CN115667298A - 自主凸起结构域肽 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及分离的抗体片段，特别是分离的牛超长CDR‑H3的凸起结构域或其结合目标抗原的部分，以及包含其的制剂。本公开还涉及分离的抗体片段和制剂在疗法中的用途。本公开还延伸至制备所述分离的抗体片段的方法。

Description

自主凸起结构域肽
技术领域
本公开涉及分离的抗体片段，特别是分离的牛超长CDR-H3的凸起结构域或其结合目标抗原的部分，以及包含其的制剂。本公开还涉及分离的抗体片段和制剂在疗法中的用途。本公开还延伸至制备所述分离的抗体片段的方法。
技术背景
抗体的高特异性和亲和力使其成为理想的诊断剂和治疗剂。标准全长单克隆抗体具有150kDa的尺寸。重组抗体技术领域中的进展已经产生抗体片段，诸如Fv、Fab、Fab’和F(ab’)2片段。与全免疫球蛋白分子相比，这些较小的分子保留全抗体的抗原结合活性，且亦可呈现改变的生物分布、组织渗透以及药物动力学特性。实际上，证明抗体片段为通用治疗剂。迄今为止，已报道的最小的天然存在的自主功能性抗体片段为衍生自骆驼的VHH片段(Hamers-Casterman,C.等人，Naturally occurring antibodies devoid of lightchains.Nature 363,446-448(1993))和来自鲨鱼的可变新抗原受体(Variable Newantigen Receptor，VNAR)片段(Greenberg,A.S.等人，A new antigen receptor genefamily that undergoes rearrangement and extensive somatic diversification insharks.Nature 374,168-173(1995))，产生一些12-15kDa的重链可变区片段。
尽管此类片段似乎呈现优于全免疫球蛋白的多种优势，但其也受血清清除率增加所困扰，因为其缺少赋予体内长寿命的Fc结构域。另外，重组生产方法和系统的可用性对抗体生产有限制，且可存在技术挑战性，例如在DNA工程改造、在细胞中的产率等方面。使抗体片段进一步缩小可允许其在无重组抗体表达的情况下产生。最小片段可适合于化学合成，且完全去除对DNA或细胞的需求。
因此，需要提供新的治疗剂，包括新抗体衍生的治疗剂，其具有适用于疗法的改进的特性，尤其具有改进的药物动力学特性(例如生物分布、生物可利用度、细胞和组织渗透、清除率)和/或改进的生物功能(例如特异性、结合亲和力、中和、细胞毒性)和/或不依赖于细胞或细胞机制通过化学合成制造的能力。
还需要鉴别产生高度多样性和特异性抗体衍生的治疗剂的新方法。
一些牛抗体已表征为长度为多至69个残基的异常长的CDR-H3(故称“牛超长CDR-H3”)，其参与抗体谱的高多样性。牛超长CDR-H3已表征为包含“茎结构域”和“凸起结构域”的十分异常的三维结构，例如，由Stanfield等人(Stanfield,R.L.,Wilson,I.A.&Smider,V.V.Conservation and diversity in the ultralong third heavy-chaincomplementarity-determining region of bovine antibodies.Sci Immunol 1,(2016)(在下文中以“Stanfield等人(见上文)”表示)所表征的。例如，WO2013/106485描述包含超长CDR-H3的人源化抗体，特别是其中异源多肽插入至超长CDR-H3的凸起结构域中或替换其至少一部分。至今，牛超长CDR-H3仅在与全抗体结构的额外的结构域相缔合时，尤其在整合为Fab片段的一部分时表征，如上文提及的Stanfield等人中所述。
发明内容
本发明人首次表明，牛抗体凸起结构域能够在不存在超长CDR-H3茎区、相邻CDR或Fab基础结构的情况下自主地以高亲和力结合抗原。
具体地，本发明提供牛超长CDR-H3的分离的凸起结构域及其部分，其出人意料地保留功能性且能够除全长牛抗体骨架外(即自行表达时)结合其目标抗原。
本发明提供改进的抗体片段，尤其是牛抗体片段，其具有对其目标抗原的高特异性，并且具有改进的特性，尤其适用于疗法的药物动力学特性(例如生物分布、生物利用度、细胞和组织渗透、清除率)和/或生物特性(例如特异性、结合亲和力、中和、细胞毒性)。
有利地，如本文所公开的抗体片段有效地桥接骆驼衍生的VHH抗体结构域与化学大环化合物之间的分子量空隙，可能可用于治疗效用。另外，借助于其低分子量，本发明提供可由化学合成制造的抗体片段而对细胞机制无要求。因此，本发明还提供编码根据本发明的抗体片段的肽，所述肽不是从牛分离而是以合成方式产生的。
另外，本发明提供新抗体格式，其可基于可靶向性的抗原、疾病和病症的多样性适用于多种应用。有利地，新抗体格式可引起发现目标抗原上的新表位、以及与其相关联的新生物途径和新作用机制。
因此，在一个方面中，提供一种分离的抗体片段，其中该片段为牛超长CDR-H3的凸起结构域或其结合目标抗原的部分。
在一个实施方案中，分离的抗体片段为牛超长CDR-H3的凸起结构域。在一个实施方案中，分离的抗体片段包含至少两个、或至少四个、或至少六个、或至少八个、或至少十个半胱氨酸残基。在一个实施方案中，分离的抗体片段包含至少一个、或至少两个、或至少三个、或至少四个、或至少五个二硫键。在一个实施方案中，分离的抗体片段在其N末端包含(Z1)X1C X2基序，其中：
a.Z1存在或不存在，且当Z1存在时，Z1表示1个氨基酸或2、3、4或5个独立选择的氨基酸；以及
b.X1为任意氨基酸残基，优选地选自由以下组成的列表：丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、组氨酸、赖氨酸、缬氨酸、精氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和天冬氨酸；以及
c.C为半胱氨酸；以及
d.X2为选自由以下组成的列表的氨基酸：脯氨酸、精氨酸、组氨酸、赖氨酸、甘氨酸和丝氨酸。
在一个实施方案中，分离的抗体片段包含(AB)n和/或(BA)n基序，其中A为任意氨基酸残基，B为选自由以下组成的组的芳族氨基酸：酪氨酸(Y)、苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)和组氨酸(H)，并且其中n为1、2、3或4。
在一个实施方案中，分离的抗体片段的长度为5个氨基酸或更多、长度为10个氨基酸或更多、长度为15个氨基酸或更多、长度为20个氨基酸或更多、长度为25个氨基酸或更多、长度为30个氨基酸或更多、长度为35个氨基酸或更多、长度为40个氨基酸或更多、长度为45个氨基酸或更多，且长度为至多55个氨基酸。在一个实施方案中，分离的抗体片段的长度为5至55个、或15至50个、或20至45个、或25至40个氨基酸。
在一个实施方案中，分离的抗体片段包含作为天然存在的序列的变体的序列。
在一个实施方案中，根据本发明的分离的抗体片段进一步包含在两个氨基酸之间的桥接部分。在一个实施方案中，桥接部分包含选自由以下组成的组的特征：二硫键、酰胺键(内酰胺)、硫醚键、芳环、不饱和脂族烃链、饱和脂族烃链和三唑环。
在一个实施方案中，分离的抗体片段完全为牛的。在一个实施方案中，分离的抗体片段为嵌合的。在一个实施方案中，分离的抗体片段为合成的。
在一个实施方案中，分离的抗体片段结合至补体的组分C5，即目标抗原为C5。在一个实施方案中，分离的牛抗体片段具有选自由以下组成的列表的序列：SEQ ID NO:157至SEQ ID NO:310、SEQ ID NO:313、SEQ ID NO:315、SEQ ID NO:317、SEQ ID NO:318、SEQ IDNO:320、SEQ ID NO:322、SEQ ID NO:324、SEQ ID NO:326至SEQ ID NO:331、SEQ ID NO:334、SEQ ID NO:336、SEQ ID NO:339、SEQ ID NO:341至SEQ ID NO:350、SEQ ID NO:352和SEQ ID NO:572至SEQ ID NO:609，或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％相似性或同一性的任一序列。
在一个实施方案中，分离的抗体片段结合人血清白蛋白，即目标抗原为人血清白蛋白。在一个实施方案中，分离的抗体片段具有序列SEQ ID NO:510。
在一个实施方案中，提供一种包含至少一个根据本发明的分离的抗体片段的多肽。在一个实施方案中，提供一种包含至少两个根据本发明的分离的抗体片段的多肽，其中所述抗体片段连接在一起，任选地通过接头连接在一起，例如，通过可裂解接头连接在一起。在一个实施方案中，至少两个分离的抗体片段结合相同的抗原。在另一实施方案中，至少两个分离的抗体片段结合不同的抗原。在一个实施方案中，多肽包含在两个氨基酸之间的至少一个桥接部分。
在一个实施方案中，根据本发明的分离的抗体片段或多肽融合至一个或多个效应分子，任选地通过接头融合，例如，通过可裂解接头融合。在一个实施方案中，效应分子为抗体。在一个实施方案中，效应分子为全IgG。在另一实施方案中，效应分子选自由以下组成的列表：Fab、VHH、VH、VL、scFv和dsscFv。在一个实施方案中，效应分子包含白蛋白结合结构域。在一个实施方案中，效应分子为白蛋白或包含白蛋白结合结构域的蛋白。在一个实施方案中，白蛋白结合结构域包含：SEQ ID NO:435作为CDR-H1，SEQ ID NO:436作为CDR-H2，SEQID NO:437作为CDR-H3，SEQ ID NO:430作为CDR-L1，SEQ ID NO:431作为CDR-L2以及SEQ IDNO:432作为CDR-L3；或选自SEQ ID NO:434和SEQ ID NO:444的重链可变结构域和选自SEQID NO:429和SEQ ID NO:443的轻链可变结构域。
在另一实施方案中，本发明还提供包含根据本发明的分离的抗体片段或多肽与一种或多种药学上可接受的赋形剂组合的药物组合物。
在另一实施方案中，本发明还提供根据本发明的分离的抗体片段或多肽以用于疗法。
在另一实施方案中，本发明还提供编码根据本发明的分离的抗体片段或多肽的多核苷酸。在另一实施方案中，本发明提供包含根据本发明的多核苷酸的载体。在另一实施方案中，本发明提供一种宿主细胞，其包含本发明的多核苷酸或载体。在另一实施方案中，本发明提供一种用于产生根据本发明的分离的抗体片段或多肽的方法，该方法包括从本发明的宿主细胞表达本发明的分离的抗体片段或多肽。
在另一方面中，本发明提供产生如本发明中所定义的分离的抗体片段或多肽的方法，该方法包括化学合成的步骤。在一个实施方案中，化学合成包括掺入具有放射性同位素的偶联剂的步骤。在一个实施方案中，放射性同位素是α发射放射性同位素，优选地是砹211。
本发明还提供发现治疗性抗体片段和由其衍生的多肽的新方法，该方法包括用目标抗原使牛免疫。
因此，在一个方面中，提供一种产生本发明的分离的抗体片段或多肽的方法，该方法包括：
a)用免疫原性组合物使牛免疫，以及
b)分离抗原特异性记忆B细胞，以及
c)对CDR-H3的cDNA或其部分进行测序，以及
d)表达或合成超长CDR-H3的凸起结构域或其部分，
其中免疫原性组合物包含目标抗原或其免疫原性部分、或编码其的DNA。
在一个实施方案中，该方法进一步包括例如针对与目标抗原的结合进行筛选的步骤，其中任选地，筛选步骤之前为将超长CDR-H3或超长CDR-H3的凸起结构域或其部分重新格式化为筛选格式的步骤。在一个实施方案中，将超长CDR-H3或超长CDR-H3的凸起结构域或其部分重新格式化为筛选格式的步骤包括将超长CDR-H3或超长CDR-H3的凸起结构域或其部分融合至载体，任选地通过接头融合至载体，例如，通过可裂解接头融合至载体。在一个实施方案中，载体为Fc多肽。在一个实施方案中，Fc多肽为scFc。
在另一方面中，提供一种包含至少一个本发明的分离的抗体片段的文库。在一个实施方案中，文库为合成文库。在一个实施方案中，文库为噬菌体文库。在一个实施方案中，噬菌体文库为天然文库(naive library)。在一个实施方案中，噬菌体文库为免疫文库。在一个实施方案中，文库是从牛制备的。
在另一方面中，本发明提供一种噬菌体展示文库，其包含多个重组噬菌体；所述多个重组噬菌体各自包含M13衍生的表达载体，其中M13衍生的表达载体包含编码本发明的分离的抗体片段的多核苷酸序列，任选地所述分离的抗体片段展示在超长CDR-H3的全长序列内。在一个实施方案中，任选地展示在超长CDR-H3的全长序列内的所述分离的抗体片段直接地或通过间隔体融合至编码M13噬菌体的pIII外壳蛋白的序列。
本发明还提供一种用于生成超长CDR-H3序列的噬菌体展示文库的方法，所述方法包括：
a)用免疫原性组合物使牛免疫，以及
b)自PBMC或次级淋巴器官分离总RNA，以及
c)扩增所述超长CDR-H3的cDNA序列，以及
d)将c)中获得的序列融合至噬菌粒载体内编码M13噬菌体的pIII蛋白的序列，以及
e)用步骤d)中获得的噬菌粒载体与辅助噬菌体共感染组合来转化宿主细菌，以及
f)培养步骤e)中获得的细菌，以及
g)自细菌的培养基回收噬菌体，
其中所述免疫原性组合物包含目标抗原或其免疫原性部分、或编码其的DNA。
在一个实施方案中，步骤c)包括：
a)使用在CDR-H3两侧、退火至VH的保守框架3和框架4的引物进行初级PCR，以扩增所有CDR-H3序列，以及
b)使用茎引物进行第二轮PCR，以从初级PCR特异性扩增超长序列。
在一个实施方案中，步骤a)所用的引物包含SEQ ID NO:446和SEQ ID NO:447或由其组成，和/或步骤b)所用的引物选自由SEQ ID NO:482至SEQ ID NO:494组成的组。
本发明还提供一种用于产生结合目标抗原的本发明的分离的抗体片段的方法，该方法包括：
a)生成超长CDR-H3序列的噬菌体展示文库；以及
b)针对目标抗原增富集噬菌体展示文库，以产生结合目标抗原的富集的噬菌体群；以及
c)对来自步骤b)获得的富集的噬菌体群的超长CDR-H3进行测序；以及
d)表达或合成步骤c)获得的超长CDR-H3衍生的分离的抗体片段。
本发明还提供一种用于产生结合目标抗原的本发明的分离的抗体片段的方法，该方法包括：
a)生成本发明的分离的抗体片段的噬菌体展示文库；以及
b)针对目标抗原富集噬菌体展示文库，以产生结合目标抗原的富集的噬菌体群；以及
c)对来自步骤b)获得的富集的噬菌体群的分离的抗体片段进行测序；以及
d)表达或合成步骤c)获得的分离的抗体片段。
应理解，利用牛免疫谱的多样性的能力至化学合成输出物的能力以新颖方式连接化学与生物学，并且提供优于免疫疗法中的当前程序的显著优势。
具体实施方式
分离的抗体片段
在一个方面中，本发明提供一种分离的抗体片段，其中该片段为牛超长CDR-H3的凸起结构域或其结合目标抗原的部分。
“分离的”抗体片段为已从其天然环境的组分分离(例如通过纯化方式)的抗体片段。在本发明的上下文中，“分离的”抗体片段可获自牛，且任选地经工程改造以产生根据本发明的任何变体，或可以重组方式或以合成方式，例如通过化学合成产生。术语“凸起结构域肽”可用来指如本发明中所述的分离的抗体片段。
用于本发明的上下文中的抗体片段涵盖牛超长CDR-H3的全凸起结构域及其任何部分，尤其是其任何功能活性部分(即，含有特异性结合目标抗原的抗原结合结构域的牛超长CDR-H3的凸起结构域的任何部分)。
全抗体，亦称为“免疫球蛋白(Ig)”，一般是指完整或全长抗体，即包含通过二硫键互连的两条重链和两条轻链的组件，其进行组装以界定特征性Y形三维结构。经典天然全抗体为单特异性的，因为其结合一种抗原类型，且为二价的，因为其具有两个独立抗原结合结构域。术语“完整抗体”、“全长抗体”和“全抗体”可互换使用，指具有与天然抗体结构类似的结构的单特异性二价抗体，包括如本文所定义的Fc区。
每个轻链包含轻链可变区(本文中缩写为VL)和轻链恒定区(CL)。取决于Ig类别，每个重链包含重链可变区(本文中缩写为VH)以及由三个恒定结构域CH1、CH2和CH3或四个恒定结构域CH1、CH2、CH3和CH4构成的重链恒定区(CH)。Ig或抗体的“类别”是指恒定区的类型，包括IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，且其中若干个可进一步划分成亚类，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。抗体恒定区可已介导免疫球蛋白与宿主组织或因子(包括免疫系统的多种细胞(例如效应细胞))和经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。
如本文所用，术语“恒定结构域”、“恒定区”可互换使用，是指抗体除可变区外的一个或多个结构域。恒定结构域在相同同种型的所有抗体中相同，但在不同同种型之间是不同的。通常，重链恒定区从N端至C端由包含三个或四个恒定结构域的“CH1-铰链-CH2-CH3-任选的CH4”形成。
“Fc”、“Fc片段”、“Fc区”可互换使用，指包含抗体的恒定区、但排除第一恒定区结构域的抗体的C端区。因此，Fc指IgA、IgD和IgG的最后两个恒定结构域CH2和CH3，或IgE和IgM的最后三个恒定结构域，以及在这些结构域N端的灵活性铰链。
全抗体的VH和VL区可进一步细分为决定抗原的识别的高变区(或“超变区”)，称为互补决定区(CDR)，穿插在称为框架区(FR)的结构上更保守的区域之间。各VH和VL由从氨基端至羧基端按以下顺序排列的三个CDR和四个FR构成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。CDR和FR共同形成可变区。按照惯例，抗体或其抗原结合片段的重链可变区中的CDR称为CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，且在轻链可变区中称为CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。其在从各链的N端至C端的方向上顺序编号。
CDR根据Kabat等人设计的系统常规编号。该系统阐述于Kabat等人,1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest，美国卫生与人力资源服务部(USDepartment of Health and Human Services),NIH,USA(下文称“Kabat等人(见上文)”)中。本说明书中使用此编号系统，除非其中另有指示。Kabat残基指定不总是直接与氨基酸残基的线性编号对应。实际线性氨基酸序列可以含有比严格Kabat编号少的氨基酸或含有额外的氨基酸，对应于基本可变结构域结构的缩短或插入至结构组分，不管是框架区还是互补决定区(CDR)。对于给定抗体，可通过将抗体序列中的同源性的残基与“标准”Kabat编号序列比对来判定残基的正确Kabat编号。
根据Kabat编号系统，重链可变结构域的CDR位于残基31-35(CDR-H1)、残基50-65(CDR-H2)和残基93-102(CDR-H3)处。然而，根据Chothia(Chothia,C.和Lesk,A.M.J.Mol.Biol.,196,901-917(1987))，等效于CDR-H1的环从残基26延伸至残基32。因此，除非另外指示，否则如Kabat编号系统与Chothia拓朴环定义的组合所描述，如本文所采用的“CDR-H1”意欲指残基26至35。根据Kabat编号系统，轻链可变结构域的CDR位于残基24-34(CDR-L1)、残基50-56(CDR-L2)和残基89-97(CDR-L3)处。基于免疫球蛋白家族的不同成员的序列比对，已提出编号方案，且其例如描述于Kabat等人,1991和Dondelinger等人,Frontiers in Immunology，第9卷，文章2278(2018)中。
不同物种展现CDR-H3长度的多样性。一些牛抗体的特征为长度为多达69个残基的异常长的CDR-H3(故称为“牛超长CDR-H3”)，表示1-15％的牛图谱，而更多常规牛抗体具有大约23个残基的CDR-H3。骆驼(Camelid)单链抗体具有至多24个残基，且鲨鱼IgNAR抗体具有至多27个残基。CDR-H3太长以致于不能由这些编号方案中的任一者适应，但已使用替代系统，如Stanfield等人(见上文)中所论述的系统。
如本文所用的“牛CDR-H3”涵盖牛中所见的所有CDR-H3，包括牛常规CDR-H3和牛超长CDR-H3。
术语“牛超长CDR-H3”指具有如下文所定义的表征超长CDR-H3的特征，尤其包含IGHVI-7基因区段的重复的CDR-H3的子集。已在所有类别的牛IgG中发现超长CDR-H3。
牛超长CDR-H3已表征为包含“茎结构域(stalk domain)”和“凸起结构域”的十分异常的三维结构。茎结构域由两条反平行β链(各链一般对应于约12个残基)构成。凸起结构域为富含二硫键的结构域，其包含环基序，且位于茎顶上，茎充当连接凸起结构域与主要牛抗体骨架的桥。
CDR-H3衍生自可变(V)、多样性(D)和接合(J)基因区段的DNA重排。超长CDR-H3由VHBUL(牛超长)、DH2和JH1基因区段编码，且其长度归因于异常长的DH2区段。超长CDR-H3已表征为IGHVI-7基因区段的重复。
本发明的分离的抗体片段不包含牛超长CDR-H3的茎结构域。
牛超长CDR-H3的“茎结构域”已由其结构特别地表征。本领域技术人员应了解，“茎结构域”的定义可依赖于晶体结构分析和/或测序信息，尤其如应了解，茎结构域位置和结构可在一个超长CDR-H3至另一个之间略微变化，例如就大小而言。术语“茎结构域”一般将由本领域技术人员了解以对应于桥接凸起结构域与主要牛抗体骨架的反平行β链。茎β链的长度可能不同，尤其在长β链(12个或更多个残基)至较短β链之间不同。
本领域技术人员应了解，凸起结构域的定义可依赖于晶体结构分析和/或测序信息，尤其如应了解，凸起结构域位置和结构可在一个超长CDR-H3至另一个之间略微变化，例如就大小、半胱氨酸含量、二硫键含量而言。具体地，超长CDR-H3的序列可通过熟知的测序方法测定，且本领域技术人员将能够基于例如对比分析来鉴别界定凸起结构域的最小序列，其中例如通过与熟知和/或标准核酸和/或氨基酸序列比对，和/或基于晶体结构分析充分表征超长CDR-H3以及其茎和凸起结构域。
如上文所提及，超长CDR-H3过长而无法由现有编号方案中的任一者适应，但已使用替代系统，如Stanfield等人(见上文)中所论述的系统。结构分析亦由例如Wang等人(Wang,F.等人Reshaping antibody diversity.Cell 153,1379-1393(2013))提供。
位置92(Kabat)处的保守半胱氨酸和位置103(Kabat)处的保守色氨酸分别界定CDR-H3的起始和末端，如图14中所说明。生殖系编码的VHBUL DH2 JH1具有以下序列：
Figure BDA0003959525510000111
(VHBUL；随后为粗体显示的DH2基因区域；随后为带下划线的JH1基因区域；编码CDR-H3的序列以斜体显示，在根据Kabat的位置92与103之间)
Kabat编号系统可用于重链残基1至100和101至228，但在100与101(对应于由DH2和JH1基因编码的残基)之间的残基不适应Kabat编号系统，且可不同地编号，例如依序用D标识符，如Stanfield等人(见上文)中所述，其中在DH2起点处的保守半胱氨酸残基为“D2”，随后为D3、D4等等)。出于说明的目的，图14表明DH2区段内的标识符D2、D10、D20、D30和D40。
在Cys H92后，共同基序TTVHQ(生殖系VHBUL中的位置93-97，根据Kabat)开始CDR-H3的β-茎区的递增链。由于通过V-D重组形成的接合多样性的差异，VHBUL的端点与DH2中的“CPD”保守基序之间的长度可变。在Stanfield看来，取决于长度(例如如图14中所示，牛CDR-H3 BLV1H12包含在H100后的3个残基，称为a、b和c)，这些接合残基称为在H100残基后的“a、b、c”。
DH2区已表征为编码凸起结构域和茎区的递减链的一部分。DH2以作为生殖系序列中保守“CPD”基序的一部分的保守半胱氨酸起始，其表征凸起结构域的起点。凸起结构域在β-茎区的递减链的起点终止。β-茎区的递减链已在一些超长CDR-H3中表征为交替的芳族-脂族残基。β-茎区的递减链以由编码基因J区域的残基结束，之后为根据Kabat的残基H101、H102。
本发明的上下文中，可界定凸起结构域的最小序列对应于由二硫键包封的超长CDR-H3的部分，更具体地是最小凸起结构域序列以超长CDR-H3的第一个半胱氨酸残基开始且以超长CDR-H3的最后一个半胱氨酸残基结束。因此，最小凸起结构域通常包含至少两个半胱氨酸。在一个实施方案中，凸起结构域序列以在超长CDR-H3的第一个半胱氨酸残基之前的一个残基开始，且在超长CDR-H3的最后一个半胱氨酸残基之后的残基之后结束。额外的氨基酸可存在于凸起结构域序列的N末端和/或C末端，优选地至多5个额外的氨基酸可存在于N末端和/或C末端。
作为一实例，牛超长CDR-H3 BLV1H12的序列在包含VHBUL、DH2(下划线表示)、JH1(Cys92和Trp103 Kabat以粗体显示)的以下序列中以斜体显示：
Figure BDA0003959525510000121
因此，该序列的凸起结构域可如以下序列所定义：
Figure BDA0003959525510000122
(即从超长CDR-H3的第一个半胱氨酸之前的一个残基至最后一个半胱氨酸残基之后的残基；半胱氨酸残基以粗体显示)：
另一实例在下文以K149超长CDR-H3(本专利申请的SEQ ID NO:1)提供：
Figure BDA0003959525510000123
可根据本申请针对此序列经界定的凸起结构域以粗体显示，从超长CDR-H3的第一个半胱氨酸残基之前的一个残基开始，且在超长CDR-H3的最后一个半胱氨酸残基之后的残基之后结束。
在一个实施方案中，分离的抗体片段由牛超长CDR-H3的凸起结构域组成，即为全长凸起结构域，尤其包含在超长CDR-H3的递增茎与递减茎之间。
在一个实施方案中，分离的抗体片段包含牛超长CDR-H3的凸起结构域结合目标抗原的部分或由其组成。
在一个实施方案中，分离的抗体片段包含至少两个、或至少四个、或至少六个、或至少八个、或至少十个半胱氨酸残基。在一个实施方案中，分离的抗体片段包含至少两个半胱氨酸残基。在一个实施方案中，分离的抗体片段包含至少四个半胱氨酸残基。在一个实施方案中，分离的抗体片段包含至少六个半胱氨酸残基。在一个实施方案中，分离的抗体片段包含至少八个半胱氨酸残基。在一个实施方案中，分离的抗体片段包含至少十个半胱氨酸残基。
在一个实施方案中，分离的抗体片段包含两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个或十四个半胱氨酸残基。在一个实施方案中，分离的抗体片段包含两个半胱氨酸残基至十个半胱氨酸残基。在一个实施方案中，分离的抗体片段包含四个半胱氨酸残基至八个半胱氨酸残基。
两个半胱氨酸残基可桥接在一起以在凸起结构域内形成二硫键。
在一个实施方案中，分离的抗体片段包含至少一个、或至少两个、或至少三个、或至少四个、或至少五个二硫键。在一个实施方案中，分离的抗体片段包含一个、两个、三个、四个、五个、六个、或七个二硫键。在一个实施方案中，分离的抗体片段包含一个二硫键至五个二硫键。在一个实施方案中，分离的抗体片段包含两个二硫键至四个二硫键。
应了解，半胱氨酸残基的含量增加将增大在分离的抗体片段内形成二硫键的可能性。该二硫键有助于在分离的抗体片段内形成环基序，其可有利于增加分离的抗体片段的稳定性和/或硬度和/或结合特异性和/或结合亲和力。
在一个实施方案中，分离的抗体片段在其N末端处包含(Z1)X1C X2基序，其中：
a.Z1存在或不存在，且当Z1存在时，Z1表示1个氨基酸或2、3、4或5个独立选择的氨基酸；以及
b.X1为任意氨基酸残基；以及
c.C为半胱氨酸；以及
d.X2为选自由以下组成的列表的氨基酸：脯氨酸、精氨酸、组氨酸、赖氨酸、甘氨酸和丝氨酸。
如本发明中所定义的Z1表示任意氨基酸或2、3、4或5个可相同或不同的独立选择的氨基酸的任何序列。在一个实施方案中，Z1为1个氨基酸。在另一实施方案中，Z1为2个氨基酸，其可相同或不同。在另一实施方案中，Z1为3个氨基酸，其可相同或不同。在另一实施方案中，Z1为4个氨基酸，其可相同或不同。在另一实施方案中，Z1为5个氨基酸，其可相同或不同。
在一个实施方案中，X1选自由以下组成的列表：丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、组氨酸、赖氨酸、缬氨酸、精氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和天冬氨酸。因此，在一个方面中，本发明提供一种分离的抗体片段，其中凸起结构域或其部分在其N末端处包含(Z1)X1C X2基序，其中：
a.Z1存在或不存在，且当Z1存在时，Z1表示1个氨基酸或2、3、4或5个独立选择的氨基酸；以及
b.X1为任意氨基酸残基，优选地选自由以下组成的列表：丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、组氨酸、赖氨酸、缬氨酸、精氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和天冬氨酸；以及
c.C为半胱氨酸；以及
d.X2为选自由以下组成的列表的氨基酸：脯氨酸、精氨酸、组氨酸、赖氨酸、甘氨酸和丝氨酸。
在一个实施方案中，分离的抗体片段在其N末端处包含(Z1)X1C X2基序，其中C为半胱氨酸；且X1选自由以下组成的列表：丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、天冬酰胺(N)、丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、脯氨酸(P)、组氨酸(H)、赖氨酸(K)、缬氨酸(V)、精氨酸(R)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、苯丙氨酸(F)和天冬氨酸(D)，且X2选自由以下组成的列表：脯氨酸(P)、精氨酸(R)、组氨酸(H)、赖氨酸(K)、甘氨酸(G)和丝氨酸(S)，且其中Z1存在或不存在，且当Z1存在时，Z1表示1个氨基酸或2、3、4或5个独立选择的氨基酸。
在一个实施方案中，分离的抗体片段的N末端包含基序，该基序对应于X1C X2基序包含3个氨基酸残基，该基序选自由以下组成的列表：SCP、TCP、NCP、ACP、GCP、PCR、HCP、SCR、KCP、VCP、TCH、RCP、ICP、ICR、HCR、LCR、SCK、SCG、NCP、TCS、DCP和FCR。
优选地，分离的抗体片段的N末端由在由以下组成的列表中选择的基序起始：(Z1)SCP、(Z1)TCP、(Z1)NCP、(Z1)ACP、(Z1)GCP、(Z1)HCP、(Z1)KCP、(Z1)VCP、(Z1)RCP、(Z1)ICP、(Z1)DCP，其中Z1存在或不存在，且当Z1存在时，Z1表示1个氨基酸或2、3、4或5个独立选择的氨基酸。
在一个实施方案中，分离的抗体片段包含(AB)n和/或(BA)n基序，其中A为任意氨基酸残基，B为选自由以下组成的组的芳族氨基酸：酪氨酸(Y)、苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)和组氨酸(H)，且其中n为1、2、3或4。
在一个实施方案中，A为脂族氨基酸残基。脂族氨基酸为含有脂族侧链官能团的氨基酸。脂族氨基酸残基包括丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸和缬氨酸。
在一个实施方案中，分离的抗体片段包含2-8个氨基酸的基序，该基序富含芳族和/或脂族氨基酸。在一个实施方案中，凸起结构域包含2-8个氨基酸的基序，该基序包含至少2个、或至少3个、或至少4个、或至少5个选自由以下组成的组的氨基酸：酪氨酸(Y)、苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)和组氨酸(H)。
在一个实施方案中，分离的抗体片段的长度为5个氨基酸或更多、长度为10个氨基酸或更多、长度为15个氨基酸或更多、长度为20个氨基酸或更多、长度为25个氨基酸或更多、长度为30个氨基酸或更多、长度为35个氨基酸或更多、长度为40个氨基酸或更多、长度为45个氨基酸或更多。在一个实施方案中，分离的抗体片段的长度为至多50个氨基酸，或长度为至多55个氨基酸。在一个实施方案中，分离的抗体片段的长度为5个氨基酸或更多、长度为10个氨基酸或更多、长度为15个氨基酸或更多、长度为20个氨基酸或更多、长度为25个氨基酸或更多、长度为30个氨基酸或更多、长度为35个氨基酸或更多、长度为40个氨基酸或更多、长度为45个氨基酸或更多，且长度为至多55个氨基酸。在一个实施方案中，分离的抗体片段为牛超长CDR-H3的凸起结构域的一部分，该分离的抗体片段的长度为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54或55个氨基酸。在一个实施方案中，分离的抗体片段的长度为5至55个、或15至50个、或20至45个、或25至40个氨基酸。在一个实施方案中，分离的抗体片段为牛超长CDR-H3的凸起结构域，该分离的抗体片段的长度为5至55个、或15至50个、或20至45个、或25至40个氨基酸。
在一个实施方案中，超长CDR-H3的凸起结构域在自行表达时结合目标抗原，其结合亲和力为包含该凸起结构域或其部分的超长CDR-H3的结合亲和力的至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％，例如当超长CDR-H3的凸起结构域表达或合成为整个超长CDR-H3的一部分时。
如上文所提及，分离的抗体片段可以合成方式产生，例如通过化学合成产生。
在一个方面中，本发明提供包含式(I)的序列或由式(I)的序列组成的结合目标抗原的肽：
(Z1)(X1)C X2(Y)n1(C)n2(Y)n3(C)n4(Y)n5(C)n6(Y)n7(C)n8(Y)n9(C)n10(Y)n11(C)n12(Y)n13(C)n14(Y)n15(C)n16(Y)n17 C(X3)(Z2) (I)
其中：
C表示一个半胱氨酸残基；以及
Z1存在或不存在，且当Z1存在时，Z1表示1个氨基酸或2、3、4或5个独立选择的氨基酸；以及
X1存在或不存在，且当X1存在时，X1为任意氨基酸残基，优选地选自由以下组成的列表：丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、组氨酸、赖氨酸、缬氨酸、精氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和天冬氨酸；以及
X2选自由以下组成的列表：脯氨酸、精氨酸、组氨酸、赖氨酸、甘氨酸和丝氨酸；以及
Z2存在或不存在，且当Z2存在时，Z2表示1个氨基酸或2、3、4或5个独立选择的氨基酸；以及
n2、n4、n6、n8、n10、n12、n14和n16独立地为0或1；以及
Y表示任意氨基酸或可相同或不同的氨基酸的任何序列；以及
n1、n3、n5、n7、n9、n11、n13、n15和n17表示Y中氨基酸的数目，且独立地选自0至22，优选地选自1至15；以及
n1、n3、n5、n7、n9、n11、n13、n15和n17中的至少一个不等于0；以及
X3存在或不存在，且当X3存在时，X3表示任意氨基酸，优选地选自由以下组成的列表：亮氨酸、丝氨酸、甘氨酸、苏氨酸、色氨酸、天冬酰胺、酪氨酸、精氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、组氨酸、谷氨酸、缬氨酸、赖氨酸、脯氨酸；以及
其中肽的长度为至多55个氨基酸。
Z1表示任意氨基酸或可相同或不同的2、3、4或5个独立选择的氨基酸的任何序列。在一个实施方案中，Z1为1个氨基酸。在另一实施方案中，Z1为2个氨基酸，其可相同或不同。在另一实施方案中，Z1为3个氨基酸，其可相同或不同。在另一实施方案中，Z1为4个氨基酸，其可相同或不同。在另一实施方案中，Z1为5个氨基酸，其可相同或不同。
Z2表示任意氨基酸或可相同或不同的2、3、4或5个独立选择的氨基酸的任何序列。在一个实施方案中，Z2为1个氨基酸。在另一实施方案中，Z2为2个氨基酸，其可相同或不同。在另一实施方案中，Z2为3个氨基酸，其可相同或不同。在另一实施方案中，Z2为4个氨基酸，其可相同或不同。在另一实施方案中，Z2为5个氨基酸，其可相同或不同。
Z1和Z2可包含任意氨基酸，只要保留以其他方式定义的肽的特性，例如与目标抗原的结合能力即可。
在一个实施方案中，包含式(I)的序列或由式(I)的序列组成的结合目标抗原的肽的长度为5个氨基酸或更多、长度为10个氨基酸或更多、长度为15个氨基酸或更多、长度为20个氨基酸或更多、长度为25个氨基酸或更多、长度为30个氨基酸或更多、长度为35个氨基酸或更多、长度为40个氨基酸或更多、长度为45个氨基酸。在一个实施方案中，包含式(I)的序列或由式(I)的序列组成的结合目标抗原的肽的长度为5至55、或15至50、或20至45、或25至40个氨基酸。
括号一般用于任选的残基或序列。举例而言，在本发明的上下文中，(C)一般指任选的半胱氨酸残基。
在一个实施方案中，肽包含2个半胱氨酸残基。因此，在一个具体方面中，本发明提供包含式(II)的序列或由式(II)的序列组成的结合目标抗原的肽：
(Z1)(X1)C X2(Y)n1 C(X3)(Z2)(II)
其中Z1、X1、C、X2、Y、n1、X3和Z2如上文所定义，且其中肽的长度为至多55个氨基酸。
在此类实施方案中，n1可被包含在1与20个氨基酸之间。在一个实施方案中，n1为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。
在一个实施方案中，包含式(II)的序列或由式(II)的序列组成的结合目标抗原的肽的长度为5个氨基酸或更多、长度为10个氨基酸或更多、长度为15个氨基酸或更多、长度为20个氨基酸或更多、长度为25个氨基酸或更多、长度为30个氨基酸或更多、长度为35个氨基酸或更多、长度为40个氨基酸或更多、长度为45个氨基酸。在一个实施方案中，包含式(II)的序列或由式(II)的序列组成的结合目标抗原的肽的长度为5至55、或15至50、或20至45、或25至40个氨基酸。
在另一实施方案中，肽包含4个半胱氨酸残基。因此，在一个具体方面中，本发明提供包含式(III)的序列或由式(III)的序列组成的结合目标抗原的肽：
(Z1)(X1)C X2(Y)n1 C(Y)n3 C(Y)n5 C(X3)(Z2) (III)
其中Z1、X1、C、X2、Y、n1、n3、n5、X3和Z2如上文所定义，且其中肽的长度为至多55个氨基酸。
在一个实施方案中，n1被包含在3与15之间，和/或n3被包含在4与12之间，和/或n5被包含在1与14之间。在一个实施方案中，n1为3、5、7、8、10、11、14或15。在一个实施方案中，n3为4、5、6、8、10、11或12。在一个实施方案中，n5为3、4、5、6、7、9、10、11或14。
在另一实施方案中，n1和/或n3和/或n5等于0，且两个或三个半胱氨酸残基相邻。
在一个实施方案中，肽具有式(IIIa)的序列：
(Z1)(X1)C X2 C C(Y)n5 C(X3)(Z2) (IIIa)
其中Z1、X1、C、X2、Y、n5、X3和Z2如上文所定义，且其中肽的长度为至多55个氨基酸。
在一个实施方案中，肽具有式(IIIb)的序列：
(Z1)(X1)C X2(Y)n1 C C(Y)n5 C(X3)(Z2) (IIIb)
其中Z1、X1、C、X2、Y、n1、n5、X3和Z2如上文所定义，且其中肽的长度为至多55个氨基酸。
在一个实施方案中，肽具有式(IIIc)的序列：
(Z1)(X1)C X2(Y)n1 C(Y)n3 C C(X3)(Z2) (IIIc)
其中Z1、X1、C、X2、Y、n1、n3、X3和Z2如上文所定义，且其中肽的长度为至多55个氨基酸。
在一个实施方案中，包含式(III)、(IIIa)、(IIIb)或(IIIc)的序列或由式(III)、(IIIa)、(IIIb)或(IIIc)的序列组成的结合目标抗原的肽的长度为5个氨基酸或更多、长度为10个氨基酸或更多、长度为15个氨基酸或更多、长度为20个氨基酸或更多、长度为25个氨基酸或更多、长度为30个氨基酸或更多、长度为35个氨基酸或更多、长度为40个氨基酸或更多、长度为45个氨基酸。在一个实施方案中，包含式(III)、(IIIa)、(IIIb)或(IIIc)的序列或由式(III)、(IIIa)、(IIIb)或(IIIc)的序列组成的结合目标抗原的肽的长度为5至55个、或15至50个、或20至45个、或25至40个氨基酸。
在另一实施方案中，肽包含6个半胱氨酸残基。因此，在一个具体方面中，本发明提供包含式(IV)的序列或由式(IV)的序列组成的结合目标抗原的肽：
(Z1)(X1)C X2(Y)n1 C(Y)n3 C(Y)n5 C(Y)n7 C(Y)n9 C(X3)(Z2) (IV)
其中Z1、X1、C、X2、Y、n1、n3、n5、n7、n9、X3和Z2如上文所定义，且其中肽的长度为至多55个氨基酸。
在一个实施方案中，n1＝2至9，和/或n3＝1至10，和/或n5＝2至9，和/或n7＝1至15，和/或n9＝1至14。在一个实施方案中，n1＝2、3、4、5、6、7、8或9。在一个实施方案中，n3＝1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一个实施方案中，n5＝2、3、4、5、6、7、8或9。在一个实施方案中，n7＝1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。在一个实施方案中，n9＝1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14。
在一个实施方案中，n1＝0和/或n3＝0和/或n5＝0和/或n7＝0和/或n9＝0，且两个或三个半胱氨酸残基相邻。在一个实施方案中，肽具有式(IVa)的序列：
(Z1)(X1)C X2 C C(Y)n5 C(Y)n7 C(Y)n9 C(X3)(Z2)(IVa)
