CN115671025A - Fa类脂质化合物在制备核酸递送试剂中的应用及其相关产品 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及通过一种或多种脂质化合物递送核酸的用途,以及包含所述脂质化合物和核酸的脂质核酸混合物、药物组合物或试剂盒。本申请提供的脂质化合物能够促进核酸的吸收，特别是口服吸收，以及促进核酸进入有此需要的对象体内的靶部位。

Description

FA类脂质化合物在制备核酸递送试剂中的应用及其相关产品
技术领域
本发明涉及生物领域。具体地，本申请涉及脂质化合物用于递送核酸的用途，这些化合物或其多种组合能够促进各种核酸通过口服体内吸收，进入有此需要的对象体内的靶部位，并进入靶细胞中。本申请涉及的这些化合物在中药中被提取和发现，也可以通过合成的方法获得。
背景技术
在过去几十年中，用核酸分子作为治疗药物的理念从概念走向了临床现实。事实上，核酸分子拥有许多的属性使得它们可以作为治疗药物。它们能够折叠形成复杂的构象让它们可以与蛋白质、小分子或者其他核酸相互结合，有些甚至可以形成催化中心。核酸药物可精准靶向，未来极有可能改变目前西医药物以化合物和蛋白类药为主的医药格局，成为继小分子化药和抗体药物后的第三大类型药物。例如，小干扰RNA(siRNA)作为RNAi的效应分子，其作为治疗药物具有越来越广阔的前景。目前全球已有13款核酸药物获批，且有多种siRNA药物进入临床实验，预示着其良好的发展前景。通常，人们将siRNA，miRNA及其它非编码小RNA不加区分地称之为小核酸或小RNA(sRNA)。除了小RNA以外，可以作为药物的核酸分子还包括例如mRNA、反义核酸等。然而，由于核酸分子例如RNA容易降解，在体内有相对较短的半衰期，因此作为治疗药物来说，其通常不被认为是最优的选择。因此，如何将核酸分子包括小RNA、mRNA等有效递送至体内靶器官以及靶细胞中，实现其生物活性和治疗或预防作用，是本领域技术人员迫切需要解决的问题。
发明内容
在一方面，本申请提供了脂质组合物在制备用于核酸递送的试剂中的用途，所述脂质组合物包含一种或多种具有式(I)的化合物或其盐、水合物或溶剂化物：
A-L1-L3-L2-B (I)
其中：
L1为不存在、直链或支链C1-24烷基、直链或支链C2-24烯基、或者任选由氧基取代的芳基；
L2为不存在、任选由胺基取代的直链或支链C1-24烷基、或者直链或支链C2-24烯基；
L3为
Figure BDA0003182377030000021
任选由氧基取代的环烷基、或者任选由氧基取代的杂环基；
A为氢、羟基、-COOH、任选由羟基取代的直链或支链C1-24烷基、直链或支链C2-24烯基、任选由一个或多个选自羟基、胺基的取代基取代的直链或支链C2-24杂烯基、或者任选由氧基取代的杂环基；
B为羟基、-CHO、-COOH、-C(O)R’、-OC(O)R’、直链或支链C1-24烷基、直链或支链C2-24烯基；
R为氢、直链或支链C1-24烷基；
R’为直链或支链C1-24烷基。
在某些实施方式中，所述化合物的盐包括药学上可接受的盐。
在另一方面，本申请还提供了脂质组合物在制备用于核酸递送的试剂中的用途，所述脂质组合物包含一种或多种选自下组的化合物，或其盐、水合物或溶剂化物：脂质501、502、503、505、519、520、521、522、525、526、527、528、529、530、537、542、543、572、573、574、578、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、635、和636，其中所述化合物如下表所示：
Figure BDA0003182377030000031
Figure BDA0003182377030000041
Figure BDA0003182377030000051
在某些实施方式中，所述脂质组合物或所述试剂可以通过口服、吸入或注射的方式递送所述核酸。在某些实施方式中，所述脂质组合物或所述试剂通过口服的方式递送所述核酸。在某些实施方式中，所述递送包括体内消化道递送。
在某些实施方式中，所述递送包括体外细胞递送。
在某些实施方式中，所述脂质组合物或所述试剂可以用于制备脂质核酸混合物。
脂质核酸混合物可以通过适当的方法制备，包括但不限于，加热法、逆向蒸发法，或者混合法。
在某些实施方式中，所述加热法包括将脂质的有机溶剂溶液加入到核酸的水溶液中得到混合溶液，并在适当的温度下加热所述混合溶液。在某些实施方式中，所述加热法进一步包括冷却所述加热的混合溶液，从而得到脂质与核酸的混合物。
在一些实施方案中，在选自如下的温度下加热所述混合溶液：25℃至100℃、30℃至100℃、40℃至100℃、50℃至100℃、60℃至100℃、70℃至100℃、80℃至100℃、90℃至100℃，和95℃至100℃。在一些实施方案中，在选自如下的温度下加热所述混合溶液：30℃、35℃、37℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃，80℃、85℃、90℃、95℃和100℃。
在一些实施方案中，加热所述混合溶液的时间为约5分钟至约24小时，约5分钟至约20小时，约5分钟至约16小时，约10分钟至约20小时，约10分钟至约16小时，约15分钟至约24小时，约15分钟至约20小时，约30分钟至约24小时，约30分钟至约20小时，约40分钟至约16小时，约50分钟至约12小时，约1小时至约8小时，或约2小时至约4小时。在一些实施方案中，加热所述混合溶液的时间为约5分钟至约1小时，约5分钟至约30分钟，约5分钟至约15分钟，或约10分钟至约15分钟。在一些实施方案中，加热所述混合溶液的时间为约5分钟、约10分钟、约15分钟、约20分钟、约25分钟、约30分钟、40分钟、50分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、12小时、16小时、20小时或24小时。
在某些实施方案中，在选自如下的温度下冷却所述混合溶液：25℃至-80℃，20℃至-80℃，15℃至-80℃，10℃至-80℃，4℃至-80℃，0℃至-80℃，-10℃至-80℃，-20℃至-80℃，-30℃至-80℃，-40℃至-80℃。在一些实施方案中，在选自如下的温度下冷却所述混合溶液：25℃、20℃、15℃、10℃、4℃或0℃。
在某些实施方案中，所述逆向蒸发法包括将核酸的水溶液与脂质化合物的有机溶剂溶液进行混合以得到混合溶液。在某些实施方案中，所述逆向蒸发法进一步包括去除所述混合溶液中的有机溶剂，然后进行水化，从而得到脂质与核酸的混合物。在某些实施方案中，将所述混合溶液进行超声和/或蒸发以去除所述有机溶剂。在某些实施方案中，去除所述混合溶液中的有机溶剂的步骤在适当的温度下进行。
在一些实施方案中，在选自如下的温度下去除所述混合溶液中的有机溶剂：约25℃至约70℃，30℃至约70℃、约30℃至约65℃，约40℃至约65℃，约40℃至约60℃、或约50℃至约60℃。在一些实施方案中，在选自如下的温度下去除所述混合溶液中的有机溶剂：约25℃、约30℃、约35℃、约40℃、约45℃、约50℃、约55℃、约60℃、约65℃和约70℃。
在另一方面，本申请提供了一种向有需要的个体递送核酸的方法，其包括通过口服、吸入或注射的方式向所述个体施用所述脂质组合物和所述核酸。在某些实施方式中，所述脂质组合物和所述核酸以脂质核酸混合物的形式施用。
在某些实施方式中，所述核酸包含DNA或RNA。在某些实施方案中，所述DNA为例如非编码DNA(如反义DNA)或编码DNA等。在某些实施方案中，所述RNA为例如反义核酸、mRNA、lncRNA、或小RNA(例如miRNA、siRNA、piRNA、snoRNA、tsRNA)等。
在某些实施方式中，所述核酸包含长度为14-32bp、16-28bp或18-24bp的小核酸。
在某些实施方式中，所述核酸为单链或双链的。
在某些实施方式中，所述核酸具有茎环结构。
在某些实施方式中，所述核酸用于治疗疾病。
在某些实施方式中，所述核酸用于治疗癌症、炎症、纤维化疾病、自身免疫疾病或自身炎性疾病、细菌感染、行为性和精神性病症、血液疾病、染色体疾病、先天性和遗传性疫病、结缔组织疾病、消化性疾病、耳鼻喉疾病、内分泌疾病、环境性疾病、眼部疾病、女性生殖性疾病、真菌感染、心脏病、遗传性癌症综合征、免疫系统疾病、肾脏和泌尿性疾病、肺部疾病、男性生殖新疾病、代谢性病症、口部疾病、肌肉骨骼疾病、骨髓增生异常性综合征、新生儿筛查、营养性疾病、寄生虫疾病、罕见癌症、罕见疾病、皮肤疾病和病毒感染。
在某些实施方式中，所述核酸用于治疗肝细胞癌、角膜新生血管形成、复发性或难治性间变性星形细胞瘤(WHO III级)或继发性胶质母细胞瘤(WHO IV级)、晚期鳞状细胞肺癌、肢端肥大症、银屑病、杜氏肌营养不良症、晚期非小细胞肺癌、转移性去势抗性前列腺癌、巨细胞病毒性视网膜炎，HIV感染、乙型肝炎、丙型肝炎、高脂蛋白症、全膝关节置换术、II型糖尿病、家族性淀粉样多发性神经病(FAP)、湿性黄斑变性(例如新血管性年龄相关性黄斑变性、中央凹下新血管性年龄相关性黄斑变性、渗出性年龄相关性黄斑变性)、高胆固醇血症、克罗恩病、广泛性肝纤维化、婴儿型脊髓性肌萎缩症、黑色素瘤、新生冠状动脉病变、轻度过敏性哮喘、慢性淋巴细胞性白血病、和高甘油三酯血症、造血干细胞移植后伴肾或肺功能障碍的肝小细胞闭塞症、伴遗传性转甲状腺素蛋白淀粉样病变。
在另一方面，本申请还提供了一种药物组合物，其包含脂质组合物以及核酸，其中所述脂质组合物包含一种或多种具有式(I)的化合物或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物。在某些实施方式中，所述脂质组合物和所述核酸以脂质核酸混合物的形式存在。
在另一方面，本申请还提供了一种药物组合物，其包含脂质组合物以及核酸，其中所述脂质组合物包含一种或多种选自下组的化合物，或其盐、水合物或溶剂化物：脂质501、502、503、505、519、520、521、522、525、526、527、528、529、530、537、542、543、572、573、574、578、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、635、和636组成的组。在某些实施方式中，所述脂质组合物和所述核酸以脂质核酸混合物的形式存在。
在另一方面，本申请还提供了本申请所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗能用核酸预防和/或治疗的疾病，或者用于将核酸体内递送至有此需要的对象中。
在另一方面，本申请还提供了一种试剂盒，其包含：置于第一容器中的一种或多种具有所述式(I)的化合物或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物，和置于第二容器中的核酸。
在另一方面，本申请还提供了一种试剂盒，其包含：置于第一容器中的一种或多种化合物或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物，和置于第二容器中的核酸，其中所述一种或多种化合物选自下组：脂质501、502、503、505、519、520、521、522、525、526、527、528、529、530、537、542、543、572、573、574、578、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、635、和636。
在另一方面，本申请提供了本申请所述的试剂盒在制备药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗能用核酸预防和/或治疗的疾病，或者用于将核酸体内递送至有此需要的对象中。
在另一方面，本申请提供了一种将核酸递送至靶细胞中的方法，包括向所述靶细胞施用本申请所述的药物组合物，或者由本申请所述的试剂盒配制得到的脂质核酸混合物。
在另一方面，本申请提供了一种将核酸体内递送至有此需要的对象中的方法，包括向所述对象施用本申请所述的药物组合物，或者由本申请所述的试剂盒配制得到的脂质核酸混合物。
应理解，在本发明范围内，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1分别示出了空白组、自由摄取组和脂质501递送PGY-sRNA-26进入小鼠心脏组织(a)、肝组织(b)、脾组织(c)、肺组织(d)、肾组织(e)、胃组织(f)、肠组织(g)、脑组织(h)及血液(i)的结果。
图2分别示出了空白组、自由摄取组和脂质502递送PGY-sRNA-26进入心脏组织(a)、肝组织(b)、脾组织(c)、肺组织(d)、肾组织(e)、胃组织(f)、肠组织(g)、脑组织(h)及血液(i)的结果。
图3分别示出了空白组、自由摄取组和脂质503递送PGY-sRNA-26进入小鼠心脏组织(a)、肝组织(b)、脾组织(c)、肺组织(d)、肾组织(e)、胃组织(f)、肠组织(g)、脑组织(h)及血液(i)的结果。
图4分别示出了空白组、自由摄取组和脂质505递送PGY-sRNA-26进入小鼠心脏组织(a)、肝组织(b)、脾组织(c)、肺组织(d)、肾组织(e)、胃组织(f)、肠组织(g)、脑组织(h)及血液(i)的结果。
图5分别示出了空白组、自由摄取组和脂质519递送PGY-sRNA-26进入小鼠心脏组织(a)、肝组织(b)、脾组织(c)、肺组织(d)、肾组织(e)、胃组织(f)、肠组织(g)、脑组织(h)及血液(i)的结果。
图6分别示出了空白组、自由摄取组和脂质520递送PGY-sRNA-26进入小鼠心脏组织(a)、肝组织(b)、脾组织(c)、肺组织(d)、肾组织(e)、胃组织(f)、肠组织(g)、脑组织(h)及血液(i)的结果。
图7分别示出了空白组、自由摄取组和脂质521递送PGY-sRNA-26进入小鼠心脏组织(a)、肝组织(b)、脾组织(c)、肺组织(d)、肾组织(e)、胃组织(f)、肠组织(g)、脑组织(h)及血液(i)的结果。
图8分别示出了空白组、自由摄取组和脂质522递送PGY-sRNA-26进入小鼠心脏组织(a)、肝组织(b)、脾组织(c)、肺组织(d)、肾组织(e)、胃组织(f)、肠组织(g)、脑组织(h)、血液(i)及股骨(j)的结果。
