CN115669680A - 一种碳量子点及其在防治植物病害中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种碳量子点及其在防治植物病害中的应用，所述碳量子点为以芒萁叶、蓖麻叶、蓖麻果、榴莲皮、楝叶中的至少一种为原料制备获得；所述植物病害为由以下病原菌中的至少一种侵染植物引起的病害：尖孢镰刀菌、水稻黄单胞杆菌水稻致病变种、青枯假单胞菌、芸薹生链格孢菌、菊欧氏杆菌、稻梨孢菌、野油菜黄单胞杆菌野油菜致病变种、韧皮部杆菌属细菌、荔枝霜疫霉菌、辣椒疫霉菌、致病疫霉。本发明经过大量的研究发现，利用水热法从芒萁叶、蓖麻叶、蓖麻果、榴莲皮和楝叶中制备的碳量子点能有效抑制多种植物致病菌，可用于防治因所述致病菌侵染导致的植物病害，作用效果持久。本发明为植物病害的防治提供了新的路径，应用前景广阔。
Description
技术领域
本发明属于农业病害防治技术领域，具体涉及一种碳量子点及其在防治植物病害中的应用。
背景技术
植物病害是指植物在病原物的侵害下生理机能失调、组织结构受到破坏的过程。大面积农作物和林木病害爆发，对国家经济和人民生产造成重大损失。植物病害分为侵染性和非侵染性两大类。由病原物引起的侵染性病害可根据病原物类型分为真菌性、细菌性、病毒性和线虫病害等。病原物侵染植物过程一般分为3个时期：侵入期、潜伏期和发病期。植物病害防治的原则是：消灭病原物或抑制其发生与蔓延；提高寄主植物的抗病能力；控制或改造环境条件，使之有利于寄主植物而不利于病原物，抑制病害的发生和发展。防治方法有植物检疫、抗病育种、农业防治、化学防治、物理和机械防治和生物防治等。
例如，香蕉(Musa spp.)作为世界热带和亚热带地区主要经济作物之一，其在非洲和中南美洲等地已成为继水稻、小麦和玉米之后的第四大重要作物。近几十年来，由尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f.sp.cubense，FOC)侵染所引起的香蕉枯萎病严重影响了世界香蕉产业的发展，并造成了巨大经济亏损。目前，对于香蕉枯萎病的防治主要集中于生物防治、生物有机肥、化学防治、无病组培苗和抗病株的培育等多个方面。其中，无病组培苗生产和抗病品种培育被认为是防控香蕉枯萎病最有效的措施。近数十年来，我国已培育出众多香蕉新品种，但随着种植年份的增加感病率逐年上升，亟需寻找有效的防治技术控制其发生。
碳量子点(carbon dots,CDs)由于其直径小、生物相容性高、毒性低等优点，加之碳元素作为生命体最重要的组成元素之一，其更容易被生物体所吸收利用。随着碳量子点的研究增多，各种不同功能化碳量子点得到发展，例如碳量子点具有有效的抗菌活性等。但目前碳量子点在防治植物病害中的应用尚缺乏。
发明内容
基于此，本发明的目的在于提供一种碳量子点及其在防治植物病害中的应用；所述碳量子点来源于特定植物原料，对多种植物致病菌具有抑制作用。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案。
碳量子点在防治植物病害中的应用，所述碳量子点为以芒萁叶、蓖麻叶、蓖麻果、榴莲皮、楝叶中的至少一种为原料制备获得的碳量子点；所述植物病害为由以下病原菌中的至少一种侵染植物引起的病害：尖孢镰刀菌、水稻黄单胞杆菌水稻致病变种、青枯假单胞菌、芸薹生链格孢菌、菊欧氏杆菌、稻梨孢菌、野油菜黄单胞杆菌野油菜致病变种、韧皮部杆菌属细菌、荔枝霜疫霉菌、辣椒疫霉菌、致病疫霉。
本发明还提供了碳量子点在制备防治植物病害的生物制剂中的应用，所述碳量子点为以芒萁叶、蓖麻叶、蓖麻果、榴莲皮、楝叶中的至少一种为原料制备获得的碳量子点；所述植物病害为由以下病原菌中的至少一种侵染植物引起的病害：尖孢镰刀菌、水稻黄单胞杆菌水稻致病变种、青枯假单胞菌、芸薹生链格孢菌、菊欧氏杆菌、稻梨孢菌、野油菜黄单胞杆菌野油菜致病变种、韧皮部杆菌属细菌、荔枝霜疫霉菌、辣椒疫霉菌、致病疫霉。