其中Z1、X1、C、X2、Y、n5、n7、n9、X3和Z2如上文所定义，且其中肽的长度为至多55个氨基酸。
在一个实施方案中，肽具有式(IVb)的序列：
(Z1)(X1)C X2(Y)n1 C C(Y)n5 C(Y)n7 C(Y)n9 C(X3)(Z2) (IVb)
其中Z1、X1、C、X2、Y、n1、n5、n7、n9、X3和Z2如上文所定义，且其中肽的长度为至多55个氨基酸。
在一个实施方案中，肽具有式(IVc)的序列：
(Z1)(X1)C X2(Y)n1 C(Y)n3 C C(Y)n7 C(Y)n9 C(X3)(Z2) (IVc)
其中Z1、X1、C、X2、Y、n1、n3、n7、n9、X3和Z2如上文所定义，且其中肽的长度为至多55个氨基酸。
在一个实施方案中，肽具有式(IVd)的序列：
(Z1)(X1)C X2(Y)n1 C(Y)n3 C(Y)n5 C C(Y)n9 C(X3)(Z2) (IVd)
其中Z1、X1、C、X2、Y、n1、n3、n5、n9、X3和Z2如上文所定义，且其中肽的长度为至多55个氨基酸。
在一个实施方案中，肽具有式(IVe)的序列：
(Z1)(X1)C X2(Y)n1 C(Y)n3 C(Y)n5 C(Y)n7 C C(X3)(Z2) (IVe)
其中Z1、X1、C、X2、Y、n1、n3、n5、n7、X3和Z2如上文所定义，且其中肽的长度为至多55个氨基酸。
在一个实施方案中，肽具有式(IVf)的序列：
(Z1)(X1)C X2(Y)n1 C C C(Y)n7 C(Y)n9 C(X3)(Z2) (IVf)
其中Z1、X1、C、X2、Y、n1、n7、n9、X3和Z2如上文所定义，且其中肽的长度为至多55个氨基酸。
在一个实施方案中，肽具有式(IVg)的序列：
(Z1)(X1)C X2(Y)n1 C(Y)n3 C C C(Y)n9 C(X3)(Z2) (IVg)
其中Z1、X1、C、X2、Y、n1、n3、n9、X3和Z2如上文所定义，且其中肽的长度为至多55个氨基酸。
在一个实施方案中，肽具有式(IVh)的序列：
(Z1)(X1)C X2(Y)n1 C(Y)n3 C(Y)n5 C C C(X3)(Z2) (IVh)
其中Z1、X1、C、X2、Y、n1、n3、n5、X3和Z2如上文所定义，且其中肽的长度为至多55个氨基酸。
在一个实施方案中，包含式(IV)、(IVa)、(IVb)、(IVc)、(IVd)、(IVe)、(IVf)、(IVg)或(IVh)的序列或由式(IV)、(IVa)、(IVb)、(IVc)、(IVd)、(IVe)、(IVf)、(IVg)或(IVh)的序列组成的结合目标抗原的肽的长度为5个氨基酸或更多、长度为10个氨基酸或更多、长度为15个氨基酸或更多、长度为20个氨基酸或更多、长度为25个氨基酸或更多、长度为30个氨基酸或更多、长度为35个氨基酸或更多、长度为40个氨基酸或更多、长度为45个氨基酸。在一个实施方案中，包含式(IV)、(IVa)、(IVb)、(IVc)、(IVd)、(IVe)、(IVf)、(IVg)或(IVh)的序列或由式(IV)、(IVa)、(IVb)、(IVc)、(IVd)、(IVe)、(IVf)、(IVg)或(IVh)的序列组成的结合目标抗原的肽的长度为5至55个、或15至50个、或20至45个、或25至40个氨基酸。
在另一实施方案中，肽包含8个半胱氨酸残基。因此，在一个具体方面中，本发明提供包含式(V)的序列或由式(V)的序列组成的结合目标抗原的肽：
(Z1)(X1)C X2(Y)n1 C(Y)n3 C(Y)n5 C(Y)n7 C(Y)n9 C(Y)n11 C(Y)n13 C(X3)(Z2) (V)
其中Z1、X1、C、X2、Y、n1、n3、n5、n7、n9、n11、n13、X3和Z2如上文所定义，且其中肽的长度为至多55个氨基酸。
在一个实施方案中，n1＝0和/或n3＝0和/或n5＝0和/或n7＝0和/或n9＝0和/或n11＝0和/或n13＝0，且两个或三个半胱氨酸残基相邻。
在一个实施方案中，包含式(V)的序列或由式(V)的序列组成的结合目标抗原的肽的长度为5个氨基酸或更多、长度为10个氨基酸或更多、长度为15个氨基酸或更多、长度为20个氨基酸或更多、长度为25个氨基酸或更多、长度为30个氨基酸或更多、长度为35个氨基酸或更多、长度为40个氨基酸或更多、长度为45个氨基酸。在一个实施方案中，包含式(V)的序列或由式(V)的序列组成的结合目标抗原的肽的长度为5至55、或15至50、或20至45、或25至40个氨基酸。
在另一实施方案中，肽包含10个半胱氨酸残基。因此，在一个具体方面中，本发明提供包含式(VI)的序列或由式(VI)的序列组成的结合目标抗原的肽：
(Z1)(X1)C X2(Y)n1 C(Y)n3 C(Y)n5 C(Y)n7 C(Y)n9 C(Y)n11 C(Y)n13 C(Y)n15 C(Y)n17C(X3)(Z2) (VI)
其中Z1、X1、C、X2、Y、n1、n3、n5、n7、n9、n11、n13、n15、n17、X3和Z2如上文所定义，且其中肽的长度为至多55个氨基酸。
在一个实施方案中，n1＝0和/或n3＝0和/或n5＝0和/或n7＝0和/或n9＝0和/或n11＝0和/或n13＝0和/或n15＝0和/或n17＝0，且两个或三个半胱氨酸残基相邻。
在一个实施方案中，包含式(VI)的序列或由式(VI)的序列组成的结合目标抗原的肽的长度为5个氨基酸或更多、长度为10个氨基酸或更多、长度为15个氨基酸或更多、长度为20个氨基酸或更多、长度为25个氨基酸或更多、长度为30个氨基酸或更多、长度为35个氨基酸或更多、长度为40个氨基酸或更多、长度为45个氨基酸。在一个实施方案中，包含式(VI)的序列或由式(VI)的序列组成的结合目标抗原的肽的长度为5至55、或15至50、或20至45、或25至40个氨基酸。
优选地，本发明的分离的抗体片段特异性结合目标抗原，即包含目标抗原的特异性结合结构域。如本文所采用的“特异性”意欲指仅识别特异性抗原的结合结构域，或与对非特异性抗原的亲和力相比对特异性抗原具有显著更高的结合亲和力(例如5、6、7、8、9、10倍更高的结合亲和力)的结合结构域。
优选地，本发明的分离的抗体片段对其同源抗原的特异性结合亲和力(如通过其解离常数KD所测量的)为10-5M或更小、10-6M或更小、10-7M或更小、10-8M或更小、10-9M或更小、10-10M或更小或10-11M或更小。在一个实施方案中，本发明的分离的抗体片段对其同源抗原的特异性结合亲和力(如通过其解离常数KD所测量的)介于1.10-7M与1.10-8M之间、或介于1.10-8M与1.10-9M之间、或介于1.10-9M与1.10-10M之间。
亲和力可通过已知技术，诸如表面等离子体共振技术，包括BiacoreTM测量。亲和力可在室温25℃或37℃下测量。亲和力可在生理pH下，即在约pH 7.4下测量。在一个实施方案中，如上所述的亲和力值在pH 7.4下使用Biacore，尤其Biacore 8K来测量。
应了解，本发明提供的抗体片段的亲和力可使用本领域中已知的任何适合方法进行改变。
分离的抗体片段变体
在一些方面中，分离的抗体片段包含作为牛超长CDR-H3的凸起结构域的天然存在的序列的变体的序列。
换言之，本发明提供如上所述的分离的抗体片段的变体，其包含非天然存在的序列，即其已进一步经工程改造，例如以改善至少一种药物动力学功能和/或生物功能。在此方面中，包含天然存在的序列的分离的抗体片段可称为“亲本”。
本发明还包括抗体片段，即牛超长CDR-H3的凸起结构域或其部分，其包含与本文中给定的序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相似或相同的序列。如本文所用，“同一性”表示在所比对序列的任何特定位置，序列之间的氨基酸残基是相同的。如本文所用，“相似性”表示在所比对序列的任何特定位置，序列之间的氨基酸残基是相似类型的。举例而言，可用亮氨酸取代异亮氨酸或缬氨酸。通常可以彼此取代的其他氨基酸包括但不限于：
-苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸(具有芳族侧链的氨基酸)；
-赖氨酸、精氨酸和组氨酸(具有碱性侧链的氨基酸)；
-天冬氨酸和谷氨酸(具有酸性侧链的氨基酸)；
-天冬酰胺和谷氨酰胺(具有酰胺侧链的氨基酸)；以及
-半胱氨酸和甲硫氨酸(具有含硫侧链的氨基酸)。
同一性和相似性的程度可容易地通过众所周知的方法，例如可获自NCBI的BLASTTM软件进行计算。
在一个实施方案中，处理本发明的抗体片段以提供针对一种或多种靶抗原的改善的亲和力。此类变体可通过多种亲和力成熟方案获得，包括使CDR突变、链改组、使用大肠杆菌(E.coli)的突变菌株、DNA改组、噬菌体展示和有性PCR。Vaughan等人(NatureBiotechnology,16,535-539,1998)论述了这些亲和力成熟的方法。适用于本发明的情形以改善分离的抗体片段在目标抗原上的结合位点处的结合的另一种方法为WO2014/198951中所述的方法。如本文在此上下文中所用的改善的亲和力是指相对于起始分离的抗体片段的改进。亲和力可如上文所述测量。
在一个实施方案中，分离的抗体片段为亲本牛抗体片段的变体，如例如通过Biacore所测量的，该分离的抗体片段具有比亲本牛抗体片段的亲和力高至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的亲和力。
“截短变体”在指代抗体片段时是在天然或起始氨基酸序列中从多肽的任一末端去除一个或多个氨基酸的那些变体。
在一些实施方案中，分离的抗体片段为已经工程改造以包含处于非天然存在的位置的二硫键的变体。二硫键可通过在所需要的一个或多个位置处将一个或多个半胱氨酸引入氨基酸链中而改造到分子中。此非天然二硫键为天然二硫键的补充或替代，该一个或多个天然二硫键可存在于亲本分离的抗体片段中。天然位置处的一个或多个半胱氨酸可被不能形成二硫桥键的氨基酸(诸如丝氨酸)置换。可使用本领域已知的任何方法进行改造的半胱氨酸的引入。这些方法包括但不限于PCR延伸重叠诱变、定点诱变或盒式诱变(一般参见Sambrook等人,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring HarbourLaboratory Press,Cold Spring Harbour,NY,1989；Ausubel等人,Current Protocols inMolecular Biology,Greene Publishing&Wiley-Interscience,NY,1993)。定点诱变试剂盒为市售的，例如
Figure BDA0003959525510000241
定点诱变试剂盒(例如Stratagene,La Jolla,CA)。盒式诱变可基于Wells等人,1985,Gene,34:315-323进行。备选地，突变可通过利用退火、连接和PCR扩增以及重叠寡核苷酸克隆进行的全基因合成来进行。
在一个方面中，其可用于减少或移除本发明的分离的抗体片段中的半胱氨酸残基和/或二硫键，例如以用于降低在向患者施用期间或之后发生的免疫原性，即副反应的风险。在该方面中，天然位置处的半胱氨酸中的一个或全部可被不能形成二硫桥键的氨基酸(诸如丝氨酸)置换。应了解，替代桥接部分可用于在不存在半胱氨酸残基的情况下稳定和/或形成环化的分离的抗体片段。在一个实施方案中，分离的抗体片段为已改造移除半胱氨酸残基且包含至少一个如本发明中所定义的桥接部分的变体。在一个实施方案中，分离的抗体片段为已改造以含有仅一个、或仅两个、或仅三个、或仅四个半胱氨酸残基和/或含有仅一个或仅两个二硫键，且任选地进一步包含至少一个如本发明中所定义的桥接部分的变体。
额外的修饰包括脯氨酸和赖氨酸的羟基化；酪氨酰基、丝氨酰基或苏氨酰基残基的羟基的磷酸化；赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的α-氨基的甲基化(Creighton,T.E.,Proteins:Structure and Molecular Properties,W.H.Freeman and Co.,SanFrancisco,1983,第79-86页)。
本发明的分离的抗体片段可经环化。环化可有利于赋予更高的蛋白水解抗性，从而产生显著改善的稳定性。
因此，在一个实施方案中，本发明的分离的抗体片段进一步包含在两个氨基酸之间的桥接部分。
环化的抗体片段包括任何抗体片段，该抗体片段具有一个或多个环状构件，诸如环、桥接部分和/或内部键作为其结构的一部分。如本文所用，术语“桥接部分”指在分离的抗体片段中的两个相邻或不相邻氨基酸、非天然氨基酸或非氨基酸之间形成的桥键的一个或多个组分。桥接部分可具有任何大小或组成。
在一个实施方案中，桥接部分可在N端位置处的氨基酸残基与C端位置处的氨基酸残基之间以形成头尾环化。在一个实施方案中，桥接部分可在不处在末端位置处的氨基酸之间。
在一个实施方案中，分离的抗体片段包含仅一个在两个氨基酸之间的桥接部分。在另一实施方案中，分离的抗体片段包含超过一个在两个氨基酸之间的桥接部分，例如两个、或三个、或五个桥接部分，其各自在两个氨基酸之间。
在一个实施方案中，桥接部分包含选自由以下组成的组的特征：二硫键、酰胺键(内酰胺)、硫醚键、芳环、不饱和脂族烃链、饱和脂族烃链和三唑环。
在一个实施方案中，二硫键在两个天然存在的半胱氨酸残基之间形成。在另一实施方案中，二硫键在半胱氨酸残基之间形成，其中至少一个半胱氨酸残基如上文所述改造的。
在一些实施方案中，桥接部分可包含一个或多个在两个相邻或不相邻氨基酸、非天然氨基酸或非氨基酸残基或其组合之间的化学键。在一些实施方案中，此类化学键可在相邻或不相邻氨基酸、非天然氨基酸、非氨基酸残基或其组合上的一个或多个官能团之间。桥接部分可包含一个或多个特征，包括但不限于酰胺键(内酰胺)、二硫键、硫醚键、芳环、三唑环和烃链。在一些实施方案中，桥接部分包含在胺官能基与羧酸官能基之间的酰胺键，该胺官能基和羧酸官能基各自存在于氨基酸、非天然氨基酸或非氨基酸残基侧链中。在一些实施方案中，胺官能基或羧酸官能基为非氨基酸残基或非天然氨基酸残基的一部分。在一些情况下，桥接部分可包含在残基之间形成的键，残基可包括但不限于(S)-2-氨基-5-叠氮基戊酸、(S)-2-氨基庚-6-烯酸、(S)-2-氨基戊-4-炔酸和(S)-2-氨基戊-4-烯酸。桥接部分可利用烯烃复分解经由环化反应形成。在一些情况下，所述桥接部分可在(S)-2-氨基戊-4-烯酸残基与(S)-2-氨基庚-6-烯酸残基之间形成。在一些实施方案中，桥接部分包含在两个含硫醇基的残基之间形成的二硫键。在一些实施方案中，桥接部分包含一个或多个硫醚键。所述硫醚键可包括环硫烷基化合物中所见的硫醚键。这些键在氯乙酸、N端修饰的基团与半胱氨酸残基之间的化学环化反应期间形成。在一些情况下，桥接部分包含一个或多个三唑环。所述三唑环可包括但不限于通过(S)-2-氨基-5-叠氮基戊酸与(S)-2-氨基戊-4-炔酸之间的环化反应形成的三唑环。在一些实施方案中，桥接部分包含基于非蛋白或非多肽的部分，包括但不限于环状环(包括但不限于芳环结构(例如二甲苯基))。所述桥接部分可通过与含有多种反应性卤化物的试剂反应来引入，卤化物包括但不限于聚(溴甲基)苯、聚(溴甲基)吡啶、聚(溴甲基)烷基苯和/或(E)-1,4-二溴丁-2-烯。
在一个实施方案中，本发明的抗体片段完全为牛的。在此类实施方案中，每一个残基衍生自牛生殖系序列。在一些实施方案中，每一个残基衍生自可能已经历针对抗原的亲和力成熟的牛生殖系序列。
在一个实施方案中，本发明的分离的抗体片段为嵌合的。
术语“嵌合”指包含至少两个部分，一个部分衍生自特定来源或物种，诸如牛，而另一个部分衍生自不同来源或物种，诸如人的抗体片段。在一个实施方案中，抗体片段为人/牛嵌合的。在一个实施方案中，抗体片段包含至少一个衍生自人序列的残基。
在一个实施方案中，本发明的分离的抗体片段为合成的。术语“合成”指已通过合成，特别地通过如本发明中所述的化学合成重新产生的分离的抗体片段。
目标抗原
目标抗原可为任何医学上相关的蛋白，诸如在疾病或感染期间上调的那些蛋白，例如受体和/或其相对应配位体。抗原的特定实例包括细胞表面受体，诸如T细胞或B细胞信号传导受体、共刺激分子、检查点抑制剂、自然杀伤细胞受体、免疫球蛋白受体、TNFR家族受体、B7家族受体、黏附分子、整合素、细胞因子/趋化因子受体、GPCR、生长因子受体、激酶受体、组织特异性抗原、癌症抗原、病原体识别受体、补体受体、激素受体或可溶分子，诸如细胞因子、趋化因子、白三烯、生长因子、激素或酶或离子通道、表位、片段及其转译后修饰形式。
在一个实施方案中，与分离的抗体片段结合的目标抗原提供募集效应功能的能力，诸如补体途径活化和/或效应细胞募集。
效应功能的募集可为直接的，因为效应功能与细胞相缔合，该细胞在其表面上带有募集分子。间接募集可在根据本发明的分离的抗体片段中的抗原结合结构域的抗原结合募集多肽引起因子释放(例如又可直接地或间接地募集效应功能的因子)时发生，或可经由信号传导途径的活化进行。实例包括IL2、IL6、IL8、IFNγ、组胺、C1q、调理素以及经典和旁路补体活化级联的其他成员，诸如C2-转化酶、C4-转化酶、C3-转化酶以及C5至C9。
如本文所用，“募集多肽”包括：FcγR，诸如FcγRI、FcγRII和FcγRIII；补体途径蛋白，诸如但不限于C1q和C3，CD标记蛋白(分化簇标记)或其片段，其保留直接地或间接地募集细胞介导的效应功能的能力。募集多肽还包括具有效应功能的免疫球蛋白分子，诸如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgE和IgA。
在一个实施方案中，根据本发明的分离的抗体片段中的抗原结合结构域对补体途径蛋白具有特异性，补体途径蛋白中C5是特别优选的。
此外，本发明的分离的抗体片段可用于借助于结合核素螯合蛋白的单结构域抗体来螯合放射性核素。所述融合蛋白用于疗法的成像或放射性核素靶向性方法中。
在一个实施方案中，根据本发明的分离的抗体片段内的抗原结合结构域对血清载体蛋白、循环免疫球蛋白分子或CD35/CR1具有特异性，例如以通过结合至该血清载体蛋白、循环免疫球蛋白分子或CD35/CR1为对该目标抗原具有特异性的分离的抗体片段提供延长的半衰期。
如本文所用，“血清载体蛋白”包括甲状腺素结合蛋白、甲状腺素运载蛋白、α1-酸性糖蛋白、运铁蛋白、纤维蛋白原和白蛋白或其任一者的片段。
如本文所用，“循环免疫球蛋白分子”包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、sIgA、IgM和IgD或其任一者的片段。
CD35/CR1为存在于红血细胞上的蛋白，具有36天的半衰期(标准范围为28至47天；Lanaro等人，1971,Cancer,28(3):658-661)。
在一个实施方案中，分离的抗体片段对其具有特异性的目标抗原为血清载体蛋白，诸如人血清载体，诸如人血清白蛋白。
结合C5的分离的抗体片段
在一个方面中，本发明提供结合补体的组分C5的本发明的分离的抗体片段。
在一个实施方案中，本发明的分离的抗体片段特异性结合补体的组分C5。
补体系统为先天性免疫反应的组分，且包括约20种循环补体组分蛋白，包括C5。活化通过利用病原体识别起始且引起病原体破坏的蛋白水解裂解的途径发生。在补体系统中已知三种此类途径，且称为经典途径、凝集素途径和旁路途径(alternative pathway)。补体组分C5通过任一C5-转化酶复合物裂解为C5a和C5b。C5a非常类似于C3a，扩散至循环中且促进炎症，充当炎症细胞的化学引诱剂。C5b保持附接至细胞表面，在该细胞表面C5b经由与C6、C7、C8和C9的相互作用触发MAC的形成。MAC为亲水性孔，其跨越膜，且促进流体自由流入和流出细胞，由此破坏该细胞。
在一个实施方案中，分离的抗体片段为牛超长CDR-H3的凸起结构域，其中牛超长CDR-H3具有选自由SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:154组成的列表的序列。在一个实施方案中，分离的抗体片段为牛超长CDR-H3的凸起结构域，其中牛超长CDR-H3具有与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％相似性或同一性的SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:154中任一项的变体的序列。
在一个实施方案中，分离的抗体片段包含以下或由以下组成：序列SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:154中任一项的截短变体。
在一个实施方案中，分离的抗体片段对应于牛超长CDR-H3的凸起结构域或其结合C5的部分，且具有选自由以下组成的列表的序列：SEQ ID NO:157至SEQ ID NO:310、SEQ IDNO:313、SEQ ID NO:315、SEQ ID NO:317、SEQ ID NO:318、SEQ ID NO:320、SEQ ID NO:322、SEQ ID NO:324、SEQ ID NO:326至SEQ ID NO:331、SEQ ID NO:334、SEQ ID NO:336、SEQ IDNO:339、SEQ ID NO:341至SEQ ID NO:350和SEQ ID NO:352。在一个实施方案中，分离的抗体片段具有序列SEQ ID NO:450。在一个实施方案中，分离的抗体片段对应于牛超长CDR-H3的凸起结构域或其结合C5的部分，且包含SEQ ID NO:157至SEQ ID NO:310、SEQ ID NO:313、SEQ ID NO:315、SEQ ID NO:317、SEQ ID NO:318、SEQ ID NO:320、SEQ ID NO:322、SEQID NO:324、SEQ ID NO:326至SEQ ID NO:331、SEQ IDNO:334、SEQ ID NO:336、SEQ ID NO:339、SEQ ID NO:341至SEQ ID NO:350、SEQ ID NO:352和SEQ ID NO:450中任一项或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％相似性或同一性的任一序列。
在一个实施方案中，分离的抗体片段为牛超长CDR-H3的凸起结构域，其中牛超长CDR-H3具有SEQ ID NO:521至SEQ ID NO:571中任一项的序列。在一个实施方案中，分离的抗体片段为牛超长CDR-H3的凸起结构域，其中牛超长CDR-H3具有与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％相似性或同一性的SEQ ID NO:521至SEQ ID NO:571中任一项的变体的序列。
在一个实施方案中，分离的抗体片段包含以下或由以下组成：序列SEQ ID NO:521至SEQ ID NO:571中任一项的截短变体。
在一个实施方案中，分离的抗体片段对应于牛超长CDR-H3的凸起结构域或其结合C5，尤其结合人C5的部分，且包含SEQ ID NO:572至SEQ IDNO:609中任一项或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％相似性或同一性的任一序列。在一个实施方案中，分离的抗体片段包含以下或由以下组成：结合C5的序列SEQ ID NO:572至SEQ ID NO:609中任一项的截短变体。
在一个实施方案中，分离的抗体片段对应于牛超长CDR-H3的凸起结构域或其结合至人C5和大鼠C5的部分，且包含SEQ ID NO:572至SEQ ID NO:578中任一项的序列或SEQ IDNO:594至SEQ ID NO:599中任一项的序列或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％相似性或同一性的任一序列。
在一个实施方案中，本发明的分离的抗体片段为物种交叉反应性的。这表示在研发治疗剂的情况下的技术优势，因为其能够在体内模型中测试，产生可靠且可再现的结果，从而预测相同分子在人中的情况。在一个实施方案中，本发明的抗体片段结合人C5并且结合兔C5、鼠类C5、大鼠C5或食蟹猴C5中至少一种。在一个实施方案中，本发明的抗体片段结合人C5、兔C5和鼠类C5，且任选地结合大鼠C5和/或食蟹猴C5。在一个实施方案中，本发明的抗体片段结合人C5、兔C5、鼠类C5、大鼠C5或食蟹猴C5。
结合白蛋白的分离的抗体片段
在一个实施方案中，本发明提供结合人血清白蛋白的本发明的分离的抗体片段，即如本文所定义的抗体片段包含白蛋白结合结构域。在一个实施方案中，分离的抗体片段特异性结合人血清白蛋白。在所述实施方案中，分离的抗体片段可具有延长的血清半衰期。另外，当本发明的分离的抗体片段融合至效应分子时，其可适用于延长该效应分子的血清半衰期。
在一个实施方案中，本发明的分离的抗体片段结合食蟹猴血清白蛋白、鼠类血清白蛋白和/或大鼠血清白蛋白。
在一个实施方案中，分离的抗体片段为牛超长CDR-H3的凸起结构域，其中牛超长CDR-H3具有SEQ ID NO:497至SEQ ID NO:508中任一项的序列。在一个实施方案中，分离的抗体片段为牛超长CDR-H3的凸起结构域，其中牛超长CDR-H3具有与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％相似性或同一性的SEQ ID NO:497至SEQ ID NO:508中任一项的变体的序列。
在一个实施方案中，分离的抗体片段包含以下或由以下组成：序列SEQ ID NO:497至SEQ ID NO:508中任一项的截短变体。
在一个实施方案中，本发明的分离的牛抗体片段具有SEQ ID NO:509至SEQ IDNO:520中任一项或与其具有至少95％、96％、97％、98％或99％相似性或同一性的任一序列。在一个实施方案中，分离的抗体片段包含以下或由以下组成：结合血清白蛋白的序列SEQ ID NO:509至SEQ ID NO:520中任一项的截短变体。在一个实施方案中，本发明的分离的牛抗体片段特异性结合鼠类血清白蛋白，且包含或具有序列SEQ ID NO:509。在一个实施方案中，本发明的分离的牛抗体片段特异性结合人血清白蛋白，且包含或具有序列SEQ IDNO:510。在一个实施方案中，本发明的分离的牛抗体片段结合鼠类和大鼠白蛋白。在一个实施方案中，本发明的分离的牛抗体片段结合鼠类和大鼠白蛋白，且包含或具有SEQ ID NO:511至SEQ ID NO:520中任一项的序列。
分离的抗体片段融合蛋白
在一些实施方案中，本发明的分离的抗体片段融合至一个或多个效应分子，任选地经由接头，例如可裂解接头融合。
在本发明的上下文中，术语“融合至”、“插入至”和“缀合至”可互换地使用。因此，抗体片段融合蛋白涵盖包含插入至外源性蛋白(例如第二抗体)中的本发明的分离的抗体片段的分子。
抗体片段融合蛋白还涵盖例如通过化学缀合而缀合至效应分子的分离的抗体片段。
在一个实施方案中，本发明的分离的抗体片段基因融合至一个或多个效应分子，任选地通过接头基因融合。在一个实施方案中，本发明的分离的抗体片段直接地(即不通过接头)基因融合至一个或多个效应分子。在另一实施方案中，本发明的分离的抗体片段经由接头基因融合至一个或多个效应分子。在一个实施方案中，本发明的分离的抗体片段直接地基因融合至一个或多个效应分子，且另外经由接头基因融合至一个或多个效应分子。
在一个实施方案中，接头为肽接头。如本文所用的术语“肽接头”指由氨基酸构成的肽。适合肽接头的范围是本领域技术人员已知的。在一个实施方案中，接头为柔性接头。在一个实施方案中，接头选自由SEQ ID NO:361至SEQ ID NO:427组成的列表中所包含的序列。
表1.柔性接头序列
Figure BDA0003959525510000311
Figure BDA0003959525510000321
(S)在序列361和365至369中是任选的。
表2.铰链接头序列
Figure BDA0003959525510000322
Figure BDA0003959525510000331
刚性接头的实例包括肽序列GAPAPAAPAPA(SEQ ID NO:412)、PPPP(SEQ ID NO:413)和PPP。
在一个实施方案中，肽接头为白蛋白结合肽。
白蛋白结合肽的实例提供于WO2007/106120中，且包括：
表3.白蛋白结合肽
SEQ ID NO: 序列
414 DLCLRDWGCLW
415 DICLPRWGCLW
416 MEDICLPRWGCLWGD
417 QRLMEDICLPRWGCLWEDDE
418 QGLIGDICLPRWGCLWGRSV
419 QGLIGDICLPRWGCLWGRSVK
420 EDICLPRWGCLWEDD
421 RLMEDICLPRWGCLWEDD
422 MEDICLPRWGCLWEDD
423 MEDICLPRWGCLWED
424 RLMEDICLARWGCLWEDD
425 EVRSFCTRWPAEKSCKPLRG
426 RAPESFVCYWETICFERSEQ
427 EMCYFPGICWM
效应分子
如本文所用，术语“效应分子”包括例如生物活性蛋白(例如酶、多肽、肽)、其他抗体或抗体片段、合成或天然存在的聚合物、核酸及其片段(例如DNA、RNA及其片段)、放射性核素(尤其放射性碘化物)、放射性同位素、螯合金属、纳米颗粒和报告基团，诸如荧光化合物或可通过NMR或ESR光谱法检测的化合物。
特定相关放射性同位素为α发射放射性同位素，尤其短寿命的α-发射同位素，诸如砹同位素。在一个实施方案中，效应分子为砹211。砹211可有利地用于靶向性α-颗粒疗法(TAT)，尤其用于癌症治疗中，具有以高度局部化和毒性方式递送放射线的潜能，同时有利地具有7.2小时的低半衰期。因此，在一个方面中，本发明提供缀合至砹211的分离的抗体片段。已描述使用偶联剂的放射性化学方法。
在一个实施方案中，分离的抗体片段包含用于卤素捕获的化学笼。化学合成本发明的分离的抗体片段的能力使得偶联剂能够掺入合成自身中，能够消除对药物或放射性同位素缀合至生物产生的抗体上的需求，其中控制取代比例可能是困难的，且可能易于产生高值物，有抗体的溶解度和活性的风险，且产生低值物，有低效产物的风险。
实例为硼笼，诸如十硼酸盐，直接地掺入分离的抗体片段合成中，以使得产物在即将施用之前可容易地在临床上用砹-211标记。这将简化当前标记条件，该当前标记条件涉及两个步骤，其中第一个步骤为使双官能接头偶联至生物产生的抗体上，通常采用琥珀酰亚胺化学以靶向抗体上的胺，或采用马来酰亚胺基团以靶向抗体上巯基，随后用放射性同位素标记。砹-211发射α颗粒，且在免疫疗法中进行试验，其中高能量和短路径长度在靶向性细胞杀死中具有吸引力。其半衰期为仅7.2小时，因此标记程序简化和缩短将对能够得到施用给患者的最佳剂量有益。
因此，在一个实施方案中，如本发明中所定义的分离的抗体片段或多肽通过化学合成制造，该化学合成包含掺入具有放射性同位素的偶联剂的步骤。在一个实施方案中，放射性同位素为α发射放射性同位素。在一个实施方案中，放射性同位素为砹211。
感兴趣的酶包括但不限于蛋白水解酶、水解酶、裂解酶、异构酶、转移酶。感兴趣的蛋白、多肽和肽包括但不限于免疫球蛋白、毒素(诸如相思豆毒素、蓖麻毒素A、假单胞菌外毒素或白喉毒素)、蛋白(诸如胰岛素、α-干扰素、β-干扰素、神经生长因子、血小板衍生生长因子或组织型纤维蛋白溶酶原活化因子)、血栓剂或抗血管生成剂(例如血管生长抑素或内皮生长抑素)或生物反应调节剂(诸如淋巴因子、白介素-1(IL-1)、白介素-2(IL-2)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、神经生长因子(NGF)或其他生长因子和免疫球蛋白。
其他效应分子可包括可用于例如诊断中的可检测物质。可检测物质的实例包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料、放射性核素、正电子发射金属(用于正电子发射断层摄影术)和非放射性顺磁性金属离子。
在另一实施方案中，效应分子可延长分离的抗体片段的体内半衰期，和/或降低分离的抗体片段的免疫原性，和/或增强分离的抗体片段跨越上皮屏障向免疫系统中的递送。此类型的适合效应分子的实例包括Fc片段、聚合物、白蛋白、白蛋白结合蛋白或白蛋白结合化合物，诸如WO05/117984中描述的那些化合物。在一个实施方案中，效应分子为棕榈酸。棕榈酸具有结合白蛋白的有利特性且改善与细胞的相互作用。在一个实施方案中，效应分子为棕榈酸的活化形式，诸如棕榈酰基。
在效应分子为聚合物的情况下，其一般可为合成或天然存在的聚合物，例如任选取代的直链或支链聚亚烷基、聚亚烯基或聚氧亚烷基聚合物，或分支或未分支多糖，例如同多糖或杂多糖。
可存在于上文所提及的合成聚合物上的任选存在的特定取代基包括一个或多个羟基、甲基或甲氧基。
合成聚合物的特定实例包括任选取代的直链或支链聚(乙二醇)、聚(丙二醇)、聚(乙烯醇)或其衍生物，尤其任选取代的聚(乙二醇)，诸如甲氧基聚(乙二醇)或其衍生物。
天然存在的特定聚合物包括乳糖、直链淀粉、葡聚糖、糖原或其衍生物。
如本文所用的“衍生物”意欲包括反应性衍生物，例如硫醇基选择性反应性基团，诸如马来酰亚胺及其类似物。反应性基团可直接地或经由接头区段连接至聚合物。应了解，此类基团的残基在一些情况下将作为抗体片段与聚合物之间的连接基团而形成产物的一部分。
聚合物尺寸可根据需要变化，但平均分子量一般在500Da至50000Da，例如5000Da至40000Da，诸如20000Da至40000Da的范围内。适合的聚合物包括聚亚烷基聚合物，诸如聚(乙二醇)或尤其是甲氧基聚(乙二醇)或其衍生物，且尤其分子量在约15000Da至约40000Da的范围内的聚合物。
在一个实施方案中，用于本发明的抗体附接至聚(乙二醇)(PEG)部分。在一个特定实例中，PEG分子可经由位于分离的抗体片段中的任何可用的氨基酸侧链或末端氨基酸官能团，例如任何游离氨基、亚氨基、硫醇基、羟基或羧基附接。所述氨基酸可天然存在于分离的抗体片段中，或可使用重组DNA方法经工程改造为片段。PEG分子适当地经由位于分离的抗体片段中的至少一个半胱氨酸残基的硫醇基共价连接。
根据本发明，分离的抗体片段可通过添加一个或多个缀合物基团修饰。
如本文所用，“缀合物”指附接至另一个分子的任何分子或部分。在本发明中，缀合物可为基于或不基于多肽(氨基酸)的。缀合物可包含脂质、小分子、RNA、DNA、多肽、聚合物或其组合。在功能上，缀合物可充当靶向性分子，或可充当待递送至细胞、器官或组织的有效负载。缀合物通常为通过使靶向性氨基酸残基或多肽的末端与有机衍生剂反应而引入的共价修饰，该有机衍生剂能够与所选侧链或末端残基反应。该修饰在本领域普通技术人员的能力范围内，且无需过度实验即可进行。
缀合过程可能涉及PEG化、脂质化、白蛋白化、生物素化、脱硫生物素化、添加其他多肽尾、或接枝至抗体Fc结构域、完整抗体的CDR区或通过多种方式产生的抗体结构域上。缀合物可包括锚，包括油酸胆固醇酯部分、月桂酸胆固醇酯部分、α-生育酚部分、植醇部分、油酸酯部分或不饱和胆固醇酯部分或选自以下的亲脂性化合物：乙酰苯胺、苯胺、氨基喹啉、二苯甲基化合物、苯并二氮
Figure BDA0003959525510000361
苯并呋喃、大麻碱、环状多肽、二苯并氮
Figure BDA0003959525510000362
洋地黄糖苷、麦角生物碱、类黄酮、咪唑、喹啉、大环内酯、萘、鸦片剂(诸如但不限于吗啡烷或其他精神作用药物)、噁嗪、噁唑、苯烷胺、哌啶、多环芳族烃、吡咯烷、吡咯烷酮、二苯乙烯、磺酰脲、砜、三唑、莨菪烷和长春花生物碱。在一个实施方案中，缀合过程涉及棕榈酰化。棕榈酰化可用于改善如本发明中所述的分离的抗体片段或多肽的药物动力学。
在一个实施方案中，效应分子为白蛋白。在一个实施方案中，效应分子为人血清白蛋白。在一个实施方案中，效应分子为大鼠血清白蛋白。在一个实施方案中，分离的抗体片段融合至白蛋白的N末端和/或C末端。在一个实施方案中，分离的抗体片段插入至白蛋白中。在该实施方案中，分离的抗体片段优选地在远离与FcRn的白蛋白相互作用位点的位置处插入。在一个实施方案中，分离的抗体片段插入至人血清白蛋白中。白蛋白上远离与FcRn的相互作用的残基可选择为用于将本发明的分离的抗体片段，例如丙氨酸59、丙氨酸171、丙氨酸364、天冬氨酸562插入在人血清白蛋白上的位点。在一个实施方案中，分离的抗体片段任选地经由一个或多个、例如两个接头插入至白蛋白中。举例而言，分离的抗体片段可经由两个接头插入至白蛋白中，其中一个接头在分离的抗体片段的N末端处，另一个接头在分离的抗体片段的C末端处。适合的接头可为如本文所述的柔性接头。在一个实施方案中，接头或接头中的至少一个为SGGGS。
在一个实施方案中，本发明提供人血清白蛋白-凸起结构域融合蛋白(即包含本发明的分离的抗体片段和人血清白蛋白的融合蛋白)，其包含或具有选自由以下组成的列表的序列：SEQ ID NO:452、SEQ ID NO:454、SEQ IDNO:456、SEQ ID NO:458、SEQ ID NO:460、SEQ ID NO:462、SEQ ID NO:464和SEQ ID NO:466。
在一个实施方案中，效应分子为Fc片段或其任何衍生物，其可延长分离的抗体片段的体内半衰期。Fc片段的衍生物的实例包括Fc变体、Fc片段的多聚体、Fc多肽，诸如scFc。
在一个实施方案中，效应分子为Fc片段。在一个实施方案中，效应分子为人IgG1的Fc片段。人IgG1重链Fc区在本文中定义为包含残基C226至其羧基端，其中编号是根据如Kabat中的EU索引。在人IgG1的情形下，根据如Kabat中的EU索引，下部铰链指位置226-236，CH2结构域指位置237-340且CH3结构域指位置341-447。其他免疫球蛋白的相对应Fc区可通过序列比对来鉴别。
在一个实施方案中，根据本发明的分离的抗体片段融合至Fc片段。在一个实施方案中，分离的抗体片段融合至Fc片段的N末端和/或C末端。在一个实施方案中，根据本发明的分离的抗体片段插入至Fc片段中。在该实施方案中，分离的抗体片段优选地在远离与FcRn的Fc相互作用位点的位置处插入。在一个实施方案中，根据本发明的分离的抗体片段插入至人IgG1的Fc片段中。Fc上远离与FcRn的相互作用的残基可选择为用于将本发明的分离的抗体片段，例如丙氨酸327、甘氨酸341、天冬酰胺384、甘氨酸402插入在IgG1 Fc片段上的位点。在一个实施方案中，分离的抗体片段任选经由一个或多个、例如两个接头插入至人IgG1的Fc片段中。举例而言，分离的抗体片段可经由两个接头插入至IgG1 Fc片段中，其中一个接头在分离的抗体片段的N末端处，另一个接头在分离的抗体片段的C末端处。适合的接头可为如本文所述的柔性接头。在一个实施方案中，接头或接头中的至少一个具有序列SEQ ID NO:365。
在一个实施方案中，本发明提供人IgG1 Fc-凸起结构域融合蛋白(即包含本发明的分离的抗体片段和人IgG1 Fc片段的融合蛋白)，其包含或具有选自SEQ ID NO:471至SEQID NO:474组成的列表的序列。
在一个实施方案中，效应分子为抗体。
在本发明的上下文中用作效应分子的抗体包括如上文所定义的全抗体及其功能活性片段(即含有特异性结合抗原的抗原结合结构域的分子，亦称为抗原结合片段)。抗体可为(或衍生自)单克隆、多价、多特异性、双特异性、全人、人源化、牛或嵌合抗体。
若存在，则抗体的恒定区结构域可相对于抗体的建议功能，且特别是可能需要的效应功能加以选择。举例而言，恒定区结构域可为人IgG1、IgG2或IgG4结构域。具体地，当抗体分子意欲用于治疗用途且需要抗体效应功能时，可使用人IgG恒定区结构域，尤其是IgG1同型。备选地，当抗体意欲用于达成治疗目的且不需要抗体效应功能时可使用IgG2和IgG4同型。应了解，还可以使用这些恒定区结构域的序列变体。举例而言，可使用IgG4分子，其中如Angal等人(Angal等人,1993.A single amino acid substitution abolishes theheterogeneity of chimeric mouse/human(IgG4)antibody as observed during SDS-PAGE analysis Mol Immunol 30,105-108)中所述，位置处241(根据Kabat编号系统进行编号)的丝氨酸已变为脯氨酸，且在本文中称为IgG4P。
人IgG1重链Fc区在本文中定义为包含残基C226至其羧基端，其中编号根据如Kabat中的EU索引。在人IgG1的情形下，根据如Kabat中的EU索引，下部铰链指位置226-236，CH2结构域指位置237-340且CH3结构域指位置341-447。其他免疫球蛋白的相对应Fc区可通过序列比对来鉴别。
在一个实施方案中，效应分子为全IgG。在一个实施方案中，效应分子为全IgG1。在一个实施方案中，效应分子为全IgG4。
在另一实施方案中，效应分子为抗体的抗原结合片段。
抗体的抗原结合片段一般包含至少一个可变轻链(VL)或可变重链(VH)结构域，且包括：单链抗体(例如全长重链或轻链)；Fab、经修饰的Fab、Fab’、经修饰的Fab’、F(ab’)2、Fv、Fab-Fv、Fab-dsFv、单结构域抗体(sdAb，例如VH或VL或VHH)、scFv、dsscFv、Bis-scFv、双功能抗体、三功能抗体(tribodies)、三抗体(triabodies)、四抗体以及以上任一种的表位结合片段(参见例如Holliger和Hudson,2005,Nature Biotech.23(9):1126-1136；Adair和Lawson,2005,Drug Design Reviews-Online 2(3),209-217)。用于形成和制造这些抗体结合片段的方法为本领域中所熟知(参见例如Verma等人,1998,Journal of ImmunologicalMethods,216,165-181)。举例而言，使用任何适合的酶促裂解和/或消化技术，例如用胃蛋白酶进行的处理，可从任何全抗体，尤其全单克隆抗体获得抗体结合片段。备选地，抗体起始材料可通过使用重组DNA技术制备，该重组DNA技术涉及操纵和再表达编码抗体可变区和/或恒定区的DNA。根据需要可以使用标准分子生物技术使氨基酸或结构域改变、添加或缺失。对可变区或恒定区的任何改变仍由如本文所用的术语“可变”区和“恒定”区涵盖。抗体片段起始材料可获自任何物种，包括例如小鼠、大鼠、兔、仓鼠、骆驼、大羊驼、山羊或人。抗体片段的各部分可获自超过一种物种；例如，抗体片段可为嵌合的。在一个实例中，恒定区来自一种物种，且可变区来自另一种物种。抗体片段起始材料还可经修饰。在另一实例中，抗体片段的可变区已使用重组DNA工程改造技术形成。该经工程改造的形式包括例如通过在天然抗体的氨基酸序列中的插入、缺失或变化从天然抗体可变区形成的形式。此类型的特定实例包括那些经工程改造的可变区结构域，其含有至少一个CDR和任选存在的一个或多个来自一种抗体的框架氨基酸以及来自第二抗体的可变区结构域的其余部分。