图9分别示出了空白组、自由摄取组和脂质525递送PGY-sRNA-26进入小鼠心脏组织(a)、肝组织(b)、脾组织(c)、肺组织(d)、肾组织(e)、胃组织(f)、肠组织(g)、脑组织(h)、血液(i)及股骨(j)的结果。
图10分别示出了空白组、自由摄取组和脂质526递送PGY-sRNA-26进入小鼠心脏组织(a)、肝组织(b)、脾组织(c)、肺组织(d)、肾组织(e)、胃组织(f)、肠组织(g)、脑组织(h)、血液(i)及股骨(j)的结果。
图11分别示出了空白组、自由摄取组和脂质527递送PGY-sRNA-26进入小鼠心脏组织(a)、肝组织(b)、脾组织(c)、肺组织(d)、肾组织(e)、胃组织(f)、肠组织(g)、脑组织(h)、血液(i)及股骨(j)的结果。
图12分别示出了空白组、自由摄取组和脂质528递送PGY-sRNA-26进入小鼠心脏组织(a)、肝组织(b)、脾组织(c)、肺组织(d)、肾组织(e)、胃组织(f)、肠组织(g)、脑组织(h)、血液(i)及股骨(j)的结果。
图13分别示出了空白组、自由摄取组和脂质529递送PGY-sRNA-26进入小鼠心脏组织(a)、肝组织(b)、脾组织(c)、肺组织(d)、肾组织(e)、胃组织(f)、肠组织(g)、脑组织(h)、血液(i)及股骨(j)的结果。
图14分别示出了空白组、自由摄取组和脂质530递送PGY-sRNA-26进入小鼠心脏组织(a)、肝组织(b)、脾组织(c)、肺组织(d)、肾组织(e)、胃组织(f)、肠组织(g)、脑组织(h)、血液(i)及股骨(j)的结果。
图15分别示出了空白组、自由摄取组和脂质537递送PGY-sRNA-26进入小鼠心脏组织(a)、肝组织(b)、脾组织(c)、肺组织(d)、肾组织(e)、胃组织(f)、肠组织(g)、脑组织(h)、血液(i)及股骨(j)的结果。
图16分别示出了空白组、自由摄取组和脂质542递送PGY-sRNA-26进入小鼠心脏组织(a)、肝组织(b)、脾组织(c)、肺组织(d)、肾组织(e)、胃组织(f)、肠组织(g)、脑组织(h)、血液(i)及股骨(j)的结果。
图17分别示出了空白组、自由摄取组和脂质543递送PGY-sRNA-26进入小鼠心脏组织(a)、肝组织(b)、脾组织(c)、肺组织(d)、肾组织(e)、胃组织(f)、肠组织(g)、脑组织(h)、血液(i)及股骨(j)的结果。
图18分别示出了空白组、自由摄取组和脂质572递送PGY-sRNA-26进入小鼠心脏组织(a)、肝组织(b)、脾组织(c)、肺组织(d)、肾组织(e)、胃组织(f)、肠组织(g)、脑组织(h)、血液(i)及股骨(j)的结果。
图19分别示出了空白组、自由摄取组和脂质573递送PGY-sRNA-26进入小鼠心脏组织(a)、肝组织(b)、脾组织(c)、肺组织(d)、肾组织(e)、胃组织(f)、肠组织(g)、脑组织(h)、血液(i)及股骨(j)的结果。
图20分别示出了空白组、自由摄取组和脂质574递送PGY-sRNA-26进入小鼠心脏组织(a)、肝组织(b)、脾组织(c)、肺组织(d)、肾组织(e)、胃组织(f)、肠组织(g)、脑组织(h)、血液(i)及股骨(j)的结果。
图21分别示出了空白组、自由摄取组和脂质578递送PGY-sRNA-26进入小鼠心脏组织(a)、肝组织(b)、脾组织(c)、肺组织(d)、肾组织(e)、胃组织(f)、肠组织(g)、脑组织(h)、血液(i)及股骨(j)的结果。
图22分别示出了空白组、自由摄取组和脂质593递送PGY-sRNA-26进入小鼠心脏组织(a)、肝组织(b)、脾组织(c)、肺组织(d)、肾组织(e)、胃组织(f)、肠组织(g)、脑组织(h)、血液(i)及股骨(j)的结果。
图23分别示出了空白组、自由摄取组和脂质594递送PGY-sRNA-26进入小鼠心脏组织(a)、肝组织(b)、脾组织(c)、肺组织(d)、肾组织(e)、胃组织(f)、肠组织(g)、脑组织(h)、血液(i)及股骨(j)的结果。
图24分别示出了空白组、自由摄取组和脂质595递送PGY-sRNA-26进入小鼠心脏组织(a)、肝组织(b)、脾组织(c)、肺组织(d)、肾组织(e)、胃组织(f)、肠组织(g)、脑组织(h)、血液(i)及股骨(j)的结果。
图25分别示出了空白组、自由摄取组和脂质596递送PGY-sRNA-26进入小鼠心脏组织(a)、肝组织(b)、脾组织(c)、肺组织(d)、肾组织(e)、胃组织(f)、肠组织(g)、脑组织(h)、血液(i)及股骨(j)的结果。
图26分别示出了空白组、自由摄取组和脂质597递送PGY-sRNA-26进入小鼠心脏组织(a)、肝组织(b)、脾组织(c)、肺组织(d)、肾组织(e)、胃组织(f)、肠组织(g)、脑组织(h)、血液(i)及股骨(j)的结果。
图27分别示出了空白组、自由摄取组和脂质598递送PGY-sRNA-26进入小鼠心脏组织(a)、肝组织(b)、脾组织(c)、肺组织(d)、肾组织(e)、胃组织(f)、肠组织(g)、脑组织(h)、血液(i)及股骨(j)的结果。
图28分别示出了空白组、自由摄取组和脂质599递送PGY-sRNA-26进入小鼠心脏组织(a)、肝组织(b)、脾组织(c)、肺组织(d)、肾组织(e)、胃组织(f)、肠组织(g)、脑组织(h)、血液(i)及股骨(j)的结果。
图29分别示出了空白组、自由摄取组和脂质600递送PGY-sRNA-26进入小鼠心脏组织(a)、肝组织(b)、脾组织(c)、肺组织(d)、肾组织(e)、胃组织(f)、肠组织(g)、脑组织(h)、血液(i)及股骨(j)的结果。
图30分别示出了空白组、自由摄取组和脂质601递送PGY-sRNA-26进入小鼠心脏组织(a)、肝组织(b)、脾组织(c)、肺组织(d)、肾组织(e)、胃组织(f)、肠组织(g)、脑组织(h)、血液(i)及股骨(j)的结果。
图31分别示出了空白组、自由摄取组和脂质602递送PGY-sRNA-26进入小鼠心脏组织(a)、肝组织(b)、脾组织(c)、肺组织(d)、肾组织(e)、胃组织(f)、肠组织(g)、脑组织(h)、血液(i)及股骨(j)的结果。
图32分别示出了空白组、自由摄取组和脂质603递送PGY-sRNA-26进入小鼠心脏组织(a)、肝组织(b)、脾组织(c)、肺组织(d)、肾组织(e)、胃组织(f)、肠组织(g)、脑组织(h)、血液(i)及股骨(j)的结果。
图33分别示出了空白组、自由摄取组和脂质604递送PGY-sRNA-26进入小鼠心脏组织(a)、肝组织(b)、脾组织(c)、肺组织(d)、肾组织(e)、胃组织(f)、肠组织(g)、脑组织(h)、血液(i)及股骨(j)的结果。
图34分别示出了空白组、自由摄取组和脂质605递送PGY-sRNA-26进入小鼠心脏组织(a)、肝组织(b)、脾组织(c)、肺组织(d)、肾组织(e)、胃组织(f)、肠组织(g)、脑组织(h)、血液(i)及股骨(j)的结果。
图35分别示出了空白组、自由摄取组和脂质606递送PGY-sRNA-26进入小鼠心脏组织(a)、肝组织(b)、脾组织(c)、肺组织(d)、肾组织(e)、胃组织(f)、肠组织(g)、脑组织(h)、血液(i)及股骨(j)的结果。
图36分别示出了空白组、自由摄取组和脂质607递送PGY-sRNA-26进入小鼠心脏组织(a)、肝组织(b)、脾组织(c)、肺组织(d)、肾组织(e)、胃组织(f)、肠组织(g)、脑组织(h)、血液(i)及股骨(j)的结果。
图37分别示出了空白组、自由摄取组和脂质608递送PGY-sRNA-26进入小鼠心脏组织(a)、肝组织(b)、脾组织(c)、肺组织(d)、肾组织(e)、胃组织(f)、肠组织(g)、脑组织(h)、血液(i)及股骨(j)的结果。
图38分别示出了空白组、自由摄取组和脂质609递送PGY-sRNA-26进入小鼠心脏组织(a)、肝组织(b)、脾组织(c)、肺组织(d)、肾组织(e)、胃组织(f)、肠组织(g)、脑组织(h)、血液(i)及股骨(j)的结果。
图39分别示出了空白组、自由摄取组和脂质610递送PGY-sRNA-26进入小鼠心脏组织(a)、肝组织(b)、脾组织(c)、肺组织(d)、肾组织(e)、胃组织(f)、肠组织(g)、脑组织(h)、血液(i)及股骨(j)的结果。
图40分别示出了空白组、自由摄取组和脂质611递送PGY-sRNA-26进入小鼠心脏组织(a)、肝组织(b)、脾组织(c)、肺组织(d)、肾组织(e)、胃组织(f)、肠组织(g)、脑组织(h)、血液(i)及股骨(j)的结果。
图41分别示出了空白组、自由摄取组和脂质612递送PGY-sRNA-26进入小鼠心脏组织(a)、肝组织(b)、脾组织(c)、肺组织(d)、肾组织(e)、胃组织(f)、肠组织(g)、脑组织(h)、血液(i)及股骨(j)的结果。
图42分别示出了空白组、自由摄取组和脂质613递送PGY-sRNA-26进入小鼠心脏组织(a)、肝组织(b)、脾组织(c)、肺组织(d)、肾组织(e)、胃组织(f)、肠组织(g)、脑组织(h)、血液(i)及股骨(j)的结果。
图43分别示出了空白组、自由摄取组和脂质614递送PGY-sRNA-26进入小鼠心脏组织(a)、肝组织(b)、脾组织(c)、肺组织(d)、肾组织(e)、胃组织(f)、肠组织(g)、脑组织(h)、血液(i)及股骨(j)的结果。
图44分别示出了空白组、自由摄取组和脂质615递送PGY-sRNA-26进入小鼠心脏组织(a)、肝组织(b)、脾组织(c)、肺组织(d)、肾组织(e)、胃组织(f)、肠组织(g)、脑组织(h)、血液(i)及股骨(j)的结果。
图45分别示出了空白组、自由摄取组和脂质616递送PGY-sRNA-26进入小鼠心脏组织(a)、肝组织(b)、脾组织(c)、肺组织(d)、肾组织(e)、胃组织(f)、肠组织(g)、脑组织(h)、血液(i)及股骨(j)的结果。
图46分别示出了空白组、自由摄取组和脂质617递送PGY-sRNA-26进入小鼠心脏组织(a)、肝组织(b)、脾组织(c)、肺组织(d)、肾组织(e)、胃组织(f)、肠组织(g)、脑组织(h)、血液(i)及股骨(j)的结果。
图47分别示出了空白组、自由摄取组和脂质618递送PGY-sRNA-26进入小鼠心脏组织(a)、肝组织(b)、脾组织(c)、肺组织(d)、肾组织(e)、胃组织(f)、肠组织(g)、脑组织(h)、血液(i)及股骨(j)的结果。
图48分别示出了空白组、自由摄取组和脂质619递送PGY-sRNA-26进入小鼠心脏组织(a)、肝组织(b)、脾组织(c)、肺组织(d)、肾组织(e)、胃组织(f)、肠组织(g)、脑组织(h)、血液(i)及股骨(j)的结果。
图49分别示出了空白组、自由摄取组和脂质620递送PGY-sRNA-26进入小鼠心脏组织(a)、肝组织(b)、脾组织(c)、肺组织(d)、肾组织(e)、胃组织(f)、肠组织(g)、脑组织(h)、血液(i)及股骨(j)的结果。
图50分别示出了空白组、自由摄取组和脂质621递送PGY-sRNA-26进入小鼠心脏组织(a)、肝组织(b)、脾组织(c)、肺组织(d)、肾组织(e)、胃组织(f)、肠组织(g)、脑组织(h)、血液(i)及股骨(j)的结果。
图51分别示出了空白组、自由摄取组和脂质622递送PGY-sRNA-26进入小鼠心脏组织(a)、肝组织(b)、脾组织(c)、肺组织(d)、肾组织(e)、胃组织(f)、肠组织(g)、脑组织(h)、血液(i)及股骨(j)的结果。
图52分别示出了空白组、自由摄取组和脂质623递送PGY-sRNA-26进入小鼠心脏组织(a)、肝组织(b)、脾组织(c)、肺组织(d)、肾组织(e)、胃组织(f)、肠组织(g)、脑组织(h)、血液(i)及股骨(j)的结果。
图53分别示出了空白组、自由摄取组和脂质624递送PGY-sRNA-26进入小鼠心脏组织(a)、肝组织(b)、脾组织(c)、肺组织(d)、肾组织(e)、胃组织(f)、肠组织(g)、脑组织(h)、血液(i)及股骨(j)的结果。
图54分别示出了空白组、自由摄取组和脂质625递送PGY-sRNA-26进入小鼠心脏组织(a)、肝组织(b)、脾组织(c)、肺组织(d)、肾组织(e)、胃组织(f)、肠组织(g)、脑组织(h)、血液(i)及股骨(j)的结果。
图55分别示出了空白组、自由摄取组和脂质626递送PGY-sRNA-26进入小鼠心脏组织(a)、肝组织(b)、脾组织(c)、肺组织(d)、肾组织(e)、胃组织(f)、肠组织(g)、脑组织(h)、血液(i)及股骨(j)的结果。
图56分别示出了空白组、自由摄取组和脂质627递送PGY-sRNA-26进入小鼠心脏组织(a)、肝组织(b)、脾组织(c)、肺组织(d)、肾组织(e)、胃组织(f)、肠组织(g)、脑组织(h)、血液(i)及股骨(j)的结果。
图57分别示出了空白组、自由摄取组和脂质628递送PGY-sRNA-26进入小鼠心脏组织(a)、肝组织(b)、脾组织(c)、肺组织(d)、肾组织(e)、胃组织(f)、肠组织(g)、脑组织(h)、血液(i)及股骨(j)的结果。
图58分别示出了空白组、自由摄取组和脂质635递送PGY-sRNA-26进入小鼠心脏组织(a)、肝组织(b)、脾组织(c)、肺组织(d)、肾组织(e)、胃组织(f)、肠组织(g)、脑组织(h)、血液(i)及股骨(j)的结果。
图59分别示出了空白组、自由摄取组和脂质636递送PGY-sRNA-26进入小鼠心脏组织(a)、肝组织(b)、脾组织(c)、肺组织(d)、肾组织(e)、胃组织(f)、肠组织(g)、脑组织(h)、血液(i)及股骨(j)的结果。
具体实施方式
本发明至少部分地基于本申请的发明人经过大量实验获得的意外发现，即，一些中药中存在一些脂质组分，这些源自中药的脂质能够促进核酸如小RNA吸收/进入细胞和/或有此需要的对象体内靶部位。为本发明的目的，这些脂质组分也可以是合成的。
如下将参照以示例性的方式示出结构和式的本申请的某些实施方案来详细描述本申请。尽管结合列举的实施方案对本申请进行了描述，但应了解其不旨在将本申请限定为所描述的那些实施方案。相反，本申请旨在涵盖落入权利要求书所限定的范围内的所有替代方式、修改方式和等同方式。本领域技术人员将会认识到可用于实施本申请的与本文描述的方法和材料类似或等同的其他方法和材料，本申请不以任何方式局限于所描述的方法和材料。当所引用的文献和类似材料不同于本申请的描述或与本申请的描述(包括限定的术语、术语使用、技术等)矛盾时，以本申请的描述为准。