在一些实施例中，所述植物病害包括尖孢镰刀菌引起的香蕉枯萎病、水稻黄单胞杆菌水稻致病变种引起的水稻白叶枯病、青枯假单胞菌引起的番茄青枯病、芸薹生链格孢菌引起的花椰菜黑斑病、菊欧氏杆菌引起的唐菖蒲菊欧氏杆菌叶斑病、稻梨孢菌引起的水稻稻瘟病、野油菜黄单胞杆菌野油菜致病变种引起的甘蓝黑腐病、韧皮部杆菌属细菌引起的柑橘黄龙病、荔枝霜疫霉菌引起的荔枝霜疫霉病、辣椒疫霉菌引起的辣椒晚疫病和致病疫霉引起的马铃薯晚疫病中的至少一种。
在一些实施例中，所述碳量子点的制备方法为水热法。
在一些实施例中，所述碳量子点的制备方法包括以下步骤：将原料烘干，粉碎，加入水，混合均匀后于150～250℃放置8～14h，离心，取上清液，过滤，透析，冷冻干燥，得到所述碳量子点。
在一些优选的实施例中，所述碳量子点的制备方法包括以下步骤：将原料烘干，粉碎，加入水，混合均匀后于150～200℃放置8～12h，离心，取上清液，过滤，透析，冷冻干燥，得到所述碳量子点。
本发明还提供了一种防治植物病害的生物制剂，所述生物制剂包含以芒萁叶、蓖麻叶、蓖麻果、榴莲皮、楝叶中的至少一种为原料制备获得的碳量子点。
在一些优选的实施例中，所述碳量子点的制备方法为水热法；优选地，所述碳量子点的制备方法包括以下步骤：将原料烘干，粉碎，加入水，混合均匀后于150～250℃放置8～14h，离心，取上清液，过滤，透析，冷冻干燥，得到所述碳量子点。
在一些优选的实施例中，所述生物制剂中所述碳量子点的浓度为250-1000mg/L。
本发明还提供了一种防治植物病害的方法，所述方法包括：使用如上所述的生物制剂喷洒植物或浇灌植物根系。
在一些优选的实施例中，所述生物制剂的喷洒部位为植物叶片和/或茎部。
本发明经过大量的研究发现，利用水热法从芒萁叶、蓖麻叶、蓖麻果、榴莲皮和楝叶中制备获得的碳量子点能有效抑制尖孢镰刀菌、水稻黄单胞杆菌水稻致病变种、青枯假单胞菌、芸薹生链格孢菌、菊欧氏杆菌、稻梨孢菌、野油菜黄单胞杆菌野油菜致病变种、韧皮部杆菌属细菌、荔枝霜疫霉菌、辣椒疫霉菌和致病疫霉，可以用于防治因上述病原菌侵染导致的植物病害，包括香蕉枯萎病、番茄青枯病、荔枝霜疫霉病、辣椒晚疫病和马铃薯晚疫病等，作用效果较为持久。本发明为植物病害的防治提供了新的路径，且绿色环保，应用前景广阔。
附图说明
图1为透射电镜扫描图；其中，A：CDs-蓖麻叶；B：CDs-芒萁叶。
图2为荧光光谱图；其中，a：CDs-蓖麻叶在EX＝462处的激发荧光光谱图；b：CDs-芒萁叶在EX＝446处的激发荧光光谱图。
图3为紫外扫描光谱图；其中，a：CDs-蓖麻叶；b：CDs-芒萁叶。
图4为CK、CDs-芒萁叶、CDs-楝叶和CDs-蓖麻叶作用下4号生理小种第4天的菌落形态图。
图5为CK、CDs-芒萁叶、CDs-楝叶和CDs-蓖麻叶作用下4号生理小种第9天的菌落形态图。
图6为CK、CDs-芒萁叶、CDs-楝叶作用下4号生理小种第9天的菌丝及孢子形态图。
图7为CK、CDs-芒萁叶、CDs-楝叶和CDs-榴莲皮作用后4号生理小种回接第4天的菌落形态图。
图8为CK、CDs-芒萁叶、CDs-楝叶作用后4号生理小种回接第9天的菌丝和孢子形态图。
具体实施方式
本发明下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。
本发明的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或模块，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤。