抗体的抗原结合片段包括单链抗体(例如scFv和dsscFv)、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、单结构域抗体或纳米抗体(例如VH或VL，或VHH或VNAR)。用于本发明的其他抗体片段包括国际专利申请WO2011/117648、WO2005/003169、WO2005/003170和WO2005/003171中所述的Fab和Fab’片段。用于形成和制造这些抗体结合片段的方法是本领域中熟知的(参见例如Verma等人,1998,Journal of Immunological Methods,216,165-181)。
如本文所用，术语“Fab片段”指包含含有可变轻链(VL)结构域与轻链的恒定结构域(CL)的轻链片段和重链的可变重链(VH)结构域与第一恒定域(CH1)的抗体片段。
典型的“Fab’片段”包含重链与轻链对，其中重链包含可变区VH、恒定结构域CH1以及天然或经修饰的铰链区，且轻链包含可变区VL和恒定结构域CL。根据本发明的Fab’的二聚体形成F(ab’)2，其中例如二聚化可经由铰链进行。
如本文所用，术语“单结构域抗体”指由单一单体可变抗体结构域组成的抗体片段。单结构域抗体的实例包括VH或VL或VHH或V-NAR。
“Fv”指两个可变结构域，例如协作可变结构域，诸如同源对或亲和力成熟可变结构域，即VH与VL对。
如本文所采用的“单链可变片段”或“scFv”指包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)或由重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)组成的单链可变片段，其通过VH与VL可变结构域之间的肽接头稳定化。VH与VL可变结构域可呈任何适合的定向，例如VH的C端可连接至VL的N端，或VL的C端可连接至VH的N端。
如本文所采用的“二硫键稳定化的单链可变片段”或“dsscFv”指通过VH与VL可变结构域之间的肽接头稳定化且还包括VH与VL之间的结构域间二硫键的单链可变片段。
在一个实施方案中，效应分子为多特异性抗体。如本文所采用的多特异性抗体指具有至少两个结合结构域(即，两个或更多个结合结构域，例如两个或三个结合结构域)的抗体，其中至少两个结合结构域独立地结合两种不同抗原或相同抗原上的两个不同表位。多特异性抗体涵盖单价和多价(例如二价、三价、四价)多特异性抗体。在一个实施方案中，效应分子为双特异性抗体。如本文所采用的双特异性抗体指具有两个抗原特异性的抗体。在一个实施方案中，效应分子为三特异性抗体。如本文所采用的三特异性抗体指具有三个抗原特异性的抗体。
各种多特异性抗体格式已生成，且可用于本发明中，例如双特异性IgG、附接IgG、多特异性(例如双特异性)抗体片段、多特异性(例如双特异性)融合蛋白和多特异性(例如双特异性)抗体缀合物，如例如Spiess等人(Spiess等人,Alternative molecular formatsand therapeutic applications for bispecific antibodies.Mol Immunol.67(2015):95-106)中所描述。
在本发明中用作效应分子的优选多特异性抗体包括附接IgG和附接Fab，其中全IgG或Fab片段分别通过将至少一个额外的抗原结合结构域(例如两个、三个或四个额外的抗原结合结构域，例如单结构域抗体(诸如VH或VL、或VHH)、scFv、dsscFv、dsFv)附接至该IgG或Fab的重链和/或轻链的N端和/或C端进行工程改造，例如如WO2009/040562、WO2010035012、WO2011/030107、WO2011/061492、WO2011/061246和WO2011/086091中所描述，所有这些以引用的方式并入本文中。具体地，Fab-Fv格式首先在WO2009/040562中公开且其二硫键稳定化形式Fab-dsFv首先在WO2010/035012中公开。单接头Fab-dsFv首先在WO2014/096390(以引用的方式并入本文中)中公开，其中dsFv经由Fv的VL或VH结构域与Fab的LC或HC的C端之间的单接头连接至Fab。包含全长IgG1的附接IgG通过将dsFv附接至IgG的重链或轻链的C端而经工程改造，其首先在WO2015/197789(以引用的方式并入本文中)中公开。
在本发明中用作效应分子的另一优选抗体包含连接至两个scFv或dsscFv的Fab，各scFv或dsscFv结合相同或不同靶标(例如一个scFv或dsscFv结合治疗靶标且一个scFv或dsscFv通过结合例如白蛋白而延长半衰期)。该抗体片段记载在国际专利申请公开号WO2015/197772中，该国际专利申请公开案以全文引用的方式并入本文中。在本发明片段中用作效应分子的另一优选抗体包含连接至仅一个scFv或dsscFv的Fab，如例如WO2013/068571(其以引用的方式并入本文中)和Dave等人,Mabs,8(7)1319-1335(2016)中所描述。
在一个实施方案中，效应分子选自由以下组成的列表：Fab、单结构域抗体(VHH、VH、VL)、scFv和dsscFv。
在一个实施方案中，效应分子为VHH，即本发明提供在VHH与本发明的分离的抗体片段之间的融合蛋白。可在CDR的相对端处将本发明的分离的抗体片段插入至VHH抗体的框架转角(framework turns)中，以制备单链双特异性抗体。在一个实施方案中，VHH为hC3nb1VHH，其结合C3和C3b。在一个实施方案中，VHH包含或具有序列SEQ ID NO:351。在一个实施方案中，hC3nb1 VHH-凸起融合蛋白包含或具有选自由SEQ ID NO:353至SEQ ID NO:357组成的列表的序列。在另一实施方案中，本发明提供hC3nb1 VHH-超长CDR-H3融合蛋白，其包含或具有序列SEQ ID NO:359或SEQ ID NO:360。
在另一实施方案中，效应分子为Fab，即本发明提供在Fab与本发明的分离的抗体片段之间的融合蛋白。在一个实施方案中，分离的抗体片段插入至Fab的CDR-H3中。在一个实施方案中，Fab包含具有序列SEQ ID NO:311的重链，其与SEQ ID NO:325的轻链配对。在一个实施方案中，Fab-凸起结构域融合蛋白具有选自由以下组成的列表的序列：SEQ IDNO:312、SEQ ID NO:314、SEQ ID NO:316、SEQ ID NO:319、SEQ ID NO:321和SEQ ID NO:323。
在一个实施方案中，抗体(即效应分子)包含白蛋白结合结构域。
在一个实施方案中，效应分子为白蛋白或包含白蛋白结合结构域的蛋白。
如本文所用的“白蛋白结合结构域”指与血清白蛋白特异性相互作用的蛋白的一部分。尤其在抗体用作效应分子的情况下，其指抗体的一部分，其包含与白蛋白特异性相互作用的一个或多个可变结构域的一部分或整体，例如一对可变结构域VH与VL。白蛋白结合结构域可包含单结构域抗体。因此，根据本发明的白蛋白结合结构域可指结合至白蛋白的VH、VL或VH/VL对。
在一个实施方案中，包含白蛋白结合结构域的抗体包含轻链和/或重链序列；和/或轻链和/或重链可变结构域序列；和/或CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列中的至少一者；和/或选自以下的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3中的至少一者(CDR以粗体显示)：
CA645 Fab轻链(gL5)：
Figure BDA0003959525510000421
VL结构域(gL5)：
Figure BDA0003959525510000422
CDR-L1:QSSPSVWSNFLS(SEQ ID NO:430)
CDR-L2:EASKLTS(SEQ ID NO:431)
CDR-L3:GGGYSSISDTT(SEQ ID NO:432)
CA645 Fab重链(gH5)：
Figure BDA0003959525510000431
VH结构域(gH5)：
Figure BDA0003959525510000432
CDR-H1:GIDLSNYAIN(SEQ ID NO:435)
CDR-H2:IIWASGTTFYATWAKG(SEQ ID NO:436)
CDR-H3:TVPGYSTAPYFDL(SEQ ID NO:437)
适用于本发明的情形中的额外的VH与VL序列列于以下：CA645 VH结构域(gH1)：
Figure BDA0003959525510000433
CA645 VH结构域(gH37)：
Figure BDA0003959525510000434
CA645 VH结构域(gH47)：
Figure BDA0003959525510000435
CA645 VL结构域(gL1)：
Figure BDA0003959525510000436
CA645 VL结构域(gL4)：
Figure BDA0003959525510000441
在一些实施方案中，白蛋白结合结构域包含如上文所述的结合人血清白蛋白的VL与VH结构域(分别为SEQ ID NO:429、SEQ ID NO:434和SEQ ID NO:442)的变体，该变体包含额外的半胱氨酸残基，以便可在VL结构域与VH结构域之间形成二硫键。含额外的半胱氨酸的变体可具有以下序列(其中额外的半胱氨酸残基以下划线表示)：
CA645-Cys VL结构域(gL5)：
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCQSSPSVWSNFLSWYQQKPGKAPKLLIYEASKLTSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCGGGYSSISDTTFGCGTKVEIK(SEQ ID NO:443)
CA645-Cys VH结构域(gH5)：
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGIDLSNYAINWVRQAPGKCLEWIGIIWASGTTF
YATWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARTVPGYSTAPYFDLWGQGTLVTVSS(SEQID NO:444)
CA645-Cys VL(gL4)：
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCQSSPSVWSNFLSWYQQKPGKAPKLLIYEASKLTSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCGGGYSSISDTTFGCGTKVEIKRT(SEQ ID NO:445)
在一些实施方案中，白蛋白结合结构域的VH框架为人的(例如VH3，诸如VH3 1-33-23)，且包含例如1、2、3、4、5或6个氨基酸取代，诸如作为供体残基的氨基酸。在该实施方案中，VH可具有SEQ ID NO:434、SEQ ID NO:438、SEQ ID NO:439、SEQ ID NO:440、SEQ IDNO:444所示的序列或与其任一项具有至少95％、96％、97％、98％或99％相似性或同一性的变体。
在一些实施方案中，白蛋白结合结构域的VL框架为人的(例如Vκ1，诸如2-1-(1)L5)，且包含例如1、2、3、4、5或6个氨基酸取代，诸如作为供体残基的氨基酸。在该实施方案中，VL可具有SEQ ID NO:429、SEQ ID NO:441、SEQ ID NO:442、SEQ ID NO:443、SEQ ID NO:445所示的序列或与其任一项具有至少95％、96％、97％、98％或99％相似性或同一性的变体。
在一些实施方案中，白蛋白结合结构域包含选自组合SEQ ID NO:434与SEQ IDNO:429、或SEQ ID NO:444与SEQ ID NO:443或与其任一项具有至少95％、96％、97％、98％或99％相似性或同一性的一个或多个变体的VH与VL序列。
在一些实施方案中，白蛋白结合结构域的VH与VL序列分别为SEQ ID NO:434与SEQID NO:429。在一些实施方案中，白蛋白结合结构域的VH与VL序列分别为SEQ ID NO:444与SEQ ID NO:443。
在一个实施方案中，白蛋白结合结构域包含SEQ ID NO:435作为CDR-H1、SEQ IDNO:436作为CDR-H2、SEQ ID NO:437作为CDR-H3、SEQ ID NO:430作为CDR-L1、SEQ ID NO:431作为CDR-L2和SEQ ID NO:432作为CDR-L3；或选自SEQ ID NO:434和SEQ ID NO:444的重链可变结构域以及选自SEQ ID NO:429和SEQ ID NO:443的轻链可变结构域。
在一个实施方案中，效应分子为结合人血清白蛋白的Fab，即Fab包含白蛋白结合结构域。因此，在一个方面中，本发明提供结合血清白蛋白的Fab，其中根据本发明的分离的抗体片段插入至其框架，例如如WO2020/011868(2020年1月16日公开)中所述的V结构域、尤其VH结构域的框架3区(FW3)中。如所解释，除了三个CDR环以外，抗体轻链与重链，即常规单链骆驼VHH两者均具有第四个由框架3形成的环。Kabat编号系统界定框架3为重链中的位置66-94和轻链中的位置57-88。
因此，在一个方面中，本发明还提供双特异性抗体格式，尤其稳定且能够同时结合两种抗原。有利地，如本文所述的CA645 Fab-分离的抗体片段融合蛋白(其也可称为CA645Fab-凸起融合蛋白)可同时结合C5和白蛋白，此可对分离的抗体片段赋予延长的血清半衰期。
在一个实施方案中，本发明提供插入至645Fab的VH的FW3中的本发明的分离的抗体片段。在一个实施方案中，645Fab包含具有序列SEQ ID NO:334的重链，其与SEQ ID NO:329的轻链配对。在一个实施方案中，本发明提供CA645 Fab-凸起融合蛋白，其包含选自由以下组成的列表的序列：SEQ ID NO:332、SEQ ID NO:333、SEQ ID NO:335、SEQ ID NO:337、SEQ ID NO:338和SEQ ID NO:340。
包含分离的抗体片段的多肽
在一个方面中，本发明提供一种包含至少一个根据本发明的分离的抗体片段的多肽。
在一个方面中，本发明提供一种包含至少两个根据本发明的分离的抗体片段的多肽，其中分离的抗体片段连接在一起，任选地通过接头连接在一起，例如通过可裂解接头连接在一起。
在一个实施方案中，至少两个分离的抗体片段结合至相同抗原，包括结合至抗原上的相同表位或结合至抗原上的不同表位。
在另一实施方案中，至少两个分离的抗体片段结合至不同抗原。
多肽可为单特异性、多特异性、多价、双特异性的。
如本文所采用的“单特异性多肽”指包含至少两个本发明的分离的抗体片段的多肽，其中多肽结合仅一种目标抗原。
如本文所采用的“多特异性多肽”指包含至少两个本发明的分离的抗体片段的多肽，其中多肽包含至少两个抗原结合结构域，即两个或更多个抗原结合结构域，例如两个或三个抗原结合结构域，其中至少两个抗原结合结构域独立地结合两种不同抗原或相同抗原上的两个不同表位。多特异性多肽对于各特异性(抗原)可为单价的。本文所述的多特异性多肽涵盖单价与多价，例如二价、三价、四价多特异性多肽，以及对于不同表位具有不同价数的多特异性多肽(例如，对于第一抗原特异性呈单价且对于与第一抗原特异性不同的第二抗原特异性呈二价的多特异性多肽)。
在一个实施方案中，多肽为单特异性且二价的。在另一实施方案中，多肽为双特异性的。
如本文所采用的“双特异性多肽”指具有两个抗原特异性的多肽。在一个实施方案中，多肽包含两个抗原结合结构域，其中一个结合结构域结合抗原1，且另一个结合结构域结合抗原2，即各结合结构域对于各抗原呈单价。在一个实施方案中，抗体为四价双特异性多肽，即多肽包含四个抗原结合结构域，其中例如两个结合结构域结合抗原1，且另两个结合结构域结合抗原2。在一个实施方案中，多肽为三价双特异性多肽。
应了解，包含至少两个分离的抗体片段的本发明的多肽可例如以合成方式或以重组方式产生，且可包含牛或嵌合或合成的分离的抗体片段或其组合。举例而言，根据本发明的多肽可包含两个分离的抗体片段，两者均为合成的或一个为合成的且另一个为牛抗体片段。在一个实施方案中，根据本发明的多肽仅包含合成的分离的抗体片段。
在一个方面中，包含至少两个分离的抗体片段的多肽是环化的。在一些实施方案中，包含至少两个分离的抗体片段的多肽包含在两个氨基酸之间的至少一个桥接部分。
当多肽为环状且不具有末端氨基酸时，其可称为大环。
结合环化抗体片段的上文所述的桥接部分的定义也适用于本发明的环化多肽。
具体地，在一个实施方案中，桥接部分包含选自由以下组成的组的特征：二硫键、酰胺键(内酰胺)、硫醚键、芳环、不饱和脂族烃链、饱和脂族烃链和三唑环。
产生方法
本发明的分离的抗体片段或多肽可通过任何适合的方法，诸如重组表达和/或化学合成产生。
在一个方面中，本发明还提供产生本发明的分离的抗体片段或多肽的方法，该方法包括化学合成的步骤。
已描述了化学合成方法，诸如固相多肽合成(参见例如Coin,I等人(2007)；NatureProtocols 2(12):3247-56)。
在一个实施方案中，本发明的分离的抗体片段通过固相多肽合成产生。
在一个实施方案中，本发明的分离的抗体片段使用标准固相Fmoc/tBu方法产生。该方法例如描述于以下中：Atherton和Sheppard 1989,Fluorenylmethoxycarbonylpolyamide solid phase peptide synthesis:general principles and development.InSolid Phase Peptide Synthesis:A Practical Approach.IRL Press,Eynsham,Oxford，第25-37页)；以及Merrifield R.B.“Solid Phase Peptide Synthesis.I.The Synthesisof a Tetrapeptide”.J.Am.Chem.Soc.85(14):2149-2154(1963)。
合成通常在机器合成器上在C至N方向上以顺次方式进行。合成可在适当的聚苯乙烯支持物上开始，其中第一氨基酸经由一个键附接至支持物。合成方案的实例描述于本发明的实施例部分中。本领域技术人员应了解，可使用其他方案，例如使用不同试剂、保护基、其他实验条件，且本领域技术人员将能够根据所要肽的性质以及合成策略而调整方案。
本发明的分离的抗体片段的化学合成有利地包括在两个半胱氨酸残基之间形成二硫键，这引起分离的抗体片段的环化。环状肽可通过在两个半胱氨酸残基之间形成二硫键，或通过头尾或侧链环化形成酰胺键而产生。使用特殊基团，有可能在肽中的两个特异性半胱氨酸之间环化，因此有可能在肽中具有超过一个二硫键。不同方法可用，且包含如本发明的实施例部分中所述的定点方法。待用于正交保护策略中的保护基的选择可变化。在两个半胱氨酸残基之间的环化可能备选地通过使用热力学受控空气氧化以获得序列中的二硫键的最小能源形式，采用还原和氧化的谷胱甘肽的混合物来达成，例如如实施例中所描述。
在一个方面中，硼笼，诸如十硼酸盐在化学合成期间直接地掺入分离的抗体片段中。因此，分离的抗体片段可恰好在施用之前用放射性同位素，例如用砹-211容易地标记。因此，在一个方面中，本发明提供一种产生如本发明中所定义的分离的抗体片段或多肽的方法，该方法包括化学合成的步骤，且其中化学合成包括掺入具有放射性同位素的偶联剂的步骤。在一个实施方案中，放射性同位素为α发射放射性同位素。在一个实施方案中，放射性同位素为砹211。
本发明还提供一种多核苷酸，其编码本发明的分离的抗体片段或多肽。本发明的多核苷酸(即DNA序列)可包含例如通过化学处理产生的合成DNA、cDNA、基因组DNA或其任何组合。
应了解，在包含至少两个本发明的分离的抗体片段的多肽的情况下，DNA可为合成的，且在单一DNA序列中包括编码至少两个分离的抗体片段的序列。备选地，包含至少两个本发明的分离的抗体片段的多肽可使用两个独立的非合成或合成的DNA序列，各自编码至少两个分离的抗体片段中的一个，其随后在表达之后缀合或连接在一起。
编码本发明的分离的抗体片段的DNA序列可以通过本领域技术人员熟知的方法获得。
本发明还涉及一种克隆或表达载体，其包含一个或多个本发明的多核苷酸或DNA序列。因此，提供一种克隆或表达载体，其包含一个或多个编码本发明的分离的抗体片段或多肽的多核苷酸。在包含至少两个本发明的分离的抗体片段的多肽的情况下，克隆或表达载体包含至少两个多核苷酸，其分别编码至少两个本发明的分离的抗体片段和适合的信号序列。
可以构建载体的一般方法、转染方法和培养方法为本领域技术人员所熟知。
还提供一种宿主细胞，其包含有包含编码本发明的分离的抗体片段的一个或多个多核苷酸的一个或多个克隆或表达载体或一个或多个包含其的载体。可使用任何适合的宿主细胞/载体系统以表达编码根据本发明的分离的抗体片段或多肽的CDR-H3多核苷酸序列。可使用细菌(例如大肠杆菌)及其他微生物系统，或亦可使用真核(例如哺乳动物)宿主细胞表达系统。适合的哺乳动物宿主细胞包括CHO、骨髓瘤或杂交瘤细胞。用于本发明中的中国仓鼠卵巢(CHO细胞)的适合类型可包括CHO和CHO-K1细胞，包括dhfr-CHO细胞，诸如可与DHFR选择标记一起使用的CHO-DG44细胞和CHO-DXB11细胞或可与谷氨酰胺合成酶选择标记一起使用的CHOK1-SV细胞。用于表达抗体的其他细胞类型包括淋巴细胞系，例如NSO骨髓瘤细胞和SP2细胞、COS细胞。
在一个方面中，本提供一种用于产生本发明的分离的抗体片段或多肽的方法，该方法包括自如本发明中所定义的宿主细胞表达本发明的分离的抗体片段或多肽。
在一个方面中，提供一种产生如本发明中所述的分离的抗体片段或多肽的方法，该方法包括：
a)用免疫原性组合物使牛免疫，以及
b)分离抗原特异性记忆B细胞，以及
c)对CDR-H3的cDNA或其部分进行测序，以及
d)表达或合成超长CDR-H3的凸起结构域或其部分，
其中免疫原性组合物包含目标抗原或其免疫原性部分、或编码其的DNA。
步骤a)
“免疫原性组合物”指能够在用该组合物施用的牛中产生免疫反应的组合物。免疫原性组合物通常允许在所施用牛中表达目标免疫原性抗原，牛抗体可针对该抗原作为免疫反应的一部分产生。
“蛋白免疫”指施用包含目标抗原的免疫原性蛋白或包含该目标抗原或其免疫原性部分的该蛋白的免疫原性部分的技术。
在一个实施方案中，免疫原性组合物包含全长蛋白。在另一实施方案中，免疫原性组合物包含蛋白的免疫原性部分。
“DNA免疫”指将编码全长蛋白或其包含目标抗原的免疫原性部分的经基因工程改造的核酸分子(本文中亦称为核酸疫苗或DNA疫苗)直接施用至牛细胞中以在该细胞中产生针对该目标抗原的免疫反应的技术。DNA免疫使用宿主细胞机制以表达对应于所施用核酸分子的肽和/或达成预期作用，尤其在细胞水平的抗原表达，以及另外在细胞水平或在宿主生物体内的免疫治疗作用。
“细胞免疫”指施用天然表达或经包含目标抗原的免疫原性蛋白或包含该目标抗原或其免疫原性部分的该蛋白的免疫原性部分转染的细胞的技术。在一个实施方案中，步骤a)的免疫使用具有经包含目标抗原的免疫原性蛋白或包含该目标抗原或其免疫原性部分的该蛋白的免疫原性部分转染的成纤维细胞的细胞免疫进行。
“免疫原性部分”意谓目标蛋白或抗原的一部分，其保留在施用目标蛋白或抗原的该部分或编码其的DNA的牛动物中诱导免疫反应的能力，以使得能够产生如本文中所公开的本发明的抗体片段。
在一个实施方案中，免疫步骤a)可使用蛋白免疫、DNA免疫或细胞免疫或其任何组合进行。
免疫步骤a)可使用初免-加强免疫方案进行，该初免-加强免疫方案意指首先施用(初免免疫或初免施用)免疫原性组合物，且随后在免疫方案的时程内时间上与首次施用间隔开的至少一次另外的施用(加强免疫或加强施用)。加强免疫涵盖一次、两次、三次或更多次施用。
在一个实施方案中，免疫步骤a)使用初免-加强免疫方案进行，该初免-加强免疫方案包含在第一佐剂存在下用目标抗原进行初免免疫，随后在第二佐剂存在下用该目标抗原进行至少一次加强免疫。
在一个实施方案中，免疫原性组合物通过皮下注射例如施用至肩部中。在一个实施方案中，目标抗原为补体的组分C5。
“佐剂”指免疫刺激剂。佐剂为本领域中熟知的物质。用作免疫刺激剂或抗原递送系统或两者的传统佐剂涵盖例如明矾、多糖、脂质体、基于生物可降解聚合物的纳米颗粒、脂多糖。举例而言，佐剂可为弗氏佐剂、Montanide佐剂或Fama佐剂。
步骤b)
用于分离抗原特异性记忆B细胞的方法已为人所熟知，且一般包含自外周血单核细胞(PBMC)或自次级淋巴器官，即自淋巴结或脾脏分离B细胞。在一个实施方案中，分离抗原特异性记忆B细胞在免疫步骤a)之后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30天进行。在一个实施方案中，分离抗原特异性记忆B细胞在免疫步骤a)之后24小时、36小时、48小时、60小时、72小时、84小时、96小时进行。在一个实施方案中，步骤b)包括通过流式细胞术分选抗原特异性B细胞。
步骤c)
步骤c)一般包含使用本领域中熟知的方法，例如包含对记忆B细胞的裂解物进行的RT-PCR的方法，自在步骤b)获得的记忆B细胞获得cDNA的第一步骤。对cDNA测序的方法为本领域中所熟知。步骤c)包括对CDR-H3的cDNA或其部分进行测序以鉴别超长CDR-H3。如本文中所公开，基于CDR-H3序列的尺寸和/或使用替代方法，诸如与超长CDR-H3的熟知和/或标准核酸或氨基酸序列的序列比对，与标准CDR-H3相比，步骤c)的序列分析允许鉴别超长CDR-H3。凸起结构域可随后如本发明中所描述地定义，且分离其序列。
举例而言，可使用如实施例中所述的用于扩增CDR-H3的cDNA的方法。该方法可包含对在步骤b)经分离的记忆B细胞的裂解物进行的RT-PCR的第一步骤。该方法可包含利用在CDR-H3两侧、退火至VH的保守框架3与框架4的引物进行初级聚合酶链反应(PCR)，从而扩增所有CDR-H3序列，与其长度或氨基酸序列无关。该方法可另外包含第二轮PCR以对CDR-H3序列进行条形码化以用于ion torrent测序，如实施例中所描述。
在一个实施方案中，用于对CDR-H3的cDNA或其部分进行测序的方法包括：
1)利用在CDR-H3两侧、退火至VH的保守框架3与框架4的引物进行初级PCR，以扩增所有CDR-H3序列，以及
2)第二轮PCR对CDR-H3序列进行条形码化以用于ion torrent测序。
在一个实施方案中，步骤1)所用的引物包含SEQ ID NO:446和SEQ IDNO:447或由其组成。在一个实施方案中，步骤2)所用的引物包含SEQ IDNO:448和SEQ ID NO:449或由其组成。
步骤d)
步骤d)可根据熟知方法进行以表达多肽，尤其通过使用如上文所述的克隆、表达载体和宿主细胞。
步骤d)备选地包括超长CDR-H3的凸起结构域或其部分的化学合成，其可根据包括如上文所述的熟知方法进行。
在一个实施方案中，产生本发明的分离的抗体片段的方法进一步包括例如针对与目标抗原的结合进行筛选的步骤。
任选地，该筛选步骤之前为将超长CDR-H3或超长CDR-H3的凸起结构域或其部分重新格式化为筛选格式的步骤。
在一个实施方案中，将超长CDR-H3或超长CDR-H3的凸起结构域或其部分重新格式化为筛选格式的步骤包括将超长CDR-H3或超长CDR-H3的凸起结构域或其部分融合至载体，任选地经由接头，例如可裂解接头进行融合。
应了解，筛选步骤可在步骤d)之前或之后进行。举例而言，本发明的分离的抗体片段(即超长CDR-H3的凸起结构域或其部分)可根据步骤d)在宿主细胞中表达，随后回收并针对与目标抗原的结合进行体外筛选，任选地在将超长CDR-H3的凸起结构域或其部分重新格式化为本发明中所述的筛选格式的步骤之后进行。
备选地，超长CDR-H3的凸起结构域可在步骤c)之后表达或合成为整个超长CDR-H3的一部分，以及在步骤d)之前，任选地在将超长CDR-H3重新格式化为本文所述的筛选格式的步骤之后，针对与目标抗原的结合进行筛选。在该备选方案中，已发现特异性结合目标抗原的超长CDR-H3中所包含的凸起结构域或其部分可在步骤d)表达或合成。
在一个实施方案中，载体为Fc多肽。本文所用的“Fc多肽”为包含Fc片段的多肽。在一个实施方案中，Fc多肽为scFc。本文所用的“单链Fc多肽”或“scFc”指包含两个CH2结构域和两个CH3结构域的单链多肽，其特征在于该CH2和CH3结构域在链内形成功能性Fc结构域。本发明的单链多肽中的功能性Fc结构域不是通过两条链的二聚化形成，即两个CH2结构域与两个CH3结构域存在于单链中且在单链内形成功能性Fc结构域。本文所用的术语“功能性”指在单链多肽内所形成的Fc结构域提供一种或多种通常与Fc结构域相关的效应功能的能力，但应了解其他功能可经工程改造至该结构域中。
在一个实施方案中，载体为scFc，且包含序列SEQ ID NO:155。在一个实施方案中，载体为scFc，且融合蛋白包含接头，其中接头包含TEV蛋白酶裂解位点和Gly-Ser接头。在一个实施方案中，载体为scFc，且融合蛋白包含序列SEQ ID NO:156。
适用于本发明的情形的额外scFc序列和变体已在WO2008/012543中描述。
在一个方面中，本发明提供一种产生如本发明中所述的分离的抗体片段的方法，该方法包括：
a)用免疫原性组合物使牛免疫，以及
b)自PBMC或次级淋巴器官分离总RNA，以及
c)扩增超长CDR-H3的cDNA，以及
d)对超长CDR-H3或其部分进行测序；以及
e)表达或合成超长CDR-H3的凸起结构域或其部分，
其中免疫原性组合物包含目标抗原或其免疫原性部分、或编码其的DNA。
步骤a)如上所述。
步骤b)，用于自PBMC或次级淋巴器官分离总RNA的方法为本领域所熟知。
应了解，步骤c)一般包括使用RT-PCR自步骤b)获得的总RNA获得cDNA的第一步骤。有利地，在步骤c)，可使用直接地扩增超长CDR-H3的cDNA且与标准CDR-H3区分的方法。该方法可包括利用在CDR-H3两侧、退火至VH的保守框架3和框架4的引物进行初级聚合酶链反应(PCR)，从而扩增所有CDR-H3序列，与其长度或氨基酸序列无关。该方法可另外包括使用茎引物进行第二轮PCR以特异性扩增来自初级PCR的超长序列。此方法是有利的，因为其允许将目标超长CDR-H3的序列直接克隆至表达载体中。
在一个实施方案中，用于扩增CDR-H3的cDNA的方法包括：
1)使用在CDR-H3两侧、退火至VH的保守框架3和框架4的引物进行初级PCR，以扩增所有CDR-H3序列，以及
2)使用茎引物进行第二轮PCR以特异性扩增来自初级PCR的超长序列。
在一个实施方案中，步骤1)所用的引物包含SEQ ID NO:446和SEQ IDNO:447或由其组成。在一个实施方案中，步骤2)所用的引物选自由SEQ IDNO:482至SEQ ID NO:494组成的组。应了解，步骤2)所用的引物包含一种递增引物和一种递减引物，即引物可包含SEQ IDNO:482至SED ID NO:488中任一项的一种递增引物以及SEQ ID NO:489至SEQ ID NO:494中任一项的一种递减引物。
步骤d)包括对CDR-H3的cDNA或其部分进行测序以鉴别超长CDR-H3的凸起结构域肽或其部分。步骤d)可根据本领域熟知的方法，诸如直接核苷酸测序进行。
步骤e)如上所述。
在一个实施方案中，产生本发明的分离的抗体片段的方法进一步包含例如针对与目标抗原的结合进行筛选的步骤。任选地，筛选步骤之前为将超长CDR-H3或超长CDR-H3的凸起结构域或其部分重新格式化为如本文所述的筛选格式的步骤。筛选步骤可在步骤e)之前或之后进行。举例而言，本发明的分离的抗体片段(即超长CDR-H3的凸起结构域或其部分)可根据步骤e)在宿主细胞中表达，随后回收并针对与目标抗原的结合进行体外筛选，任选地在将超长CDR-H3的凸起结构域或其部分重新格式化为本发明中所述的筛选格式的步骤之后。
备选地，超长CDR-H3的凸起结构域可在步骤d)之后表达或合成为整个超长CDR-H3的一部分，且在步骤e)之前，任选地在将超长CDR-H3重新格式化为如本文所述的筛选格式的步骤之后，针对与目标抗原的结合进行筛选。在该备选方案中，已发现特异性结合目标抗原的超长CDR-H3中所包含的凸起结构域或其部分可在步骤e)表达或合成。
在另一方面中，本发明提供一种产生如本发明中所述的分离的抗体片段的方法，该方法包括：
a)用免疫原性组合物使牛免疫，以及
b)分离抗原特异性记忆B细胞，以及
c)扩增超长CDR-H3的cDNA，以及
d)对超长CDR-H3进行测序；以及
e)表达或合成超长CDR-H3的凸起结构域或其部分，
其中免疫原性组合物包含目标抗原或其免疫原性部分、或编码其的DNA。
步骤a)至e)如上文所述。
在一个实施方案中，产生如本发明中所述的分离的抗体片段的方法进一步包括例如针对与目标抗原的结合进行筛选的步骤，该筛选步骤如上文所述，且特别地可在步骤e)之前或之后进行。
抗体片段文库
在一个方面中，本发明提供免疫文库以及用于生成免疫文库的方法，该免疫文库包含本发明的分离的抗体片段，尤其是牛超长CDR-H3的凸起结构域或其部分的多样性或编码其的DNA或RNA序列的多样性。
有利地，本发明提供发现治疗性抗体片段及自其衍生的多肽的新方法，该方法包括用如上文所述的目标抗原使牛免疫。可能生成分离的牛抗体片段，尤其是牛超长CDR-H3的凸起结构域及其部分的广泛免疫文库，且可能针对例如对其与目标抗原的结合和/或结合亲和力，尤其通过展示技术对具有所需要作用的那些凸起结构域进行筛选和选择。
抗体片段的免疫谱使用编码本发明的牛抗体片段的遗传信息生成，该牛抗体片段可衍生自从施用了目标抗原的牛分离的B细胞。免疫文库可使用牛抗体片段的展示技术，例如使用体外展示技术(诸如噬菌体展示、细菌展示、酵母展示、核糖体展示、mRNA展示)进行筛选。哺乳动物细胞展示可有利于富含二硫键的蛋白，诸如牛超长CDR-H3或其片段的展示，例如如Crook,Z.R.等人.Publisher Correction:Mammalian display screening ofdiverse cystine-dense peptides for difficult to drug targets.NatCommun 9,1072,(2018)中所述。
在一个实施方案中，本发明提供在哺乳动物细胞表面表达为融合蛋白，诸如Fc多肽融合蛋白的本发明的分离的抗体片段的文库。在一个实施方案中，本发明提供牛超长CDR-H3的凸起结构域的文库。
在一个实施方案中，本发明提供由尚未施用免疫原的动物制备的本发明的分离的抗体片段的免疫文库或天然文库。在一个实施方案中，本发明提供本发明的分离的抗体片段的噬菌体展示文库。在该实施方案中，本发明的分离的抗体片段可使用任何适合的方法在噬菌体的表面直接地表达。
在一个方面中，本发明提供超长CDR-H3序列的文库，即本发明的分离的抗体片段的文库，此时表达为CDR-H3的全序列(即包含凸起和茎结构域)的一部分。在一个实施方案中，文库为天然文库。在一个实施方案中，天然文库从牛制备。在另一实施方案中，文库为免疫文库。在一个实施方案中，文库从免疫的牛制备。在一个特定方面中，本发明提供任选展示在CDR-H3的全序列内的本发明的分离的抗体片段的噬菌体展示文库。在一个实施方案中，噬菌体展示文库为M13噬菌体展示文库。在一个实施方案中，任选展示在CDR-H3的全序列内的本发明的分离的抗体片段直接地融合至M13噬菌体的pIII外壳蛋白。在一个实施方案中，任选展示在CDR-H3的全序列内的本发明的分离的抗体片段经由接头(或“间隔体”)融合至M13噬菌体的pIII外壳蛋白。适合接头可为允许分隔富含半胱氨酸的结构域与pIII的半胱氨酸、尤其确保pIII和凸起结构域肽独立地且正确地折叠的接头。用于产生噬菌体展示文库的方法已为人所熟知。噬菌粒载体例如描述于Hoogenboom HR等人(Hoogenboom HR,Multi-subunit proteins on the surface of filamentous phage:methodologies fordisplaying antibody(Fab)heavy and light chains.Nucleic Acids Res.1991；19(15):4133-4137)中。在一个实施方案中，本发明的分离的抗体片段的噬菌体展示文库包含序列SEQ ID NO:477和/或SEQ ID NO:104和/或SEQ ID NO:13和/或SEQ ID NO:1的CDR-H3。
在一个方面中，本发明提供一种噬菌体展示文库，其包含多个重组噬菌体；该多个重组噬菌体各自包含M13衍生的表达载体，其中M13衍生的表达载体包含编码如本发明中所公开的分离的抗体片段的多核苷酸序列，该分离的抗体片段任选展示在超长CDR-H3的全序列内。在一个实施方案中，任选展示在超长CDR-H3的全序列内的分离的抗体片段直接地或经由间隔体融合至编码M13噬菌体的pIII外壳蛋白的序列。
在一个方面中，本发明提供用于生成超长CDR-H3序列的噬菌体展示文库，即展示在CDR-H3的全序列内的本发明的分离的抗体片段的文库的方法。举例而言，可使用如实施例12中所述的方法，其中超长CDR-H3的全序列直接地融合至M13噬菌体的pIII外壳蛋白。
在一个方面中，提供一种生成超长CDR-H3序列的免疫噬菌体展示文库的方法，该方法包括：
a)用免疫原性组合物使牛免疫，以及
b)自PBMC或次级淋巴器官分离总RNA，以及
c)扩增超长CDR-H3的cDNA序列，以及
d)将c)中所获得的序列融合至噬菌粒载体内编码M13噬菌体的pIII蛋白的序列，以及
e)用步骤d)中所获得的噬菌粒载体与辅助噬菌体共感染组合来转化宿主细菌，以及
f)培养步骤e)中所获得的细菌，以及
g)自细菌的培养基回收噬菌体，
其中免疫原性组合物包含目标抗原或其免疫原性部分、或编码其的DNA。
步骤a)至g)为本领域熟知的方法。举例而言，步骤a)至g)可如实施例12中所述进行。具体地，对于步骤c)，可使用如实施例12中所述的用于扩增CDR-H3的cDNA的方法。该方法可包含利用在CDR-H3两侧、退火至VH的保守框架3和框架4的引物进行初级PCR，以扩增所有CDR-H3序列，与其长度或氨基酸序列无关。该方法可另外包含使用茎引物进行第二轮PCR以特异性扩增来自初级PCR的超长序列。
在一个实施方案中，用于扩增CDR-H3的cDNA的方法包括：
1)使用在CDR-H3两侧、退火至VH的保守框架3和框架4的引物进行初级PCR，以扩增所有CDR-H3序列，以及
2)使用茎引物进行第二轮PCR以特异性扩增来自初级PCR的超长序列。
在一个实施方案中，步骤1)所用的引物包含SEQ ID NO:446和SEQ ID NO:447或由其组成。在一个实施方案中，步骤2)所用的引物选自由SEQ ID NO:482至SEQ ID NO:494组成的组。应了解，步骤2)所用的引物包含一种递增引物和一种递减引物，即引物可包含SEQID NO:482至SED ID NO:488中任一项的一种递增引物和SEQ ID NO:489至SEQ ID NO:494中任一项的一种递减引物。
在一个方面中，本发明提供一种用于产生结合目标抗原的本发明的分离的抗体片段的方法，该方法包括：
a)生成超长CDR-H3的噬菌体展示文库；以及
b)针对目标抗原富集噬菌体展示文库以产生结合目标抗原的富集噬菌体群；以及
c)对来自步骤b)中所获得的富集噬菌体群的超长CDR-H3进行测序；以及
d)表达或合成衍生自步骤c)中所获得的超长CDR-H3的分离的抗体片段(即超长CDR-H3的凸起结构域或其部分)。
步骤a)至d)为本领域熟知的方法。举例而言，步骤a)至d)可如实施例12中所述进行。举例而言，在步骤b)针对目标抗原富集噬菌体展示文库可通过针对目标抗原淘选步骤a)所获得的文库进行。富集的亚文库可通过如实施例中所述的单克隆噬菌体筛选ELISA进行进一步筛选。
在步骤c)，超长CDR-H3序列的序列可使用PCR使用适当的引物，例如退火至噬菌粒载体的测序引物进行扩增。在一个实施方案中，所用引物包含SEQ ID NO:495和/或SEQ IDNO:496或由其组成。
在另一方面中，本发明提供一种用于产生结合目标抗原的本发明的分离的抗体片段的方法，该方法包括：
a)生成本发明的分离的抗体片段的噬菌体展示文库；以及
b)针对目标抗原富集噬菌体展示文库以产生结合目标抗原的富集噬菌体群；以及
c)测序来自步骤b)中所获得的富集噬菌体群的分离的抗体片段；以及
d)表达或合成步骤c)中所获得的分离的抗体片段(即超长CDR-H3的凸起结构域或其部分)。
步骤a)可根据如本发明中所公开的方法进行。
步骤b)至d)如上文所公开。
有利地，本发明提供避开为发现牛抗体片段而进行的细胞分选和深度测序的途径，因此CDR-H3序列的文库可针对与一种抗原、或一组抗原的结合使用体外展示技术进行克隆和筛选。
文库将一般含有至少102个成员，更优选至少106个成员，且更优选至少10’个成员(例如mRNA-多肽复合物中任一种)。在一些实施方案中，文库将包括至少1012个成员或至少1014个成员。一般而言，成员将彼此不同；然而，预期任何文库中将存在一定程度的冗余。
在另一方面中，本发明提供合成文库以及用于生成合成文库的方法，该合成文库包含本发明的分离的抗体片段的多样性或编码其的DNA或RNA序列的多样性。
合成文库可包含在细胞表面表达的分离的抗体片段。合成文库可使用展示技术，例如使用体外展示技术(诸如噬菌体展示、细菌展示、酵母展示、核糖体展示、mRNA展示)进行筛选。也可使用哺乳动物细胞展示。
在一个方面中，本发明提供合成文库以及用于生成合成文库的方法，该合成文库包含融合至(或插入至)适合骨架，优选地蛋白框架中的本发明的分离的抗体片段。适合蛋白框架可为另一种抗体片段，例如抗体的抗原结合片段，诸如VHH、VH、VL、Fab、scFv和dsscFv或任何其他适合的基础结构。举例而言，本发明的分离的抗体片段可插入至VH或VL结构域中，更具体地插入至VH或VL的框架3区中，例如如WO2020/011868中所描述，该文献以引用的方式并入本文中。
合成文库可使用展示技术，例如使用体外展示技术(诸如噬菌体展示、细菌展示、酵母展示、核糖体展示、mRNA展示)进行筛选，其中本发明的各分离的抗体片段表达为与适合蛋白框架(诸如抗原结合片段)的融合蛋白的一部分。