还应理解在不同实施方案中描述的某些特征也可在单个实施方案中组合提供。反之，在单个实施方案中描述的多种特征也可以单独提供或以任何适当的亚组合提供。
还应理解本文所记载的数值点旨在包括各数值点本身，以及任意两个所记载的点之间的数值范围(如同这些数值范围已经单独列出)。
定义
如本文所用，除非另有说明，否则应适用以下定义。出于本申请的目的，根据Handbook ofChemistry and Physics(第75版)的元素周期表(CAS版)鉴定化学元素。另外，有机化学的一般原理以及特定的官能部分和反应活性描述于“Organic Chemistry”，Thomas Sorrell，University Science Books，Sausalito：1999和“March's AdvancedOrganic Chemistry”，第5版，Smith，M.B.和March，J.，John Wiley&Sons，New York：2001中，其全部内容通过引用并入本申请。
在本文中描述了连接取代基。当结构明确需要连接基团时，应理解针对该基团所列出的马库什变量为连接基团。例如，如果结构需要连接基团，且针对该变量的马库什基团定义列出了“烷基”，则应理解“烷基”表示亚烷基连接基团。
本文所用的术语“取代的”，无论前面是否有术语“任选地”，都是指指定基团中的一个或多个氢被合适的取代基取代。除非另有说明，否则“取代的”基团可以在所述基团的每个可取代的位置具有合适的取代基，并且当任何给定结构中一个以上的位置可以被选自特定基团的一个以上的取代基取代时，所述取代基可以在每个位置上都相同或不同。本发明所设想的取代基组合优选地是导致形成稳定的或化学上可行的化合物的那些取代基组合。本文所用的术语“稳定的”是指这样的化合物：当其经受允许其生产、检测、以及(在某些实施方案中)其回收、纯化的条件、以及用于本文公开的一个或多个目的时，其基本上不会改变。除非特别指出为“未取代的”，否则本文所述的化学部分应被理解为包括取代基。例如，当提及“芳基”时，其包括取代的芳基和未取代的芳基。
当连接至取代基的键显示为与环中连接两个原子的键交叉时，该取代基可键连至环中的任意原子。当列出取代基但未指明该取代基通过何种原子键连至给定式的化合物的其余部分时，该取代基可通过所述式中的任意原子键连。取代基和/或变量的组合是允许的，但前提是该组合得到稳定的化合物。
本文所用的术语“Ci-j”表示碳原子数的范围，其中i和j为整数且j大于i，并且碳原子数的范围包括端点(即i和j)以及端点之间的每个整数点。例如，C1-6表示1至6个碳原子的范围，包括1个碳原子，2个碳原子，3个碳原子，4个碳原子，5个碳原子和6个碳原子。在一些实施方案中，术语“C1-12”表示1至12，特别地1至10，特别地1至8，特别地1至6，特别地1至5，特别地1至4，特别1至3，或特别地1至2个碳原子。
本文所用的术语“烷基”，无论作为另一术语的一部分还是独立地使用，是指饱和的直链或支链烃基。术语“Ci-j烷基”指具有i至j个碳原子的烷基。在一些实施方案中，烷基包含1至20个碳原子。在一些实施方案中，烷基包含5至20个碳原子。在一些实施方案中，烷基包含1至20个碳原子，1至19个碳原子，1至18个碳原子，1至17个碳原子，1至16个碳原子，1至15个碳原子，1至14个碳原子，1至13个碳原子，1至12个碳原子，1至11个碳原子，1至10个碳原子，1至9个碳原子，1至8个碳原子，1至7个碳原子，1至6个碳原子，1至5个碳原子，1至4个碳原子，1至3个碳原子，或1至2个碳原子。烷基的例子包括但不限于甲基、乙基、1-丙基(正丙基)、2-丙基(异丙基)、1-丁基(正丁基)、2-甲基-1-丙基(异丁基)、2-丁基(新丁基)、2-甲基-2-丙基(叔丁基)、1-戊基(正戊基)、2-戊基、3-戊基、2-甲基-2-丁基、3-甲基-2-丁基、3-甲基-1-丁基、2-甲基-1-丁基、1-己基、2-己基、3-己基、2-甲基-2-戊基、3-甲基-2-戊基、4-甲基-2-戊基、3-甲基-3-戊基、2-甲基-3-戊基、2，3-二甲基-2-丁基、3，3-二甲基-2-丁基、1-庚基、1-辛基、1-壬基、1-癸基等。“C1-24烷基”的例子包括但不限于甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基、十九烷基、二十烷基。
本文所用的术语“烯基”，无论作为另一术语的一部分还是独立地使用，是指具有至少一个碳-碳双键的直链或支链烃基，其可任选地被一个或多个本文所述的取代基独立地取代，并且包括具有“顺式”和“反式”取向，或者“E”和“Z”取向的基团。在一些实施方案中，烯基含有2至20个碳原子。在一些实施方案中，烯基含有5至20个碳原子。在一些实施方案中，烯基含有2至20个碳原子，2至19个碳原子，2至18个碳原子，2至17个碳原子，2至16个碳原子，2至15个碳原子，2至14个碳原子，2至13个碳原子，2至12个碳原子，2至11个碳原子，2至10个碳原子，2至9个碳原子，2至8个碳原子，2至7个碳原子，2至6个碳原子，2至5个碳原子，2至4个碳原子，2至3个碳原子。在一些实施方案中，烯基包含超过1个碳-碳双键。应理解，在所述烯基包含超过1个碳-碳双键的情况下，所述双键可以互相分离或共轭。在一些实施方案中，烯基包含5个碳-碳双键，4个碳-碳双键，3个碳-碳双键，2个碳-碳双键，或1个碳-碳双键。
本文所用的术语“环烷基”，无论作为另一术语的一部分还是独立地使用，是指饱和的单环和多环环系，其中所有的环原子为碳，其包含至少3个成环碳原子。在一些实施方案中，环烷基可含有3至20个成环碳原子，3至19个成环碳原子，3至18个成环碳原子，3至17个成环碳原子，3至16个成环碳原子，3至15个成环碳原子，3至14个成环碳原子，3至13个成环碳原子，3至12个成环碳原子，3至11个成环碳原子，3至10个成环碳原子，3至9个成环碳原子，3至8个成环碳原子，3至7个成环碳原子，3至6个成环碳原子，3至5个成环碳原子，4至20个成环碳原子，4至19个成环碳原子，4至18个成环碳原子，4至17个成环碳原子，4至16个成环碳原子，4至15个成环碳原子，4至14个成环碳原子，4至13个成环碳原子，4至12个成环碳原子，4至11个成环碳原子，4至10个成环碳原子，4至9个成环碳原子，4至8个成环碳原子，4至7个成环碳原子，4至6个成环碳原子，4至5个成环碳原子。环烷基可任选地在一个或多个环位置处被一个或多个本文所述的取代基取代。环烷基可为饱和的、部分不饱和的或完全不饱和的。在一些实施方案中，环烷基可为饱和环状烷基。在一些实施方案中，环烷基可为在环系中含有至少一个双键或三键的不饱和环状烷基。
本文所用的术语“环烯基”，无论作为另一术语的一部分还是独立地使用，是指包含3-20个成环碳原子以及至少一个碳-碳双键的单环和多环环系，只要所述环烯基环的大小允许，其中所有的环原子为碳。在一些实施方案中，环烯基包含超过1个碳-碳双键。应理解，在所述烯基包含超过1个碳-碳双键的情况下，所述双键可以互相分离或共轭。在一些实施方案中，环烯基包含5个碳-碳双键，4个碳-碳双键，3个碳-碳双键，2个碳-碳双键，或1个碳-碳双键。
本文所用的术语“杂原子”是指氮、氧、硫或磷，并包括氮或硫的任意氧化形式，以及碱性氮的任意季化形式。
本文所用的术语“杂烷基”，无论作为另一术语的一部分还是独立地使用，是指至少一个碳原子被选自氮、氧、硫或磷的杂原子替换的烷基，其中所述杂原子可位于烷基的端部或中间。
本文所用的术语“杂烯基”，无论作为另一术语的一部分还是独立地使用，是指至少一个碳原子被选自氮、氧、硫或磷的杂原子替换的烯基，其中所述杂原子可位于烯基的端部或中间。
本文使用的术语“杂环基”是指这样的环烷基：其中一个或多个(例如1、2或3个)环原子被杂原子代替，所述杂原子包括，但不限于，氧、硫、氮、磷等。含有一个杂原子的示例性杂环基基团包括吡咯烷、四氢吡喃、四氢呋喃和哌啶，含有两个杂原子的示例性杂环基基团包括吗啉和哌嗪。
本文所用的术语“氧基”是指＝O。
本文所用的术语“羟基”是指-OH。
本文所用的术语“胺基”是指-NH2。
本文所用的术语“药学上可接受的盐”是指在合理的医学判断范围内适合用于与人或动物的组织接触而没有过度的毒性、刺激性、过敏性反应或其它问题，并且与合理的有益效果/风险比相称的本文所述化合物的盐或两性离子形式。
本文所用的术语“药物组合物”指包含本申请所述的脂质组合物和核酸的组合物，该组合物可任选地进一步含有药学上可接受的运载体。
本文所用的术语“药学上可接受的”是指这样的化合物、材料、组合物和/或剂型：其在合理的医学判断范围内适合用于与人和动物的组织接触而无过多毒性、刺激性、过敏反应或其他问题或并发症，与合理的利益/风险比相称。在一些实施方案中，药学上可接受的化合物、材料、组合物和/或剂型是指用于动物(更特别地，用于人)的由管理机构(例如美国食品和药物管理局、中国食品药品管理局或欧洲药品管理局)批准的或通常在公认的药典(例如美国药典、中国药典或欧洲药典)中列出的化合物、材料、组合物和/或剂型。
本文所用的术语“药学上可接受的运载体”是指药学上可接受的材料、组合物或媒介物，例如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料，其涉及将本文提供的化合物从一个位置、体液、组织、器官(内部或外部)或身体的一部分携带或运输至另一个位置、体液、组织、器官或身体的一部分。药学上可接受的运载体可以是媒介物、稀释剂、赋形剂或可用于接触动物的组织而无过多毒性或副作用的其他材料。示例性的药学上可接受的运载体包括糖、淀粉、纤维素、麦芽、黄蓍胶、明胶、林格氏溶液、海藻酸、等渗盐水、缓冲剂等。可用于本申请的药学上可接受的运载体包括本领域通常L知的运载体，例如在“RemingtonPharmaceutical Sciences”Mack Pub.Co.，New Jersey(1991)中公开的运载体，该文章通过引入并入本文。
本文所用的术语“递送”涵盖局部和全身递送两者。“局部递送”是指将待递送的治疗剂(例如核酸)直接递送至生物体内的靶部位。例如，试剂可以通过直接注射到靶部位(例如疾病部位，如肿瘤或炎症部位)或靶器官(例如心脏、脾、肺、肾等)而被局部递送。“全身递送”是指导致治疗剂(例如核酸)在生物体内广泛生物分布的递送，从而使有效量的治疗剂暴露于身体的大多数部位。为了获得广泛的生物分布，通常需要这样的血液寿命，使得这些治疗剂在到达远离给药部位的靶部位之前不迅速降解或清除。脂质组合物的全身递送可以是任何合适的方式，包括，例如，口服、吸入、消化道内、静脉内、皮下、和腹膜内来进行。
如本文所用的术语“脂质”是指一类有机化合物，其包括但不仅限于脂肪酸的酯，并且特征是不溶于水(例如水中的溶解度小于约0.01重量％)但可溶于许多有机溶剂中。脂质可以是，例如简单脂质(例如脂肪、油、蜡)，化合物脂质(例如磷脂、糖脂)，和衍生的脂质(例如类固醇)。
如本文所用的“核酸”是指含有处于单链或双链形式的至少两个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的聚合物。核酸可以具有天然的核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸，也可以包含非天然的核糖核苷酸和非天然的脱氧核糖核苷酸。天然的核糖核苷酸包括，例如腺苷酸、鸟苷酸、胞苷酸、尿苷酸、假尿甘酸、肌苷酸、黄苷酸。天然的脱氧核糖核苷酸包括，例如脱氧腺苷酸、脱氧鸟苷酸、脱氧胞苷酸、脱氧胸苷酸。非天然的核糖核苷酸和脱氧核糖核酸通常具有修饰的核碱基、修饰的核糖或脱氧核糖、和/或修饰的磷酸酯键。
“核苷酸”包含糖(例如脱氧核糖或核糖)，碱基，和磷酸基团。核苷酸通过磷酸基团连接在一起，形成聚合物。“碱基”包括嘌呤和嘧啶，其进一步包括天然化合物腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、肌苷、和天然类似物，以及嘌呤和嘧啶的合成衍生物，其包括但不限于，具有胺、醇、硫醇、羧化物和烷基卤化物等的修饰。在本申请中，核酸还可以包含核苷酸类似物或修饰的核苷酸，其可以是合成的、天然存在的、和非天然存在的，且其具有与天然核酸类似的结合特性。所述核苷酸类似物或修饰的核苷酸的实例包括，但不仅限于，具有硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基磷酸酯、或手性-甲基磷酸酯的核苷酸、2’-O-甲基核糖核苷酸和肽-核酸(PNAs)。
核酸的例子包括DNA或RNA。DNA包括编码DNA和非编码DNA，例子包括，但不限于，反义DNA、质粒DNA、预浓缩DNA、PCR产物、DNA载体(P1，PAC，BAC，YAC，人工染色体)、表达盒、嵌合序列、染色体DNA、或这些组的衍生物和组合。RNA的例子包括，但不限于，反义RNA、siRNA、不对称干扰RNA(aiRNA)、微小RNA(miRNA)、mRNA、tRNA、rRNA、病毒RNA(vRNA)、长非编码RNA(1ncRNA)、Piwi-相互作用RNA(piRNA)、核仁小RNA(snoRNA)、tRNA来源小RNA(tsRNA)或其组合。
除非另外指明，具体的核酸序列还固有地包括其保守修饰变体(例如，简并密码子取代)、等位基因、正交同源物、SNP、和互补序列以及明确指出的序列。特别地，简并密码子取代可以通过产生这样的序列实现，在所述序列中，一种或多种所选(或全部)密码子的第三个位置被混合的碱性和/或脱氧肌苷残基(Batzer等，NucleicAcidRes.(核酸研究)，19：5081(1991)；Ohtsuka等，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)，260：2605-2608(1985)；Rossolini等，Mol.Cell.Probes(分子细胞探针)，8：91-98(1994))取代。
本文在核苷酸配对情况下所用的术语“互补”包括经典的沃森-克里克配对，即G-C、A-T或A-U配对。经典的沃森-克里克配对也涵盖当一个或两个核苷酸已被修饰(例如通过核糖修饰或磷酸酯主链修饰)的情形。本文所用的“互补的”序列还可包括非沃森-克里克碱基对和/或非天然和修饰的核苷酸形成的碱基对。