在本发明中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
下面结合具体实施例进行说明。
实施例1
本实施例提供了分别以芒萁叶、蓖麻叶、蓖麻果、榴莲皮、楝叶作为原料，通过以下方法制备获得的碳量子点：将原料放置于60℃烘箱中，烘干，经粉碎机打成细粉并过80目筛子，按1:45(材料：去离子水)，经磁力搅拌器混匀30min装于100ml反应釜中，180℃保温11小时，自然冷却至室温，4000r/min离心10mim，取上清液，经0.22um微孔滤膜过滤，1000分子质量透析袋透析48h得到碳量子点原液，60℃冷冻干燥，得到固体粉末。
结构表征：以从蓖麻叶(CDs-蓖麻叶)和芒萁叶(CDs-芒萁叶)中制备获得的碳量子点为例，对制备获得的碳量子点的结构进行表征。
1.透射电镜扫描
采用日本JEOL 200kV场发射透射电子显微镜JEM-2100F对制备的碳量子点进行扫描。如图1所示，CDs-蓖麻叶(图1A)和CDs-芒萁叶(图1B)大部分粒径分布均一且在10nm以下，少量复合物出现团聚现象，粒径进一步明显变大。
2.荧光光谱分析
采用日立荧光分光光度计F-4600对制备的碳量子点进行激发波长的测定。结果如图2所示，从CDs-蓖麻叶在EX＝462处的激发荧光光谱图(图2a)和CDs-芒萁叶在EX＝446处的激发荧光光谱图(图2b)可以看出2种碳点较为相似，激发波长较为接近，最大荧光强度在1100～1300之间且相差很小。
3.紫外光谱分析
采用Shanghai Metash instruments Co.,Ltd UV-6100紫外光度计对制备的碳量子点进行全波段扫描，结果如图3所示，其中，图2a为CDs-蓖麻叶；图2b为CDs-芒萁叶。
实施例2
实施例1制备获得的碳量子点对香蕉枯萎病菌尖孢镰刀菌古巴专化型Foc 4(以下简称4号生理小种)的抑制作用。
1.供试菌株与培养基
供试菌：香蕉枯萎病菌-4号生理小种
培养基：PDA培养基(土豆200g、葡萄糖20g、琼脂18g、蒸馏水1000mL)
2.抑菌实验
(1)碳点原液浓度：取10ml碳量子点原液，60℃冷冻干燥得到固体粉末，称取重量计算原液浓度。
(2)菌液制备：将香蕉枯萎病菌接种于PDA液体培养基中，28℃，180rpm培养2天，按菌液和50％浓度甘油1：1保存于2ml冻存管中。
(3)接菌：将不同碳量子点按原液浓度配置成500mg/L碳点PDA培养基，使用不添加碳点的PDA培养基作为对照组，各组培养基高压蒸汽灭菌后倒平板，待凝固后每个平板接种1ul菌液。
(4)测定指标：第3天使用游标卡尺测定菌落大小，第4天拍照记录菌落形态，第9天菌落拍照并测定菌丝宽度和孢子大小，利用以下公式计算抑菌率：抑菌率＝[菌落直径(对照)-菌落直径(碳点)]/菌落直径(对照)*100％，每组5个重复。
(5)回接实验：经过碳量子点初处理后，刮取少量菌丝，接种于新鲜无碳量子点PDA培养基。
(6)回接指标测定：第9天菌落形态观测、孢子和菌丝观察。
3.数据处理
采用image-pro plus测定菌丝宽度和孢子大小，SPSS 26进行单因素显著性分析并用Qrigin2021制图。
4.实验结果
(1)菌落大小和抑菌率
与对照组(CK)相比，CDs-芒萁叶、CDs-楝叶和CDs-蓖麻叶作用下香蕉枯萎病菌第4天菌落形态如图4所示，第9天菌落形态如图5所示；CDs-芒萁叶、CDs-楝叶、CDs-蓖麻叶和CDs-蓖麻果作用下第3天菌落大小和抑菌率结果如表1所示：
表1菌落大小和抑菌率实验结果
注：不同字母表示不同处理间有显著差异。
图4、图5和表1的结果说明，CDs-蓖麻叶对香蕉枯萎病4号小种菌落大小抑制效果明显，达到65.92％，CDs-芒萁叶、CDs-楝叶、CDs-蓖麻叶、CDs-蓖麻果和CDs-榴莲皮均能抑制香蕉枯萎病4号小种气生菌丝的生长，其中CDs-芒萁叶、CDs-榴莲皮对气生菌丝的抑制尤为显著，近乎完全抑制其气生菌丝的生长。