在一个实施方案中，融合蛋白由任选地经由一个或多个(例如两个)接头融合至适合蛋白框架(诸如抗原结合片段)的本发明的分离的抗体片段组成。在另一实施方案中，融合蛋白包含本发明的分离的抗体片段，其任选展示在CDR-H3的全序列或其部分内，任选经由一个或多个，例如两个接头融合至适合蛋白框架，诸如抗原结合片段。
在一个方面中，本发明提供本发明的分离的抗体片段的合成噬菌体展示文库，其中分离的抗体片段中的每一个展示为与抗体的抗原结合片段的融合蛋白的一部分。在一个实施方案中，融合蛋白包含任选展示在CDR-H3的全序列或其部分内的本发明的分离的抗体片段。在一个实施方案中，抗体的抗原结合片段为VHH。因此，本发明提供包含本发明的分离的抗体片段的噬菌体展示文库，本发明的分离的抗体片段任选展示在CDR-H3的全序列或其部分内，在噬菌体表面表达为VHH融合蛋白。在一个实施方案中，任选展示在CDR-H3的全序列或其部分内的本发明的各分离的抗体片段任选地经由一个或多个接头插入至VHH中，例如未结合VH框架3环中。适合的接头可改进分离的抗体片段或CDR-H3的全序列和VHH的独立且正确的折叠。在一个实施方案中，VHH噬菌体展示文库为VHH M13噬菌体展示文库。在一个实施方案中，VHH融合蛋白直接地融合至M13噬菌体的pIII外壳蛋白。在一个实施方案中，VHH融合蛋白经由接头融合至M13噬菌体的pIII外壳蛋白。在一个实施方案中，VHH包含或具有序列SEQ ID NO:351。在一个实施方案中，本发明的分离的抗体片段的噬菌体展示文库包含序列SEQ ID NO:476和/或SEQ ID NO:478和/或SEQ ID NO:479和/或SEQ ID NO:480的VHH融合蛋白。
用于产生噬菌体展示文库的方法已为人所熟知。本发明中所描述用于产生噬菌体-VHH文库的方法可作为实例使用，其中CDR-H3插入至VHH中。
药物组合物及医疗用途
在一个方面中，本发明提供包含如本发明中所定义的分离的抗体片段或多肽以及与一种或多种药学上可接受的赋形剂组合的药物组合物。
如本文所用的术语“药学上可接受的赋形剂”指用于增强本发明的组合物的所要特征的药学上可接受的制剂载剂、溶液或添加剂。赋形剂为本领域所熟知，且包括缓冲液(例如，柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液及碳酸氢盐缓冲液)、氨基酸、脲、醇、抗坏血酸、磷脂、蛋白(例如血清白蛋白)、EDTA、氯化钠、脂质体、甘露醇、山梨醇和甘油。溶液或混悬液可包封在脂质体或生物可降解微球体中。制剂一般将采用无菌制造过程以实质上无菌形式提供。此可包括通过过滤用于制剂的缓冲溶剂溶液、将分离的抗体片段无菌混悬于无菌缓冲溶剂溶液中以及通过本领域普通技术人员所熟悉的方法将制剂分配至无菌容器中来产生及灭菌。
药学上可接受的载剂自身不应诱导产生对接受组合物的个体有害的抗体且不应有毒。适合载剂可为大的缓慢代谢的巨分子，诸如蛋白、多肽、脂质体、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚氨基酸、氨基酸共聚物和非活性病毒颗粒。
可使用药学上可接受的盐，例如无机酸盐，诸如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐和硫酸盐，或有机酸盐，诸如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐和苯甲酸盐。
治疗性组合物中的药学上可接受的载剂可另外含有液体，诸如水、生理盐水、甘油和乙醇。另外，诸如湿润剂或乳化剂或pH缓冲物质的辅助物质可存在于该组合物中。所述载剂使得药物组合物能够配制成片剂、丸剂、糖衣药丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液和混悬液，以便患者摄入。
本发明的分离的抗体片段或多肽可以分散于溶剂中，例如呈溶液或混悬液形式进行递送。其可混悬于适合生理溶液，例如生理盐水、药理学上可接受的溶剂或缓冲溶液中。
药学上可接受的载剂的充分论述可获自Remington’s Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Company,N.J.1991)。
药物组合物适当地包含治疗有效量的本发明的分离的抗体片段或多肽。如本文所用，术语“治疗有效量”指治疗、改善或预防靶向性疾病或病况或呈现可检测的治疗或预防作用所需要的治疗剂的量。关于任何抗体片段，治疗有效量可最初在细胞培养分析中或在动物模型中，通常在啮齿动物、兔、狗、猪或灵长类动物中估算。动物模型亦可用于确定适当的施用浓度范围和途径。该信息可随后用于判定适用于在人中施用的剂量和途径。用于人受试者的精确治疗有效量将取决于疾病状态的严重程度、受试者的整体健康状况、受试者的年龄、体重及性别、饮食、施用的时间及频率、药物组合、反应敏感性及对疗法的耐受性/反应。该量可以通过常规实验确定且在临床医师的判断内。
组合物可单独地向患者施用或可与其他药剂、药物或激素组合施用(例如同时、顺次或分别)。如本文所采用的药剂指在施用时具有生理影响的实体。如本文所采用的药物指在治疗剂量下具有适当的生理影响的化学实体。
施用本发明的分离的抗体片段或多肽的剂量视待治疗的病况的性质、存在的炎症的程度和分离的抗体片段是否正预防性使用或正用于治疗现有病况而定。
给药频率将视分离的抗体片段或多肽的半衰期及其作用的持续时间而定。若分离的抗体片段或多肽具有短半衰期(例如2至10小时)，则可能需要每日给予一次或多次剂量。备选地，若分离的抗体片段或多肽具有长半化期(例如2至15天)，则可能仅需要给予每日一次、每周一次或甚至每隔1或2个月一次剂量。
本发明的药物组合物可通过多种途径施用，包括但不限于经口、静脉内、肌肉内、动脉内、髓内、鞘内、心室内、透皮、经皮、皮下、腹膜内、鼻内、经肠、局部、舌下、阴道内或经直肠途径。也可以使用无针注射器来施用本发明的药物组合物。
适合的施用形式包括适合于肠胃外施用的形式，例如通过注射或输注，例如通过弹丸注射或连续输注。在产品用于注射或输注的情况下，其可采用于油性或水性媒剂中的混悬液、溶液或乳液的形式且其可含有调配剂，诸如混悬剂、防腐剂、稳定剂和/或分散剂。备选地，分离的抗体片段可呈干燥形式，用于在使用前用适当无菌液体复原。
组合物的直接递送将一般通过皮下、腹膜内、经静脉内或肌肉内注射实现，或递送至组织之间质间隙。亦可将组合物施用至相关特定组织中。剂量治疗可为单次剂量时程或多次剂量时程。
在一个实施方案中，制剂作为用于包括吸入在内的局部施用的制剂来提供。
适合的可吸入制剂包括可吸入粉末、含有推进剂气体的计量气雾剂或不含推进剂气体的可吸入溶液(诸如可雾化溶液或混悬液)。根据本发明的含有活性物质的可吸入粉末可仅由上文所提及的活性物质组成或由上文所提及的活性物质与生理学上可接受的赋形剂的混合物组成。可用于制备可吸入气雾剂的推进剂气体为本领域已知的。适合的推进剂气体选自烃类，诸如正丙烷、正丁烷或异丁烷，以及卤代烃类，诸如甲烷、乙烷、丙烷、丁烷、环丙烷或环丁烷的氯化和/或氟化衍生物。上文所提及的推进剂气体可独立地或以其混合物形式使用。
含有推进剂气体的可吸入气雾剂亦可含有其他成分，诸如共溶剂、稳定剂、表面活性剂、抗氧化剂、润滑剂和用于调节pH的手段。所有这些成分均为本领域已知的。根据本发明的含有推进剂气体的可吸入气雾剂可含有至多5重量％的活性物质。根据本发明的气雾剂含有例如0.002至5重量％、0.01至3重量％、0.015至2重量％、0.1至2重量％、0.5至2重量％或0.5至1重量％的活性物质。
备选地，也可以通过施用液体溶液或混悬液制剂，例如采用诸如喷雾器的装置，例如连接至压缩器的喷雾器(例如，由弗吉尼亚州里士满(Richmond,Va.)Pari RespiratoryEquipment公司制造的连接至Pari Master(R)压缩器的Pari LC-Jet Plus(R)喷雾器)向肺部局部施用。
在一个实施方案中，制剂作为用于通过雾化递送的含有单位剂量的离散安瓿提供。
在一个实施方案中，分离的抗体片段或多肽以冻干形式供应，以用于复原或备选地作为混悬液制剂。
本发明的分离的抗体片段或多肽可以分散于溶剂中，例如呈溶液或混悬液形式进行递送。其可混悬于适合生理溶液，例如生理盐水、药理学上可接受的溶剂或缓冲溶液中。本领域已知的缓冲溶液可每1ml水含有0.05mg至0.15mg乙二胺四乙酸二钠、8.0mg至9.0mgNaCl、0.15mg至0.25mg聚山梨醇酯、0.25mg至0.30mg无水柠檬酸和0.45mg至0.55mg柠檬酸钠以达成约4.0至5.0的pH。如上文所提及，混悬液可例如由冻干的分离的抗体片段或多肽制成。
根据本发明的可雾化制剂可例如作为封装在箔封套中的单次剂量单位(例如密封塑料容器或小瓶)提供。各小瓶含有在例如2ml体积的溶剂/溶液缓冲液中的单位剂量。
认为本发明的分离的抗体片段或多肽适于经由雾化递送。
本发明还提供一种用于制备药物或诊断性组合物的方法，其包含添加本发明的分离的抗体片段或多肽且将其与药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载剂中的一种或多种混合在一起。
本发明还提供通过基因疗法，尤其通过腺相关病毒(AAV)载体递送如本文所述的分离的抗体片段的方法及组合物。
因此，本发明提供一种药物组合物，其包含具有病毒衣壳的病毒载体和包含反向末端重复序列(ITR)侧接的表达盒的人工基因组，其中表达盒包含有包含编码如本文所述的分离的抗体的多核苷酸序列的转基因。ITR序列可用于将包含编码如本文所述的分离的抗体片段或多肽的多核苷酸序列的人工基因组包装至病毒载体的病毒粒子中。
表达盒中的转基因可操作地连接至表达控制元件，诸如启动子，其将控制转基因在人细胞中的表达。
病毒载体优选地为基于AAV的病毒载体。各种AAV衣壳在本领域已有记载。生成AAV载体的方法也已充分记载在文献(例如WO 2003/042397；WO 2005/033321、WO 2006/110689；美国专利号7,588,772B2)中。AAV衣壳的来源可选自靶向所要组织的AAV。举例而言，适合AAV可包括例如AAV9(美国专利号7,906,111；US 2011-0236353-A1)、rh10(WO2003/042397)和/或hu37(US 7,906,111B2；US20110236353)。然而，还可选择其他AAV，包括例如AAV1、AAV2、AAV-TT、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8和AAV.PHP.B(或其变体)和其他者。
生成并分离适合于向受试者递送的AAV病毒载体的方法为本领域已知的(US7,790,449B2；US7,282,199B2；WO 2003/042397；WO 2005/033321、WO 2006/110689；和US7,588,772 B2)。
在一个方面中，本发明提供如本发明中所定义的分离的抗体片段或多肽以用于疗法。
本发明的分离的抗体片段和多肽适用于治疗疾病或病症，包括炎性疾病和病症、免疫疾病和病症、补体相关疾病和病症、自体免疫疾病、血管适应症、神经疾病和病症、肾相关适应症、眼部疾病。
在一些实施方案中，当C5裂解导致疾病、病症和/或病况进展时，根据本发明的分离的抗体片段、多肽及其药物组合物可适用于治疗疾病、病症和/或病况。所述疾病、病症和/或病况可包括但不限于免疫和自体免疫、神经、心血管、肺部和眼部疾病、病症和/或病况。
免疫和自体免疫疾病和/或病症可包括但不限于急性播散性脑脊髓炎(ADEM)、急性坏死性出血性脑白质炎、艾迪生病(Addison’s disease)、无γ球蛋白血症(Agammaglobulinemia)、斑秃、淀粉样沉积症、强直性脊椎炎、器官移植之后急性抗体介导的排斥反应、抗GBM/抗TBM肾炎、抗磷脂综合征(APS)、自体免疫血管性水肿、自体免疫再生不全性贫血、自体免疫自主神经失调、自体免疫肝炎、自体免疫高脂质血症、自体免疫缺陷症、自体免疫内耳疾病(AIED)、自体免疫心肌炎、自体免疫胰脏炎、自体免疫视网膜病变、自体免疫血小板减少性紫癜病(ATP)、自体免疫甲状腺疾病、自体免疫荨麻疹、轴突和神经元神经病变、细菌性败血症和脓毒性休克、巴洛病(Balo disease)、白塞氏病(Behcet’sdisease)、大疱性类天疱疮、心肌病、卡斯特曼氏病(Castleman disease)、乳糜泻、查加斯病(Chagas disease)、慢性疲劳综合征、慢性炎性脱髓鞘多发性神经病变(CIDP)、长期复发性多病灶骨髓炎(CRMO)、查格-施特劳斯综合征(Churg-Strauss syndrome)、瘢痕性类天疱疮/良性黏膜类天疱疮、克罗恩氏病(Crohn’s disease)、柯根氏综合征(Coganssyndrome)、冷凝集素病、先天性心传导阻滞、柯沙奇心肌炎(Coxsackie myocarditis)、CREST病、原发性混合性冷凝球蛋白症、脱髓鞘神经病变、疱疹样皮炎、皮肌炎、德维克氏病(Devic’s disease)(视神经脊髓炎)、I型糖尿病、盘状狼疮、德雷斯勒氏综合征(DressIer’s syndrome)、子宫内膜异位症、嗜酸性食道炎、嗜酸性筋膜炎、结节性红斑、实验性过敏性脑脊髓炎、伊凡氏综合征(Evans syndrome)、肌肉纤维疼痛、纤维化肺泡炎、巨大细胞动脉炎(颞动脉炎)、肾小球肾炎、古巴斯德氏综合征(Goodpasture’s syndrome)、肉芽肿伴随多血管炎(GPA)、参见韦格纳氏病(Wegener’s disease)、格雷夫氏病(Graves’disease)、吉兰-巴雷综合征(Guillain-Barre syndrome)、桥本氏脑炎(Hashimoto’s encephalitis)、桥本氏甲状腺炎、溶血性贫血(包括非典型性溶血性尿毒性综合征和抗血浆疗法非典型性溶血性尿毒性综合征)、荷-索二氏紫癜病(Henoch-Schonlein purpura)、妊娠性疱疹、低γ球蛋白血症、特发性血小板减少性紫癜病(ITP)、IgA肾病、IgG4相关硬化性疾病、免疫调节脂蛋白、包涵体肌炎、胰岛素依赖性糖尿病(1型)、间质性膀胱炎、青少年关节炎、青少年糖尿病、川崎综合征(Kawasaki syndrome)、兰伯特-伊顿综合征(Lambert-Eaton syndrome)、大血管血管病变、白血球破裂性血管炎、扁平苔癣、硬化性苔癣、木样结膜炎、线性IgA疾病(LAD)、狼疮(SLE)、莱姆病(Lyme disease)、梅尼尔氏病(Meniere’s disease)、显微多血管炎、混合性结缔组织疾病(MCTD)、穆伦氏溃疡(Mooren’s ulcer)、穆-哈二氏病(Mucha-Habermann disease)、多发性内分泌瘤综合征、多发性硬化症、多病灶运动神经病、肌炎、重症肌无力、嗜睡症、视神经脊髓炎(德维克氏病)、中性粒细胞减少症、眼部瘢痕性类天疱疮、视神经炎、骨关节炎、阵发性风湿症、与链球菌相关的儿童自体免疫神经精神病症(Pediatric Autoimmune Neuropsychiatric Disorders Associated withStreptococcus；PANDAS)、副肿瘤小脑退化症、阵发性夜间血红素尿症(Paroxysmalnocturnal hemoglobinuria；PNH)、帕瑞隆伯格综合征(Parry Romberg syndrome)、帕森奇-特纳综合征(Parsonnage-Turner syndrome)、睫状体扁平部炎(周边葡萄膜炎)、天疱疮、周边神经病变、静脉周脑脊髓炎、恶性贫血、POEMS综合征、结节性多动脉炎、I型、II型和III型自体免疫多腺综合征、多内分泌病变、风湿性多肌痛、多发性肌炎、心肌后梗塞综合征、心包切开术后综合征、孕酮皮炎、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、牛皮癣、牛皮癣性关节炎、特发性肺纤维化、坏疽性脓皮病、纯红细胞发育不全、雷诺氏现象(Raynauds phenomenon)、反应性关节炎、交感反射性营养不良综合征、莱特尔氏综合征(Reiter’s syndrome)、复发性多软骨炎、腿不宁综合征、腹膜后纤维化、风湿热、类风湿性关节炎、类肉瘤病、斯密特氏综合征(Schmidt syndrome)、巩膜炎、硬皮病、产志贺毒素大肠杆菌溶血性尿毒性综合征(STEC-HUS)、舍格伦综合征(Sjogren’s syndrome)、小血管血管病变、精子和睾丸自体免疫、僵人综合征、亚急性细菌性心内膜炎(SBE)、苏萨克氏综合征(Susac’s syndrome)、交感神经眼炎、高安氏动脉炎(Takayasu’s arteritis)、颞动脉炎/巨大细胞动脉炎、血小板减少性紫癜病(Thrombocytopenic purpura；TTP)、托-亨二氏综合征(Tolosa-Hunt syndrome)、横贯性脊髓炎、小管自体免疫病症、溃疡性结肠炎、未分化的结缔组织疾病(UCTD)、葡萄膜炎、水疱皮肤病、血管炎、白斑病和韦格纳氏肉芽肿病(亦称为肉芽肿伴随多血管炎(GPA))。
神经疾病、病症和/或病况可包括但不限于阿尔茨海默病(Alzheimer’sdisease)、帕金森病(Parkinson’s disease)、路易体性痴呆(Lewy body dementia)和多发性硬化症。
心血管疾病、病症和/或病况可包括但不限于动脉粥样硬化、心肌梗塞、中风、血管炎、创伤(手术)和由心血管干预(包括但不限于心脏旁路手术、动脉接枝和血管成形术)引起的病况。
肺部疾病、病症和/或病况可包括但不限于哮喘、肺纤维化、慢性阻塞性肺病(COPD)和成人呼吸窘迫综合征。
眼部相关应用包括但不限于：年龄相关黄斑部变性、过敏性和巨乳头状结膜炎、白塞氏病、脉络膜炎症、与眼内手术相关的并发症、角膜移植排斥反应、角膜溃疡、巨细胞病毒视网膜炎、干眼综合征、内眼炎、法曲氏病(Fuch’s disease)、青光眼、免疫复合性血管炎、炎性结膜炎、缺血性视网膜疾病、角膜炎、黄斑部水肿、眼部寄生虫侵染/迁移、色素性视网膜炎、巩膜炎、斯特格氏病(Stargardt disease)、视网膜下纤维化、葡萄膜炎、玻璃体-视网膜炎症和原田氏病(Vogt-Koyanagi-Harada disease)。
在一个实施方案中，本发明提供如本发明中所定义的分离的抗体片段或多肽或药物组合物以用于预防和/或治疗病理学疾病、病症或病况，其选自由以下组成的组：感染(病毒、细菌、真菌和寄生虫)、与感染相关的内毒素休克、关节炎(诸如类风湿性关节炎)、哮喘(诸如重度哮喘)、慢性阻塞性肺病(COPD)、骨盆炎性疾病、阿尔茨海默病、炎性肠病、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、佩罗尼氏病(Peyronie’s Disease)、乳糜泻、胆囊疾病、潜毛病(ilonidal disease)、腹膜炎、牛皮癣、血管炎、手术黏连、中风、I型糖尿病、莱姆病、脑膜脑炎、自体免疫葡萄膜炎、中枢和周边神经系统的免疫介导的炎性病症(诸如多发性硬化症、狼疮(诸如全身性红斑狼疮)和吉兰-巴雷综合征)、异位性皮炎、自体免疫肝炎、纤维化肺泡炎、格雷夫氏病、IgA肾病、特发性血小板减少性紫癜病、梅尼尔氏病、天疱疮、原发性胆汁性肝硬化、类肉瘤病、硬皮病、韦格纳氏肉芽肿病、其他自体免疫病症、胰脏炎、创伤(手术)、移植物抗宿主疾病、移植排斥反应、心脏病(包括缺血性疾病，诸如心肌梗塞以及动脉粥样硬化)、血管内凝聚、骨骼再吸收、骨质疏松、骨关节炎、齿根骨膜炎和胃酸过少症。
实现小分子药物发现的分离的抗体片段
在另一方面中，本发明涉及采用抗体-蛋白靶标相互作用以帮助呈现和/或保持蛋白的构象来鉴别治疗性相关化合物的改进方法，该构象暴露或呈现具有改变蛋白功能的可能性的结合位点，且可能封闭在“天然”构象中。该方法已描述于2014年1月3日公开的WO2014/001557和Lawson,A.Nat Rev Drug Discovery 11,519-525,(2012)中。
因此，本发明的分离的抗体片段可用作促进化学药物发现的工具。
因此，在一个方面中，提供一种鉴别能够结合目标蛋白或其蛋白片段的功能性构象状态的化合物的方法，该方法包括以下步骤：
(a)使本发明的功能改变的分离的抗体片段结合至相关目标蛋白或其片段以提供抗体限制性蛋白或片段，其中分离的抗体片段与该蛋白或片段具有结合动力学，以使得其具有低解离速率常数，
(b)提供具有低分子量的测试化合物，
(c)评估步骤b)的测试化合物是否结合抗体限制性蛋白或片段，以及
(d)基于结合至蛋白或其片段的能力选择来自步骤c)的化合物。
在一个实施方案中，该方法包括评估步骤d)中选择的化合物的类似物关于结合至步骤a)中制备的抗体限制性蛋白或片段的结合的另一步骤。
在一个实施方案中，该方法进一步包括进行合成化学方法以改变或详细描述在步骤d)中选择的第一测试化合物的步骤。
在一个实施方案中，该方法包括产生三维结构信息，例如在步骤c)与步骤d)之间或在步骤d)之后采用X射线结晶学以获得关于测试化合物的结合的结构信息的另一步骤。
在一个实施方案中，抗体限制性蛋白或片段用于例如在步骤c)中鉴别的结合化合物存在的情况下采用X射线结晶学产生三维结构信息，且任选地包括基于自其所获得的三维结构信息进行运算建模的另一步骤。
3D结构表示
在一个实施方案中，至少一个该分离的抗体片段与目标蛋白复合的三维结构表示随后产生以获得关于以下的信息：分离的抗体片段结合目标蛋白的位置、目标蛋白的功能性构象状态和目标蛋白和分离的抗体片段上的哪些氨基酸残基以及因此哪些原子彼此接触或彼此相互作用。此可视需要在步骤a)或步骤b)之前进行。
结构分析揭示的功能性构象状态可为先前已知或未知的。在一个实例中，抗体-目标蛋白结构分析揭示的功能性构象状态为新的。在一个实例中，抗体-目标蛋白的结构分析揭示先前封闭的结构特征，其在不受限蛋白中不可获得。在一个实例中，这些先前封闭的结构特征可为适用于小分子结合的靶标。
在一些实施方案中，本发明提供本发明的分离的抗体片段用以鉴别小分子在蛋白上的功能性结合位点和/或用以界定生物学相关构象；蛋白结合或信号传导功能不全，使复合物稳定化或诱导信号传导的构象的用途。
本领域已知的任何适合方法可用于产生抗体:目标蛋白复合物的三维结构表示。所述方法的实例包括溶液中的X射线结晶学、核磁共振(Nuclear Magnetic Resonance；NMR)光谱法和氢氘质谱法。优选地使用X射线结晶学。如上文所阐述，目标蛋白可为成熟蛋白或其适合片段或衍生物。
化合物筛选
在本发明的方法中，候选化合物、化合物片段或分离的抗体片段可各自针对其对目标蛋白的生物活性的作用进行测试。举例而言，结合至目标蛋白的所鉴别的分离的抗体片段和化合物可经由标准筛选形式引入生物测定中以测定化合物或分离的抗体片段的抑制或刺激活性，或备选地或另外，引入结合测定中以确定结合或阻断，诸如ELISA、BIAcore、蛋白X射线结晶学和基于NMR的筛选可为适当的，备选地或另外，分离的抗体片段或化合物诱导结构改变的能力可使用例如如WO2014/001557中所述的基于FRET的测定进行鉴别。
因此，在一些实施方案中，本发明提供本发明的分离的抗体片段用以通过诸如
Figure BDA0003959525510000691
共振能量转移/荧光共振能量转移(FRET)的技术体外筛选蛋白上特异性功能位点处的新颖化学物质的用途。
在本发明的方法中，测定测试化合物片段结合分离的抗体片段限制性蛋白的能力。在一个实例中，该方法的步骤(d)中选择的化合物不结合不受限的目标蛋白。在一个实例中，该方法的步骤(d)中选择的化合物在不存在目标蛋白的情况下不结合分离的抗体片段。在一个实例中，该方法的步骤(d)中选择的化合物不单独结合不受限的目标蛋白或分离的抗体片段。在本发明的方法的一个实例中，步骤c)进一步包括评估步骤b)的测试化合物是否在不存在分离的抗体片段的情况下结合蛋白或片段，且步骤(d)进一步包括基于测试化合物仅结合分离的抗体片段限制性蛋白或片段而不结合不受限的蛋白或片段的能力选择来自步骤c)的化合物。
通常，在随后的筛选阶段中，在进一步详细描述通过该方法鉴别的化合物片段之后且在化合物的效能达到适当程度后，目标蛋白结合足以允许化合物在不存在分离的抗体片段的情况下结合目标蛋白。
在本发明的上下文中“包含”意欲意谓包括。在技术上适合的情况下，可组合本发明的实施方案。本文中将实施方案描述为包含某些特征/要素。本发明也延伸至由或主要由所述特征/要素组成的独立实施方案。
诸如专利和申请的技术参考文献以引用的方式并入本文中。
本文中专门和明确引述的任何实施方案可单独或与一个或多个其他实施方案组合形成免责声明。
附图说明
在以下实例中仅借助于参考附图的图示来进一步描述本发明，在附图中：
图1：结合至C5的PGT121 Fab-凸起结构域融合蛋白的SPR单循环动力学。纵轴：折射率单位(RU)；横轴：时间，以秒为单位。
图2：通过疏水性相互作用层析显示来自645Fab和TEV蛋白酶蛋白的K57凸起结构域肽的纯化的层析图。纵轴：任意单位(AU)；横轴；时间，以分钟为单位。
图3：645Fab蛋白水解裂解的结合至C5的凸起结构域的SPR单循环动力学。纵轴：折射率单位(RU)；横轴：时间，以秒为单位。
图4：显示结合至小鼠和兔C5的K8和K92凸起结构域肽的SPR单循环动力学的传感图。纵轴：折射率单位(RU)；横轴：时间，以秒为单位。
图5：补体活化ELISA。纵轴：对补体活化的抑制，以％为单位；横轴：凸起结构域肽的浓度，以nM为单位。C5b n/e：C5b新表位。图5A：经典途径的K8抑制；图5B：旁路途径的K8抑制；图5C：经典途径的K57抑制；图5D：旁路途径的K57抑制；图5E：经典途径的K92抑制；图5F：旁路途径的K92抑制；图5G：经典途径的K149抑制；图5H：旁路途径的K149抑制。
图6：来自旁路途径和经典途径细菌杀死测定的实例曲线。纵轴：大肠杆菌(Escherichia Coli)的存活率，以％为单位；横轴：凸起结构域肽的浓度，以微摩尔为单位。图6A：在经典途径细菌死分析中评估的K8、K57和K92；图6B：在旁路途径细菌死分析中评估的K57、K92和K8。
图7：通过单循环动力学使合成的凸起结构域肽结合至C5。纵轴：折射率单位(RU)；横轴：时间，以秒为单位。
图8：纵轴：对补体活化的抑制，以％为单位；横轴：凸起结构域肽的浓度，以nM为单位。图8A：经典途径C5b新表位ELISA中化学方式衍生的凸起结构域肽的实例曲线。图8B：旁路途径C5b新表位ELISA中化学方式衍生的凸起结构域肽的实例曲线。
图9：与C5复合的K8肽的晶体结构。K8肽用网格曲面显示。
图10：K8肽与C5的MG8结构域相互作用。C5的MG8结构域以与K8肽分开的方式显示。显示参与H键或盐桥相互作用的某些重要K8残基。
图11：K8肽与C5的MG8结构域相互作用。C5的MG8结构域以与K8肽分开的方式显示。显示参与H键或盐桥相互作用的某些重要C5残基。
图12：K8肽的二硫键排列。
图13：纵轴：对补体活化的抑制，以％为单位；横轴：凸起结构域肽的浓度，以nM为单位。图13A：旁路途径C5b新表位ELISA中hC3nb1-K57构建体的实例曲线。图13B：经典途径C5b新表位ELISA中hC3nb1-K57的实例曲线。
图14：牛超长CDR-H3序列特征和编号系统：BLV1H12与生殖系编码的VHBUL、DH2、JH1区段的序列比对。半胱氨酸残基以粗体显示，VHBUL区段中位置92Kabat处的保守半胱氨酸(H92)、JH1区段中位置103Kabat处的保守色氨酸(H103)和DH2起点处的保守半胱氨酸以粗体显示且以矩形框出。
图15：人血清白蛋白、新生儿Fc受体(FcRn)、人IgG1 Fc(仅单链)三元复合物(PDB登录码：4N0F)的晶体结构的两个不同视图。远离与FcRn的界面的人血清白蛋白残基突出显示，这些残基已被选择为针对K57和K92凸起结构域肽的插入位点(丙氨酸59、丙氨酸171、丙氨酸364、天冬氨酸562)。
图16：人血清白蛋白、新生儿Fc受体(FcRn)、人IgG1 Fc(仅单链、CH2和CH3结构域)三元复合物(PDB登录码：4N0F)的晶体结构。远离与FcRn的相互作用的Fc上的残基被选择为用于工程改造K149凸起结构域肽的位点(丙氨酸327、甘氨酸341、天冬酰胺384、甘氨酸402)。
图17：如通过ELISA评估的超长CDR-H3的噬菌体展示。横轴：光密度OD 630nm；纵轴；用于评估结合的生物素标记的C3、生物素标记的C5、C5、C3、抗myc。所用构建体为hC3nb1-K149 CDR-H3、hC3nb1-K92CDR-H3、hC3nb1-K57 CDR-H3、hC3nb1-K8 CDR-H3、hC3nb1(无任何插入)。
图18：关于K8chemFE、K57chemFE和K92chemFE的CP和AP驱动的测定的补体抑制ELISA数据。纵轴：对补体活化的抑制，以％为单位；横轴：凸起结构域肽的对数浓度，以nM为单位。图18A：CP ELISA。图18B：AP ELISA。
图19：关于K8chemFE、K8chemFE环状、K57chemFE和K92chemFE、RA101295-14和His-SOBI002，对旁路途径(AP)或经典途径(CP)活化具有特异性的溶血分析。纵轴：溶血抑制(以％为单位)；横轴：凸起结构域肽的对数浓度，以nM为单位。图19A：CP溶血分析。图19B：AP溶血分析。
图20：血浆稳定性。纵轴：血浆中凸起结构域的浓度(以ng/mL为单位)；横轴：时间(小时)。图20A：K57chemFE。图20B：K57chemFE-棕榈酰基。图20C：K8chemFE。
图21：关于K8chemFE、K57chemFE和K57chemFE-棕榈酰基，在向SD大鼠(Sprague Dawleyrat)静脉内给药后的体内药物动力学。纵轴：凸起结构域的浓度(以ng/mL为单位)；横轴：时间(小时)。
图22：与C5复合的K92肽的晶体结构。图22A：与C5复合的K92肽。图22B：K92肽的半胱氨酸排列。图22C：K92的突变位置。
实施例
实施例1：由用补体的C5组分使奶牛免疫而生成牛抗体片段和生物活性
如下所述，用C5使奶牛免疫，随后分离免疫材料，且自接近免疫部位获取的引流淋巴结进行抗原特异性记忆B细胞的细胞分选。使用流式细胞术鉴别对两个荧光标记的C5群体呈双阳性的记忆B细胞，且收集抗原富集的B细胞的多克隆混合物。
1.用补体C5使荷兰牛(Holstein Friesian)免疫且分离抗原特异性记忆B细胞
用补体C5(重组全长C5蛋白，获自来自CompTech的实施例)使两头成年荷兰奶牛免疫。以一个月的时间间隔以与佐剂Fama(GERBU Biotechnik)1:1(v/v)混合的1.25mg C5向肩部进行三次皮下注射。三周之后以与完全弗氏佐剂(Sigma)1:1乳化的1.25mg C5向肩部进行第四次注射。一个月之后以与Montanide(Seppic)1:1乳化的1.25mg C5向肩部进行最终注射。每次注射之后十天获得血清采血以检查血清抗体滴度。
收集免疫材料
用C5免疫后获得500mL全血样品。根据制造商说明书，使用Leucosep管(GrienerBio-one)分离PBMC。另外，收集来自邻近免疫部位的颈部以及脾脏的一部分的引流淋巴结。组织使用平缓MACS组织解离器(Miltenyi)均质化，通过40μm细胞过滤器，且收集在RPMI10％胎牛血清中。细胞在胎牛血清、10％DMSO中冷冻。
通过流式细胞术分选抗原特异性记忆B细胞
引流淋巴结的样品在37℃下解冻，且重悬在温热RPMI、10％FCS(v/v)、1mM EDTA中。将细胞以400g离心5分钟，且移除上清液。破坏细胞团块，且将其在室温下重悬在包含PBS、1mM EDTA、1％BSA(w/v)、25mM Hepes的测定缓冲液(AB)中。如前所述使细胞离心，且将其重悬在含有各为2μg/mL的C5-AF488(Alexa Fluor 488荧光团)和C5-AF647(Alexa Fluor647荧光团)的2mL冰冷的AB中，且在冰上培育30分钟。随后使细胞离心，移除上清液，且将团块在冰冷的AB中洗涤。获得等分试样以用于计数。再次使细胞离心，移除上清液，且以5×106个/毫升将细胞重悬在冰冷的AB中，随后经由40μm筛网过滤。恰好在BD BiosciencesFACSAria III(San Jose)细胞分选器上获取之前以1μg/mL的最终浓度添加DAPI。通过正向和侧向散射鉴别细胞，且自分析移除DAPI阳性的死细胞。通过脉冲处理高度和面积散射参数鉴别单细胞。随后鉴别对C5-AF488和C5-AF647两者均呈阳性的细胞，且将其分选至含有保持在4℃的1mL PBS、20％FCS、25mM Hepes的1.5mL eppendorfs中。
AF488由488nm激光激发，且经由530/30BP滤波器收集，且AF647由640nm激光激发，且经由660/20BP滤波器收集。DAPI由407nm激光激发，且经由450/40BP滤波器收集。
2.对C5富集的CDR-H3文库深度测序揭示超长CDR-H3克隆型
与来自仅重链抗体的骆驼VHH发现类似，配对重链(HC)和轻链(LC)无要求，因为延伸的CDR-H3凸起结构域含有抗原结合组分；因此，对抗原富集的CDR-H3的多克隆文库进行测序用作发现凸起结构域的快速方法。
裂解抗原富集的记忆B细胞库，且对裂解物直接进行RT-PCR。利用在CDR-H3两侧、退火至VH的保守框架3和框架4的引物进行的初级聚合酶链反应(PCR)用于扩增所有CDR-H3序列，与其长度或氨基酸序列无关。使用第二轮PCR对CDR-H3序列进行条形码化以用于iontorrent测序。
方法：
对B细胞裂解物进行的RT PCR
来自FACS的C5特异性记忆B细胞通过在4℃离心机中以10,000g沉淀。使细胞重悬，且用120μL的NP-40洗涤剂(0.5％v/v)和1U/μL的RNasin(Promega)的冰冷的溶液裂解。RTPCR混合物使用Super Script IV vilo Master Mix(Invitrogen)制备，包含32μL细胞裂解物和8μL Master Mix。反应混合物在25℃下温育10分钟，在50℃下再温育10分钟，且最终加热至85℃维持5分钟。
初级PCR
使用初级PCR特异性地扩增IgG CDR3 cDNA序列。正向引物退火至重链VH的可变结构域的保守框架3序列，且反向引物序列退火至VH保守框架4序列。PCR产物在自5’至3’读取时因此编码CDR3序列，与长度、氨基酸序列或V-基因区段、D-基因区段、J-基因区段的组成无关。根据制造商说明书使用热启动KOD主混合物试剂盒(Merck Millipore)制备PCR混合物。所用引物为5’-GGACTCGGCCACMTAYTACTG-3’(SEQ ID NO:446)和5’-GCTCGAGACGGTGAYCAG-3’(SEQ ID NO:447)，且每50μL PCR使用2μL cDNA模板。将反应混合物在96℃下加热2分钟，且随后经历三十个以下循环：96℃30秒、55℃30秒和68℃60秒。最终，将混合物在68℃下加热5分钟。
凝胶纯化
PCR产物含有包含常规和超长CDR-H3的CDR-H3序列的多克隆混合物，这些CDR-H3序列在分析凝胶上可见。基于标记，跨越大约250-500bp进行切除。根据制造商说明书，使用QiaQUICK凝胶提取试剂盒(Qiagen)自凝胶的切除部分提取DNA。
对PCR进行条形码化和凝胶纯化
进行次级PCR以对序列进行条形码化以用于ion torrent测序。引物如前所述使用，但添加了衔接子(斜体)和条形码化序列(粗体)：
Figure BDA0003959525510000751
ACTG-3’(SEQ ID NO:448)和
5’-CCTCTCTATGGGCAGTCGGTGATGCTCGAGACGGTGAYCAG-3’(SEQ ID NO:449)。
如针对初级PCR所描述，使用KOD Master Mix试剂盒进行次级PCR。次级PCR产物经凝胶纯化且浓缩。最终，根据制造商说明书，使用Beckman coulter AMP磁性珠粒纯化样品。
对CDR3文库进行Ion Torrent深度测序
将经纯化的DNA样品稀释至20ng/μL(总共1μg)且在-20℃下储存。使用MACROGEN的Ion Torrent PGM技术商业服务在318个芯片上对所有样品进行深度测序。
简言之，每芯片获得大约1.1Gb数据，其翻译为170bp平均长度的6613415个原始读数。第一处理步骤由以下组成：将FASTQ转换为FASTA，随后多路分析后者以根据其条形码分选序列且生成个别FASTA档案。各FASTA档案随后在所有三个阅读框架中翻译，且级联至含有所有框架的一个档案中。使用Perl脚本，在保守FR3与FR4蛋白序列(使用DSATYY和LL[V,I]TVSS基序)之间侧接的仅目标序列保持在单一档案中。最终，所有序列导出为具有以下频率的excel档案：找到的各序列的拷贝数。处理之后，对于条形码1和2，各样品有意义的读数的数目分别发现为约680000和530000。
结果：
CDR-H3文库的深度测序揭示占总序列的4.3％的超长CDR-H3序列。超长CDR-H3通过其长度(＞90bp)且通过IGHV1-7基因区段的特征性重复容易地鉴别，其已报道为超长CDR-H3的通用特点。在过滤之后，从单一引流淋巴结样品获得3559个独特的CDR-H3序列。其中，154个为超长CDR-H3，完整列表显示在表4中。
表4.衍生自用C5免疫的奶牛的超长CDR-H3序列
Figure BDA0003959525510000761
Figure BDA0003959525510000771
Figure BDA0003959525510000781
Figure BDA0003959525510000791
Figure BDA0003959525510000801
Figure BDA0003959525510000811
Figure BDA0003959525510000821
Figure BDA0003959525510000831
Figure BDA0003959525510000841
Figure BDA0003959525510000851
3.与支持抗体基础结构(框架)无关，超长CDR-H3可自主地起作用以结合人补体组分C5。
为了针对C5结合凸起结构域进行筛选，自所鉴别的154个超长CDR-H3序列，基于克隆型、拷贝数和半胱氨酸图案选择超长CDR3序列以制备52个序列的代表集合，描述于表5中。
表5.经选择用于筛选的超长CDR3序列的52个序列
Figure BDA0003959525510000852
Figure BDA0003959525510000861
凸起-TEV-HKH-ScFc融合蛋白的表达：
我们取整个超长CDR-H3，涵盖H93-H102(Kabat)，且在C端用单链Fc(ScFc)标签对其进行重组表达，且当以Expi293F细胞的2mL瞬时转染时表达为CDR-H3-ScFc融合体。使用标准方法将序列克隆至适用于哺乳动物表达的载体中。
CDR-H3序列记载在表5中，C端标签包含Gly-Ser接头(斜体)、TEV蛋白酶裂解位点(带下划线)、10×聚组氨酸序列和单链Fc。
TEV蛋白酶的七个氨基酸识别位点为Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly，其中裂解发生在Gln与Gly之间。
scFc序列的序列如下(CH2-CH3-接头(呈斜体)-CH2-CH3)：PKSGDKTHTSPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGSSTASGSGSGGSGTAGSSGGAGSSGGSTTAGGSASGSGSTGSGTGGASSGGASGASGEPKSSDKTHTSPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:155)
C端标签的序列显示如下：
GSGSGSGSGSENLYFQGSGSHHHHHHHHHHGSGSPKSGDKTHTSPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGSSTASGSGSGGSGTAGSSGGAGSSGGSTTAGGSASGSGSTGSGTGGASSGGASGASGEPKSSDKTHTSPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:156)
各构建体的质粒DNA使用小规模制备试剂盒(Qiagen)扩增。根据制造商说明书，每个构建体用3×106个细胞/毫升的个体2.0mL Expi293F细胞培养物在48孔培养块中使用Expifectamine 293转染试剂盒(Invitrogen)设置。将细胞培养四天，且以2500rpm离心30分钟。
C5结合ELISA：
根据以下方法在C5结合ELISA中筛选细胞上清液：96孔ELISA板(Nunc Maxisorp)用2μg/mL C5在碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液(Sigma)中的溶液涂布。所有洗涤步骤包含用PBS、0.05％Tween 20进行的四次洗涤循环。封闭缓冲液为PBS、1％BSA(w/v)。将细胞上清液以在测定缓冲液(PBS、0.05％Tween 20、0.1％BSA[w/v])中1:10和1:100的稀释液涂板。为了揭示，将山羊抗人Fc HRP(Thermo Scientific)二级抗体的1/5,000稀释液与“单步”3,3’,5,5’四甲基联苯胺(Thermo Scientific)一起使用。利用添加2％(w/v)NaF溶液终止反应，且使用BMG labtech平板读取器在630和390nm波长下测量OD。
结果：
鉴别了14种C5结合子。命中序列显示于表6中。
表6
Figure BDA0003959525510000881
Figure BDA0003959525510000891
对于该命中，根据如下所述的方法制备经纯化的蛋白。使用纯Akta(GEHealthcare)，Hi-Trap镍excel柱(GE Healthcare)用10个柱体积(CV)的PBS平衡。加载细胞上清液，且柱用7×CV的PBS、0.5M NaCl洗涤。柱随后用7×CV的缓冲液A(0.5M NaCl、0.02M咪唑、PBS pH 7.3)洗涤。蛋白样品通过利用10×CV的缓冲液B(0.5M NaCl、0.25M咪唑、PBSpH 7.3)的等度洗脱而洗脱下来。柱用0.1M NaOH洗涤，且再平衡至PBS中，随后继续加载。洗脱后，汇集含蛋白的级分，使用PD-10柱(GE Healthcare)将缓冲液交换为PBS。