本文所用的术语“治疗”是指消除、减少或改善疾病或病况和/或与其相关的症状。尽管未排除，但治疗疾病或病况不要求所述疾病、病况或与其相关的症状被完全消除。本文所用的术语“治疗”可包括“预防性治疗”，其是指在未患有疾病，但有风险或易于重新发生疾病或病况或所述疾病或病况有复发风险或易于复发的受试者中，减少重新发生疾病或病况的可能性，或减少之前控制的疾病或病况的复发的可能性。本发明的含义内，“治疗”还包括复发预防或阶段预防，以及治疗急性或慢性征兆、症状和/或机能障碍。治疗可以是针对症状的，例如，抑制症状。其可在短时期内起作用，针对中等时期内，或可以是长期治疗，例如在维持疗法的情况下。
本文所用的术语“对象”是指为了治疗目的可对其施用本文所述的脂质组合物的任何生物体。在一些实施方案中，对象是指灵长类(例如人)，狗，兔子，豚鼠，猪，大鼠和小鼠。在某些实施方案中，对象是灵长类动物。在其他实施方案中，对象是人。
脂质化合物用于递送控酸的方法和用途
本申请提供了脂质化合物用于递送核酸的方法和用途。本发明至少部分地基于对某些脂质化合物在核酸递送方面的突出效果的发现。本申请提供了多种脂质化合物，其被发现能够与核酸形成稳定的核酸脂质混合物，并且能够将核酸递送到细胞中，特别是在体内的细胞中。本申请提供的脂质化合物能够通过口服的方式，将核酸分子递送到体内，并且进入到体内的靶器官中，以实现良好的治疗效果。令人预想不到的是，不同的脂质化合物在递送核酸进入靶器官时的效果不尽相同，表现出对不同靶器官的不同的偏好。某些脂质化合物表现出对不止一种靶器官的显著的核酸递送效果，可以高效地递送核酸至多个靶器官，因此具有广泛的核酸递送的用途。某些脂质化合物表现出对某一种靶器官的特别显著的递送效果，因此可以用于递送作用于该靶器官的核酸。
在一方面，本申请提供了脂质组合物在制备用于核酸递送的试剂中的用途，或者脂质组合物用于递送核酸的方法，其中所述脂质组合物包含一种或多种具有式(I)的化合物或其盐、水合物或溶剂化物：
A-L1-L3-L2-B (I)
其中：
L1为不存在、直链或支链C1-24烷基、直链或支链C2-24烯基、或者任选由氧基取代的芳基；
L2为不存在、任选由胺基取代的直链或支链C1-24烷基、或者直链或支链C2-24烯基；
L3为
Figure BDA0003182377030000231
任选由氧基取代的环烷基、或者任选由氧基取代的杂环基；
A为氢、羟基、-COOH、任选由羟基取代的直链或支链C1-24烷基、直链或支链C2-24烯基、任选由一个或多个选自羟基、胺基的取代基取代的直链或支链C2-24杂烯基、或者任选由氧基取代的杂环基；
B为羟基、-CHO、-COOH、-C(O)R’、-OC(O)R’、直链或支链C1-24烷基、直链或支链C2-24烯基；
R为氢、直链或支链C1-24烷基；
R’为直链或支链C1-24烷基。
在某些实施方式中，L1为不存在；在某些实施方式中，L1为直链或支链C1-24烷基；在某些实施方式中，L1为直链或支链C2-24烯基；在某些实施方式中，L1为任选由氧基取代的芳基。
在某些实施方式中，L2为不存在；在某些实施方式中，L2为任选由胺基取代的直链或支链C1-24烷基；在某些实施方式中，L2为直链或支链C2-24烯基。
在某些实施方式中，L3为
Figure BDA0003182377030000241
在某些实施方式中，L3为
Figure BDA0003182377030000242
在某些实施方式中，L3为
Figure BDA0003182377030000243
在某些实施方式中，L3为
Figure BDA0003182377030000244
在某些实施方式中，L3为
Figure BDA0003182377030000245
在某些实施方式中，L3为任选由氧基取代的环烷基；在某些实施方式中，L3为任选由氧基取代的杂环基。
在某些实施方式中，A为氢；在某些实施方式中，A为羟基；在某些实施方式中，A为-COOH；在某些实施方式中，A为任选由羟基取代的直链或支链C1-24烷基；在某些实施方式中，A为直链或支链C2-24烯基；在某些实施方式中，A为任选由一个或多个选自羟基、胺基的取代基取代的直链或支链C2-24杂烯基；在某些实施方式中，A为任选由氧基取代的杂环基。
在某些实施方式中，B为羟基；在某些实施方式中，B为-CHO；在某些实施方式中，B为-COOH；在某些实施方式中，B为-C(O)R’；在某些实施方式中，B为-OC(O)R’；在某些实施方式中，B为直链或支链C1-24烷基；在某些实施方式中，B为直链或支链C2-24烯基。
在某些实施方式中，R为氢；在某些实施方式中，R为直链或支链C1-24烷基；在某些实施方式中，R’为直链或支链C1-24烷基。
在某些实施方式中，所述脂质组合物包含一种或多种具有式(I)结构的化合物或其盐、水合物或溶剂化物，所述化合物选自下组：脂质501、502、503、505、519、520、521、522、525、526、527、528、529、530、537、542、543、572、573、574、578、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、635、和636，其中所述脂质的化学名和化学结构等信息如表1所示。
在另一方面，本申请还提供了脂质组合物在制备用于核酸递送的试剂中的用途，或者脂质组合物用于递送核酸的方法，其中所述脂质组合物包含一种或多种化合物或其盐、水合物或溶剂化物，所述化合物选自下组：脂质501、502、503、505、519、520、521、522、525、526、527、528、529、530、537、542、543、572、573、574、578、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、635、和636，其中所述脂质的化学名和化学结构等信息如表1所示。
表1.脂质501-636的Cas号、结构和商品名
Figure BDA0003182377030000251
Figure BDA0003182377030000261
Figure BDA0003182377030000271
Figure BDA0003182377030000281
Figure BDA0003182377030000291
Figure BDA0003182377030000301
Figure BDA0003182377030000311
Figure BDA0003182377030000321
Figure BDA0003182377030000331
Figure BDA0003182377030000341
在某些实施方式中，所述化合物是合成的。根据化合物的化学结构，本领域技术人员可以通过化学合成的方式合成得到上述化合物。或者也可以通过商购的方式获得本申请所述的某些化合物。
在某些实施方式中，所述化合物是来自于中药提取物。“中药提取物”在本申请中是指通过适当的方法从中药材或药用植物中提取得到的提取物。可以使用任何适当的提取方法获得所述中药提取物。作为一个示例，可以将中药饮片在水中浸泡，然后依次进行强火煎煮和弱火煎煮，将煎煮后的中药药液浓缩，然后依次添加氯仿-甲醇、氯仿和水充分混合，取氯仿层获得所述中药提取物。在某些实施方式中，可以进一步地从所述中药提取物中分离或纯化出所述化合物单体。
在某些实施方式中，所述中药提取物通过Bligh&Dyer法(Bligh E.G.and Dyer，W.J.，A rapid method for total lipid extraction and purification，Can.J.Biochem.Physiol.，1959，37：911-917)提取脂溶性成分获得，或者通过中药的煎煮制备提取获得。
在某些实施方式中，所述中药提取物通过中药的煎煮制备提取获得。
在某些实施方式中，所述中药提取物通过如下方式获得：将中药在水中浸泡，然后依次进行强火煎煮和弱火煎煮，将煎煮后的中药药液浓缩，然后依次添加氯仿-甲醇、氯仿和水搅拌处理，取氯仿层提取获得。
脂质组合物
在某些实施方式中，本申请提供的脂质组合物包含一种或多种本申请提供的化合物或其盐、水合物或溶剂化物。所述脂质组合物可以为一种本申请提供的化合物或其盐、水合物或溶剂化物，也可以为两种或更多种本申请提供的化合物的混合物。
在某些实施方式中，所述脂质组合物还可以包含一种或多种本申请提供的化合物以外的其他脂质化合物。所述其他脂质化合物可以是，例如中性脂质、带电脂质、甾族化合物和聚合物缀合的脂质。“中性脂质”是指在所选pH值(例如生理pH值)下以不带电形式或中性两性离子形式存在的脂质化合物。“带电脂质”是指不受有用的生理范围内的pH值(例如pH约3至约9)的限制，以带正电或带负电的形式存在的脂质化合物。
在某些实施方式中，所述脂质组合物还可以进一步包含一种或多种溶剂，其能够与本申请提供的化合物或其盐、水合物或溶剂化物混合并形成均一的混合物。
所述脂质组合物中包含的溶剂可以包含有机溶剂或溶剂混合物，例如氯仿，二氯甲烷，二乙醚，环己烷，环戊烷，苯，甲苯，甲醇或其他脂族醇，例如乙醇，丙醇，异丙醇，丁醇，叔丁醇，异丁醇，戊醇和己醇。这些溶剂可以单独地，混合地和/或任选地与合适的缓冲剂一起作为脂质组合物中的溶剂。溶剂的选择通常可以考虑溶剂的极性，在脂质核酸混合物形成的后期除去溶剂的难易程度，和/或药学上可接受的性质。在某些实施方式中，所述溶剂是无毒的，或药学上可接受的。示例性的药学上可接受的溶剂包括低级醇(1-6个碳原子)，例如甲醇，乙醇，正丙醇，异丙醇和正丁醇。在某些实施方式中，可以使用适量的溶剂，以使核酸和脂质能够形成澄清的单相混合物。
本申请提供的脂质组合物可以用于递送核酸，或者制备用于核酸递送的试剂。在某些实施方式中，所述核酸包含DNA或RNA。在某些实施方式中，所述核酸可以包括，例如，编码DNA、非编码DNA、反义核酸、信使RNA(mRNA)、长非编码RNA(lncRNA)和小RNA(例如微RNA(miRNA)、小干扰RNA(siRNA)，Piwi-相互作用RNA(piRNA)，核仁小RNA(snoRNA)，tRNA来源小RNA(tsRNA))等。
在某些实施方式中，所述核酸为单链或双链的。单链的核酸例如，miRNA，mRNA，反义DNA、反义RNA等。双链的核酸例如，siRNA，双链DNA，双链RNA等。
在某些实施方式中，所述核酸具有茎环结构。茎环结构是指在单链核酸的两个部分分别存在反向互补的序列，当通过碱基配对时，这部分反向互补的序列形成双链，而在两个反向互补区的中间的非互补部分则突出形成环的结构。茎环结构也被称为发卡结构。
在某些实施方式中，所述核酸包括小核酸。小核酸是指长度较短的(例如小于200个核苷酸)核酸。小核酸可以是非编码的，例如小RNA(例如miRNA、siRNA、piRNA、snoRNA、tsRNA)等。可以是单链的，或者是双链的。在某些实施方式中，所述核酸为长度为14-32bp、16-28bp或18-24bp的小核酸。
在某些实施方式中，所述核酸是核酸药物。核酸药物可以有多种种类，例如反义核酸、siRNA、CpG寡脱氧核苷酸、核酸适配体、编码目标蛋白的mRNA或DNA、或miRNA等。示例性的核酸药物包括，AEG35156、aganirsen、AP 12009、Apatorsen、ATL1103、AVT-02UE、Bevasiranib Sodium、BMN 044、BMN 053、CpG 7909、Custirsen、Drisapersen、Eteplirsen、Fomivirsen、Pegaptanib，Mipomersen，Eteplirsen，Defibrotide，Nusinersen，Patisiran，Tegsedi和Fovista。
在某些实施方式中，所述核酸可用于治疗疾病。
在某些实施方案中，所述核酸用于治疗癌症、炎症、纤维化疾病、自身免疫疾病或自身炎性疾病、细菌感染、行为性和精神性病症、血液疾病、染色体疾病、先天性和遗传性疫病、结缔组织疾病、消化性疾病、耳鼻喉疾病、内分泌疾病、环境性疾病、眼部疾病、女性生殖性疾病、真菌感染、心脏病、遗传性癌症综合征、免疫系统疾病、肾脏和泌尿性疾病、肺部疾病、男性生殖新疾病、代谢性病症、口部疾病、肌肉骨骼疾病、骨髓增生异常性综合征、新生儿筛查、营养性疾病、寄生虫疾病、罕见癌症、罕见疾病、皮肤疾病和病毒感染。
在某些实施方案中，所述核酸用于治疗肝细胞癌、角膜新生血管形成、复发性或难治性间变性星形细胞瘤(WHO III级)或继发性胶质母细胞瘤(WHO IV级)、晚期鳞状细胞肺癌、肢端肥大症、银屑病、杜氏肌营养不良症、晚期非小细胞肺癌、转移性去势抗性前列腺癌、巨细胞病毒性视网膜炎，HIV感染、乙型肝炎、丙型肝炎、高脂蛋白症、全膝关节置换术、II型糖尿病、家族性淀粉样多发性神经病(FAP)、湿性黄斑变性(例如新血管性年龄相关性黄斑变性、中央凹下新血管性年龄相关性黄斑变性、渗出性年龄相关性黄斑变性)、高胆固醇血症、克罗恩病、广泛性肝纤维化、婴儿型脊髓性肌萎缩症、黑色素瘤、新生冠状动脉病变、轻度过敏性哮喘、慢性淋巴细胞性白血病、和高甘油三酯血症、造血干细胞移植后伴肾或肺功能障碍的肝小细胞闭塞症、伴遗传性转甲状腺素蛋白淀粉样病变。
在某些实施方式中，脂质组合物可以与核酸形成脂质核酸混合物。所述核酸可以通过所述脂质核酸混合物进行递送。“脂质核酸混合物”在本申请中是指，递送核酸的基于脂质的混合物，例如脂质体。脂质体的例子包括，例如包封了核酸的脂质颗粒或脂质囊泡。脂质核酸混合物可以通过适当的方法制得，例如包括混合法，加热法，逆向蒸发法等。
混合法包括将本申请提供的化合物或其盐、水合物或溶剂化物，与待递送的核酸进行混合的步骤。在某些实施方式中，所述混合可以是本申请提供的脂质组合物与待递送的核酸的直接混合(例如脂质组合物和核酸的干粉混合，再加入适当溶剂形成脂质包封核酸的脂质核酸混合物)。在某些实施方式中，所述混合可以是将溶于适当溶剂中的本申请所述的脂质组合物与核酸混合，或将溶于适当溶剂中的核酸与本申请所述的脂质组合物混合，或将溶于适当溶剂中的本申请所述的脂质组合物与溶于适当溶剂中的核酸混合。可用于本申请所述的脂质组合物的合适的溶剂的例子如本申请说明书之前所述。可用于核酸的合适的溶剂包括水(DEPC处理过的水、双蒸水)、缓冲液、生理盐水、或者葡萄糖溶液等。所述混合步骤可以以任何合适的步骤进行，例如可以将核酸(或其溶液)加入到脂质组合物(或其溶液)中，也可以是脂质组合物(或其溶液)加入到核酸(或其溶液)中。在某些实施方式中，所述混合还可以包括例如涡旋、超声等步骤，以帮助混合均匀。