(2)碳量子点对香蕉4号小种孢子和菌丝的影响
CDs-芒萁叶、CDs-楝叶组菌丝及孢子第9天形态图如图6所示，菌丝宽度及孢子大小测定分别如表2和表3所示。由图6、表2和表3的结果可知，CDs-芒萁叶、CDs-楝叶、CDs-蓖麻果和CDs-榴莲皮对香蕉枯萎病4号小种抑制效果较好且近乎完全抑制气生菌丝的生长，菌丝宽度分别增加19.73％、71.38％和80.59％，孢子面积分别减少84.82％、63.42％和56.60％。
表2菌丝宽度
注：不同字母表示不同处理间有显著差异。
表3孢子面积
注：不同字母表示不同处理间有显著差异。
(3)回接菌落形态
图7为回接菌落第4天的菌落形态图，图8所示为回接菌落第9天菌丝和孢子形态图。由结果可知，经过碳量子点处理后，回接的菌落形态与对照组有较为明显的差异，说明碳量子点对其造成了较为持久的损伤，其中CDs-芒萁叶组、CDs-楝叶组菌丝和孢子观察结果与回接之前所测一致，说明CDs-芒萁叶能够长时间抑制香蕉枯萎病4号小种的孢子生长、CDs-楝叶明显减少香蕉枯萎病4号小种孢子的产生。
实施例3
实施例1制备获得的碳量子点对侵染植物的其他细菌性或真菌性病原菌的抑制作用。
1.供试菌：水稻黄单胞杆菌水稻致病变种、青枯假单胞菌、芸薹生链格孢菌、菊欧氏杆菌、稻梨孢菌、野油菜黄单胞杆菌野油菜致病变种、韧皮部杆菌属细菌、荔枝霜疫霉菌、辣椒疫霉菌、致病疫霉。
2.抑菌实验：
真菌：将CDs-芒萁叶、CDs-楝叶、CDs-蓖麻叶、CDs-蓖麻果和CDs-榴莲皮按照表4中的不同浓度加入PDA培养基中，使用不添加碳量子点的PDA培养基作为对照组，各组培养基高压蒸汽灭菌后倒平板，待凝固后每个平板接种1ul上述供试菌液。培养4天后，检测菌落大小，计算抑菌率，具体方法同实施例2。
细菌：
(1)将CDs-芒萁叶、CDs-楝叶、CDs-蓖麻叶、CDs-蓖麻果和CDs-榴莲皮按照表4中的不同浓度加入NA液体培养基中，使用不添加碳量子点的NA液体培养基作为对照组，高压蒸汽灭菌后，接种等量过夜培养、离心、PBS重新悬浮、在酶标仪下OD600＝0.1的细菌悬浮液，适宜温度下，培养16小时并测定其600nm下的吸光度，从而计算其抑菌率。
(2)柑橘黄龙病：将用碳量子点处理(清水为对照)过的带有黄龙病(韧皮部杆菌属细菌引起)的接穗切接到健康的枳砧上。120天后采集叶片(用药前也采集接穗叶片)，并提取中脉DNA。利用引物HLBas/HLBr和探针HLBp对提取的DNA进行实时荧光定量PCR检测，从而获取样品的Ct值，计算出柑橘叶中含有的病菌拷贝数。根据以下公式计算防效：防治效果评价病菌减退率(％)＝(处理前带菌数-处理后带菌数)/处理前带菌数×100。相对防效(％)＝(药剂组病菌减退率-对照组病菌减退率)/(1-对照组病菌减退率)×100。
3.实验结果
具体抑菌效果或相对防效如表4所示：
表4抑菌效果
由上表可知，CDs-芒萁叶、CDs-楝叶、CDs-蓖麻叶、CDs-蓖麻果和CDs-榴莲皮对水稻黄单胞杆菌水稻致病变种(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)、青枯假单胞菌(Pseudomonas solanacearum)、芸薹生链格孢菌(Alternaria brassicicola)、菊欧氏杆菌(Erwinia chrysanthemi)、稻梨孢菌(Pyricularia oryzae)、野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestris pv.campestris)、韧皮部杆菌属细菌(CandidatusLiberobacter spp.)、荔枝霜疫霉菌(Peronophythora litchii)、辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)和致病疫霉(Phytophthora infestans)均具有较好的抑制效果，可用于防治因上述病原菌侵染导致的植物病害。