针对与C5和牛血清白蛋白阴性对照物的结合，将纯化的蛋白在ELISA实验中滴定。这些数据出人意料地显示：某些超长CDR-H3是有活性的，甚至是在不存在亲本抗体的支持基础结构的情况下也是有活性的。
实施例2：根据本发明的分离的抗体片段在插入至Fab的CDR-H3中时赋予与人补体组分C5的结合
1.产生包含插入至其CDR-H3中的凸起结构域的Fab
为评估β-茎的重要性，凸起结构域自茎分离且插入至Fab的CDR-H3中，由TEV蛋白酶位点侧接以允许凸起结构域肽被切除。我们考虑自CDR-H3的第一个半胱氨酸残基之前的残基至CDR-H3的最后一个半胱氨酸残基之后的残基的凸起结构域肽片段，其中超长CDR-H3具有最少两个半胱氨酸。SEQ ID NO:1至154的154个CDR-H3的凸起结构域肽以粗体展示于表4中，且列于下表7中：
表7
Figure BDA0003959525510000892
Figure BDA0003959525510000901
Figure BDA0003959525510000911
Figure BDA0003959525510000921
Figure BDA0003959525510000931
Figure BDA0003959525510000941
侧接凸起结构域片段的区域在表4中以斜体显示。
为了表达凸起结构域肽，人Fab PGT121选择为载体。在HIV的gp120包膜内结合复合型N-聚糖的PGT121的CDR-H3含有延伸的反平行β-茎，其为之上展现凸起结构域肽的理想平台，而天然抗原不大可能不适当地促进C5结合。Kabat H100c至H100h的氨基残基(Gly-Ile-Val-Ala-Phe-Asn)缺失，且在两个TEV蛋白酶位点之间置换为凸起结构域肽序列。自14种结合子的集合，具有不同编号和半胱氨酸排列的各种肽序列的六个凸起结构域重新格式化为可裂解的PGT121-凸起融合蛋白。
具有C端His标签、TEV蛋白酶裂解位点(以粗体显示)和GS基序(带下划线)的PGT-121重链序列如下所示，缺失的CDR-H3残基以斜体显示：QMQLQESGPGLVKPSETLSLTCSVSGASISDSYWSWIRRSPGKGLEWIGYVHKSGDTNYSPSLKSRVNLSLDTSKNQVSLSLVAATAADSGKYYCARTLHGRRIYGIVAFNEWFTYFYMDVWGNGTQVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTLEENLYFQGSGGSHHHHHHHHHH(SEQ ID NO:311)
PGT-121-凸起融合物的重链序列如下所示，所插入序列以斜体显示，其中TEV蛋白酶裂解位点以粗体显示，且GS基序带下划线：PGT-121-K149
Figure BDA0003959525510000942
K149(部分)
SCPDGFSYRSWDDFCCPMVGRCLAPRN(SEQ ID NO:313)
PGT-121-K136
Figure BDA0003959525510000951
K136
TCPDNYREVDGCDPYDCCLTTWCTNSYCTRYI(SEQ ID NO:315)
PGT-121-K92
Figure BDA0003959525510000952
K92 VTCPEGWSECGVAIYGYECGRWGCGHFLNSGPNISPYVTT(SEQ ID NO:317)
对于K92，丝氨酸在超长CDR-H3的初始序列中带下划线的位置处突变为苏氨酸T而对结合特性无影响。
相同测定可用初始序列重现：
VTCPEGWSECGVAIYGYECGRWGCGHFLNSGPNISPYVST(SEQ ID NO:318)
PGT-121-K57
Figure BDA0003959525510000953
K57 SGCPPGYKSGVDCSPGSECKWGCYAVDGRRYGGYGADSGVGS(SEQ ID NO:320)
对于K57，自C端移除GS，且TEV蛋白酶位点在无GS接头的情况下直接地附接至C端。
PGT-121-K8
QMQLQESGPGLVKPSETLSLTCSVSGASISDSYWSWIRRSPGKGLEWIGYVHKSGDTNYSPSLKSRVNLSLDTSKNQVSLSLVAATAADSGKYYCARTLHGRRIYGSENLYFQGVCPDGFNWGYGCAAGSSRFCTRHDWCCYDERADSHTYGFCTGNRVENLYFQGSEWFTYFYMDVWGNGTQVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTLEENLYFQGSGGSHHHHHHHHHH(SEQ ID NO:321)
K8 VCPDGFNWGYGCAAGSSRFCTRHDWCCYDERADSHTYGFCTGNRV(SEQ ID NO:322)
PGT-121-K60
QMQLQESGPGLVKPSETLSLTCSVSGASISDSYWSWIRRSPGKGLEWIGYVHKSGDTNYSPSLKSRVNLSLDTSKNQVSLSLVAATAADSGKYYCARTLHGRRIYGSENLYFQGKSCREGYIDGGGCCLPGSCRGCACSYYDWLKCPRDCRGTSEEENLYFQGSEWFTYFYMDVWGNGTQVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTLEENLYFQGSGGSHHHHHHHHHH(SEQ ID NO:323)
K60 KSCREGYIDGGGCCLPGSCRGCACSYYDWLKCPRDCRGTSEE(SEQ ID NO:324)
重链与PGT-121轻链配对，序列如下：
QSVLTQPPDISVAPGETARISCGEKSLGSRAVQWYQHRAGQAPSLIIYNNQDRPSGIPERFSGSPDSPFGTTATLTITSVEAGDEADYYCHIWDSRVPTKWVFGGGTTLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS(SEQ ID NO:325)
2.与C5结合的Biacore分析
与C5的结合使用如下文所述的表面等离子体共振(SPR)单循环动力学来测量。C5已显示通过pH的极值活化，且因此采用单循环动力学维持C5蛋白在传感器芯片表面上的完整性，其中在不存在严苛的再生步骤的情况下进行增加浓度的分析物的连续注射。
Biacore单循环动力学。使用Biacore 8K(GE Healthcare)，通过胺偶联使C5固定在CM5芯片上。流动池使用EDC/NHS(流动速率：10μL/min；接触时间：30s)活化。使1μg/mL于pH 4.5的乙酸钠缓冲液中的C5固定在仅两个流动池(流动速率：10μL/min；接触时间：420s)上。最终，将乙醇胺应用于两个流动池(流动速率：10μL/min；接触时间：420s)。获得大约2,000个反应单位的最终固定水平。
单循环动力学使用在HBS-EP缓冲液中的滴定来测量。使用40μL/min的高流动速率，接触时间为230s，解离时间为900s。减去与参考表面的结合，且使用Biacore评估软件将数据拟合至单位点结合模型。
结果
作为融合蛋白，凸起结构域赋予与PGT121 Fab的高亲和力C5结合。
通过SPR，五个PGT121-凸起以在皮摩尔至奈摩尔范围内的亲和力结合C5(图1和表8)，其中发现仅K60凸起结构域在重新格式化之后无功能性。
表8.关于PGT121-凸起结构域融合蛋白的Biacore单循环动力学数据
来自n＝3的动力学总结
Figure BDA0003959525510000971
针对与人补体组分C3的结合对PGT121-凸起结构域融合蛋白进行逆筛选。C3为与C5最接近的人同源物，共享保守性折叠和26.5％的序列同源性。在这些实验中，未检测到交叉反应性。
3.纯化来自Fab融合蛋白的凸起结构域肽
为了获得凸起结构域肽，使用TEV蛋白酶以蛋白水解方式自PGT121 Fab的CDR-H3切除凸起结构域。在室温下以1:100(w/w)的比率使Fab-凸起肽融合蛋白(10mg/mL)与TEV蛋白酶一起温育最少2小时。可使用具有Waters XBridge Protein BEH C4 OBD制备型柱(
Figure BDA0003959525510000982
5μm，19mm×100mm)的Waters UV导引的FractionLynx系统纯化和分离肽。使用水、0.1％三氟乙酸(TFA)的水性溶剂和100％MeCN的有机溶剂。柱在10.8分钟内在40℃下以5-50％有机溶剂的梯度在20mL/min下运行。柱用三种急剧匀变的5-95％有机溶剂清洁。将含有凸起肽的级分汇集，且使用Labconco Freezone冷冻干燥器冻干。对于-80℃储存和后续分析，使肽与20mM Tris pH 7.4一起重悬。
表9.裂解之后可获得的六个经分离凸起结构域肽的序列如下：
Figure BDA0003959525510000981
实施例3：根据本发明的分离的抗体片段在插入至结合白蛋白的Fab(645Fab)的VH结构域的框架3区中时赋予与人补体组分C5的结合
如WO2020/011868(2020年1月16日公开)中所述，在V结构域，尤其VH结构域的框架3区内包含插入多肽的Fab抗体片段可提供新颖双特异性抗体格式，特别是稳定的且能够同时结合两种抗原。有利地，如本文所述的CA645 Fab-凸起融合蛋白可同时结合C5和白蛋白，其可对凸起结构域肽赋予延长的血清半衰期。
除了三个CDR环以外，抗体轻链和重链，即常规和单链骆驼VHH两者均具有第四个由框架3形成的环。Kabat编号系统界定框架3为重链中的位置66-94和轻链中的位置57-88。
与实施例2中所描述的相同方法用于重新格式化六个超长CDR-H3凸起结构域，其结合至C5，作为可裂解的CA645 Fab-凸起融合蛋白。
以下实施例中所述的CA645 Fab融合蛋白的轻链V区或轻链分别包含或具有SEQID NO:429(CA645 VL结构域(gL5))或SEQ ID NO:428(CA645轻链gL5)。可使用替代轻链或轻链V区，例如包含SEQ ID NO:441或SEQ ID NO:442的VL结构域的轻链V区。
645Fab重链凸起结构域融合物的序列：645Fab重链(gH5)，其中K8凸起肽(斜体)插入至其框架3区中，具有C端His标签、TEV蛋白酶裂解位点和GS基序(粗体)
Figure BDA0003959525510000991
K8 SEQ.VCPDGFNWGYGCAAGSSRFCTRHDWCCYDERADSHTYGFCTGNRV(SEQ ID NO:322)
645Fab重链，其中K57凸起肽(斜体)插入至其框架3区中，具有C端His标签、TEV蛋白酶裂解位点和GS基序(粗体)
Figure BDA0003959525510000992
K57 SEQ.GCPPGYKSGVDCSPGSECKWGCYAVDGRRYGGYGADSGV(SEQ ID NO:334)
645 Fab重链，其中K60凸起肽(斜体)插入至其框架3区中，具有C端His标签、TEV蛋白酶裂解位点和GS基序(粗体)
Figure BDA0003959525510000993
K60 KSCREGYIDGGGCCLPGSCRGCACSYYDWLKCPRDCRGTSEE(SEQ ID NO:336)
645 Fab重链，其中K92凸起肽(斜体)插入至其框架3区中，具有C端His标签、TEV蛋白酶裂解位点和GS基序(粗体)
Figure BDA0003959525510001002
K92 SEQ.VTCPEGWSECGVAIYGYECGRWGCGHFLNSGPNISPYVTT(SEQ ID NO:317)
645Fab重链，其中K136凸起肽(斜体)插入至其框架3区中，具有C端His标签、TEV蛋白酶裂解位点和GS基序(粗体)
Figure BDA0003959525510001003
K136 SEQ.STCPDNYREVDGCDPYDCCLTTWCTNSYCTRYI(SEQ ID NO:339)
645 Fab重链，其中K149凸起肽(斜体)插入至其框架3区中，具有C端His标签、TEV蛋白酶裂解位点和GS基序(粗体)
Figure BDA0003959525510001004
K149 SEQ.SCPDGFSYRSWDDFCCPMVGRCLAPRN SEQ ID NO:313
凸起结构域肽如上文所述纯化和分离，分离肽的序列在下文提供于表10中：
表10
Figure BDA0003959525510001001
Figure BDA0003959525510001011
来自K57肽的制备型规模纯化的实例层析轨迹显示在图2中。
与人C5的结合
我们通过上文所述的Biacore单循环动力学方法测量结合C5的凸起结构域肽的个体速率常数(kon和koff)和平衡解离常数(KD)。
当通过SPR单循环动力学测量时，肽显示高亲和力结合，KD＜40nM(图3和表11)。发现不结合的唯一凸起结构域肽为K60。
表11.关于分离的凸起结构域肽的Biacore单循环动力学数据
来自n＝3的动力学总结
Figure BDA0003959525510001012
针对与人补体组分C3和与卵白蛋白的交叉反应性逆筛选凸起结构域肽，未观测到与任一种蛋白结合的迹象。
与小鼠和兔C5蛋白的结合
针对小鼠和兔C5蛋白测试分离的K8、K57、K92和K149凸起结构域肽。使用例如Macpherson等人,J Biol Chem.2018年9月7日；293(36):14112-14121中所述的方法纯化来自人血清或动物血清(TCS biosciences)的C5。对于K8和K92凸起结构域肽，观测到与小鼠C5的交叉反应性(图4)。K57和K149肽对人C5具有特异性，且并不与小鼠或兔蛋白交叉反应。我们在表12中报告结合至小鼠和兔C5的K8和K92的个体速率常数(kon和koff)和平衡解离常数(KD)。
表12.凸起结构域肽的Biacore单循环动力学数据
数据来自n＝1实验。
Figure BDA0003959525510001021
补体活化测定
为了阐明结合至人C5的凸起结构域肽的功能性结果，我们使用SVAR补体活化ELISA进行补体活化测定，该补体活化ELISA经由形成C5b新表位来测量人血清中的经典途径(Classical Pathway；CP)和旁路途径(Alternative Pathway；AP)活化。我们还开发了正交ELISA分析，其测量总补体和AP特异性介导的C3b和攻膜复合物(Membrane AttackComplex；MAC)沉积。对于所有活化条件，我们还经由ELISA追踪C5a释放。
方法
对于C3和C9 ELISA，微量滴定板(例如MaxiSorp；Nunc)与含有2.5μg/ml聚集的人IgG(Sigma-Aldrich)(用于CP)或含有20mg/ml酵母聚糖(Sigma-Aldrich)(用于AP)在75mM碳酸钠(pH 9.6)中的50ml溶液一起在4℃温育过夜。作为阴性对照，用1％(w/v)BSA/PBS涂布孔。在程序的各步骤之间用250ml洗涤缓冲液(50mM Tris-HCl、150mM NaCl和0.1％Tween20(pH 8))洗涤微量滴定孔四次。在室温使用250uL的1％(w/v)BSA/PBS封闭孔2小时。标准人血清(NHS)在具有钙和镁的明胶弗洛拿缓冲液(Gelatin veronal buffer)(0.1％明胶、5mM弗洛拿、145mM NaCl、0.025％NaN3、0.15mM氯化钙、1mM氯化镁，pH 7.3；用于CP)或Mg-EGTA(含有70mM NaCl、140mM葡萄糖、0.1％明胶、7mM MgCl2和10mM EGTA的2.5mM弗洛拿缓冲液[pH 7.3]；用于AP)中稀释。NHS以1％的浓度用于CP或5％的浓度用于AP。NHS与连续稀释浓度的肽(16μM-15.6nM)于适当缓冲液中混合，且在冰上预温育30分钟。肽-NHS溶液随后在微量滴定板的孔中温育35min以用于CP/LP(检测C3b和C9两者)或温育35min以用于AP(C3b)或温育60min以用于AP(C9)。补体活化是经由使用特异性抗C3b(大鼠抗人C3d；例如来自Hycult)和MAC(山羊抗人C9；例如CompTech)的Ab检测沉积的补体活化因子进行评估。用HRP缀合的山羊抗大鼠(Abcam)或兔抗山羊(Dako)二级Ab检测结合的初级Ab。使用TMB One溶液(Eco-TEK)检测结合的HRP缀合抗体，在OD450测量吸光度。
对于C5b ELISA，按照制造商的方案，使用CP和AP补体功能性ELISA试剂盒(SVAR)进行分析。对于样品制备：按照用于CP和AP分析的各自方案稀释血清。制备肽的滴定，且使其在室温温育15分钟，随后平板涂板。
对于C5a ELISA，按照制造商的方案，使用补体C5a人ELISA试剂盒(Invitrogen)进行分析。对于样品制备：在血清/肽样品在C5b ELISA测定板上37℃温育结束时，将50μL稀释的活化血清转移至含有50μL/孔的测定缓冲液的C5a ELISA测定板。所有后续实验步骤如方案中所述进行。
结果
这些测定揭示，K57凸起结构域肽为C5活化的强效且完全有效的抑制剂，防止释放C5a，形成C5b新表位和MAC。对C3b沉积无作用，表明肽抑制在C3下游的补体活化。相比之下，K149肽为C5的高亲和力沉默结合子，其对C5a释放不具有可检测的作用，形成C5b新表位或MAC沉积，即使是在超过100×KD的肽浓度下也如此。
我们还鉴别了对C5施加更具细微差别的异位作用的凸起结构域肽。K92肽为通过AP防止C5活化的非竞争性C5抑制剂。我们在分离出AP组分的测定中观测到C5a释放减少、C5b新表位的形成减少和MAC沉积减少。令人感兴趣地，在AP组分未经分离的测定中或在CP组分经分离的测定中未观测到作用，表明K92肽不通过CP C5转化酶抑制C5活化，但其的确通过AP C5转化酶部分地抑制活化。
类似地，K8肽为AP的非竞争性抑制剂，且也证实为CP的非竞争性抑制；减少C5a释放，在CP和AP驱动测定两者中形成C5b新表位和MAC沉积。对于K8和K92肽两者，未检测到对C3b沉积的作用。我们的补体ELISA数据显示于图5和表13-18中。
表13.经典途径C5b沉积ELISA
除非指明，否则数据来自n＝3个实验。
Figure BDA0003959525510001041
*ND＝未检测。
a数据为来自n＝6个实验的平均值。
表14.旁路途径C5b沉积ELISA
除非指明，否则数据来自n＝3个独立滴定。
Figure BDA0003959525510001042
*ND＝未检测。
a数据为来自n＝5个独立滴定的平均值。
b数据为来自n＝4个独立滴定的平均值。
表15.抑制经典途径介导的C5a释放
除非另外陈述，否则数据来自n＝3个独立滴定。
Figure BDA0003959525510001043
Figure BDA0003959525510001051
*ND＝未检测。
a数据为来自n＝5个独立滴定的平均值。
表16.抑制旁路途径介导的C5a释放
除非另外陈述，否则数据来自n＝3个独立滴定。
Figure BDA0003959525510001052
*ND＝未检测。
a数据为来自n＝4个独立滴定的平均值。
表17.抑制经典途径介导的C9沉积
除非另外陈述，否则数据来自n＝3个独立滴定。
Figure BDA0003959525510001053
*ND＝未检测。
a数据来自n＝1个滴定。
表18.抑制旁路途径介导的C9沉积
数据来自n＝3个独立滴定
Figure BDA0003959525510001054
*ND＝未检测。
a数据来自n＝1个滴定。
凸起结构域肽抑制补体介导的细菌裂解“杀死测定”
在稀释人血清(如例如在Monk IR等人；Transforming the untransformable:application of direct transformation to manipulate genetically Staphylococcusaureus and Staphylococcus epidermidis.mBio.第3(2)卷；2012中所描述，且为市售的)中均匀孵育时，使用对补体介导的裂解敏感的大肠杆菌菌株DC10B，我们研究我们的肽在细菌杀死测定中的作用。
方法
标准人血清(NHS)是使用自8名健康供体使用血清真空收集管(BD)新鲜抽出的血液来制备。使血液保持在室温下且使其凝结30分钟，随后在冰上温育1小时。两轮离心(700×g；4℃，8分钟)之后，收集血清级分，汇集且在-80℃下以等分试样储存。经由在56℃下温育30分钟来制备热不活化血清(DNHS)。
在37℃下在振荡(180rpm)下将大肠杆菌菌株DC10B于LB培养液中培养至指数期(OD600为0.4-0.5)。细菌通过离心采集，在PBS中洗涤一次且在具有钙和镁的明胶弗洛拿缓冲液(“GVB++”；5mM弗洛拿缓冲液[pH 7.3]，0.1％[w/v]明胶、140mM NaCl、1mM MgCl2和0.15mM CaCl2)中重悬至OD600＝0.1(与大约107CFU/ml相关联)。将特定浓度的肽或PBS(对照)与不同百分比的汇集NHS/GVB++缓冲液在冰上一起孵育30分钟。随后，将50μL细菌添加至50μL肽/PBS NHS溶液中且在37℃下孵育20分钟。在孵育之后，移除等分试样，连续稀释且涂布至LB琼脂板上。板在37℃下孵育18小时，随后计数剩余CFU且与在时间0时的CFU相比，计算存活率。对照由DNHS和用补体C5抑制剂OmCI(10mg/ml；0.625mM)处理的血清组成。
结果
K57凸起结构域肽完全有效地防止补体介导的裂解。我们分别报道CP和AP介导的杀死测定的K57 IC50值为115nM和1.22μM，数据显示在表19-20和图6中。
K8凸起结构域能够在CP和AP驱动的杀死测定两者中抑制，我们报道CP和AP介导的杀死测定的K8 IC50值分别为16.9μM和25.8μM。与我们的途径特异性ELISA数据一致，K92肽仅能够抑制AP驱动的杀死测定，从而实现2.465μM的IC50和91.0％的Emax。
表19.抑制经典途径介导的细菌裂解
数据来自n＝3个独立滴定
Figure BDA0003959525510001071
*ND＝未检测。
表20.抑制旁路途径介导的细菌裂解
数据来自n＝3个独立滴定
Figure BDA0003959525510001072
a数据来自n＝1个实验。
实施例4：通过化学、尤其固相肽合成产生本发明的分离的抗体片段
如下文中所示，超长CDR-H3的功能性分离的凸起结构域可通过固相肽合成以化学方式合成。为了在凸起结构域肽内的两个半胱氨酸残基之间形成二硫键，凸起结构域肽通过以下两种方法合成：1)定点方法，其中半胱氨酸受特异性保护且去除保护基，以预定义方式形成二硫键；和2)通过自由能方法，由此使得在自由能下在谷胱甘肽氧化还原缓冲液存在的情况下形成二硫键。
肽合成
所有肽使用固相合成，采用Fmoc技术(例如Atherton,E.和R.C.Sheppard.1989.Fluorenylmethoxycarbonylpolyamide solid phase peptide synthesis:generalprinciples and development.In Solid Phase Peptide Synthesis:A PracticalApproach.IRL Press,Eynsham,Oxford,第25-37页中所描述)合成。合成通常在机器合成器(Symphony,Protein Technologies)上在C至N方向上以顺次方式进行。合成在适当的聚苯乙烯支持物(nova biochem)上开始，其中第一氨基酸经由Wang键附接至羧基，取代0.3mM/g。通过使用二十分钟双偶联策略促进链伸长，该双偶联策略在DIPEA存在的情况下利用3倍摩尔过量试剂，用溶解于DMF中的N-α受保护氨基酸(经适合保护基正交保护的侧链以用于Fmoc化学物质)和偶合剂TBTU加载树脂。通过用在DMF中的20％哌啶进行两次5分钟的处理来除去临时氨基保护。在肽序列完成之后，肽基树脂用95:3:2的TFA、乙烷二硫醇和三异丙基硅烷的混合物处理3小时以裂解肽和所有保护基。肽通过过滤分离，且用乙醚研磨。将肽溶解于乙腈水中，且在纯化之前冷冻干燥。
1)通过定点法形成二硫键
使用特殊保护基，有可能在肽中的两个特异性半胱氨酸之间环化，因此有可能在肽中具有超过一个二硫键。仅K149方法通过定点法合成以形成两种不同二硫键键结形式K149A和K149B。定点二硫键形成如下：
K149A
SC1PDGFSYRSWDDFC1C2PMVGRC2LAPRN(SEQ ID NO:347)
K149B
SC1PDGFSYRSWDDFC2C1PMVGRC2LAPRN(SEQ ID NO:348)
肽K149使用针对半胱氨酸残基的正交保护策略合成。对于K149A，残基C2和C15使用乙酰胺基甲基(acetamidomethyl；ACM)在侧链上受保护，而C16和C22在侧链上受三苯甲基保护。对于K149B，残基C2和C16使用乙酰胺基甲基(ACM)在侧链上受保护，而C15和C22在侧链上受三苯甲基保护。
肽使用如上文所述的标准Fmoc固相化学物质合成。在三氟乙酸(trifluoroacetic；TFA)裂解之后，其移除除ACM的外的所有侧链保护基，线性肽在C18柱上使用rHPLC纯化。
第一环化反应在温和氧化条件下使用亚铁氰化钾进行，且通过LC-MS监测C16与C22(K149A)或C15与C22(K149B)之间的反应进程。当观察到反应已完成时，纯化肽以移除任何残余线性肽，且随后用过量碘处理。碘促进同时移除ACM保护基且最终氧化半胱氨酸残基C2和C15(K149A)或C2和C16(K149B)。反应通过LC-MS监测，且二环状肽通过HPLC再纯化。
2)通过自由能方法合成及形成二硫键。肽在以下显示于表21中。
表21
Figure BDA0003959525510001091
已发现，获得具有超过两个二硫键的这些环状肽的最有利和高产率方式为RP-HPLC纯化线性序列且不经过冷冻干燥步骤就立即引发环化，否则会产生大量不溶性聚合物质。
环化通过使用热力学受控空气氧化以获得序列中的二硫键的最小能源形式，采用还原和氧化谷胱甘肽的混合物来达成。
将粗肽溶解于DMSO/水中，且用TCEP处理以确保半胱氨酸残基完全还原。肽在配备有两个210泵和355uv分光光度计的瓦瑞安(varian)prostar系统上经RP-HPLC纯化。操作缓冲液对于泵A为溶剂A：0.1％(v/v乙酸铵在水中，pH 7.5 -7.8)，且对于泵B为溶剂B：100％乙腈。将肽引入制备型RP-HPLC柱(C18 Axia，22mm×250mm，5微米颗粒，尺寸为110埃孔大小，Phenomenex)中，且线性序列通过在60分钟内在溶剂A与溶剂B之间操作梯度5％B至65％B自柱洗脱。通过ESMS鉴别线性肽。
将线性肽(大约50mL)的溶液添加至500mL环化缓冲液(含有1mM EDTA、5mM还原谷胱甘肽和0.5mM氧化谷胱甘肽的0.2M磷酸盐缓冲液，pH 7.5)中将溶液在室温下搅拌48小时。随后，通过分析型HPLC分析少量样品以评估环化程度。
当认为环化充分完成时，含有肽的全缓冲液泵送至制备型RP HPLC柱(如上所述C-18Axia)上。在60分钟内在溶剂A(0.1％TFA在水中)与溶剂B(0.1％TFA在乙腈中)使用梯度5％B至65％B洗脱环状肽。在分析之前冷冻干燥经鉴别为正确化合物的级分。
与C5的结合
我们使用SPR单循环动力学以测量与人C5蛋白的结合。结果显示于下图7和表22中。
对于通过谷胱甘肽环化产生的肽，所有实例结合C5的亲和力与以重组方式表达时广泛地相当。这些数据表明功能性凸起结构域肽可通过化学合成衍生，由此获得最小能量二硫键形式。对于定点方法，K149A和K149B肽两者均结合C5，但K149A肽比K149B强效41倍，且等效于通过谷胱甘肽环化产生的K149。K149A二硫键排列为较低能源形式和C5的结合自由能最低的形式两者。
表22.通过SPR单循环动力学检测化学方式衍生的凸起结构域肽与C5的结合
数据来自n＝1个实验。
构建体 ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
K8 3.29E+04 3.97E-04 1.21E-08
K57 2.45E+05 5.89E-04 2.41E-09
K92 1.60E+05 1.03E-04 6.43E-10
K149 1.54E+06 6.85E-03 4.46E-09
K149A 1.17E+06 7.23E-03 6.17E-09
K149B 2.97E+04 7.32E-03 2.46E-07
功能活性测定
以化学方式衍生的凸起结构域肽的功能活性在补体活化ELISA中确认，该ELISA测量C5b新表位沉积的抑制。这些数据显示于图8和表23-24中。
表23.经典途径C5b沉积ELISA
除非指明，否则数据来自n＝3个独立滴定。
Figure BDA0003959525510001101
表24.旁路途径C5b新表位ELISA
除非指明，否则数据来自n＝3个独立滴定。
Figure BDA0003959525510001111
a数据来自n＝2个独立滴定
实施例5：晶体结构
为了阐明通过凸起结构域肽异位调节C5的结构机制，我们解析C5-K8复合物的晶体结构。作为一个实例，可使用
Figure BDA0003959525510001112
的分辨率。
6.1mg/ml(20mM Tris、75mM NaCl，pH 7.35)的C5与K8凸起结构域肽以1:1摩尔比混合。在18℃下用母液的1:1混合物(v/v)通过蒸气扩散方法设定液滴。晶体在0.1M ADA、14％乙醇(v/v)，pH 6.0的母液中生长。在液氮中急骤冷冻之前，C5-K8晶体在具有30％MPD(v/v)的母液中低温保护。
数据在Diamond Light Source(Harwell,UK)处收集。使用自动分子置换管道Balbes(F.Long等人“BALBES:a Molecular Replacement Pipeline”Acta Cryst.D64 125-132(2008))，使用apo C5结构(PDB 3CU7)减去C345c结构域解析C5-K8结构。K8肽的主链模型使用ARP-wARP(常用于在X射线结晶学中自动建模的软件包)产生，该ARP-wARP通知在CCP4包(Collaborative Computational Project,Number 4)内在Coot中手动建模(M.D.Winn等人Acta.Cryst.D67,235-242(2011))。例如Langer G,Cohen SX,Lamzin VS,Perrakis A.(2008)Automated macromolecular model building for x-raycrystallography using ARP/wARP version 7.Nat.Protoc.3,1171-1179。该模型在Phenix中经历多轮优化。
结构数据显示在图9、10和11中。结构显示K8肽结合至用于调节C5的α链的MG8结构域上的C5的先前未识别位点。K8肽介导确保低局部B因子的晶体接触，明确地阐明二硫键排列和肽主链和侧链的链内和链间相互作用。K8肽的二硫键键结合排列阐明且显示在图12中。欧洲生物信息学会的交互服务(Interactive service at the EuropeanBioinformatics Institute；PDBePISA)用于检查K8肽与C5之间的分子界面。氢键和盐桥相互作用列于表25-28中。
表25.参与C5-K8相互作用表面的K8残基
Figure BDA0003959525510001121
表26.参与C5-K8相互作用表面的C5残基
Figure BDA0003959525510001122
Figure BDA0003959525510001131
Figure BDA0003959525510001141
表27.与C5的侧链和主链氢键相互作用
K8肽残基 C5上的H键合配偶体
GLY 15 LEU 1379
GLY 15 MET 1507
SER 17 ASP 1382
ARG 22 GLU 1373
ARG 22 GLU 1373
ARG 22 SER 1371
ARG 22 THR 1370
ARG 22 CYS 1375
ARG 31 ASP 1471
ARG 31 ASP 1471
HIS 35 CYS 1405
GLY 42 SER 1407
ASN 43 SER 1469
ASN 43 SER 1470
ARG 44 SER 1411
ARG 44 GLU 1414
ALA 13 LEU 1379
GLY 15 ILE 1381
SER 17 LYS 1380
ASP 24 TYR 1378
ASP 24 LYS 1409
HIS 35 LYS 138
表28.参与与C5的盐桥相互作用的K8残基
肽残基 C5残基
ARG 31 ASP 1471
ARG 31 ASP 1471
ASP 24 LYS 1409
实施例6：根据本发明的分离的抗体片段在插入至VHH的N端或C端或框架转角中以形成单链双特异性抗体时赋予与人补体组分C5的结合
我们通过在CDR的相对端处将K57凸起结构域肽插入VHH抗体框架转角(frameworkturns，环1、环2和环3)中来产生VHH凸起结构域融合蛋白，从而制备单链双特异性抗体。K57凸起结构域以重组方式融合至hC3nb1VHH，其结合C3和C3b，且其中已公开晶体结构(Protein Data Bank(PDB)代码：6EHG)。
序列展示如下，表达的构建体带有C端单链Fc标记(未显示)：hC3nb1
QVQLVETGGGLVQAGGSLRLSCAASGSIFSLNAMGWFRQAPGKEREFVATINRSGGRTYYADSVKGRFTISRDNGKNMVYLQMHSLKPEDTAIYYCAAGTGWSPQTDNEYNYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:351)
K57肽(接头以斜体显示)
SGGGSGCPPGYKSGVDCSPGSECKWGCYAVDGRRYGGYGADSGVSGGGS(SEQ ID NO:352)
hC3nb1-K57环1(肽和接头以斜体显示)
QVQLVETGGGLVQASGGGSGCPPGYKSGVDCSPGSECKWGCYAVDGRRYGGYGADSGVSGGGSGSLRLSCAASGSIFSLNAMGWFRQAPGKEREFVATINRSGGRTYYADSVKGRFTISRDNGKNMVYLQMHSLKPEDTAIYYCAAGTGWSPQTDNEYNYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:353)
hC3nb1-K57环2(肽和接头以斜体显示)
QVQLVETGGGLVQAGGSLRLSCAASGSIFSLNAMGWFRQAPSGGGSGCPPGYKSGVDCSPGSECKWGCYAVDGRRYGGYGADSGVSGGGSKEREFVATINRSGGRTYYADSVKGRFTISRDNGKNMVYLQMHSLKPEDTAIYYCAAGTGWSPQTDNEYNYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:354)
hC3nb1-K57环2Δ脯氨酸(肽和接头以斜体显示)
QVQLVETGGGLVQAGGSLRLSCAASGSIFSLNAMGWFRQASGGGSGCPPGYKSGVDCSPGSECKWGCYAVDGRRYGGYGADSGVSGGGSKEREFVATINRSGGRTYYADSVKGRFTISRDNGKNMVYLQMHSLKPEDTAIYYCAAGTGWSPQTDNEYNYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:355)
hC3nb1-K57环3(肽和接头以斜体显示)
QVQLVETGGGLVQAGGSLRLSCAASGSIFSLNAMGWFRQAPGKEREFVATINRSGGRTYYADSVKGSGGGSGCPPGYKSGVDCSPGSECKWGCYAVDGRRYGGYGADSGVSGGGSRFTISRDNGKNMVYLQMHSLKPEDTAIYYCAAGTGWSPQTDNEYNYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:356)
hC3nb1-K57 C端(肽和接头以斜体显示)
QVQLVETGGGLVQAGGSLRLSCAASGSIFSLNAMGWFRQAPGKEREFVATINRSGGRTYYADSVKGRFTISRDNGKNMVYLQMHSLKPEDTAIYYCAAGTGWSPQTDNEYNYWGQGTQVTVSSGGGSGCPPGYKSGVDCSPGSECKWGCYAVDGRRYGGYGADSGV(SEQ ID NO:357)
另外，制得构建体，其中如下融合整个K57超长CDR-H3作为N端和C端，：
K57超长CDR-H3
TTVHQRTIKSGCPPGYKSGVDCSPGSECKWGCYAVDGRRYGGYGADSGVGSTYTHEFYVDAWGQG(SEQID NO:358)
K57超长CDR-H3-hC3nb1(CDR-H和接头以斜体显示)
TTVHQRTIKSGCPPGYKSGVDCSPGSECKWGCYAVDGRRYGGYGADSGVGSTYTHEFYVDAWGQGSSSSGSSSSGQVQLVETGGGLVQAGGSLRLSCAASGSIFSLNAMGWFRQAPGKEREFVATINRSGGRTYYADSVKGRFTISRDNGKNMVYLQMHSLKPEDTAIYYCAAGTGWSPQTDNEYNYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:359)
hC3nb1-K57超长CDR-H3(CDR-H3和接头以斜体显示)
QVQLVETGGGLVQAGGSLRLSCAASGSIFSLNAMGWFRQAPGKEREFVATINRSGGRTYYADSVKGRFTISRDNGKNMVYLQMHSLKPEDTAIYYCAAGTGWSPQTDNEYNYWGQGTQVTVSSGSSSSTTVHQRTIKSGCPPGYKSGVDCSPGSECKWGCYAVDGRRYGGYGADSGVGSTYTHEFYVDAWGQG(SEQ ID NO:360)
我们通过SPR多循环动力学测量与C3和C5的结合，且我们报告结合至两种蛋白的全结合动力学和平衡解离常数(KD)。
表29.来自Biacore单循环动力学的C3结合动力学的总结。
数据来自n＝3个独立实验
Figure BDA0003959525510001171
表30.来自Biacore单循环动力学的C5结合动力学的总结。
数据来自n＝3个独立实验
Figure BDA0003959525510001172
Figure BDA0003959525510001181
最后，我们在AP和CP补体活化ELISA中测试我们的构建体，该ELISA测量C5b新表位沉积。这些数据显示在图13中。
实施例7：融合至效应分子以改善体内半衰期的本发明的分离的抗体片段
如所公开，根据本发明的分离的抗体片段可融合至效应分子，其可延长分离的抗体片段的体内半衰期。适合的此类型的效应分子的实例包括Fc片段和白蛋白。
在本实施例中，凸起结构域肽插入至白蛋白和Fc片段中。有利地，所得融合蛋白可对凸起结构域肽赋予改善的半衰期，这适用于疗法。
7.1.人和大鼠白蛋白凸起结构域融合蛋白
借助于接近N端和C端，凸起结构域肽可在多肽链的中间的环或转角基序内经工程改造而不扰乱整体蛋白折叠。
表达融合蛋白，其将接头序列侧接的K57和K92凸起结构域肽在各个位点掺入智人(Homo sapiens)和褐家鼠(Rattus norvegicus)血清白蛋白蛋白的多肽链中，如图14中所示。基于位点不大可能阻碍与新生儿Fc受体的结合，选择该位点。在此基础上，这些融合蛋白可呈现与人C5蛋白的结合和延长的体内血清半衰期。
K57凸起结构域(以斜体显示)：
GCPPGYKSGVDCSPGSECKWGCYAVDGRRYGGYGADSGV(SEQ ID NO:334)
K92凸起结构域(以斜体显示)：
TCPEGWSECGVAIYGYECGRWGCGHFLNSGPNISPYVST(SEQ ID NO:450)
接头(以粗体显示)：
Figure BDA0003959525510001182
大鼠血清白蛋白-K57位点1
Figure BDA0003959525510001191
人血清白蛋白-K57位点1
Figure BDA0003959525510001192
大鼠血清白蛋白-K92位点1
Figure BDA0003959525510001193
人血清白蛋白-K92位点1
Figure BDA0003959525510001194
Figure BDA0003959525510001201
大鼠血清白蛋白-K57位点2
Figure BDA0003959525510001202
人血清白蛋白-K57位点2
Figure BDA0003959525510001203
大鼠血清白蛋白-K92位点2
Figure BDA0003959525510001204
Figure BDA0003959525510001211
人血清白蛋白-K92位点2
Figure BDA0003959525510001212
大鼠血清白蛋白-K57位点3
Figure BDA0003959525510001213
人血清白蛋白-K57位点3
Figure BDA0003959525510001214
Figure BDA0003959525510001221
大鼠血清白蛋白-K92位点3
Figure BDA0003959525510001222
人血清白蛋白-K92位点3
Figure BDA0003959525510001223
大鼠血清白蛋白-K57位点4
Figure BDA0003959525510001224
人血清白蛋白-K57位点4
Figure BDA0003959525510001231
大鼠血清白蛋白-K92位点4
Figure BDA0003959525510001232
人血清白蛋白-K92位点4
Figure BDA0003959525510001233
7.2.人和大鼠IgG1Fc-凸起结构域融合蛋白