在某些实施方式中，混合法包括将本申请所述脂质组合物的乙醇溶液添加到待递送的核酸的合适体积的水性缓冲液中，通过涡旋或超声混匀后孵育得到脂质核酸混合物。在某些实施方式中，混合法包括将本申请所述脂质化合物的乙醇溶液与待递送的核酸的合适体积的乙醇溶液合并，通过涡旋或超声混匀后孵育得到脂质核酸混合物后除去乙醇，并将所得脂质核酸混合物重悬于水性缓冲液中。
在某些实施方式中，核酸和脂质化合物可以以一定的比例进行混合。所述比例取决于需要递送的核酸及其量，以及为达到核酸包封的效果所需要使用的脂质化合物。所述比例可以是满足治疗需求的任何比例，只要能形成稳定的脂质核酸混合物，并且提供所需量的核酸即可。在某些实施方式中，核酸与脂质化合物的比例可以是，例如，0.1nmol：100μg至10nmol：100μg，0.2nmol：100μg至10nmol：100μg，0.3nmol：100μg至10nmol：100μg，0.4nmol：100μg至10nmol：100μg，0.5nmol：100μg至10nmol：100μg，1nmol：100μg至10nmol：100μg，2nmol：100μg至10nmol：100μg，3nmol：100μg至10nmol：100μg，4nmol：100μg至10nmol∶100μg，5nmol∶100μg至10nmol：100μg，6nmol∶100μg至10nmol，7nmol：100μg至10nmol，8nmol：100μg至10nmol，或9nmol：100μg至10nmol：100μg。在某些实施方式中，核酸与脂质化合物的比例可以为1nmol：100μg，2nmol：100μg，3nmol：100μg，4nmol：100μg，5nmol：100μg，6nmol：100μg，7nmol：100μg，8nmol：100μg，9nmol：100μg或10nmol：100μg。在某些实施方式中，核酸与脂质化合物的比例可以为10nmol：100μg。
所述混合法可以在任何适当的温度下进行，只要能形成能够递送核酸的脂质核酸混合物即可。在某些实施方式中，核酸和脂质化合物可以在适当的温度下进行混合，例如，但不限于，0℃至100℃，4℃至100℃，10℃至100℃，15℃至100℃，20℃至100℃，25℃至100℃，30℃至100℃，35℃至100℃，40℃至100℃，45℃至100℃，50℃至100℃，55℃至100℃，60℃至100℃，65℃至100℃，70℃至100℃，75℃至100℃，80℃至100℃，85℃至100℃，90℃至100℃，或95℃至100℃。在一些实施方式中，所述温度为0℃，4℃，10℃，20℃，30℃，40℃，50℃，55℃，60℃，65℃，70℃，75℃，80℃，85℃，90℃。在一些实施方式中，所述温度为90℃。
在某些实施方式中，所述脂质核酸混合物通过加热法制备。所述加热法包括将本申请提供的化合物或其盐、水合物或溶剂化物溶于适当溶剂中的溶液与待递送的核酸的水溶液混合得到混合溶液，并在适当的温度下加热所述混合溶液的步骤。在某些实施方式中，加热所述混合溶液的步骤在选自如下的温度下进行：25℃至100℃、30℃至100℃、40℃至100℃、50℃至100℃、60℃至100℃、70℃至100℃、80℃至100℃、90℃至100℃或95℃至100℃。在某些实施方式中，加热所述混合溶液的步骤在选自如下的温度下进行：约30℃、约35℃、约37℃、约40℃、约45℃、约50℃、约55℃、约60℃、约65℃、约70℃、约75℃，约80℃、约85℃、约90℃、约95℃和约100℃。在一些实施方式中，加热所述混合溶液的步骤在90℃下进行。
在某些实施方式中，所述加热法包括加热混合溶液达适当的时间。本领域技术人员可以根据所用的脂质化合物和核酸的性质以及所需的脂质核酸混合物，选择适当的加热时间。所述加热时间可为例如，约5分钟至约24小时，约5分钟至约20小时，约5分钟至约16小时，约10分钟至约20小时，约10分钟至约16小时，约15分钟至约24小时，约15分钟至约20小时，约30分钟至约24小时，约30分钟至约20小时，约40分钟至约16小时，约50分钟至约12小时，约1小时至约8小时，或约2小时至约4小时。在某些实施方式中，所述加热时间可为例如，约5分钟、约10分钟、约15分钟、约20分钟、约30分钟、约40分钟、约50分钟、约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约12小时、约16小时、约20小时或约24小时。在一些实施方案中，所述加热时间为约15分钟。
在某些实施方式中，所述加热法进一步包括冷却步骤。所述冷却可以在加热混合溶液的步骤之后在适当的温度下进行，只要不破坏形成的脂质核酸混合物即可。示例性的冷却温度包括，但不限于，25℃至-80℃，20℃至-80℃，15℃至-80℃，10℃至-80℃，4℃至-80℃，0℃至-80℃，-10℃至-80℃，-20℃至-80℃，-30℃至-80℃，-40℃至-80℃。在一些实施方案中，在加热混合溶液的步骤之后在室温下自然冷却所述混合溶液，所述室温例如为25℃或20℃。
在某些实施方式中，所述脂质核酸混合物通过逆向蒸发法制备。所述逆向蒸发法包括将核酸的水溶液加入到脂质化合物的溶于适当溶剂中的溶液，再通过超声、蒸发等方法除去溶剂。在某些实施方式中，所述逆向蒸发法进一步包括在去除溶剂之后进行水化，得到脂质核酸混合物。在一些实施方案中，所述水化包括将水或适当的培养基加入体系中，在一些实施方案中，适当的培养基例如为OPTI-MEM培养基。
在某些实施方式中，除去溶剂的步骤在适当的温度下进行，例如，约25℃至约70℃，30℃至约70℃、约30℃至约65℃，约40℃至约65℃，约40℃至约60℃、或约50℃至约60℃。在某些实施方式中，除去溶剂的步骤在约25℃、30℃、约35℃、约37℃、约40℃、约45℃、约50℃、约55℃、约60℃、约65℃或约70℃的温度下进行。在某些实施方式中，除去溶剂的步骤在约55℃的温度下进行。
在某些实施方式中，所述核酸递送是通过口服、吸入或注射的方式递送。在某些实施方式中，所述核酸递送是通过口服的方式。在某些实施方式中，所述试剂用于通过口服的方式递送所述核酸。在某些实施方式中，所述核酸递送是体内消化道递送。
在某些实施方式中，所述脂质核酸混合物被个体口服后，能够将所述核酸递送至个体的感兴趣的靶器官或靶组织。
在某些实施方式中，所述脂质核酸混合物被个体口服后，能够将所述核酸递送至个体的心脏组织。某些实施方式中，所述脂质核酸混合物含有选自下组的脂质化合物：脂质501、502、519、520、522、526、527、528、529、530、537、542、543、572、573、574、578、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、607、608、609、613、614、616、620、621、623、624、625、626、627、628、635和636。
在某些实施方式中，所述脂质核酸混合物被个体口服后，能够将所述核酸递送至个体的肝组织。某些实施方式中，所述脂质核酸混合物含有选自下组的脂质化合物：脂质501、503、505、520、521、526、527、528、529、530、537、542、543、572、573、574、578、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、606、607、609、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、635和636。
在某些实施方式中，所述脂质核酸混合物被个体口服后，能够将所述核酸递送至个体的脾组织。某些实施方式中，所述脂质核酸混合物含有选自下组的脂质化合物：脂质501、502、503、520、522、525、526、527、528、529、530、537、542、543、572、573、574、578、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、608、610、611、613、614、615、616、617、619、620、622、623、625、627、628、635和636。
在某些实施方式中，所述脂质核酸混合物被个体口服后，能够将所述核酸递送至个体的肺组织。某些实施方式中，所述脂质核酸混合物含有选自下组的脂质化合物：脂质501、503、519、520、522、525、526、527、528、529、530、537、542、543、578、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、608、609、610、613、614、615、616、617、618、620、621、622、624、625、626、627、628、635和636。
在某些实施方式中，所述脂质核酸混合物被个体口服后，能够将所述核酸递送至个体的肾组织。某些实施方式中，所述脂质核酸混合物含有选自下组的脂质化合物：脂质501、502、503、519、521、525、526、527、528、529、530、537、542、543、572、574、578、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、607、609、610、613、617、619、620、623、625、626、627、628、635和636。
在某些实施方式中，所述脂质核酸混合物被个体口服后，能够将所述核酸递送至个体的胃组织。某些实施方式中，所述脂质核酸混合物含有选自下组的脂质化合物：脂质501、502、503、505、519、522、525、526、527、528、529、530、537、542、543、572、573、574、578、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、607、608、609、610、611、612、613、615、617、619、620、621、622、623、624、625、627、628、635和636。
在某些实施方式中，所述脂质核酸混合物被个体口服后，能够将所述核酸递送至个体的肠组织。某些实施方式中，所述脂质核酸混合物含有选自下组的脂质化合物：脂质501、502、503、522、525、526、527、528、529、530、537、542、543、572、573、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、635和636。
在某些实施方式中，所述脂质核酸混合物被个体口服后，能够将所述核酸递送至个体的脑组织。某些实施方式中，所述脂质核酸混合物含有选自下组的脂质化合物：脂质501、502、503、505、520、526、527、528、529、530、537、542、543、572、573、574、578、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、609、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、635和636。
在某些实施方式中，所述脂质核酸混合物被个体口服后，能够将所述核酸递送至个体的血液。某些实施方式中，所述脂质核酸混合物含有选自下组的脂质化合物：脂质501、502、503、505、521、522、526、527、528、529、530、537、542、543、572、573、574、578、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、613、614、615、616、617、619、621、622、623、625、626、627、628、635和636。
在某些实施方式中，所述脂质核酸混合物被个体口服后，能够将所述核酸递送至个体的股骨。某些实施方式中，所述脂质核酸混合物含有选自下组的脂质化合物：脂质526、527、528、529、530、537、542、543、572、573、574、578、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、635和636。
在某些实施方式中，所述脂质核酸混合物被个体口服后，所述核酸被递送至两个或多个组织。
在某些实施方式中，所述核酸递送包括体外细胞递送。“体外”在本申请中是指在多细胞的生物体以外，例如人体或动物体以外。体外细胞包括例如，体外细胞培养物、离体组织或细胞等。体外递送包括将核酸递送到体外的细胞内。例如，包括将所述脂质核酸混合物与体外细胞在允许核酸进入细胞的条件下接触。
药物组合物
在另一方面，本申请还提供了一种药物组合物，其包含脂质组合物以及核酸，其中所述脂质组合物包含一种或多种选自脂质501、502、503、505、519、520、521、522、525、526、527、528、529、530、537、542、543、572、573、574、578、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、635、和636组成的组的化合物，或其盐、水合物或溶剂化物。
本申请提供的药物组合物可以是固体或液体的形式，包括半固体、半液体、悬浮液和胶形式。固体形式例如，片剂或粉末形式。液体形式例如，口服溶液、口服糖浆、可注射液体、或气溶胶，所述气溶胶适用于，例如，吸入施用。
在某些实施方式中，所述药物组合物被配制成经口服、经吸入、经消化道、或经呼吸道施用。在某些实施方式中，所述药物组合物被配制成通过体内消化道递送的方式递送所述核酸。在某些实施方式中，所述药物组合物是口服药物组合物。当用于口服施用时，药物组合物优选为固体或液体形式。
作为用于口服施用的固体药物组合物，药物组合物可以配制成粉末、颗粒、压缩的片剂、丸剂、胶囊、咀嚼胶等形式。这类固体组合物通常还可以含有一种或多种惰性稀释剂或可食用载体(例如淀粉、乳糖或糊精)、以及一种或多种选自下组的辅料：粘合剂(例如羧甲基纤维素、乙基纤维素、微晶纤维素、黄蓍胶或明胶)、崩解剂(海藻酸、海藻酸钠、Primogel、玉米淀粉等)，润滑剂(例如硬脂酸镁或Sterotex)，助流剂(例如胶体二氧化硅)，甜味剂(例如蔗糖或糖精)，调味剂；以及着色剂。
