生物相容性材料连接。
14.根据权利要求13所述的药物组合物，其中所述缀合物由以下化学式1表示：
[化学式1]
X–La–F
其中，
X是GLP-2衍生物；
L是包含乙二醇重复单元的连接体；
a是0或自然数，条件是当a是2或更大时，每个L彼此独立；
F是免疫球蛋白Fc区；以及
“–”是共价键。
15.根据权利要求14所述的药物组合物，其中所述免疫球蛋白Fc区是非糖基化IgG4 Fc区。
16.根据权利要求14所述的药物组合物，其中所述F是由两条多肽链组成的二聚体，并且所述L的一端仅与所述两条多肽链中的一条多肽链连接。
17.根据权利要求14所述的药物组合物，其中所述L是聚乙二醇。
18.根据权利要求14所述的药物组合物，其中所述L中的乙二醇重复单元部分的式量在1kDa至100kDa的范围内。
CN202180036642.5A 2020-04-03 2021-04-02 预防或治疗放疗、化疗或其组合引发的粘膜炎的包含glp-2衍生物或其长效缀合物的药物组合物 Pending CN115697375A (zh)

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