设计融合蛋白，其将接头序列侧接的K149凸起结构域肽掺入在智人和褐家鼠免疫球蛋白γ-1重链恒定区的多肽链的中间的各个位点中，如图15中所示。基于位点不大可能阻碍与新生儿Fc受体的结合，选择该位点。在此基础上，这些K149-IgG1融合蛋白可呈现与人C5蛋白的结合和延长的体内血清半衰期。
K149序列(以斜体显示)：
SCPDGFSYRSWDDFCCPMVGRCLAPRN(SEQ ID NO:313)
接头序列(以粗体显示)：
Figure BDA0003959525510001241
大鼠IgG1重链恒定区位点1-K149
Figure BDA0003959525510001242
大鼠IgG1重链恒定区位点2-K149
Figure BDA0003959525510001243
大鼠IgG1重链恒定区位点3-K149
Figure BDA0003959525510001246
大鼠IgG1重链恒定区位点4-K149
Figure BDA0003959525510001245
Figure BDA0003959525510001251
人IgG1重链恒定区位点1-K149
Figure BDA0003959525510001252
人IgG1重链恒定区位点2-K149
Figure BDA0003959525510001253
人IgG1重链恒定区位点3-K149
Figure BDA0003959525510001254
人IgG1重链恒定区位点4-K149
Figure BDA0003959525510001255
7.3.融合蛋白的合成、Expi293F细胞中的表达和与C5的结合
在Expi293F细胞中的合成和表达：
常规合成并克隆至含有人巨细胞病毒(CMV)启动子和同框C端10×组氨酸标签的pMH表达载体中可通过ATUM进行。对于所有构建体，可使用小家鼠(Mus musculus)免疫球蛋白重链前导序列：MEWSWVFLFFLSVTTGVHS(SEQ ID NO:475)。
质粒DNA使用QIAGEN Plasmid Plus Giga试剂盒扩增，且通过A260定量。根据制造商说明书，使用Expifectamine 293转染试剂盒(Invitrogen)设置每个构建体3×106个细胞/毫升的个体Expi293F细胞培养物。将细胞培养四天，以4000rpm离心一小时，且经由0.22μm过滤器过滤。使用纯Akta(GE Healthcare)，Hi-Trap镍excel柱(例如GE Healthcare)用10个柱体积(CV)的PBS平衡。以1.0mL/min加载细胞上清液，且柱用7×CV的PBS、0.5M NaCl洗涤。柱随后用7×CV的缓冲液A(0.5M NaCl、0.02M咪唑、PBS pH 7.3)洗涤。蛋白样品通过利用10×CV的缓冲液B(0.5M NaCl、0.25M咪唑、PBS pH 7.3)的等度洗脱来洗脱。洗脱后，汇集含蛋白的级分，使用PD-10柱(GE Healthcare)或Slide-a-lyzer透析盒(ThermoFisher)，将缓冲液更换为PBS。通过SDS-PAGE显现蛋白，用A280定量且等分以用于在-80℃下储存。
Biacore单循环动力学：
融合蛋白特异性结合C5的能力可通过Biacore评定。使用Biacore 8K(GEHealthcare)，通过胺偶联使C5蛋白固定在CM5 S系列传感器芯片上。流动池使用最小固定方案：EDC/NHS以1:2比率混合(流动速率：10μL/min；接触时间：30s)。使1μg/mL于pH 4.5的乙酸钠缓冲液中的C5固定在仅两个流动池(流动速率：10μL/min；接触时间：420s)上。最终，将乙醇胺应用于两个流动池(流动速率：10μL/min；接触时间：420s)上。获得大约100-200个反应单位的最终固定水平。
单循环动力学自最高浓度1μM(跨越1μM至1.4nM的范围)于HBS-EP缓冲液(GEhealthcare)中使用7个点、3倍滴定来测量。使用40μL/min的流动速率，接触时间为230s，解离时间为1800s。减去与参考表面的结合，且使用Biacore评估软件将数据拟合至单位点结合模型。
实施例8：根据本发明的分离的抗体片段的噬菌体展示文库
如本文所公开的凸起结构域肽的噬菌体展示文库可由任何适合方法产生，诸如直接地或经由间隔体将凸起结构域连接至M13的pIII，例如在整个牛CDR-H3内或备选地在另一蛋白的框架，诸如抗体片段，例如scFv、Fab或VHH内。
为了能够在M13丝状细菌噬菌体的pIII上进行超长CDR-H3序列的噬菌体展示，结合补体组分C3的骆驼VHH的hC3nb1经工程改造以容纳牛超长CDR-H3序列。CDR-H3序列在残基H74与H75(Kabat编号系统)之间插入未结合VH框架3环中。当在噬菌体上展示时，修饰的hC3nb1以通过共晶体结构(pdb登录码：6EHG)充分解释的方式保持经由其典型CDR与C3的结合。在大多数情况下，还观测到与C5的结合。下文显示序列、方法和结果。
序列：
hC3nb1序列，其中插入位点以粗体显示：
Figure BDA0003959525510001271
hC3nb1-K8
Figure BDA0003959525510001272
K8 CDR-H3:
Figure BDA0003959525510001273
hC3nb1-K57
Figure BDA0003959525510001274
K57 CDR-H3:
Figure BDA0003959525510001275
hC3nb1-K92
Figure BDA0003959525510001276
K92 CDR-H3:
Figure BDA0003959525510001277
hC3nb1-K149
Figure BDA0003959525510001281
K149 CDR-H3:
Figure BDA0003959525510001282
Figure BDA0003959525510001283
方法
通过TWIST Biosciences将牛CDRH3、hC3nb1和hC3nb1-超长CDR-H3克隆至噬菌粒载体中。噬菌粒载体在CDRH3、hC3nb1或hC3nb1-超长CDR-H3序列之前含有pelB前导序列以用于展示。这之后为聚组氨酸和c-myc-标签，其直接地融合至pIII。整个pIII融合蛋白处于葡萄糖可抑制型lac启动子的控制下。在用辅助噬菌体重复感染后，M13复制起点将引起单链噬菌粒DNA的合成，从而编码pIII融合展示构建体。各构建体在FKBP型肽基-脯胺酰基顺式-反式异构酶(FkpA，登录号：P45523(FKBA_ECOLI)的共表达存在和不存在的情况下制备。
使用热激方法将构建体转化到TG-1细胞中。简言之，将1μL质粒DNA添加至50μl感受态细胞中，简单混合，且在冰上孵育30分钟。细胞在42℃下热激30秒且在冰上孵育2分钟。添加200μL培养基，且将50μL涂铺在2TY培养基+100μg/ml羧苄青霉素(Carbenicillin)+2％葡萄糖上，且在37℃下孵育过夜。
从板挑选个体菌落，且置放于个体2TY培养基+100μg/ml羧苄青霉素+2％葡萄糖的5.0mL培养物中。培养物在振荡下在37℃下孵育直至达至约0.5的OD，此时其用MOI为10的M13K07辅助噬菌体(New England Biolabs)重复感染。将培养物离心且在葡萄糖不存在的情况下(2TY培养基+100μg/ml羧苄青霉素+50μg/ml卡那霉素)重悬，从而允许lac启动子渗漏且因此自噬菌粒表达重组VHH-pIII融合蛋白。最后，使细胞在30℃下生长过夜。
补体C5和C3用生物素非位点特异性地标记以准许固定至ELISA板上。胺反应性EZ-link生物素(例如Thermo Scientific)的储备液在DMSO中制备，且在-20℃下冷冻。生物素以十倍摩尔过量添加至C5和C3/PBS中。在室温下温育溶液60分钟。根据制造商说明书，未反应的生物素使用两个连续0.5mL Zeba去盐柱(Thermo Fisher)移除。
96孔ELISA板用100μL/孔的抗c-Myc抗体(例如Novus克隆#9E10)、C3蛋白或C5蛋白/PBS(10μg/mL)涂布。额外的板用链霉亲和素/PBS(5μg/mL)涂布且在2-8℃下温育过夜。涂布后，过夜噬菌体拯救培养物以4,500rpm离心10分钟。为了封闭噬菌体，移除500μL上清液且置于新鲜封闭物中，该新鲜封闭物含有500μL/孔6％脱脂奶粉(w/v)/PBS。使用板洗涤器(BMG labtech)通过用300μL/孔的四次循环的洗涤缓冲剂(PBS，0.1％Tween 20)洗涤，自ELISA板移除涂布溶液。添加(100μL/孔)封闭缓冲液(PBS，3％脱脂奶粉(w/v))，且在室温下温育板1小时。再次洗涤封闭的链霉亲和素板，且添加100μL/孔的C5-生物素(5μg/mL)、C3-生物素(5μg/mL)或测定缓冲液(1×PBS)，且温育30分钟。随后洗涤所有板，且添加(100μL/孔)封闭噬菌体上清液，且在振荡(400rpm)下温育1小时。再次洗涤板，且添加(100μL/孔)抗M13 HRP Ab，其以1:11000稀释于封闭缓冲液(PBS，3％脱脂奶粉(w/v))中；且在振荡(400rpm)下在室温下温育1小时。最终，洗涤板，且添加100μL/孔的“单步”TMB(ThermoScientific)，且温育大约5分钟。在630nm下在BMG Labtech板读取器上读取板。
结果
结果显示在图16中。当直接地固定至板上时和当在链霉亲和素板上捕获生物素标记C3时，如由抗myc标签和结合至人C3所指示，hC3nb1 VHH成功地展示于噬菌体上。未观测到C5蛋白有交叉反应性。
当直接地固定至板时且当在链霉亲和素板上捕获生物素标记C5时，hC3nb1-K8、hC3nb1-K57和hC3nb1-K92蛋白皆显示结合至人C5。此表明，超长CDR-H3在VHH上采用天然折叠，实现成功表面展示。仅hC3nb1-K149蛋白并不结合C3或C5的形式。
FkpA的共表达不是hC3nb1融合蛋白的超长CDR-H3展示的前提条件，但可能考虑到噬菌体ELISA中的信号的增加较少(数据未展示)，其可提供展示水平的适当提高。
实施例9：
Figure BDA0003959525510001291
共振能量转移(FRET)分析
为提供凸起结构域肽的高亲和力结合的其他证据，开发稳态
Figure BDA0003959525510001292
共振能量转移(FRET)测定。此通过用铽螯合剂供体荧光团标记C5和用AlexaFluor647受体荧光团标记如实施例2中所述的活性PGT121凸起融合蛋白中的各项来达成。在饱和浓度的未经标记的C5蛋白存在和不存在下，在温育24小时之后，PGT121凸起融合蛋白的滴定用于导出与C5相互作用的表观KD(KD app)。
方法：
Figure BDA0003959525510001301
共振能量转移(FRET)根据制造商说明书，自血清纯化的C5用胺反应性铽螯合剂(分子探针，life technologies)标记。简言之，使用zeba柱(Thermo Scientific)将1.15mg/mL的C5缓冲液换为50mM二甘氨酸、100mM NaCl、pH 8.2缓冲液。铽在5mM的DMSO中复原，且添加至1％最终浓度(v/v)以形成相对C5大致10倍摩尔过量。在室温下温育一小时之后，再次使用zeba柱(Thermo Scientific)通过两次依序缓冲液换为20mM Tris、100mMNaCl，pH 7.4，移除未结合的染料。标记比率通过UV光谱法定量，染料与蛋白的最终摩尔比为4:1。接着，使用如上所述相同的方案，但与染料一起温育30分钟，如实施例2中所述的PGT121凸起结构域融合蛋白用胺反应性AlexaFluor 647(AF647)染料(分子探针，lifetechnologies)标记。在移除未结合的染料之后，UV光谱法将染料与蛋白的最终摩尔比定量为2:1。
为了测定PGT121凸起结构域融合KD app，将C5 Tb涂铺至黑色低体积384孔测定板(Corning)中，得到1nM的最终测定浓度(final assay concentration；FAC)，添加HBS-EP缓冲液(GE healthcare)或未经标记的C5(1μM FAC)。在HBS-EP中制备PGT121凸起结构域融合蛋白的八个点的三倍滴定，得到100nM-0.046nM或500nM-0.22nM(FAC)的范围。在振荡下将板包裹在箔中且温育48小时。以2、24和48小时的时间间隔在Envision板读取器(PerkinElmer)上读取板(HTRF激光，激发330nm和发射665/615nm)。为了拟合，减去背景，且使用prism软件将曲线拟合至4个参数的对数模型。
结果：
尽管通过标记修饰两种蛋白，但PGT121融合蛋白以与我们的SPR实验一致的方式以高亲和力结合C5(表40和41)。
表40.在2小时温育之后结合至C5-Tb的PGT121融合蛋白的FRET测定KD app
Figure BDA0003959525510001302
Figure BDA0003959525510001311
表41.在24小时温育之后结合至C5-Tb的PGT121融合蛋白的FRET测定KD app
n1 n2 n3 几何平均K<sub>D</sub> app(nM)
PGT121 K8 6.6 5.0 4.7 5.4
PGT121 K57 3.3 2.3 3.4 3.0
PGT121 K92 19.3 7.7 11.3 11.9
PGT121 K136 46.3 23.4 58.1 39.8
PGT121 K149 126.6 90.6 24.9 65.9
尽管PGT121-K92和PGT121-K136融合蛋白在biacore中显示由缓慢koff介导的特别紧密的结合，但通过稳态方法亲和力较低。
竞争分析
接着，使用亲本PGT121凸起结构域融合蛋白置换作为结合的读数，在竞争分析格式中测试凸起结构域的滴定。
C5-Tb涂铺至1nM(FAC)，且在HBS-EP缓冲液中制备凸起结构域肽的滴定，得到1000nM-0.46nM(FAC)的范围。制备PGT121凸起结构域融合-AF647蛋白，得到以下浓度，其等同于在先前实验中经测量的KD app：PGT121-K8 AF647 5nM(FAC)、PGT121-K57 AF647 3nM(FAC)、PGT121-K92 AF647 12nM(FAC)、PGT121-136 AF647 40nM(FAC)和PGT121-149 AF64766nM(FAC)。板包裹在箔中，在振荡下温育24小时，且在Envision板读取器上读取(HTRF激光，激发330nm和发射665/615nm)。使用prism软件将曲线拟合至4个参数的对数模型。IC50值转化为抑制常数(Ki)。
测量IC50值，且使用Cheng-Prusoff方程针对各个凸起结构域肽导出抑制常数(Ki)：
Figure BDA0003959525510001312
结果显示在下表42中。
表42.24小时温育的竞争FRET测定
Figure BDA0003959525510001313
Figure BDA0003959525510001321
这些为高亲和力的(低于-50nM)相互作用进一步提供证据，且证实实施例2中通过SPR的观测结果。在所有FRET实验中，希尔斜率(Hill slope)在预期范围(0.5-2)内，此指示如质量作用定律所定义的可逆结合，而PGT121凸起结构域融合蛋白的位移(单位nM)表明相互作用实际上是位点特异性的。
实施例10：
进行额外的实验以表征通过化学肽合成产生的凸起结构域。
1-凸起结构域肽
K149A和K149B和其制造方法描述于实施例4中(有时对于定点呈下标chemSD)。K8、K57、K92、K149使用自由能方法产生，且在下文显示于表43中(有时对于自由能呈下标chemFE)。对于通过两种方法产生的肽，液相层析/质谱(LC/MS)证实与具有完全键形成的所预测氨基酸序列一致的物质一致地存在。
表43：在本实施例中测试的凸起结构域的序列
Figure BDA0003959525510001322
化学变体
K8chemFE环状：为了形成小的环状抗体片段，进行K8chemFE凸起结构域的头尾环化，产生环状肽，称为“K8chemFE环状的”)。凸起结构域的N端和C端极为贴近，且此可能意味着在抗体片段中，其唯一地适合于进行环化。
K92chemFE W21A/W6A/Y14A/Y16A/F26A：一系列π-π堆栈相互作用横跨K92的一侧，涵盖残基：Y14、Y16 F26、H25、W21、W6和P3。为了评估维持三级结构的堆栈相互作用的重要性，合成一系列丙氨酸突变Y14A、Y16A、F26A、H25A、W21A和W6A。
K92chemFE W21H：基于结构，认为W21H突变可在组氨酸咪唑环的极性氮与N77C5(基于成熟C5序列进行编号)之间引入额外的静电相互作用，可能产生改进的结合亲和力。
K57chemFE-棕榈酰基：为了探究脂肪酸缀合的作用，合成K57chem的棕榈酰化形式。
2-与C5的结合
凸起结构域肽与人C5的结合通过SPR使用如下的多循环动力学方法测量：
使用具有CM5芯片的Biacore 8K(GE Healthcare)来测量动力学，该CM5芯片制备如下：以1:1比率混合EDC/NHS(流动速率：10μL/min；接触时间：30秒)，仅在一个流动池(流动速率：10μL/min；接触时间：60秒)内注射pH4.5的乙酸钠缓冲液中的1μg/mL的人C5蛋白。获得2000-3000个反应单位(RU)的范围内的最终固定水平，得到约50-60RU的Rmax理论值。肽的连续稀释液在HBS-EP缓冲液中制备且注射(流动速率：30μL/min；接触时间：240秒；解离时间：6000秒)。在每次注射之后，表面用两次连续注射2MMgCl2(流动速率：30μL/min；接触时间：30秒)再生。减去与参考表面的结合，且使用Biacore评估软件将数据拟合至单位点结合模型。
结果显示在下表44中。
表44：来自n＝3个实验的Biacore多循环动力学数据的总结
Figure BDA0003959525510001331
Figure BDA0003959525510001341
*平均化学计量比通过将测量的Rmax值除以理论Rmax来计算
化学凸起结构域以高亲和力结合C5(表44)，等于先前针对生物肽报道的值。对于具有两条二硫键的K149，相邻半胱氨酸C15和C16无法配对，仅产生两个可能的二硫键键合排列：K149chemSD-A(C2-C15、C16-C22)和K149chemSD-B(C2-C16、C15-C22)。尽管这两种形式均结合C5，但K149B显示亲和力要低大约35倍。当通过自由能方法(此后下标chemFE)产生时，K149(K149chemFE)结合C5的亲和力等于较高亲和力的K149chemSD-A形式。
由于K149二硫键的错配在一定程度上为耐受的，因此接下来经由用碘乙酰胺(IAM)还原和封端半胱氨酸来完全测试移除二硫键的作用。在LC/MS分析之后，为了确认均匀的封端已出现，再次通过SPR测量与C5的结合。对于K149chem，二硫键的损失完全消除结合，而对于K92而言，亲和力自411pM显著下降为2μM，主要由on速率的延长介导。在K57中损失二硫键亦影响亲和力，但保留76nM的KD。在两种情况下，亲和力降低主要由on速率减小介导，可能是由于失去三级结构。
化学突变体：
K8chemFE环状：此片段结合人C5。
K92chemFE W21A/W6A/Y14A/Y16A/F26A：在通过SPR测试与C5的结合时，移除任何芳族残基对结合十分有害，而H25A突变完全防止肽折叠。相对于野生型K92chemFE，所有突变降低亲和力，包括远离互补位的残基(诸如W6)和不与C5维持分子相互作用的残基(诸如Y16)；突出了非共价三级结构在维持结合完整性方面的重要性。
K92chemFE W21H：尽管此突变实际上未提高K92chemFE的亲和力，但容许用组氨酸置换W21以使得突变体可折叠且相对于其他位点中的芳族物的移除使亲和力的损失低得多；表明组氨酸能够部分维持折叠和维持三级结构所需的堆栈相互作用。特别地，W21H能够相对于其他突变体维持亲和力，因为kon的值大大提高。
K57chemFE-棕榈酰基：结合至C5不受N端结合的影响。
3-功能活性
已证明结合至C5，在一系列补体ELISA和对旁路途径(AP)或经典路径(CP)活化具有特异性的红细胞溶血分析中评估生物功能。
补体ELISA：按照制造商的方案，使用CP和AP补体功能性ELISA试剂盒(SVAR，COMPL300RUO)进行分析。对于样品制备而言，根据各自方案对血清进行稀释以用于CP和AP分析；制备肽的连续稀释液且使其与血清一起在室温下温育15分钟，随后涂铺。
溶血分析：对于AP，50μL的24％正常人血清(Complement Technology)，50μL的20mM MgEGTA(Complement Technology)，和48μL的GVB0缓冲液(0.1％明胶，5mM弗洛拿，145mM NaCl，0.025％NaN3，pH7.3，Complement Technology)等分至96孔组织培养板(USAScientific)的单孔中，随后与在DMSO中连续稀释的2μL抑制剂混合。在室温下平衡15分钟之后，将以2.5×107个/孔的50μL兔红细胞(Complement Technology)添加至板，随后将其在37℃下温育30分钟。板以1,000×g离心3分钟且收集100μL上清液，转移至另一96孔组织培养物处理的板中，且在412nm下测量吸光度。对于CP，将50μL 4％正常人血清、48μL GVB++缓冲液(0.1％明胶、5mM弗洛拿、145mM NaCl、0.025％NaN3，pH 7.3与0.15mM CaCl2和0.5mMMgCl2，Complement Technology)和在DMSO中连续稀释的2μL抑制剂等分至单孔中且如所描述平衡。接着，向板中添加5×107个/孔的100μL抗体致敏绵羊红细胞(ComplementTechnology)，随后在37℃下温育1小时。随后如所述处理样品。
结果
CP ELISA分析的结果显示在图18A中。AP ELISA分析的结果显示在图18B中。CP和AP溶血分析的结果分别显示在图19A和图19B中。
在追踪C5b沉积的补体活化ELISA中，K57chemFE为CP和AP两者的强效且完全有效的抑制剂；化学物质K8(K8chemFE)为CP和AP的部分抑制剂；而化学物质K92(K92chemFE)部分地抑制AP且适度地展示CP的剂量依赖性增强。与以生物衍生的K149获得的结果一致，K149chemFE为C5的非功能性沉默结合子。
红细胞溶血分析中的行为与ELISA一致。K57chemFE为补体介导的细胞裂解的强效且完全有效的抑制剂，K92chemFE仅在AP驱动溶血分析中具有活性且K8为CP的部分抑制剂且在AP分析中活性较弱。重要地，ELISA和溶血分析中的这些观测结果密切地反映先前用肽的生物形式报道的那些观测结果。在溶血分析中，K57chemFE广泛地等效于两种临床C5抑制剂：RA101295-14，一种目前在III期试验中的UCB-Ra Pharma大环肽Zilucoplan的密切类似物；和SOBI002，一种来自Swedish Orphan Biovitrum的亲和抗体，其在1期试验中展示短暂不良作用之后中断。
K8chemFE环状：为功能活性补体抑制剂，相对于K8chemFE仅具有适度效能损失(图19)。
4-交叉反应
因为标靶结合可影响药物动力学，所以我们测试凸起结构域与来自褐家鼠(大鼠)的C5蛋白的交叉反应。
方法
使用具有CM5芯片的Biacore 8K(GE Healthcare)来测量动力学，该CM5芯片制备如下：以1:1比率混合EDC/NHS(流动速率：10μL/min；接触时间：30秒)，仅在一个流动池(流动速率：10μL/min；接触时间：60秒)内注射pH 4.5的乙酸钠缓冲液中的1μg/mL的大鼠C5蛋白。获得2000-3000个反应单位(RU)的范围内的最终固定含量，得到约50-60RU的Rmax理论值。肽的连续稀释液在HBS-EP缓冲液中制备且注射(流动速率：30μL/min；接触时间：240秒；解离时间：6000秒)。在每次注射之后，表面用两次连续注射2M MgCl2(流动速率：30μL/min；接触时间：30秒)再生。减去与参考表面的结合，且使用Biacore评估软件将数据拟合至单位点结合模型。
结果
通过SPR，K8chem与大鼠C5蛋白以及来自其他物种的C5交叉反应(数据未示出)，而K57chem对人C5具有特异性。
5-稳定性
为了测试凸起结构域是否借助于其丰富二硫键对蛋白水解具有抗性，我们使用质谱法追踪人、大鼠和小家鼠(小鼠)血浆中的K8chemFE、K57chemFE和K57chemFE-棕榈酰基在24小时的时段内的稳定性。
方法
在室温下在24小时时段内，大鼠/小鼠/人肝素锂血浆的稳定性在1.25μg/mL的浓度水平下评估K57chemFE-棕榈酰基，6.25μg/mL用于评估K57和8ng/mL用于评估K8。制备校准线和适合质量控制样品且在-80℃下与其他单独尖峰一起冷冻用于评估。这些单独尖峰以0.116、0.25、0.5、1、2、4、6和24小时的时间间隔在初始校准线之后置放于冷冻器中。在最少1小时冷冻后得到最终24小时尖峰。与初始校准线同时，经由蛋白沉淀来提取这些样品。
结果
未修饰的凸起结构域在人血浆中格外稳定，在10小时之后＞75％肽保持完整(图20)。
6-药物动力学
在给药之后经由静脉内推注至SD大鼠来测量K8chemFE、K57chemFE和K57chemFE-棕榈酰基的药物动力学(图21)。
方法
在324g与425g之间体重的雄性SD大鼠中研究各肽的血浆药物动力学。药物经由尾部静脉进行静脉内施用。对于肽K8chemFE、K57chemFE，所施用的剂量为10mg/kg，且对于K57chemFE-棕榈酰基，所施用的剂量为1mg/kg。在7分钟、15分钟、30分钟，随后1、2、4、8和24小时采集血液样品。将血液收集至Li肝素试管中且离心以制备用于生物分析的血浆样品。在个体动物基础上使用Pharsight Phoenix 64Build 8.1分析生物分析数据。进行非隔室分析且计算各药物的平均药物动力学参数。
结果
在以10mg/kg施用之后，使K57chemFE经历肾清除且以典型的快速方式消除肽和低分子量蛋白(t1/2＝17min/血浆清除率[Clp]＝10.6ml/min/kg)。相比之下，K8chemFE紧密结合大鼠C5蛋白且采用目标类动力学，使得暴露显著改良(t1/2＝约9小时/Clp＝3.3ml/min/kg)。由于溶解度降低，以1mg/kg的剂测量试K57chemFE-棕榈酰基；相对于未经修饰的K57chem，棕榈酸脂肪酸延长的暴露的结合(t1/2＝1.6小时/Clp＝0.8ml/min/kg)。此表明结合可能与环化或其他化学修饰组合为延伸化学凸起结构域的生物暴露的可行途径。
实施例11：C5-K92复合物的晶体结构
亦分别如实施例5中所描述，以
Figure BDA0003959525510001381
和
Figure BDA0003959525510001382
的分辨率对自牛(K92bio)分离或通过化学合成(K92chemFE)产生的K92凸起结构域与C5复合的晶体结构进行解析。
mFo-DFc模拟退火省略C5-K92chemFE复合物的定位显示肽的清晰电子密度，而最终结构显示与K92bio相邻的C5-K92chemFE的折叠和二硫键排列。用大分子结构分析工具PDBPiSA的分析证实，维持结合至C5的分子相互作用在K92chemFE与K92bio之间一致。
图22A展示与C5复合的K92chemFE。图22B展示在K92上的二硫键排列。图22C显示先前实施例中提及的K92突变的位置。
实施例12：构建超长CDR-H3噬菌体文库以用于发现凸起结构域肽
以下方法能够产生可针对任何目标抗原进行的富含抗原的超长CDR-H3文库。超长CDR-H3的噬菌体展示文库可通过任何适合方法产生，诸如使超长CDR-H3直接或经由间隔子连接至M13的pIII，例如融合至hC3nb1 VHH。
举例而言，为了能够形成富含抗原的CDR-H3文库，用人C5以及人和小鼠血清白蛋白蛋白质使牛免疫。超长CDR-H3序列特异性扩增且直接融合至噬菌体次要外壳蛋白基因g3p(或pIII)，以允许使用噬菌体展示针对抗原富集。噬菌粒载体在超长CDR-H3序列之前含有pelB前导序列以用于展示。此之后为聚组氨酸和c-myc-标签，其直接地融合至g3p。编码融合蛋白的整个开放阅读框架处于葡萄糖可抑制型lac启动子的控制下。在用辅助噬菌体重复感染后，M13复制起点将引起单链噬菌粒DNA的合成和包装，从而编码噬菌体病毒粒子内的噬菌体展示构建体。通过此方法，超长CDRH3序列可展示在噬菌体病毒粒子的表面上以保留基因型与表型连接，且经由噬菌体生物淘选，分离结合免疫抗原的那些抗体片段。
方法
免疫：
使荷兰牛(Holstein Friesian cattle)免疫接种经纯化的人C5或血清白蛋白抗原，每个免疫原用于一只母牛，其中一次初免和两次加强间隔四周。对于C5，使两只成年荷兰母牛免疫接种补体C5(CompTech)。对于早期免疫接种，将1.25mg C5与Fama佐剂(Adjuvant Fama)(GERBU Biotechnik)1:1(v/v)混合。以1个月间隔向肩部执行三次皮下注射。免疫接种后十天，采集10mL血液以允许测试血清抗体力价。对于后续加强，将1.25mg C5用完全弗氏佐剂(Sigma)，且对于最后射注，用孟塔纳(Montanide)(Seppic)-1:1乳化，之后立即皮下注射至肩部中。对于人和小鼠血清白蛋白(分别为HSA/MSA)，以四周间隔执行三次免疫接种，其中将1mg总蛋白、各0.5mg的HSA和MSA与孟塔纳佐剂(Seppic)1:1(v/v)均匀地混合，之后施用至左肩中。
免疫物质收取和ELISA分析：
第二次和第三次免疫接种后七天，采集血清样品以在蛋白以2μg/ml在PBS中直接吸附至Nunc Maxisorb板时使用ELISA评估目标特异性反应。将血清稀释至补充有1％BSA(w/v)的PBS中，且使用二级抗体抗牛H+L–HRP缀合物(Stratech)测定反应。测定选择性血清力价反应后，在最后一次加强后十天，自该母牛进行额外取样：在免疫接种部位附近采集的500mL血液、约2cm3脾样品和单一引流淋巴结。
鉴别结合至所关注的抗原的超长CDR-H3序列：
根据制造商方案，使用RNeasy plus midi试剂盒(Qiagen)以自5×107个细胞纯化总RNA，所述细胞自淋巴结纯化。RNA即刻用于使用Super script IV vilo主混合物(Invitrogen)进行的RT-PCR反应中。
初级PCR
经由PCR选择性地扩增编码CDR-H3区的cDNA。引物退火至重链的框架3和框架4，由此扩增CDR-H3区，不论长度如何变化(标准或超长CDR-H3)。所用引物(自5’至3’读取)为：正向引物：GGACTCGGCCACMTAYTACTG(SEQ ID NO:446)和反向引物：GCTCGAGACGGTGAYCAG(SEQID NO:447)。使用Phusion Green Hotstart II主混合物(Thermo scientific)执行PCR。对初级PCR DNA进行柱纯化，之后将其用于次级PCR中。
次级PCR
使用衍生自超长CDR-H3递增和递减茎序列的引物集合以自初级PCR DNA特异性地扩增超长序列。在独立PCR反应中个别地使用7个递增茎引物，同时汇集6个递减茎引物。递增引物以10μM的浓度使用，且各递减引物在汇集溶液中的浓度为10μM。引物集合亦含有允许接合至载体中的SfiI和NotI限制酶位点。
所用引物(自5’至3’读取)如下：
递增引物集合：
CTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCACTACTGTGCACCAAAAAACA(SEQ ID NO:482)
CTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCACTACTGTGCACCAAAGAACC(SEQ ID NO:483)
CTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCACTACTGTGCACCAAAAAACG(SEQ ID NO:484)
CTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCACTACTGTGCACCAACAAACT(SEQ ID NO:485)
CTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCACTACTGTGCACCAACAGACC(SEQ ID NO:486)
CTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCACTACTGTGGTCCAGAAAACA(SEQ ID NO:487)
CTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCACTACTGTAGTCCAACGAACA(SEQ ID NO:488)
递减引物集合：
TGATGGGCGGCCGCGGCATCGACGTACCATTCGTA(SEQ ID NO:489)
TGATGGGCGGCCGCGGTATCGACGTACCATTCGTA(SEQ ID NO:490)
TGATGGGCGGCCGCGGCTTCGACGTACAATTCGTA(SEQ ID NO:491)
TGATGGGCGGCCGCGGCATTGACGTAGAATTCGTA(SEQ ID NO:492)
TGATGGGCGGCCGCGGCCTCGATGTCAAATTCGTA(SEQ ID NO:493)
TGATGGGCGGCCGCGGTTTCGACGTGGTATTCGTA(SEQ ID NO:494)
使用Phusion Green Hotstart II主混合物(Thermo scientific)执行PCR。对次级PCR产物进行柱纯化，之后将其用于克隆至噬菌粒载体中。
文库构建
噬菌粒载体(pUC119的衍生物)用于整个研究中。使用NotI和SfiI消化噬菌粒载体和次级PCR产物两者。一旦消化，则载体与CDR-H3插入片段使用1:3摩尔比的载体与插入片段来连接。使用电穿孔，使用沉淀接合来转化大肠杆菌TG1细胞(Lucigen)。将所回收的样品涂铺至选择性培养基，即补充有1％葡萄糖、100μg/mL羧苄青霉素的2TY琼脂上，且在30℃下孵育过夜。
噬菌体拯救
通过添加选择性液体培养基，即补充有1％葡萄糖和100μg/mL羧苄青霉素的2TY且将生物质刮擦至液体培养物中来收取培养物。以0.1AU的OD600使用所收集的培养物来接种新鲜选择性培养基。在37℃下温育培养物直至其达到约0.5AU的OD600为止。以20的感染倍率(MOI)添加M13K07辅助噬菌体，且使培养物在37℃下静置1小时。随后，对培养物进行离心，且使团块重悬在补充有50μg/mL卡那霉素和100μg/mL羧苄青霉素的2TY培养基中且在30℃下孵育过夜。
孵育过夜后，通过离心来回收培养物上清液，使噬菌体团块重悬在20mL PBS中。执行另一轮沉淀，且使噬菌体团块重悬在补充有20％甘油的PBS中，最终浓度为约1012PFU/mL。将经纯化的噬菌体等分试样储存于-80℃下直至需要为止。
噬菌体生物淘选
对于C5文库，用人或大鼠C5蛋白执行单轮富集。对于白蛋白文库，用人和小鼠血清白蛋白执行两轮富集。对噬菌体进行封闭30分钟。以100nM的浓度向经封闭的噬菌体中添加经生物素标记的抗原且在混合的情况下在室温下进行温育。
使链霉亲和素戴诺磁珠(Streptavidin Dynabead)(Thermofisher)重悬在经封闭噬菌体溶液中，将其温育10分钟且用1mL含0.1％Tween 20的PBS洗涤四次。洗涤后，集结珠粒，且移除上清液。添加500μl 0.1M盐酸以自珠粒洗提噬菌体，之后将其与对数中期(mid-log)大肠杆菌TG1细胞一起温育以允许进行细菌性感染。
在固体选择性培养基，即补充有1％葡萄糖和100μg/mL羧苄青霉素的2TY琼脂上生长细胞，以回收经富集的次文库，且回收单菌落以进行筛选。
单克隆噬菌体筛选ELISA
将菌落挑选至含有补充有1％葡萄糖和100μg/ml羧苄青霉素的选择性培养基2TY的96孔培养板中，且将其在37℃下温育直至孔达到生长的对数中期为止，之后添加M13K07辅助噬菌体。在补充有50μg/ml卡那霉素和100μg/ml羧苄青霉素的选择性培养基中，在无振荡的情况下温育封闭物1小时以使用持续培养达成感染和噬菌体生产。
通过单克隆噬菌体ELISA评估与抗原的结合，用2.5μg/ml人、小鼠或大鼠血清白蛋白、人C5或小鼠C5的经PBS稀释的溶液涂布96孔平底Nunc MaxiSorp板(Thermofisher)，且使其在4℃下静置过夜。还制备阴性对照板和抗myc标签板。
单克隆噬菌体拯救上清液用等体积的含2％乳液(w/v)的PBS来封闭，对于血清白蛋白，或用含2％BSA和2％乳液(w/v)的PBS溶液来封闭。自经涂布Nunc板移除涂布溶液，且用含1％BSA的PBS(对于C5文库)或含1％乳粉的PBS(对于白蛋白文库)封闭各板。在室温下对噬菌体板和Nunc板两者进行封闭1小时。使用96孔微定量板式洗涤器(BioTek)用含有0.1％Tween20的PBS溶液(Sigma Aldrich)洗涤Nunc板。将100μL经封闭噬菌体溶液添加至Nunc MaxiSorp板的各孔中且使其在室温下振荡1小时。如先前所描述对板进行洗涤和干燥。将稀释(1:5,000)于1％BSA或乳液溶液中的100μL抗M13辣根过氧化酶缀合抗体(GEHealthcare)添加至各孔中且使其在室温下振荡1小时。再次洗涤板，且将50μL TMB溶液(Merck Millipore)添加至各孔中。将板振荡10分钟。测量在630nm和490nm下的吸亮度。获得结合信号，其中在630nm下的吸亮度为无关抗原上的信号的＞3倍。
对于测序，将来自经富集的单克隆拯救封闭物的0.5μl含细胞培养基添加至含有以下的PCR板中的对应孔中：20.75μL DPEC处理水；2.5μL 10×标准Taq缓冲液(NewEngland Biolabs)；0.5μL正向和反向10μM引物储备液和0.25μL Taq DNA聚合酶(5000μ/mL-New England Biolabs)。
用于扩增处于噬菌粒载体内且退火至噬菌粒载体的插入片段的引物(自5’至3’读取)如下：
正向：GTTGGCCGATTCATTAATGCAG(SEQ ID NO:495)
反向：ACAGACAGCCCTCATAGTTAGC(SEQ ID NO:496)。
将板在热循环仪中加热至95℃达五分钟且随后将其加热持续以下三十五个循环：(95℃40秒；55℃40秒；68℃100秒和72℃2分钟)。最后，将1μLIllustra ExoProStar添加至各孔中以移除未使用的dNTP和引物，之后进行测序。将板置放于热循环仪中37℃下40分钟且80℃下15分钟，之后在Macrogen处执行桑格测序(Sanger sequencing)。
结果
通过单克隆噬菌体ELISA，以下超长CDR-H3序列经鉴别为结合子(OD＞0.2AU)：
表45：抗血清白蛋白超长CDR-H3
Figure BDA0003959525510001431
表46：对白蛋白具有特异性的超长CDR-H3凸起结构域的序列
Figure BDA0003959525510001432
Figure BDA0003959525510001441
表47：抗-C5超长CDR-H3
Figure BDA0003959525510001442
Figure BDA0003959525510001451
Figure BDA0003959525510001461
Figure BDA0003959525510001471
表48：抗-C5超长CDR-H3凸起结构域
如本申请案中所定义的凸起结构域的最小序列在下表中以粗体突出显示。
Figure BDA0003959525510001481
Figure BDA0003959525510001491
序列表
<110> UCB生物制药有限责任公司（UCB BIOPHARMA SRL）
<120> 自主凸起结构域肽
<130> PF0255-WO-PCT
<150> GB2004462.4
<151> 2020-03-27
<150> GB2008095.8
<151> 2020-05-29
<160> 609
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 48
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 超长CDR-H3 K149
<400> 1
Thr Ser Val Leu Gln Ser Thr Lys Pro Gln Lys Ser Cys Pro Asp Gly
1 5 10 15
Phe Ser Tyr Arg Ser Trp Asp Asp Phe Cys Cys Pro Met Val Gly Arg
20 25 30
Cys Leu Ala Pro Arg Asn Thr Tyr Thr Thr Glu Phe Thr Ile Glu Ala
35 40 45
<210> 2
<211> 48
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 超长CDR-H3 K152
<400> 2
Thr Ser Val Leu Gln Ser Thr Lys Pro Gln Lys Ser Cys Pro Asp Gly
1 5 10 15
Phe Ser Tyr Arg Ser Trp Asp Asp Phe Leu Leu Ser Tyr Gly Trp Glu
20 25 30
Cys Leu Ala Pro Arg Asn Thr Tyr Thr Thr Glu Phe Thr Ile Glu Ala
35 40 45
<210> 3
<211> 49
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 超长CDR-H3 K147
<400> 3
Val Thr Val His Gln Gln Thr Lys Arg Thr Cys Pro Arg Gly Tyr Glu
1 5 10 15
Tyr Val Ser Cys Trp Trp Gly Ala Thr Cys Thr Tyr Gly Gly Arg Cys
20 25 30
Ser Gly Ser Arg Asp Asp Gly Ser Leu Thr Tyr Glu Phe His Val Asp