作为用于口服施用的液体药物组合物，药物组合物可以配置成例如，酏剂、糖浆、溶液、乳液或悬浮液。当用于口服施用时，液体药物组合物含有一种或多种选自下组的辅料：甜味剂、防腐剂、染色/着色剂和增味剂。
本发明的药物组合物还可以配置成经呼吸道吸入施用。适当的吸入制剂可以包含可作为气溶胶施用的制剂。气溶胶可以以单相、双相系统或三相系统来递送。例如，气溶胶可以通过液化气和压缩气来递送，或者通过分散活性成分的适合的系统来递送。气溶胶的递送包括必要的容器、活化器、阀、子容器等，其在一起可以形成试剂盒。
在某些实施方式中，本申请的药物组合物还可以配置成通过胃肠外施用，例如注射施用。注射用液体组合物可以是溶液、悬浮液或注射粉针，可以包括表面活性剂、防腐剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、缓冲剂、稳定剂和等渗剂中的一种或多种。
在某些实施方式中，所述药物组合物还可以用于通过体外细胞递送。
在某些实施方式中，所述脂质组合物和所述核酸在所述药物组合物中至少部分地或全部以混合物的形式存在。在某些实施方式中，所述混合物是通过加热法、逆向蒸发法，或混合法制得的。
在另一方面，本申请还提供了上述药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗能用核酸预防和/或治疗的疾病，或者用于将核酸体内递送至有此需要的对象中。
本申请提供的药物组合物可以用于治疗可用核酸治疗的疾病。常见的疾病例如，但不限于，癌症、炎症、纤维化疾病、自身免疫疾病或自身炎性疾病、细菌感染、行为性和精神性病症、血液疾病、染色体疾病、先天性和遗传性疫病、结缔组织疾病、消化性疾病、耳鼻喉疾病、内分泌疾病、环境性疾病、眼部疾病、女性生殖性疾病、真菌感染、心脏病、遗传性癌症综合征、免疫系统疾病、肾脏和泌尿性疾病、肺部疾病、男性生殖新疾病、代谢性病症、口部疾病、肌肉骨骼疾病、骨髓增生异常性综合征、新生儿筛查、营养性疾病、寄生虫疾病、罕见癌症、罕见疾病、皮肤疾病和病毒感染。
癌症的例子包括但不限于，胃癌、肺癌、结直肠癌、肝癌、胰腺癌、宫颈癌、乳腺癌、白血病、多发性骨髓瘤。
炎症的例子包括但不限于，肺炎、心肌炎、急慢性胃炎、急慢性肠炎、急慢性肝炎、急慢性肾炎、皮炎、脑炎、淋巴炎、结膜炎、角膜炎、虹膜睫状体炎、中耳炎、过敏性鼻炎、哮喘、肺纤维化慢性阻塞性肺疾病、过敏性皮炎、镰状细胞病、多发性硬化、系统性红斑狼疮、狼疮性肾炎。
L知的核酸药物可以治疗多种疾病。已知核酸药物的适应症包括，例如，肝细胞癌、角膜新生血管形成、复发性或难治性间变性星形细胞瘤(WHO III级)或继发性胶质母细胞瘤(WHO IV级)、晚期鳞状细胞肺癌、肢端肥大症、银屑病、杜氏肌营养不良症、晚期非小细胞肺癌、转移性去势抗性前列腺癌、巨细胞病毒性视网膜炎，HIV感染、乙型肝炎、丙型肝炎、高脂蛋白症、全膝关节置换术、II型糖尿病、家族性淀粉样多发性神经病(FAP)、湿性黄斑变性(例如新血管性年龄相关性黄斑变性、中央凹下新血管性年龄相关性黄斑变性、渗出性年龄相关性黄斑变性)、高胆固醇血症、克罗恩病、广泛性肝纤维化、婴儿型脊髓性肌萎缩症、黑色素瘤、新生冠状动脉病变、轻度过敏性哮喘、慢性淋巴细胞性白血病、和高甘油三酯血症、造血干细胞移植后伴肾或肺功能障碍的肝小细胞闭塞症、伴遗传性转甲状腺素蛋白淀粉样病变。
试剂盒
在另一方面，本申请还提供了一种试剂盒，其包含：置于第一容器中的一种或多种化合物或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物，和置于第二容器中的核酸，其中所述一种或多种化合物选自由脂质501、502、503、505、519、520、521、522、525、526、527、528、529、530、537、542、543、572、573、574、578、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、635、和636组成的组。
在某些实施方式中，在所述试剂盒中，所述脂质组合物和所述核酸在使用前被至少部分地或全部地配制成脂质核酸混合物。在某些实施方式中，在所述试剂盒中，所述混合物是通过加热法、逆向蒸发法，或者混合法制得的。
在某些实施方式中，其中所述试剂盒被配制成口服药物组合物。
在某些实施方式中，其中所述试剂盒被配制成经口服、经吸入、经消化道、或经呼吸道施用。
在某些实施方式中，所述试剂盒被配制成通过体外细胞递送，或通过体内消化道递送的方式递送所述核酸。
在另一方面，本申请提供了试剂盒在制备药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗能用核酸预防和/或治疗的疾病，或者用于将核酸体内递送至有此需要的对象中。
递送核酸的方法
在另一方面，本申请提供了一种将核酸递送至靶细胞中的方法，包括向所述靶细胞施用本申请所述的药物组合物，或者本申请所述的试剂盒配制得到的脂质核酸混合物。
在另一方面，本申请提供了一种将核酸体内递送至有此需要的对象中的方法，包括向所述对象施用本申请所述的药物组合物，或者本申请所述的试剂盒配制得到的脂质核酸混合物。
在某些实施方式中，所述对象是人或动物，如哺乳动物。
在某些实施方式中，所述核酸被体内递送至所述对象的血液循环中或者靶组织/细胞中。
在某些实施方式中，所述方法包括通过口服、吸入或注射施用所述药物。
在某些实施方式中，所述方法包括经消化道、经呼吸道施用所述药物。
在某些实施方式中，所述方法包括经口服施用所述药物。
项目1：脂质组合物在制备用于核酸递送的试剂中的用途，所述脂质组合物包含一种或多种具有式(I)的化合物或其盐、水合物或溶剂化物：
A-L1-L3-L2-B (I)
其中：
L1为不存在、直链或支链C1-24烷基、直链或支链C2-24烯基、或者任选由氧基取代的芳基；
L2为不存在、任选由胺基取代的直链或支链C1-24烷基、或者直链或支链C2-24烯基；
L3为
Figure BDA0003182377030000471
任选由氧基取代的环烷基、或者任选由氧基取代的杂环基；
A为氢、羟基、-COOH、任选由羟基取代的直链或支链C1-24烷基、直链或支链C2-24烯基、任选由一个或多个选自羟基、胺基的取代基取代的直链或支链C2-24杂烯基、或者任选由氧基取代的杂环基；
B为羟基、-CHO、-COOH、-C(O)R’、-OC(O)R’、直链或支链C1-24烷基、直链或支链C2-24烯基；
R为氢、直链或支链C1-24烷基；
R’为直链或支链C1-24烷基。
项目2：如项目1所述的用途，其中所述脂质组合物用于通过口服、吸入或注射的方式递送所述核酸。
项目3：如项目2所述的用途，其中所述脂质组合物用于通过口服的方式递送所述核酸。
项目4：如上述项目中任一项所述的用途，其中所述递送包括体外细胞递送，或体内消化道递送。
项目5：如上述项目中任一项所述的用途，其中所述脂质组合物与核酸混合制备成脂质核酸混合物，可选地，所述的脂质核酸混合物通过加热法、逆向蒸发法，或者混合法制得。
项目6：如项目5所述的用途，其中所述加热法包括将所述脂质组合物与所述核酸混合获得混合物，并在选自25℃至100℃、30℃至100℃、40℃至100℃、50℃至100℃、60℃至100℃、70℃至100℃、80℃至100℃、90℃至100℃，和95℃至100℃的温度下加热所述混合物。
项目7：如项目6所述的用途，其中在选自30℃、35℃、37℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃，80℃、85℃、90℃、95℃和100℃的温度下加热所述混合物。
项目8：如项目6或7任一项所述的用途，其中将所述脂质组合物与所述核酸混合包括将所述脂质组合物的有机溶剂溶液加入到所述核酸的水溶液中。
项目9：如项目 如项目5所述的用途，其中所述逆向蒸发法包括将所述核酸的水溶液与脂质化合物的有机溶剂溶液混合以得到混合溶液，然后去除所述混合溶液中的有机溶剂。
项目10：如项目9所述的用途，其中在选自约25℃至约70℃，30℃至约70℃、约30℃至约65℃，约40℃至约65℃，约40℃至约60℃、或约50℃至约60℃的温度下去除所述混合溶液中的有机溶剂。
项目11：如项目9所述的用途，其中将所述核酸的水溶液与脂质化合物的有机溶剂溶液混合包括将所述核酸的水溶液加入到所述脂质化合物的有机溶剂溶液中。
项目12：如上述项目中任一项所述的用途，L1为不存在。
项目13：如上述项目中任一项所述的用途，L1为直链或支链C1-24烷基。
项目14：如上述项目中任一项所述的用途，L1为直链或支链C2-24烯基。
项目15：如上述项目中任一项所述的用途，L1为任选由氧基取代的芳基。
项目16：如上述项目中任一项所述的用途，L2为不存在。
项目17：如上述项目中任一项所述的用途，L2为任选由胺基取代的直链或支链C1-24烷基。
项目18：如上述项目中任一项所述的用途，L2为直链或支链C2-24烯基。
项目19：如上述项目中任一项所述的用途，L3为
Figure BDA0003182377030000491
项目20：如上述项目中任一项所述的用途，L3为
Figure BDA0003182377030000492
项目21：如上述项目中任一项所述的用途，L3为
Figure BDA0003182377030000493
项目22：如上述项目中任一项所述的用途，L3为
Figure BDA0003182377030000494
项目23：如上述项目中任一项所述的用途，L3为
Figure BDA0003182377030000495
项目24：如上述项目中任一项所述的用途，L3为任选由氧基取代的环烷基。
项目25：如上述项目中任一项所述的用途，L3为任选由氧基取代的杂环基。
项目26：如上述项目中任一项所述的用途，A为氢。
项目27：如上述项目中任一项所述的用途，A为羟基。
项目28：如上述项目中任一项所述的用途，A为-COOH。
项目29：如上述项目中任一项所述的用途，A为任选由羟基取代的直链或支链C1-24烷基。
项目30：如上述项目中任一项所述的用途，A为直链或支链C2-24烯基。
项目31：如上述项目中任一项所述的用途，A为任选由一个或多个选自羟基、胺基的取代基取代的直链或支链C2-24杂烯基。
项目32：如上述项目中任一项所述的用途，A为任选由氧基取代的杂环基。
项目33：如上述项目中任一项所述的用途，B为羟基。
项目34：如上述项目中任一项所述的用途，B为-CHO。
项目35：如上述项目中任一项所述的用途，B为-COOH。
项目36：如上述项目中任一项所述的用途，B为-C(O)R’。
项目37：如上述项目中任一项所述的用途，B为-OC(O)R’。
项目38：如上述项目中任一项所述的用途，B为直链或支链C1-24烷基。
项目39：如上述项目中任一项所述的用途，B为直链或支链C2-24烯基。
项目40：如上述项目中任一项所述的用途，R为氢。
项目41：如上述项目中任一项所述的用途，R为直链或支链C1-24烷基。
项目42：如上述项目中任一项所述的用途，R’为直链或支链C1-24烷基。
项目43：如上述项目中任一项所述的用途，其中A为具有1-5个双键的直链C2-24烯基。
项目44：如上述项目中任一项所述的用途，其中B为具有1-5个双键的直链C2-24烯基。
项目45：如项目43或44所述的用途，其中所述双键在所述直链C2-24烯基中的位置选自如下：C1-C2位置、C2-C3位置、C3-C4位置、C4-C5位置、C5-C6位置、C6-C7位置、C7-C8位置、C8-C9位置、C9-C10位置、C10-C11位置、C12-C13位置、C13-C14、C14-C15、C15-C16、C16-C17位置或其组合。
项目46：脂质组合物在制备用于核酸递送的试剂中的用途，所述脂质组合物包含一种或多种选自下组的化合物或其盐、水合物或溶剂化物：
Figure BDA0003182377030000511
Figure BDA0003182377030000521
Figure BDA0003182377030000531
项目47：如上述项目中任一项所述的用途，其中所述盐是药学上可接受的盐。
项目48：如上述项目中任一项所述的用途，其中所述化合物来自于中药提取物。
项目49：如项目48所述的用途，其中所述中药提取物通过中药的煎煮制备提取获得。
项目50：如项目49所述的用途，其中所述中药提取物通过如下方式获得：将中药在水中浸泡，然后依次进行强火煎煮和弱火煎煮，将煎煮后的中药药液浓缩，然后依次添加氯仿-甲醇、氯仿和水搅拌处理，取氯仿层提取获得。
项目51：如上述项目中任一项所述的用途，其中所述核酸包含DNA或RNA，任选地，所述DNA选自编码DNA和非编码DNA，所述RNA选自反义核酸、mRNA、1ncRNA和小RNA。
项目52：如项目51所述的用途，其中所述核酸包含长度为14-32bp、16-28bp或18-24bp的小核酸。
项目53：如上述项目中任一项所述的用途，其中所述核酸为单链或双链的。
项目54：如上述项目中任一项所述的用途，其中所述核酸具有茎环结构。
项目55：如上述项目中任一项所述的用途，其中所述核酸用于治疗疾病。
项目56：如项目55所述的用途，其中所述核酸用于治疗癌症、炎症、纤维化疾病、自身免疫疾病或自身炎性疾病、细菌感染、行为性和精神性病症、血液疾病、染色体疾病、先天性和遗传性疫病、结缔组织疾病、消化性疾病、耳鼻喉疾病、内分泌疾病、环境性疾病、眼部疾病、女性生殖性疾病、真菌感染、心脏病、遗传性癌症综合征、免疫系统疾病、肾脏和泌尿性疾病、肺部疾病、男性生殖新疾病、代谢性病症、口部疾病、肌肉骨骼疾病、骨髓增生异常性综合征、新生儿筛查、营养性疾病、寄生虫疾病、罕见癌症、罕见疾病、皮肤疾病和病毒感染。