综上所述，本发明利用水热法从芒萁叶、蓖麻叶、蓖麻果、榴莲皮和楝叶中制备获得的碳量子点对多种植物致病菌均具有良好的抑制作用，可用于植物病害的防治，且绿色环保，应用前景广阔。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对以上实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.碳量子点在防治植物病害中的应用，其特征在于，所述碳量子点为以芒萁叶、蓖麻叶、蓖麻果、榴莲皮、楝叶中的至少一种为原料制备获得的碳量子点；所述植物病害为由以下病原菌中的至少一种侵染植物引起的病害：尖孢镰刀菌、水稻黄单胞杆菌水稻致病变种、青枯假单胞菌、芸薹生链格孢菌、菊欧氏杆菌、稻梨孢菌、野油菜黄单胞杆菌野油菜致病变种、韧皮部杆菌属细菌、荔枝霜疫霉菌、辣椒疫霉菌、致病疫霉。
2.碳量子点在制备防治植物病害的生物制剂中的应用，其特征在于，所述碳量子点为以芒萁叶、蓖麻叶、蓖麻果、榴莲皮、楝叶中的至少一种为原料制备获得的碳量子点；所述植物病害为由以下病原菌中的至少一种侵染植物引起的病害：尖孢镰刀菌、水稻黄单胞杆菌水稻致病变种、青枯假单胞菌、芸薹生链格孢菌、菊欧氏杆菌、稻梨孢菌、野油菜黄单胞杆菌野油菜致病变种、韧皮部杆菌属细菌、荔枝霜疫霉菌、辣椒疫霉菌、致病疫霉。
3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述植物病害包括尖孢镰刀菌引起的香蕉枯萎病、水稻黄单胞杆菌水稻致病变种引起的水稻白叶枯病、青枯假单胞菌引起的番茄青枯病、芸薹生链格孢菌引起的花椰菜黑斑病、菊欧氏杆菌引起的唐菖蒲菊欧氏杆菌叶斑病、稻梨孢菌引起的水稻稻瘟病、野油菜黄单胞杆菌野油菜致病变种引起的甘蓝黑腐病、韧皮部杆菌属细菌引起的柑橘黄龙病、荔枝霜疫霉菌引起的荔枝霜疫霉病、辣椒疫霉菌引起的辣椒晚疫病和致病疫霉引起的马铃薯晚疫病中的至少一种。
4.如权利要求1～3任一项所述的应用，其特征在于，所述碳量子点的制备方法为水热法。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述碳量子点的制备方法包括以下步骤：将原料烘干，粉碎，加入水，混合均匀后于150～250℃放置8～14h，离心，取上清液，过滤，透析，冷冻干燥，得到所述碳量子点。
6.一种防治植物病害的生物制剂，其特征在于，所述生物制剂包含以芒萁叶、蓖麻叶、蓖麻果、榴莲皮、楝叶中的至少一种为原料制备获得的碳量子点。
7.如权利要求6所述的生物制剂，其特征在于，所述碳量子点的制备方法为水热法；优选地，所述碳量子点的制备方法包括以下步骤：将原料烘干，粉碎，加入水，混合均匀后于150～250℃放置8～14h，离心，取上清液，过滤，透析，冷冻干燥，得到所述碳量子点。
8.如权利要求6所述的生物制剂，其特征在于，所述生物制剂中所述碳量子点的浓度为250～1000mg/L。
9.一种防治植物病害的方法，其特征在于，所述方法包括：使用权利要求6～8任一项所述的生物制剂喷洒植物或浇灌植物根系。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述生物制剂的喷洒部位为植物叶片和/或茎部。
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