35 40 45
Ala
<210> 4
<211> 49
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 超长CDR-H3 K148
<400> 4
Val Thr Val His Gln Gln Thr Lys Arg Thr Cys Pro Arg Gly Tyr Glu
1 5 10 15
Tyr Val Ser Cys Trp Trp Gly Ala Thr Cys Thr Tyr Gly Gly Arg Cys
20 25 30
Ser Ala Val Gly Asp Asp Gly Ser Leu Thr Tyr Glu Phe His Val Asp
35 40 45
Ala
<210> 5
<211> 52
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 超长CDR-H3 K142
<400> 5
Thr Thr Val His Gln Glu Pro Lys Lys Ser Cys Pro Glu Gly Tyr Thr
1 5 10 15
Tyr Val Trp Gly Cys Asp Asp Asp Ser Gly Gly Val Gly Tyr Gly Cys
20 25 30
Ala Pro Asn Gly Ala Ser Ser Cys Ser Phe Thr Tyr Thr Tyr Glu Phe
35 40 45
His Ile Asp Ala
50
<210> 6
<211> 52
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 超长CDR-H3 K143
<400> 6
Thr Thr Val His Gln Glu Thr Lys Lys Ser Cys Pro Glu Gly Tyr Thr
1 5 10 15
Tyr Val Trp Gly Cys Asp Asp Asp Ser Gly Gly Val Gly Tyr Gly Cys
20 25 30
Ala Pro Asn Gly Ala Ser Ser Cys Ser Phe Thr Tyr Thr Tyr Glu Phe
35 40 45
His Ile Asp Ala
50
<210> 7
<211> 55
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 超长CDR-H3 K132
<400> 7
Thr Thr Val His Gln Arg Thr Leu His Asn Arg Asn Cys Pro Asp Gly
1 5 10 15
Tyr Gly Tyr Gln Arg His Cys Thr Val Gly Glu Asp Cys Thr Glu Arg
20 25 30
Cys Cys Asp Asn Tyr Gly Leu Cys Thr Ser Tyr Thr Asp Thr Tyr Thr
35 40 45
Tyr Glu Phe Asn Val Asn Ala
50 55
<210> 8
<211> 55
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 超长CDR-H3 K133
<400> 8
Thr Thr Val His Gln Arg Thr Leu Lys Asn Arg Asn Cys Pro Ala Gly
1 5 10 15
Tyr Gly Tyr Gln Arg His Cys Thr Val Gly Glu Asp Cys Thr Asp Ser
20 25 30
Cys Cys Asp Arg Tyr Gly Leu Cys Thr Thr Ser Thr Glu Thr Tyr Thr
35 40 45
Tyr Glu Phe Asn Val Asp Ala
50 55
<210> 9
<211> 53
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 超长CDR-H3 K140
<400> 9
Thr Ala Val His Gln Arg Thr Lys Arg Thr Cys Pro Glu Gly Leu Val
1 5 10 15
Tyr Asn Ser Asp Gln Ser Arg Cys Cys Ala Ala Asp Ser Gly Val Cys
20 25 30
Trp Glu Tyr Trp Arg Gly Glu Arg Val Thr Arg Gly Phe Thr Tyr Glu
35 40 45
Trp Tyr Val Glu Ala
50
<210> 10
<211> 53
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 超长CDR-H3 K141
<400> 10
Thr Ala Val His Gln Arg Thr Lys Arg Thr Cys Pro Glu Gly Leu Ile
1 5 10 15
Tyr Asn Ser Asp Gln Ser Arg Cys Cys Ala Ala Asp Ser Gly Val Cys
20 25 30
Trp Glu Tyr Trp Arg Gly Glu Arg Val Thr Arg Gly Phe Thr Tyr Glu
35 40 45
Trp Tyr Val Glu Ala
50
<210> 11
<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 超长CDR-H3 K126
<400> 11
Thr Thr Val His Gln Gln Thr His Lys Lys Arg Ser Cys Pro Ala Asn
1 5 10 15
His Ser Val Arg Asp Met Cys Ser Tyr Gly Pro Asp Asp Cys Gly Arg
20 25 30
Ser Cys Cys Thr Asp Gly Ile Tyr Val Arg Arg Gly Ser Cys Ser Ser
35 40 45
Ala Tyr Glu Phe His Val Asp Ala
50 55
<210> 12
<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 超长CDR-H3 K129
<400> 12
Thr Thr Val His Gln Gln Thr His Lys Lys Arg Ser Cys Pro Glu Asn
1 5 10 15
His Ser Val Arg Asp Met Cys Ser Tyr Gly Pro Asp Asp Cys Gly Arg
20 25 30
Ser Cys Cys Thr Asp Gly Ile Tyr Val Arg Arg Gly Ser Cys Ser Ser
35 40 45
Ala Tyr Glu Phe His Val Asp Ala
50 55
<210> 13
<211> 59
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 超长CDR-H3 K92
<400> 13
Ser Ile Val His Gln Lys Ala His Thr Ser Val Thr Cys Pro Glu Gly
1 5 10 15
Trp Ser Glu Cys Gly Val Ala Ile Tyr Gly Tyr Glu Cys Gly Arg Trp
20 25 30
Gly Cys Gly His Phe Leu Asn Ser Gly Pro Asn Ile Ser Pro Tyr Val
35 40 45
Ser Thr His Lys Tyr Glu Trp Tyr Val Asp Ala
50 55
<210> 14
<211> 59
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 超长CDR-H3 K93
<400> 14
Ser Ile Val His Gln Lys Thr Gln Thr Ser Glu Gly Cys Pro Glu Gly
1 5 10 15
Trp Ser Glu Cys Gly Val Gly Thr Tyr Gly Tyr Asp Cys Gly Arg Trp
20 25 30
Gly Cys Gly His Tyr Leu Asn Thr Gly Pro Leu Ile Ser Gly Tyr Val
35 40 45
Thr Thr Asn Lys Tyr Glu Trp His Val Glu Ala
50 55
<210> 15
<211> 59
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 超长CDR-H3 K94
<400> 15
Ser Thr Val His Gln Lys Ala His Thr Ser Val Ala Cys Pro Glu Gly
1 5 10 15
Trp Ser Glu Cys Gly Val Ala Ile Tyr Gly Tyr Asp Cys Gly Arg Trp
20 25 30
Gly Cys Gly His Phe Leu Asn Ser Gly Pro Asn Ile Ser Pro Tyr Val
35 40 45
Thr Thr Asp Ala Tyr Glu Trp Tyr Val Asp Ala
50 55
<210> 16
<211> 59
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 超长CDR-H3 K95
<400> 16
Ser Ile Val His Gln Arg Thr Gln Thr Ser Lys Gly Cys Pro Glu Gly
1 5 10 15
Trp Asn Asp Cys Gly Gly Asn Thr Tyr Gly Tyr Asp Cys Gly Arg Trp
20 25 30
Gly Cys Gly His Tyr Leu Asn Ser Gly Pro Arg Ile Ser Ala Tyr Gln
35 40 45
Thr Thr Tyr Asn Tyr Glu Trp Tyr Val Asp Ala
50 55
<210> 17
<211> 59
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 超长CDR-H3 K97
<400> 17
Thr Ile Val His Gln Lys Thr Gln Thr Arg Glu Gly Cys Pro Glu Gly
1 5 10 15
Trp Asn Glu Cys Gly Glu Ala Ile Tyr Gly Tyr Asp Cys Gly Arg Trp
20 25 30
Gly Cys Gly His Phe Leu Asn Thr Gly Pro Arg Ile Ser Gly Tyr Val
35 40 45
Thr Thr Tyr Ser Tyr Glu Trp Phe Val Asp Thr
50 55
<210> 18
<211> 59
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 超长CDR-H3 K98
<400> 18
Ser Ile Val His Gln Lys Thr Gln Thr Ser Lys Gly Cys Pro Glu Gly
1 5 10 15
Trp Asn Asp Cys Gly Val Asn Ile Tyr Gly Tyr Asp Cys Gly Arg Trp
20 25 30
Gly Cys Gly His Phe Leu Asn Ser Gly Pro Arg Ile Ser Ala Tyr Gln
35 40 45
Thr Thr Tyr Asn Tyr Glu Trp Tyr Val Asp Ala
50 55
<210> 19
<211> 59
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 超长CDR-H3 K99
<400> 19
Ser Ile Val His Gln Arg Thr Gln Thr Arg Thr Gly Cys Pro Glu Gly
1 5 10 15
Trp Asn Asp Cys Gly Arg Asn Thr Tyr Gly Tyr Asp Cys Gly Arg Trp
20 25 30
Gly Cys Gly His Phe Leu Asn Ser Gly Pro Arg Ile Ser Asp Tyr Leu
35 40 45
Thr Thr Tyr Asn Tyr Glu Trp Tyr Val Asp Ala
50 55
<210> 20
<211> 59
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 超长CDR-H3 K100
<400> 20
Ser Ile Val His Gln Lys Ala His Thr Ser Val Thr Cys Pro Glu Gly
1 5 10 15
Trp Ser Glu Cys Gly Val Ala Ile Tyr Gly Tyr Glu Cys Gly Arg Trp
20 25 30
Gly Cys Gly His Phe Leu Asn Ser Gly Pro Asn Ile Ser Pro Tyr Val
35 40 45
Thr Thr Asp Ala Tyr Glu Trp Tyr Val Asp Ala
50 55
<210> 21
<211> 59
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 超长CDR-H3 K101
<400> 21
Ser Thr Val His Gln Lys Ala His Thr Ser Val Ala Cys Pro Glu Gly
1 5 10 15
Trp Ser Glu Cys Gly Val Ala Ile Tyr Gly Tyr Asp Cys Gly Arg Trp
20 25 30
Gly Cys Gly His Phe Leu Asn Ser Gly Pro Asn Ile Ser Pro Tyr Val
35 40 45
Ser Thr His Lys Tyr Glu Trp Tyr Val Asp Ala
50 55
<210> 22
<211> 59
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 超长CDR-H3 K102
<400> 22
Ser Thr Val His Gln Lys Ala His Thr Ser Val Ala Cys Pro Glu Gly
1 5 10 15
Trp Ser Glu Cys Gly Val Ala Ile Tyr Gly Tyr Asp Cys Gly Arg Trp
20 25 30
Gly Cys Gly His Phe Leu Asn Ser Gly Ser Lys Tyr Gln Ser Tyr Val
35 40 45
Thr Thr Asp Ala Tyr Glu Trp Tyr Val Asp Ala
50 55
<210> 23
<211> 59
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 超长CDR-H3 K103
<400> 23
Thr Thr Val His Gln Lys Ala His Thr Ser Val Ala Cys Pro Glu Gly
1 5 10 15
Trp Ser Glu Cys Gly Val Ala Ile Tyr Gly Tyr Asp Cys Gly Arg Trp
20 25 30
Gly Cys Gly His Phe Leu Asn Ser Gly Pro Asn Ile Ser Pro Tyr Val
35 40 45
Thr Thr Asp Ala Tyr Glu Trp Tyr Val Asp Ala
50 55
<210> 24
<211> 59
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 超长CDR-H3 K104
<400> 24
Ser Ile Val His Gln Lys Ala His Thr Ser Val Ala Cys Pro Glu Gly
1 5 10 15
Trp Ser Glu Cys Gly Val Ala Ile Tyr Gly Tyr Asp Cys Gly Arg Trp
20 25 30
Gly Cys Gly His Phe Leu Asn Ser Gly Pro Asn Ile Ser Pro Tyr Val
35 40 45
Thr Thr Asp Ala Tyr Glu Trp Tyr Val Asp Ala
50 55
<210> 25
<211> 59
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 超长CDR-H3 K107
<400> 25
Ser Ile Val His Gln Lys Ala His Thr Ser Val Thr Cys Pro Glu Gly
1 5 10 15
Trp Ser Glu Cys Gly Val Ala Ile Tyr Gly Tyr Asp Cys Gly Arg Trp
20 25 30
Gly Cys Gly His Phe Leu Asn Ser Gly Pro Asn Ile Ser Pro Tyr Val
35 40 45
Thr Thr Asp Ala Tyr Glu Trp Tyr Val Asp Ala
50 55
<210> 26
<211> 59
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 超长CDR-H3 K108
<400> 26
Ser Ile Val His Gln Lys Thr Gln Thr Ser Glu Gly Cys Pro Glu Gly
1 5 10 15
Trp Ser Glu Cys Gly Val Gly Thr Tyr Gly Tyr Asp Cys Gly Arg Trp
20 25 30
Gly Cys Gly His Tyr Leu Asn Thr Gly Pro Leu Ile Ser Gly Tyr Val
35 40 45
Thr Thr Asn Lys Tyr Glu Trp His Val Asp Ala
50 55
<210> 27
<211> 59
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 超长CDR-H3 K109
<400> 27
Ser Thr Val His Gln Lys Ala His Thr Ser Val Ala Cys Pro Glu Gly
1 5 10 15
Trp Ser Glu Cys Gly Val Ala Ile Tyr Gly Tyr Glu Cys Gly Arg Trp
20 25 30
Gly Cys Gly His Phe Leu Asn Ser Gly Pro Asn Ile Ser Pro Tyr Val
35 40 45
Ser Thr His Lys Tyr Glu Trp Tyr Val Asp Ala
50 55
<210> 28
<211> 59
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 超长CDR-H3 K110
<400> 28
Ser Ile Val His Gln Arg Thr Gln Thr Ser Lys Gly Cys Pro Glu Gly
1 5 10 15
Trp Asn Asp Cys Gly Gly Asn Thr Tyr Gly Tyr Asp Cys Gly Arg Trp
20 25 30
Gly Cys Gly His Phe Leu Asn Ser Gly Pro Asn Ile Ser Pro Tyr Val
35 40 45
Thr Thr Asp Ala Tyr Glu Trp Tyr Val Asp Ala
50 55
<210> 29
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 超长CDR-H3 K115
<400> 29
Thr Thr Ile Gln Gln Leu Thr Glu Arg Thr Cys Pro Glu Gly Ser Met
1 5 10 15
Leu Gly Ser Glu Cys Asn Ser His Trp Ser Cys Glu Gly Cys Asp Cys
20 25 30
Ala Lys His Cys Thr Trp Gly Gly Arg Cys Val Asp Cys Ser Pro Tyr
35 40 45
Met Ser Thr His Glu Trp His Ile Glu Thr
50 55
<210> 30
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 超长CDR-H3 K119
<400> 30
Thr Thr Ile Gln Gln Ser Thr Glu Arg Thr Cys Pro Glu Gly Ser Met
1 5 10 15
Leu Gly Ser Glu Cys Asn Ser His Trp Ser Cys Glu Ala Cys Asp Cys
20 25 30
Ala Arg His Cys Thr Trp Gly Gly Arg Cys Val Asp Cys Ser Pro Tyr
35 40 45
Met Ser Thr Tyr Glu Trp His Ile Glu Thr
50 55
<210> 31
<211> 63
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 超长CDR-H3 K27
<400> 31
Thr Ser Val Tyr Gln Lys Thr Asp Thr Ile Arg His Pro Cys Arg Asp
1 5 10 15
Asp Ser Ser Tyr Ala Cys Val Cys Arg Trp Thr Arg Gly Cys Ser Gly
20 25 30
Thr Asp Cys Ser Gly Cys Thr Pro Asp Ser Asp Ile Asp Tyr Gly Cys
35 40 45
Asp Thr Ile Ala Cys Asn Tyr Thr Tyr Gln Leu Tyr Val Asp Ala
50 55 60
<210> 32
<211> 63
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 超长CDR-H3 K32
<400> 32
Thr Thr Val Tyr Gln Lys Thr Asp Thr Lys Lys His Pro Cys Arg Asp
1 5 10 15
Asp Ser Ser Tyr Ala Cys Val Cys Arg Trp Thr Arg Gly Cys Ser Gly
20 25 30
Thr Asp Cys Ser Gly Cys Thr Pro Asp Ser Asp Ile Asp Tyr Gly Cys
35 40 45
Asp Thr Ile Ala Cys Asn Tyr Thr Tyr Gln Leu Tyr Val Asp Thr
50 55 60
<210> 33
<211> 63
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 超长CDR-H3 K44
<400> 33
Thr Thr Val Val Pro Glu Asn Arg His Lys Lys His Pro Cys Arg Asp
1 5 10 15
Asp Ser Ser Tyr Ala Cys Val Cys Arg Trp Thr Arg Gly Cys Ser Gly
20 25 30
Thr Asp Cys Ser Gly Cys Thr Pro Asp Ser Asp Ile Asp Tyr Gly Cys
35 40 45
Asp Thr Ile Ala Cys Asn Tyr Thr Tyr Gln Leu Tyr Val Asp Thr
50 55 60
<210> 34
<211> 62
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 超长CDR-H3 K52
<400> 34
Thr Thr Val His Gln His Ser Asn Asn Lys Lys Thr Cys Pro Asp Gly
1 5 10 15
Thr Ser Ser His Ser Ala Cys Ile Leu Gly Thr Gly Gly Cys Cys Leu
20 25 30
Asp Gln Tyr Tyr Arg Arg Gly Ile Cys Gly Arg Val Asp Ala Cys Tyr
35 40 45
Glu Tyr Ser Ser Ser Val Asn Tyr Glu Trp Tyr Val Asp Ala
50 55 60
<210> 35
<211> 62
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 超长CDR-H3 K54
<400> 35
Thr Thr Val His Gln His Thr Asn Asn Lys Lys Thr Cys Pro Asp Gly
1 5 10 15
Ser Ser Ser His Ser Ala Cys Lys Leu Gly Thr Gly Gly Cys Cys Leu
20 25 30
Asp Gly Tyr Tyr Arg Arg Gly Ile Cys Gly Arg Val Asp Ala Cys Tyr
35 40 45
Glu Tyr Ser Ser Ser Val Asn Tyr Glu Trp Tyr Val Asp Ala
50 55 60
<210> 36
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 超长CDR-H3 K83
<400> 36
Ala Thr Val His Gln Arg Thr Glu Arg Ser Cys Pro Asp Gly Ser Ser
1 5 10 15
Asp Ala Glu Ser Gly Val Cys Ser Gly Cys Cys Arg Gly Trp Asp Cys
20 25 30
Cys Ser Phe Glu Val Asp Trp Val Gly Cys Lys Gly Cys Thr Ala Tyr
35 40 45
Thr Tyr Arg Thr Val Tyr Glu His His Val Asp Ala
50 55 60
<210> 37
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 超长CDR-H3 K85
<400> 37
Ala Thr Val His Gln Arg Thr Glu Arg Ser Cys Pro Asp Gly Ser Ser
1 5 10 15
Asp Ala Glu Ser Gly Val Cys Ser Gly Cys Cys Arg Gly Trp Asp Cys
20 25 30
Cys Ser Phe Glu Val Asp Trp Val Gly Cys Lys Gly Cys Thr Ala Tyr
35 40 45
Thr Tyr Arg Thr Ile His Glu His His Val Asp Ala
50 55 60
<210> 38
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 超长CDR-H3 K87
<400> 38
Ala Thr Val His Gln Arg Thr Glu Arg Ser Cys Pro Asp Gly Ser Ser
1 5 10 15
Asp Ala Glu Ser Gly Val Cys Ser Gly Cys Cys Arg Gly Trp Asp Cys
20 25 30
Cys Ser Phe Glu Val Asp Trp Val Gly Cys Lys Gly Cys Thr Ala Tyr
35 40 45
Thr Tyr Arg Ser Ile Tyr Glu His His Val Asp Ala
50 55 60
<210> 39
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 超长CDR-H3 K89
<400> 39
Val Thr Val His Gln Arg Ala Glu Arg Thr Cys Pro Asp Gly Ser Ser
1 5 10 15
Asp Ala Glu Ser Gly Val Cys Ser Gly Cys Cys Gly Gly Trp Asp Cys
20 25 30
Cys Ser Phe Lys Val Asp Trp Val Gly Cys Lys Glu Cys Thr Ala Tyr
35 40 45
Pro Tyr Asn Thr Arg Tyr Glu His His Val Asp Ala
50 55 60
<210> 40
<211> 64
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 超长CDR-H3 K13
<400> 40
Thr Thr Val His Gln Gln Thr Lys Thr Lys Lys Asn Pro Cys Arg Asp
1 5 10 15
Val Ala Ser Pro Val Cys Val Cys Arg Trp Ala Glu Gly Cys Ser Gly
20 25 30
Thr Asp Cys Ser Glu Cys Thr Pro Asp Pro Asp Arg Asp Tyr Gly Thr
35 40 45
Cys Glu Ile Ile Ala Cys Thr His Thr Tyr Glu Leu His Val Asp Ala
50 55 60
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Thr Thr Val His Gln Lys Thr Lys Thr Lys Lys Asn Pro Cys Arg Asp
1 5 10 15
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20 25 30
Thr Asp Cys Ser Asp Cys Thr Pro Asp Pro Asp Arg Asp Tyr Gly Thr
35 40 45
Cys Glu Ile Ile Ala Cys Thr His Ala Tyr Glu Leu His Val Asp Ala
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Thr Thr Val His Gln Lys Thr Lys Thr Lys Lys Asn Pro Cys Arg Asp
1 5 10 15
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20 25 30
Thr Asp Cys Ser Asp Cys Thr Pro Asp Pro Asp Arg Asp Tyr Gly Thr
35 40 45
Cys Glu Ile Ile Ala Cys Thr His Thr Tyr Glu Leu His Val Asp Ala
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Thr Thr Val Ile Gln Lys Thr Ala Thr Lys Gln Ser Cys Pro Asp Asp
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Tyr Arg Asp Gly Gly Glu Cys Cys Ile Tyr Gly Arg Cys Ser Ala Glu
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Asp Cys Ser Val Thr Gly Trp Glu Tyr Tyr Gly Ser Thr Leu Cys Arg
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Tyr Arg Asp Gly Gly Glu Cys Cys Ile Tyr Glu Arg Cys Ser Ala Glu
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Cys Gly Glu Gly Ala Gly Ala Trp Arg Cys Trp Glu Cys Ser Asp Thr
35 40 45
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Thr Thr Val His Gln Glu Ser Arg Arg His Cys Pro Asp Gly Tyr Ser
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35 40 45
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Thr Thr Val His Gln Glu Thr Arg Arg Asn Cys Pro Asp Gly Tyr Ser
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Cys Gly Glu Gly Ala Gly Ala Trp Arg Cys Trp Glu Cys Ser Asp Thr
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Ile Arg Pro Ser Ser Thr Tyr Glu Phe Tyr Val Asp Ala
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Glu Glu Tyr Ile Tyr Thr Tyr Asn Phe Arg Val Asp Ala
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<213> 人工序列
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Gly Ile Val Tyr Gln Glu Thr Ile Lys Ser Cys Pro Glu Gly Tyr Ile
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Asp Gly Gly Gly Cys Cys Leu Pro Gly Ser Cys Arg Gly Cys Ala Cys
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Thr Tyr Tyr Asn Val Leu Lys Cys Pro Arg Asp Cys Arg Gly Thr Ser
35 40 45
Glu Glu Tyr Ile Tyr Arg Tyr Lys Phe His Val Asp Ala
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Ser Thr Val His Gln Leu Thr Ile Thr Thr Leu Gly Cys Pro Asp Gly
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Ser Ile Tyr Cys Ser Arg Ser Ala Asp Ser Gly Met Trp Cys Gly Arg
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Cys Gly Asp Cys Thr Ser Thr His Thr His Gln Trp His Val Asp Ala
50 55 60
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<213> 人工序列
<220>
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<400> 61
Ser Thr Val His Gln Leu Thr Ile Thr Thr Leu Gly Cys Pro Asp Gly
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Val Ser Val Val Pro Thr Cys Gly Trp Leu Arg Cys Asn Cys Gly Glu
20 25 30
Asp Leu Tyr Cys Ser Arg Ser Asp Glu Gln Gly Thr Trp Cys Gly Arg
35 40 45
Cys Gly Asp Cys Thr Ser Thr Tyr Thr His Gln Trp His Val Asp Ala
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Ser Thr Val His Gln Leu Thr Ile Thr Thr Val Gly Cys Pro Asn Gly
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20 25 30
Asn Ile Tyr Cys Ser Arg Ser Asp Asp Ser Gly Thr Trp Cys Gly Arg
35 40 45
Cys Gly Asp Cys Thr Gly Thr Tyr Thr Tyr Gln Trp His Val Asp Ala
50 55 60
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Ser Thr Val His Gln Leu Thr Ile Thr Thr Val Gly Cys Pro Asn Gly
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20 25 30
Asn Ile Tyr Cys Ser Arg Ser Asp Asp Ser Gly Thr Trp Cys Gly Arg
35 40 45
Cys Gly Asp Cys Thr Gly Thr Tyr Thr Tyr Gln Trp His Val Asp Ala
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<400> 64
Gly Thr Val His Gln Leu Thr Ile Thr Thr Leu Gly Cys Pro Asp Gly
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Thr Thr Phe Cys Ser Arg Ser Asp Asp Ser Gly Thr Trp Cys Gly Arg
35 40 45
Cys Gly Asp Cys Ser Ser Thr His Thr His Gln Trp His Val Asp Ala
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<211> 64
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<213> 人工序列
<220>
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<400> 65
Ser Thr Val His Gln Leu Thr Ile Thr Thr Leu Gly Cys Pro Asp Gly
1 5 10 15
Val Ser Val Val Asn Thr Cys Gly Trp Lys Arg Cys Asn Cys Gly Asp
20 25 30
Ser Ile Tyr Cys Ser Arg Ser Ala Asp Asp Asp Gly Trp Cys Gly Arg
35 40 45
Cys Gly Asp Cys Thr Ser Thr His Thr His Gln Trp His Val Asp Ala
50 55 60
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<211> 64
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 66
Ser Thr Val His Gln Leu Thr Ile Thr Thr Val Gly Cys Pro Asn Gly
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20 25 30
Asn Ile Tyr Cys Ser Arg Ser Asp Asp Ser Gly Thr Trp Cys Gly Arg
35 40 45
Cys Gly Asp Cys Thr Asn Thr Tyr Thr Phe Gln Trp His Val Asp Ala