项目57：如项目55所述的用途，其中所述核酸用于治疗肝细胞癌、角膜新生血管形成、复发性或难治性间变性星形细胞瘤(WHO III级)或继发性胶质母细胞瘤(WHO IV级)、晚期鳞状细胞肺癌、肢端肥大症、银屑病、杜氏肌营养不良症、晚期非小细胞肺癌、转移性去势抗性前列腺癌、巨细胞病毒性视网膜炎，HIV感染、乙型肝炎、丙型肝炎、高脂蛋白症、全膝关节置换术、II型糖尿病、家族性淀粉样多发性神经病(FAP)、湿性黄斑变性(例如新血管性年龄相关性黄斑变性、中央凹下新血管性年龄相关性黄斑变性、渗出性年龄相关性黄斑变性)、高胆固醇血症、克罗恩病、广泛性肝纤维化、婴儿型脊髓性肌萎缩症、黑色素瘤、新生冠状动脉病变、轻度过敏性哮喘、慢性淋巴细胞性白血病、和高甘油三酯血症、造血干细胞移植后伴肾或肺功能障碍的肝小细胞闭塞症、伴遗传性转甲状腺素蛋白淀粉样病变。
项目58：一种药物组合物，其包含脂质组合物以及核酸，其中所述脂质组合物包含一种或多种具有式(I)的化合物或其盐、水合物或溶剂化物：
A-L1-L3-L2-B (I)
其中：
L1为不存在、直链或支链C1-24烷基、直链或支链C2-24烯基、或者任选由氧基取代的芳基；
L2为不存在、任选由胺基取代的直链或支链C1-24烷基、或者直链或支链C2-24烯基；
L3为
Figure BDA0003182377030000551
任选由氧基取代的环烷基、或者任选由氧基取代的杂环基；
A为氢、羟基、-COOH、任选由羟基取代的直链或支链C1-24烷基、直链或支链C2-24烯基、任选由一个或多个选自羟基、胺基的取代基取代的直链或支链C2-24杂烯基、或者任选由氧基取代的杂环基；
B为羟基、-CHO、-COOH、-C(O)R’、-OC(O)R’、直链或支链C1-24烷基、直链或支链C2-24烯基；
R为氢、直链或支链C1-24烷基；
R’为直链或支链C1-24烷基。
项目59：一种药物组合物，其包含脂质组合物和核酸，其中所述脂质组合物包含一种或多种选自脂质501、502、503、505、519、520、521、522、525、526、527、528、529、530、537、542、543、572、573、574、578、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、635和636，或其盐、水合物或溶剂化物组成的组的化合物。
项目60：如项目58或59所述的药物组合物，其中所述药物组合物被配制成经口服、经吸入、经消化道、或经呼吸道施用。
项目61：如项目58或59所述的药物组合物，其中所述药物组合物用于通过体外细胞递送，或通过体内消化道递送的方式递送所述核酸。
项目62：如项目58或59所述的药物组合物，其中所述药物组合物是口服药物组合物。
项目63：如项目58-62中任一项所述的药物组合物，其中所述脂质组合物和所述核酸至少部分地或全部以脂质核酸混合物的形式存在。
项目64：如项目63所述的药物组合物，其中所述脂质核酸混合物是通过加热法、逆向蒸发法，或混合法制得的。
项目65：如项目64所述的药物组合物，其中所述加热法包括将所述脂质组合物与所述核酸混合获得混合物，并在选自25℃至100℃，50℃至100℃，80℃至100℃，或95℃至100℃的温度下加热所述混合物。
项目66：如项目65所述的药物组合物，其中在选自37℃，60℃，80℃或100℃的温度下加热所述混合物。
项目67：如项目64-66中任一项所述的药物组合物，其中将所述脂质组合物与所述核酸混合包括将所述脂质组合物的有机溶剂溶液加入到所述核酸的水溶液中。
项目68：如项目64所述的药物组合物，其中所述逆向蒸发法包括将所述核酸的水溶液与脂质化合物的有机溶剂溶液混合以得到混合溶液，然后在25℃至70℃，30℃至65℃，或40℃至60℃的温度下去除所述混合溶液中的有机溶剂。
项目69：如项目68所述的药物组合物，其中在55℃的温度下去除所述混合溶液中的有机溶剂。
项目70：如项目64和68-69中任一项所述的药物组合物，其中所述逆向蒸发法包括将所述核酸的水溶液加入到所述脂质组合物的有机溶剂溶液中。
项目71：如项目58-70中任一项所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗能用核酸预防和/或治疗的疾病，或者用于将核酸体内递送至有此需要的对象中。
项目72：一种试剂盒，其包含：
置于第一容器中的一种或多种具有式(I)的化合物或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物：
A-L1-L3-L2-B (I)
以及置于第二容器中的核酸；
其中：
L1为不存在、直链或支链C1-24烷基、直链或支链C2-24烯基、或者任选由氧基取代的芳基；
L2为不存在、任选由胺基取代的直链或支链C1-24烷基、或者直链或支链C2-24烯基；
L3为
Figure BDA0003182377030000571
任选由氧基取代的环烷基、或者任选由氧基取代的杂环基；
A为氢、羟基、-COOH、任选由羟基取代的直链或支链C1-24烷基、直链或支链C2-24烯基、任选由一个或多个选自羟基、胺基的取代基取代的直链或支链C2-24杂烯基、或者任选由氧基取代的杂环基；
B为羟基、-CHO、-COOH、-C(O)R’、-OC(O)R’、直链或支链C1-24烷基、直链或支链C2-24烯基；
R为氢、直链或支链C1-24烷基；
R’为直链或支链C1-24烷基。
项目73：一种试剂盒，其包含：
置于第一容器中的一种或多种化合物或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物，和置于第二容器中的核酸，其中所述一种或多种化合物选自由脂质501、502、503、505、519、520、521、522、525、526、527、528、529、530、537、542、543、572、573、574、578、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、635、和636组成的组。
项目74：如项目72或73所述的试剂盒，其中所述脂质组合物和所述核酸在使用前被至少部分地或全部地配制成脂质核酸混合物。
项目75：如项目74所述的试剂盒，其中所述脂质核酸混合物是通过加热法、逆向蒸发法，或者混合法制得的。
项目76：如项目75所述的试剂盒，其中所述加热法在选自如下的温度下进行：25℃至100℃，50℃至100℃，80℃至100℃，或95℃至100℃的温度下进行。
项目77：如项目76所述的试剂盒，其中所述加热法在选自如下的温度下进行：37℃，60℃，80℃或100℃的温度下进行。
项目78：如项目75-77任一项所述的试剂盒，其中所述加热法包括将所述脂质组合物的有机溶剂溶液加到所述核酸的水溶液中。
项目79：如项目75所述的试剂盒，所述逆向蒸发法在选自如下的温度下进行：25℃至70℃，30℃至65℃，或40℃至60℃的温度下进行。
项目80：如项目79所述的试剂盒，所述逆向蒸发法在55℃的温度下进行。
项目81：如项目75和79-80任一所述的试剂盒，其中所述逆向蒸发法包括将核酸的水溶液加入到所述脂质组合物的有机溶剂溶液中。
项目82：如项目72-81任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒被配制成口服药物组合物。
项目83：如项目72-81中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒被配制成经口服、经吸入、经消化道、或经呼吸道施用。
项目84：如项目72-81中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒被配制成通过体外细胞递送，或通过体内消化道递送的方式递送所述核酸。
项目85：如项目72-84中任一项所述的试剂盒在制备药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗能用核酸预防和/或治疗的疾病，或者用于将核酸体内递送至有此需要的对象中。
项目86：一种将核酸递送至靶细胞中的方法，包括向所述靶细胞施用如权利要求58-70中任一项所述的药物组合物，或者由权利要求72-84中任一项所述的试剂盒配制得到的脂质核酸混合物。
项目87：一种将核酸体内递送至有此需要的对象中的方法，包括向所述对象施用如权利要求58-70中任一项所述的药物组合物，或者由权利要求72-84中任一项所述的试剂盒配制得到的脂质核酸混合物。
项目88：如项目87所述的方法，其中所述对象是人或动物，如哺乳动物。
项目89：如项目87或77所述的方法，其中所述核酸被体内递送至所述对象的血液循环中或者靶组织/细胞中。
项目90：如项目87-89中任一项所述的方法，其中包括通过口服、吸入或注射施用所述药物。
项目91：如项目87-90中任一项所述的方法，其中包括经消化道、经呼吸道施用所述药物。
项目92：如项目91所述的方法，其中包括经口服施用所述药物。
通过本申请所提供的以上技术方案，能够显著改进核酸的高效靶向递送，克服了现有技术中核酸脂质体存在包封率低、安全性差、稳定性差、制备工艺复杂、产品不均一、难以重现、以及靶向性有待进一步提高的缺陷。
本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以被任何提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1：中药来源脂质的提取、鉴定和合成
1.1中药的煎煮制备
1)取100g中药饮片(购自北京同仁堂药店)，加入1000mL ddH2O浸泡30min。
2)中药煎煮锅强火煎煮15min，弱火煎煮20min。
3)煎煮后的中药药液400mL加入旋转蒸发仪，60℃，60rpm，30min浓缩至100mL。
1.2中药来源脂质的提取
1)向160mL根据以上1.1项所得中药汤汁(旋转蒸发仪浓缩)中加入氯仿-甲醇混合液(氯仿∶甲醇＝1∶2，v/v)600mL，使得氯仿∶甲醇∶水＝1∶2∶0.8，搅拌混匀10-15min。
2)向锥形瓶中加入200mL氯仿，搅拌混匀10min。
3)向锥形瓶中加入200ml ddH2O，使得氯仿：甲醇∶水＝2∶2∶1.8，搅拌混匀10min。
4)除去上层液体和中间层的不溶性物质，取下层的氯仿层，-40℃冻存。
1.3中药来源的脂质鉴定
利用HPLC-MS/MS鉴定中药来源的脂质成分。
仪器条件
1)色谱条件：
仪器：Ultimate 3000；色谱柱：Kinetex C18(100×2.1mm，1.9μm)；柱温：45℃；流动相：A：乙腈：水(V/V，60：40)，溶液含10mmol/L甲酸铵，流动相B：乙腈：异丙醇(10：90，V/V)，溶液含10mmol/L甲酸铵和0.1％甲酸。流速：0.4mL/min；进样量：4μL。
2)质谱参数：
a)正模式：加热器温度300℃，鞘气流速，45arb，辅助气流速，15arb，吹扫气流速，1arb，喷嘴电压，3.0KV，毛细管温度，350℃，S-Lens RF Level，30％。扫描范围：200-1500。
b)负模式：加热器温度300℃，鞘气流速，45arb，辅助气流速，15arb，吹扫气流速，1arb，喷嘴电压，2.5KV，毛细管温度，350℃，S-Lens RF Level，60％。扫描范围：200-1500。
1.4脂质的获取
在以下实施例中所用的59个FA类脂质化合物分别为自Aladdin、Santa Cruz、MedChemExpress、Cayman、Macklin、Sigma-Aldrich购买所得。
实施例2：脂质核酸混合物的制备(加热法)：
脂质氯仿溶液浓度为10mg/ml(储存液)，并按照脂质化合物编号进行分组。
将小RNA 10nmol(如表2所示)用400μlDEPC处理过的水于玻璃管中溶解，加入10μl相应的脂质储存液溶液，使得体系中脂质的质量为100μg，充分混匀，90℃水浴加热15min后自然冷却，得脂质-小RNA的脂质核酸混合物。
表2.小RNA序列信息(订购于通用生物系统有限公司)
Figure BDA0003182377030000611
Figure BDA0003182377030000621
实施例3：脂质核酸混合物的体内递送研究
1.实验动物：
实验所用C57BL/6雄性小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，约6周龄，20-24g。饲养于中国医学科学院基础医学研究所动物中心SPF级动物房。小鼠灌胃前禁食12h。
2.脂质-小RNA混合物制备：
按照实施例2的方法制备脂质核酸混合物。将制备好的脂质核酸混合物以每只小鼠100μg脂质：10nmol单链3’甲基化小RNAPGY-sRNA-26的剂量进行口服给药。
3.相对进入量检测：
3.1实验分组：
1)空白组：小鼠(n＝4)灌胃500μl生理盐水，该组作为空白对照；
2)自由摄取组：小鼠(n＝4)直接灌胃小RNA PGY-sRNA-26溶液(10nmol/只，500μl)，该组作为阴性对照组；
3)脂质处理组：将步骤2中制备的500μl脂质核酸混合物以灌胃方式给药小鼠(n＝4)。
3.2组织取样提取RNA：
每组小鼠灌胃12h后，眼球取血500μl，加入1.5ml Trizol Reagent LS(购自Invitrogen)充分混匀裂解。组织样品加入3ml Trizol Reagent LS，匀浆使其充分裂解，组织取样：心/肝/脾/肺/肾/胃/肠/脑/血/股骨。取1ml血液或组织裂解液按如下步骤提取RNA：
4℃，12,000rpm离心5min，弃沉淀，将Trizol转移到新的离心管中；
按200μL氯仿/mL Trizol加入氯仿，充分振荡，混匀后室温放置5min；
4℃，12,000rpm，离心15min；
吸取上层水相，至另一离心管中，按0.4mL异丙醇/mL Trizol加入异丙醇混匀，低温放置10-20min；
4℃，12,000rpm，离心15min，弃上清，RNA沉于管底；
加入1mL 75％乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀；
4℃，12,000rpm，离心15min，弃上清，加入1mL 75％乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀；
4℃，12,000rpm，离心15min，弃上清，室温晾干，用50μL RNase-free的H2O溶解RNA样品，测OD值定量RNA浓度。
3.3将sRNA逆转录为cDNA：
通过逆转录试剂盒(High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits，Applied Biosystems，cat.no.4368813)，用茎环法(stem-loop法)(参见例如Real-timequantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR，Nucleic Acids Res.2005 Nov27；33(20)：e179，通过引用并入本文)将sRNA逆转录为cDNA，逆转录体系如下：模板RNA(200ng/μL)10μL，10X RT缓冲液2.0μL，25X dNTP Mix(100mM)0.8μL，U6 RT stem-loop引物(10μM)2.0μL，PGY-sRNA-26RT stem-loop引物(10μM)2.0μL，MultiScribeTM逆转录酶(50U/μL)1.0μL，RNA酶抑制剂(40U/μL)1.0μL，无核酸酶H2O1.2μL，瞬时离心后，放入PCR仪反应，反应条件如下：(1)25℃，10min；(2)37℃，120min；(3)85℃，5min；(4)4℃，终止反应。反应结束后加入20μL无RNA酶ddH2O，补足终体积至40μL。该逆转录过程中使用的茎环法引物由(北京天一辉远生物科技有限公司)合成(U6RT引物，因为RT-qPCR反应对小RNA的定量只能是相对定量，所以以U6作为标准的参考基因，计算其相对表达量)：
U6 RT stem-loop引物：
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAAAAATATG(SEQ ID No.5)；
PGY-sRNA-26RT stem-loop引物：
GTCGTATCCAGTGCACGCTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACGCTT(SEQ ID No.2)。
3.4定量PCR扩增反应：
qPCR反应体系总体积10μl，包括：5μL2×SYBR Green Master Mix，0.5μl正向引物(10μM)，0.5μl反向引物(10μM)，1 μl逆转录得到的cDNA，3μl无RNA酶ddH2O。使用LightCycler 480荧光定量PCR仪，PCR反应条件是：95℃，持续5min预变性，开始进入PCR扩增循环：(1)95℃，10s；(2)55℃，10s；(3)72℃，20s；总共进行40个循环；最后40℃持续10s降温。扩增反应正向引物和反向引物均由北京天一辉远公司设计和合成(U6 F引物：GCGCGTCGTGAAGCGTTC(SEQ ID No.6)，U6 R引物：GTGCAGGGTCCGAGGT(SEQ ID No.7)；PGY-sRNA-26正向引物：TCGCGCTCCGGAATGATTGGG(SEQ ID No.3)，反向引物miR all rev：GTGCACGCTCCGAGGT(SEQ ID No.4))。
3.5利用2-ΔCt法计算相对表达量。
4.实验结果以图的形式示出。
图1-59分别显示了空白组、自由摄取组和测试的不同脂质递送单链小RNAPGY-sRNA-26进入不同靶组织的结果。
结论：
脂质501、502、519、520、522、526、527、528、529、530、537、542、543、572、573、574、578、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、607、608、609、613、614、616、620、621、623、624、625、626、627、628、635和636可以有效口服递送sRNA单链核酸进入小鼠心脏组织。
脂质501、503、505、520、521、526、527、528、529、530、537、542、543、572、573、574、578、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、606、607、609、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、635和636可以有效口服递送sRNA单链核酸进入小鼠肝组织。
脂质501、502、503、520、522、525、526、527、528、529、530、537、542、543、572、573、574、578、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、608、610、611、613、614、615、616、617、619、620、622、623、625、627、628、635和636可以有效口服递送sRNA单链核酸进入小鼠脾组织。
脂质501、503、519、520、522、525、526、527、528、529、530、537、542、543、578、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、608、609、610、613、614、615、616、617、618、620、621、622、624、625、626、627、628、635和636可以有效口服递送sRNA单链核酸进入小鼠肺组织。
脂质501、502、503、519、521、525、526、527、528、529、530、537、542、543、572、574、578、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、607、609、610、613、617、619、620、623、625、626、627、628、635和636可以有效口服递送sRNA单链核酸进入小鼠肾组织。
脂质501、502、503、505、519、522、525、526、527、528、529、530、537、542、543、572、573、574、578、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、607、608、609、610、611、612、613、615、617、619、620、621、622、623、624、625、627、628、635和636可以有效口服递送sRNA单链核酸进入小鼠胃组织。
脂质501、502、503、522、525、526、527、528、529、530、537、542、543、572、573、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、635和636可以有效口服递送sRNA单链核酸进入小鼠肠组织。
脂质501、502、503、505、520、526、527、528、529、530、537、542、543、572、573、574、578、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、609、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、635和636可以有效口服递送sRNA单链核酸进入小鼠脑组织。
脂质501、502、503、505、521、522、526、527、528、529、530、537、542、543、572、573、574、578、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、613、614、615、616、617、619、621、622、623、625、626、627、628、635和636可以有效口服递送sRNA单链核酸进入小鼠血液。
脂质526、527、528、529、530、537、542、543、572、573、574、578、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、635和636可以有效口服递送sRNA单链核酸进入小鼠股骨。
对于实验中的9个组织以及血液来看，不同脂质单体递送核酸进入效果最佳的为肝、胃两个组织，有效进入肝组织、胃组织的脂质最多。
脂质501、526、527、528、529、530、537、542、543、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、613、625、627、628、635和636的递送效果最佳，其均能有效递送核酸进入其试验的每个组织以及血液，有望作为一种较为广谱的核酸递送载体。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.脂质组合物在制备用于核酸递送的试剂中的用途，所述脂质组合物包含一种或多种具有式(I)的化合物或其盐、水合物或溶剂化物：
A-L1-L3-L2-B (I)
其中：
L1为不存在、直链或支链C1-24烷基、直链或支链C2-24烯基、或者任选由氧基取代的芳基；
L2为不存在、任选由胺基取代的直链或支链C1-24烷基、或者直链或支链C2-24烯基；
L3为
Figure FDA0003182377020000011
任选由氧基取代的环烷基、或者任选由氧基取代的杂环基；
A为氢、羟基、-COOH、任选由羟基取代的直链或支链C1-24烷基、直链或支链C2-24烯基、任选由一个或多个选自羟基、胺基的取代基取代的直链或支链C2-24杂烯基、或者任选由氧基取代的杂环基；
B为羟基、-CHO、-COOH、-C(O)R’、-OC(O)R’、直链或支链C1-24烷基、直链或支链C2-24烯基；
R为氢、直链或支链C1-24烷基；
R’为直链或支链C1-24烷基。
2.脂质组合物在制备用于核酸递送的试剂中的用途，所述脂质组合物包含一种或多种选自下组的化合物或其盐、水合物或溶剂化物：
Figure FDA0003182377020000012
Figure FDA0003182377020000021
Figure FDA0003182377020000031
。
3.根据前述权利要求中任一项所述的用途，其中所述化合物来自于中药提取物。
4.根据前述权利要求任一项所述的用途，其中所述核酸包含DNA或RNA，任选地，所述DNA选自编码DNA和非编码DNA，所述RNA选自反义核酸、mRNA、lncRNA和小RNA。
5.根据前述权利要求任一项所述的用途，其中所述核酸用于治疗疾病。
6.根据权利要求5所述的用途，其中所述核酸用于治疗癌症、炎症、纤维化疾病、自身免疫疾病或自身炎性疾病、细菌感染、行为性和精神性病症、血液疾病、染色体疾病、先天性和遗传性疫病、结缔组织疾病、消化性疾病、耳鼻喉疾病、内分泌疾病、环境性疾病、眼部疾病、女性生殖性疾病、真菌感染、心脏病、遗传性癌症综合征、免疫系统疾病、肾脏和泌尿性疾病、肺部疾病、男性生殖新疾病、代谢性病症、口部疾病、肌肉骨骼疾病、骨髓增生异常性综合征、新生儿筛查、营养性疾病、寄生虫疾病、罕见癌症、罕见疾病、皮肤疾病和病毒感染。
7.一种药物组合物，其包含脂质组合物以及核酸，其中所述脂质组合物包含一种或多种具有式(I)的化合物或其盐、水合物或溶剂化物：
A-L1-L3-L2-B (I)
其中：
L1为不存在、直链或支链C1-24烷基、直链或支链C2-24烯基、或者任选由氧基取代的芳基；
L2为不存在、任选由胺基取代的直链或支链C1-24烷基、或者直链或支链C2-24烯基；
L3为
Figure FDA0003182377020000041
任选由氧基取代的环烷基、或者任选由氧基取代的杂环基；
A为氢、羟基、-COOH、任选由羟基取代的直链或支链C1-24烷基、直链或支链C2-24烯基、任选由一个或多个选自羟基、胺基的取代基取代的直链或支链C2-24杂烯基、或者任选由氧基取代的杂环基；
B为羟基、-CHO、-COOH、-C(O)R’、-OC(O)R’、直链或支链C1-24烷基、直链或支链C2-24烯基；
R为氢、直链或支链C1-24烷基；
R’为直链或支链C1-24烷基。
8.一种药物组合物，其包含脂质组合物和核酸，其中所述脂质组合物包含一种或多种选自脂质501、502、503、505、519、520、521、522、525、526、527、528、529、530、537、542、543、572、573、574、578、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、635和636，或其盐、水合物或溶剂化物组成的组的化合物。
9.一种试剂盒，其包含：
置于第一容器中的一种或多种具有式(I)的化合物或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物：
A-L1-L3-L2-B (I)
以及置于第二容器中的核酸；
其中：
L1为不存在、直链或支链C1-24烷基、直链或支链C2-24烯基、或者任选由氧基取代的芳基；
L2为不存在、任选由胺基取代的直链或支链C1-24烷基、或者直链或支链C2-24烯基；
L3为
Figure FDA0003182377020000051
任选由氧基取代的环烷基、或者任选由氧基取代的杂环基；
A为氢、羟基、-COOH、任选由羟基取代的直链或支链C1-24烷基、直链或支链C2-24烯基、任选由一个或多个选自羟基、胺基的取代基取代的直链或支链C2-24杂烯基、或者任选由氧基取代的杂环基；
B为羟基、-CHO、-COOH、-C(O)R’、-OC(O)R’、直链或支链C1-24烷基、直链或支链C2-24烯基；
R为氢、直链或支链C1-24烷基；
R’为直链或支链C1-24烷基。
10.一种试剂盒，其包含：
置于第一容器中的一种或多种化合物或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物，和置于第二容器中的核酸，其中所述一种或多种化合物选自由脂质501、502、503、505、519、520、521、522、525、526、527、528、529、530、537、542、543、572、573、574、578、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、635、和636组成的组。
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