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<400> 67
Thr Thr Val His Gln Lys Thr Ile Ala Lys Cys Pro Asp Gly Tyr Thr
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20 25 30
Arg Ala Tyr Asp Cys Ala Gly Asp Thr Ser Leu Tyr Met Cys Gly Arg
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Arg Ser Pro Thr Leu Leu Thr Tyr Gln Phe His Val Asp Val
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Thr Thr Val Thr Pro Glu Thr Ile Ala Lys Cys Pro Asp Gly Tyr Thr
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Tyr Ser Gly Asp Cys Gly Ile Cys Asp Asp Cys Gly Gly Arg Thr Ser
20 25 30
Arg Ala Tyr Asp Cys Ala Gly Asp Thr Ser Leu Tyr Met Cys Gly Arg
35 40 45
Arg Ser Pro Thr Leu Leu Thr Tyr Gln Phe His Val Asp Val
50 55 60
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<211> 67
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 超长CDR-H3 K2
<400> 69
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1 5 10 15
Asp Gly Tyr Thr Tyr Ile Asn Asp Cys Ile Gly Ala Ser Gly Ala Val
20 25 30
Ser Arg Tyr Asp Cys Trp Arg Phe Arg Arg Met Asn Gly Val Cys Ile
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Asp Gly Thr Tyr Ser Thr Thr Ala Asp Thr Tyr Thr Tyr Glu Phe His
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65
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Ala Thr Val His Gln Gln Thr Lys Lys Gln Thr Glu Arg Ser Cys Pro
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Asp Gly Tyr Thr Tyr Ile Val Asp Cys Ile Gly Ala Thr Gly Ala Val
20 25 30
Ser Arg Tyr Asp Cys Trp Arg Phe Arg Arg Met Asn Gly Val Cys Ile
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Asp Gly Thr Tyr Ser Thr Thr Ala Asp Thr Tyr Thr Tyr Glu Phe His
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Thr Thr Val His Gln Lys Thr Arg Lys Ser Cys Pro Gly Gly Cys Arg
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Asp Thr Asp Gly His Asp Tyr Asp His Trp Ser Cys Ala Gly Ser Asp
20 25 30
Cys Cys Cys Phe Gly Thr Asp Gly Gly Cys Gly Arg Trp Gly Ile Tyr
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<213> 人工序列
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<400> 72
Thr Thr Val His Gln Lys Thr Arg Lys Ser Cys Pro Gly Gly Cys Arg
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Cys Cys Cys Phe Gly Thr Asp Gly Gly Cys Gly Arg Trp Gly Val Tyr
35 40 45
Cys Ser His Ser Tyr Thr Tyr Thr Tyr Glu Tyr His Val Asp Thr
50 55 60
<210> 73
<211> 63
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 超长CDR-H3 K45
<400> 73
Thr Thr Val His Gln Lys Thr Arg Lys Ser Cys Pro Gly Gly Cys Arg
1 5 10 15
Asp Thr Asp Gly His Asp Tyr Asp His Trp Ser Cys Ala Gly Ser Asp
20 25 30
Cys Cys Cys Phe Gly Thr Asp Gly Gly Cys Gly Arg Trp Gly Ile Tyr
35 40 45
Cys Ser His Ser Tyr Thr Tyr Thr Tyr Glu Tyr His Val Asp Thr
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<210> 74
<211> 64
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<213> 人工序列
<220>
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<400> 74
Cys Thr Val Gln Gln Lys Thr His Gln Val Cys Pro Asp Gly Phe Asn
1 5 10 15
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50 55 60
<210> 75
<211> 64
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 超长CDR-H3 K9
<400> 75
Thr Thr Val Gln Gln Lys Thr His Gln Asp Cys Pro Asp Gly Phe Asn
1 5 10 15
Trp Gly Tyr Gly Cys Ala Ala Gly Ser Ser Leu His Cys Ala Arg His
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
<210> 76
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 超长CDR-H3 K1
<400> 76
Thr Thr Val His Gln Lys Thr Asp Gln Lys Arg Ser Ser Cys Pro Asp
1 5 10 15
Gly Tyr Ser Asp Cys Leu Val Cys Gly Ala Asp Arg Asp Gly Cys Ser
20 25 30
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65
<210> 77
<211> 65
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 超长CDR-H3 K4
<400> 77
Thr Ser Val Tyr Gln Lys Thr Thr Lys Arg Phe Thr Cys His Asp Pro
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Glu
65
<210> 78
<211> 65
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 超长CDR-H3 K5
<400> 78
Cys Thr Val Tyr Gln Lys Thr Glu Thr Lys Lys Ser Cys Pro Asp Gly
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20 25 30
Asp Asp Cys Val Cys Tyr Asp Gly Arg Gly Gly Phe Arg Trp Arg Asn
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Gly Cys Thr Thr Tyr Thr Tyr Thr Tyr Arg His Asn Leu His Val Glu
50 55 60
Thr
65
<210> 79
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 超长CDR-H3 K6
<400> 79
Thr Thr Val Tyr Gln Glu Thr Lys Ile Met Arg Ile Cys Pro Asp Asp
1 5 10 15
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20 25 30
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50 55 60
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65
<210> 80
<211> 65
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 超长CDR-H3 K7
<400> 80
Val Ala Val His Gln Lys Thr Thr Glu Arg Tyr Ser Cys Pro Asp Gly
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Tyr Ser Ser Cys Ser Ser Cys Arg Ala Asn Asp Leu Asp Cys Arg Gly
20 25 30
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35 40 45
Ser Ser Arg Gly Tyr Ile Val Thr Tyr Asn Tyr Asp Phe Arg Val Asp
50 55 60
Ala
65
<210> 81
<211> 64
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 超长CDR-H3 K12
<400> 81
Ala Ala Val His Gln Glu Thr Lys Thr Leu Arg Thr Cys Pro Pro Gly
1 5 10 15
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20 25 30
Thr Gly Cys Cys Ser Cys Cys Asp Arg Phe Cys Gly Gly Tyr Ser Thr
35 40 45
Cys Thr Asp Tyr Thr Asp Thr Tyr Thr Tyr Glu Trp His Val Asp Thr
50 55 60
<210> 82
<211> 64
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<213> 人工序列
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<223> 超长CDR-H3 K15
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Thr Thr Val His Gln Glu Thr Lys Ile Thr Ser Pro Ala Cys Pro Asp
1 5 10 15
Gly Tyr Phe Tyr Glu Tyr Arg Cys Leu Val Gly Gly Gly Cys Gly Trp
20 25 30
Gly Cys Trp Asn Ala Ala Gly Gly Arg Pro Asn Ala Ala Gly Ser Leu
35 40 45
Asp Arg Ser Pro Ile Glu Thr Val Thr Tyr Glu Phe Gln Val Asp Ala
50 55 60
<210> 83
<211> 64
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 超长CDR-H3 K16
<400> 83
Thr Thr Val Tyr Gln Lys Thr Thr Lys Ser Thr Cys Pro Asp Gly Tyr
1 5 10 15
Ile Ala Asp Gly Gly Cys Arg Lys Ala Gly Ser Trp Cys Ser Ser Val
20 25 30
Asp Cys Ala Gly Tyr Gly Glu Asp Gly Asp Tyr Gly Gly Trp Arg Thr
35 40 45
Ser Cys Cys Tyr Phe Val Ala Ser Ala Tyr Glu Phe His Val Asp Thr
50 55 60
<210> 84
<211> 64
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 超长CDR-H3 K17
<400> 84
Gly Thr Val His Gln Gln Thr Gln Glu Lys Cys Pro Asp Gly Tyr Thr
1 5 10 15
Phe Thr Ala Asn Asn Cys Val Thr Ser Ser Val Arg Cys Ser Gly Arg
20 25 30
Asn Cys Cys Gly Gly Asp Ser Tyr Gly Tyr Tyr Ile Gly Ile Gly Gly
35 40 45
Ile Cys His Tyr Asp Tyr Thr Tyr Thr Tyr Glu Asn Tyr Val Glu Ala
50 55 60
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 85
Thr Ile Val His Gln Glu Thr Asn Lys Glu Lys Ile Cys Arg Val Asp
1 5 10 15
Tyr Val Asp Ser Ala Thr Cys Thr Trp Asn Cys Asp Cys Cys Arg Ser
20 25 30
Arg Lys Ser Asp Cys Cys Ala Tyr Ala Asn Ser Arg Ser Cys Trp Asn
35 40 45
Thr Ser Gly Thr Tyr Thr Tyr Thr Tyr Glu Phe His Val Asp Ala
50 55 60
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<211> 63
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<213> 人工序列
<220>
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<400> 86
Thr Thr Val His Gln Arg Thr Ile Thr Arg Cys Pro Asp Asp Phe Gly
1 5 10 15
Asn Thr Cys Arg Cys Ser Lys Gly Thr Cys Pro Cys Gly Glu Asp Ala
20 25 30
Cys Cys Gly Thr Asn Gln Tyr Ser Phe Trp Gly Asp Cys Arg Asp Val
35 40 45
Gly Arg Thr Thr Phe Ile Glu Thr Tyr Glu Trp Asn Val Asp Asp
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<220>
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Thr Thr Val Tyr Gln Asn Thr Arg Ser Lys Glu Arg Ser Cys Pro Tyr
1 5 10 15
Gly Thr Gly Phe Asp Pro Thr Trp Cys Asp Ser Val Leu Pro Cys Arg
20 25 30
Arg Asp Gly Cys Trp Thr Thr Val Trp Gly Cys Cys Glu Gly Asp Val
35 40 45
Asp Gly Gly Glu Thr Thr Pro Thr Tyr Glu Phe Tyr Val Asp Ala
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<400> 88
Thr Thr Val Tyr Gln Lys Thr Arg Ser Asp Cys Pro Ala Gly Tyr Lys
1 5 10 15
Gln Val Tyr Gly Cys Ser Ala Gly Asn Cys Gly Cys Arg Gly Asn Gly
20 25 30
Cys Cys Asn Ser Gly Ser Cys Gly Thr Trp Ser Glu Trp Gly Gln Tyr
35 40 45
Gly Cys Cys Asn Cys His Ser Ser Tyr Glu Phe His Val Asp Ala
50 55 60
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Thr Thr Val His Gln Thr Thr Arg Lys Thr Gln Ser Cys Pro Asp Gly
1 5 10 15
Tyr Thr Asp Ile Asp Gly Cys Ser Trp Arg His Gly Cys Cys Arg Tyr
20 25 30
Asp Cys Cys Ser Asp Arg Ser Cys Ser Trp Cys Val Asp Arg Asp Trp
35 40 45
Ser Ser Tyr Ile Val Thr Ala Thr Tyr Glu Leu Asp Ile Glu Ala
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Thr Thr Val His Gln Glu Thr Lys His Thr Arg Ser Cys Pro Asp Gly
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Tyr Thr Asp Arg Val Gly Cys Pro Tyr Leu Trp Thr Ser Cys Ala Arg
20 25 30
Gly Asp Cys Trp Arg Ile Asp Arg Gly Ala Thr Ala Asn Pro Ala Ala
35 40 45
Thr Thr Tyr Thr Tyr Thr Asp Thr Tyr Asp Trp His Ile Glu Thr
50 55 60
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<211> 63
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<400> 91
Ile Thr Ala His Gln Lys Thr Asn Lys Ile Pro His Cys Arg Asp Gly
1 5 10 15
Tyr Asp Tyr Gly Gly Gly Cys Cys Val Ser Ser Gly Val Tyr Gly Glu
20 25 30
Ser Cys Arg Ser Ser Gly Gly Ser Asp Cys Asp Gln Trp Val Gly Cys
35 40 45
Glu Ser Val Thr Tyr Thr Glu Thr Tyr Glu Trp His Val Asp Ala
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<211> 63
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Thr Ser Val Leu Gln Lys Thr Arg His Thr Cys Pro Asp Gly Tyr Glu
1 5 10 15
Tyr Asp Thr Ala Cys Gly His Gly Arg Cys Cys Cys Val Gly Ser Ser
20 25 30
Cys Arg Arg Asn His Thr Tyr Gly Asp Tyr Arg Arg Trp Gly Leu Tyr
35 40 45
Asn Ser Tyr Ser Pro Ala Tyr Thr Tyr Glu Phe His Val Asp Thr
50 55 60
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<211> 63
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<213> 人工序列
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<400> 93
Thr Ala Val His Gln Gln Thr Glu Arg Ser Cys Pro Pro Asp Thr Thr
1 5 10 15
Glu His Asp Cys Cys Gly Cys Gly Gly Arg Gly Cys Ala Trp Ser Gly
20 25 30
Cys Tyr Arg Lys Gly Tyr Gly Thr Gly Cys Arg Val Cys Thr Ser Ile
35 40 45
Gln Ala Arg Asp Tyr Ile Tyr Thr Tyr Lys Leu His Ile Asp Thr
50 55 60
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<211> 63
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 94
Thr Thr Val His Gln Asn Thr Ile Arg Ser Cys Pro Asp Gly Thr Asp
1 5 10 15
Tyr Ala Tyr Gly Cys Arg Leu Gly Ala Trp Gly Cys Ala Gly Val Gly
20 25 30
Cys Cys Arg Gly Gly Ala Val Gly Ala Trp Gly Cys Tyr Gly Gly Asp
35 40 45
Thr Phe Asn Thr Asp Ser Tyr Thr Tyr Glu Phe Tyr Val Asp Ala
50 55 60
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Thr Ala Val Tyr Gln Arg Thr Glu Ala Arg Lys Ser Cys Pro Asp Gly
1 5 10 15
Tyr Asn Asp Val Glu Ala Arg Ala His Arg Ser Glu Cys Ser Pro Asn
20 25 30
Asp Cys Leu Arg Asp Gly Leu Gly Val Ala Ser Gly Cys Ala Trp Tyr
35 40 45
Arg Ala Tyr Ile Leu Ile Glu Thr Tyr Glu Phe Tyr Val Glu Ala
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Thr Thr Val Tyr Gln Lys Thr Arg Lys Leu Pro Ser Cys Arg Glu Gly
1 5 10 15
Thr Phe Tyr His Ala Val Cys Gly Gly Val Val Arg Cys Gln Val Val
20 25 30
Asp Cys Asp Ala Asp Gly Gly Cys Cys Tyr Asn Ala Ile Gly Gln Tyr
35 40 45
Phe Gly Val Ser Tyr Ser Tyr Lys Tyr Glu Trp Phe Val Glu Ala
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Ala Thr Val His Gln Lys Thr Asn Lys Lys Gln Ser Cys Pro Asp Gly
1 5 10 15
Tyr Ser Asp Asp Asp Gly Arg Pro Asp His Trp Ser Cys Met Asp Val
20 25 30
Asp Cys Trp Arg Pro Ala Arg Gly Gly Trp Gly Ser Asn Cys Glu His
35 40 45
Thr Asn Tyr Ile Tyr Thr Tyr Thr Tyr Glu Tyr His Val Asp Ala
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Thr Ile Val His Gln Lys Thr Lys Arg Glu Glu Arg Cys Pro Ala Gly
1 5 10 15
Tyr Ser Ile Ser Ala Cys Arg Asp Gly Ile Gly Cys Gly Ala Thr Asp
20 25 30
Cys Cys Ala Asp Gly Ala Thr Asp Tyr Ala Trp Gly Trp Glu Cys Lys
35 40 45
Ser Arg Ile Tyr Gly Asp Ser Tyr Glu Phe His Val Asp Ala
50 55 60
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<212> PRT
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<400> 99
Thr Thr Thr Val Gln Arg Thr His Lys Thr Thr Ser Cys Pro Asp Gly
1 5 10 15
Tyr His Phe Ile Glu Pro Cys His Ser Gly Leu Cys Trp Arg Glu Gly
20 25 30
Ala Cys Asn Gly Asp Gly Ile Cys Ala Asn Gly Leu Gly Arg Cys Arg
35 40 45
Thr Val Ser Glu Thr Ser Thr Tyr Glu Phe Tyr Val Asp Ala
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<211> 62
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 100
Thr Thr Val Tyr Gln Arg Ala Gln Ser Lys Ser Cys Pro Asp Tyr Cys
1 5 10 15
Ser Cys Ile Phe Ser Tyr Cys Ser Gly Ala Asp Gly Cys Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Tyr Cys Gly His Gly Gly Asp Glu Gly Asp Gly Phe Asn Gly Gly
35 40 45
Gly Ser Arg Val Ser Tyr Thr Tyr Glu Phe Tyr Val Asp Ser
50 55 60
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<211> 62
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<213> 人工序列
<220>
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<400> 101
Thr Thr Val His Gln Gln Thr Arg Thr Arg Cys Pro Asp Asp Tyr Ser
1 5 10 15
Tyr Arg Ser Arg Gly Trp Ile Gly Ser Asp Cys Gly Gly His Gly Cys
20 25 30
Trp Ser Asp Arg Asp Ala Arg Arg Tyr Asp Val Tyr Gly Asn Cys Asn
35 40 45
Arg Val Gly Glu Ile Asn Thr Tyr Glu Trp Tyr Val Asp Ala
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<211> 62
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<213> 人工序列
<220>
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<400> 102
Thr Thr Val His Gln Arg Thr Lys Lys Lys Leu Val Leu Ser Val Met
1 5 10 15
Ile Leu Met Ile Val Val Thr Ile Leu Ile Leu Cys Arg Val Glu Glu
20 25 30
Cys Cys Lys Asn Gly Val Val Asn Ala Tyr Gly Ile Cys Glu Tyr Ala
35 40 45
Gly Gly Ser Ala Thr Tyr Thr Tyr Glu Trp Tyr Val Asp Ala
50 55 60
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<211> 61
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<213> 人工序列
<220>
<223> 超长CDR-H3 K56
<400> 103
Thr Thr Val His Gln Lys Thr Ile Thr Ser Cys Pro Asp Gly Tyr Val
1 5 10 15
Tyr Ser Tyr Asp Cys Gly Ile Cys Asp Asp Cys Gly Gly Arg Thr Ser
20 25 30
Arg Ala Tyr Asp Cys Ala Gly Asp Thr Ser Leu Tyr Met Cys Gly Arg
35 40 45
Arg Ser Pro Ser Ser Ala Tyr Gln Phe His Val Asp Arg
50 55 60
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<211> 61
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 104
Thr Thr Val His Gln Arg Thr Ile Lys Ser Gly Cys Pro Pro Gly Tyr
1 5 10 15
Lys Ser Gly Val Asp Cys Ser Pro Gly Ser Glu Cys Lys Trp Gly Cys
20 25 30
Tyr Ala Val Asp Gly Arg Arg Tyr Gly Gly Tyr Gly Ala Asp Ser Gly
35 40 45
Val Gly Ser Thr Tyr Thr His Glu Phe Tyr Val Asp Ala
50 55 60
<210> 105
<211> 61
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 超长CDR-H3 K58
<400> 105
Thr Thr Val His Gln Arg Thr Lys Lys Thr Cys Pro Leu Gly Tyr Asp
1 5 10 15
Leu Asn Asp Arg Cys Asp His Phe Asn Thr Cys Arg Val Glu Glu Cys
20 25 30
Cys Lys Asn Gly Val Val Asn Ala Tyr Gly Ile Cys Glu Tyr Ala Gly
35 40 45
Gly Ser Ala Thr Tyr Thr Tyr Glu Trp Tyr Val Asp Ala
50 55 60
<210> 106
<211> 61
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 超长CDR-H3 K63
<400> 106
Thr Thr Val His Gln Lys Thr Gln Arg Pro Ile Cys Pro Asp Asp Tyr
1 5 10 15
Thr Ala Leu Asn Gly Trp Gly Cys Gly Glu Tyr Arg Cys Cys Pro Lys
20 25 30
Ser Gly Ala Cys Cys Cys Ser Gly Gly Gly Val His Leu Leu Gln Ser
35 40 45
Cys Ser Leu Glu Thr Lys Tyr Glu Phe Tyr Val Ser Ala
50 55 60
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<211> 61
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 超长CDR-H3 K67
<400> 107
Leu Thr Val Leu Gln Val Thr Asp Arg Arg Ala Ser Cys Pro Ala Gly
1 5 10 15
Cys Gln Asp Glu Cys Gly Ser Ser Glu Asn Cys Tyr Cys Phe Arg Tyr
20 25 30
Gly Ile Trp Cys His Gly Arg Tyr Ser Ser Gly Asn Ser Gly Thr Tyr
35 40 45
Ser Ser Asn Gly Tyr Ser Ser Thr Trp Tyr Ala Asp Ala
50 55 60
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<211> 61
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 超长CDR-H3 K69
<400> 108
Ser Thr Val His His Glu Ala His Lys Arg Cys Pro Glu Asp Tyr Ser
1 5 10 15
Asp Arg Asp His Cys Ser Cys Trp Ala Gly Cys Gly Asp Asp Asp Cys
20 25 30
Trp Arg Val Val Ala Gly Trp Arg Cys Ser Asn Tyr Arg Tyr Ile Gly
35 40 45
Ala Ser Tyr Thr His Thr Tyr Asp Phe Tyr Ala Asp Thr
50 55 60
<210> 109
<211> 61
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 超长CDR-H3 K70
<400> 109
Thr Thr Val His Gln Lys Thr Lys Lys Ser Cys Pro Leu Gly Tyr Ala
1 5 10 15
Ile Asn Asp Arg Cys Asp Asp Leu Lys Thr Cys Gly Pro Asp Glu Cys
20 25 30
Cys Leu Asn Gly Val Val Asn Ala Tyr Gly Ile Cys Glu Tyr Glu Gly
35 40 45
Glu Ser Ala Thr His Thr Tyr Glu Trp Tyr Val Asp Ala
50 55 60
<210> 110
<211> 61
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 110
Thr Leu Val Tyr Gln Lys Thr Lys Lys Ser Cys Pro Glu Gly Tyr Glu
1 5 10 15
Gly Ala Pro Asp Cys Gly Ala Phe Asp Tyr Cys Arg Val Asp Asp Cys
20 25 30
Cys Cys Arg Ser Gly Tyr Gly Ser Cys Arg Arg Asp Ser Cys Arg Ser
35 40 45
Gly Ile Arg Thr Ser Thr Tyr Glu Phe Tyr Val Asp Thr
50 55 60
<210> 111
<211> 61
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 超长CDR-H3 K73
<400> 111
Thr Thr Val Tyr Gln His Thr Arg Asn Arg Cys Pro Asp Asp Tyr Arg
1 5 10 15
Asp Cys Gly His Cys Cys Cys Gln Tyr Gly Cys His Ala Val Gly Cys
20 25 30
Trp Arg Arg Gln Gly Gly Gly Phe Glu Arg Cys Gly Glu Val Asp Ser
35 40 45
Gln Ser Pro Thr Tyr Met Tyr Glu Phe His Val Asp Ala
50 55 60
<210> 112
<211> 61
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 超长CDR-H3 K75
<400> 112
Ala Thr Val Leu Gln Tyr Thr His Lys Thr Cys Pro Asp Gly Tyr Glu
1 5 10 15
Phe Gly Lys Asn Cys Pro Asp Gly His Gly Cys Ser Gly Ser Asp Cys
20 25 30
Trp Arg Cys Asp Ser Arg Ser Ala Trp Trp Cys Thr Asn Tyr Ser Trp
35 40 45
Thr Asp Ser Ile His Ala Tyr Glu Leu Tyr Val Asp Ala
50 55 60
<210> 113
<211> 61
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 超长CDR-H3 K76
<400> 113
Thr Thr Val His Gln Lys Thr Glu Lys Ser Cys Lys Gly Gly Thr Asp
1 5 10 15
Cys Gly Ala Gly Cys Cys Ala Asp Gly Asp Pro Cys Ser Ser Gly Arg
20 25 30
Cys Arg Ala Trp Ser Ser Thr Leu Arg Asp Tyr Phe Tyr Tyr Pro Thr
35 40 45
Ser Asn Tyr Thr Tyr Ile Cys Asp Phe His Ile Asp Ala
50 55 60
<210> 114
<211> 61
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 超长CDR-H3 K80
<400> 114
Thr Ile Val Phe Gln Lys Thr Thr Lys Ser Cys Pro Gly Val Ser Ala
1 5 10 15
Glu Gly Gly Val Cys Cys Ser Gly Thr Ala Cys Thr Val Pro Glu Cys
20 25 30
Trp Trp Phe His Gln Gly His Tyr Ser Ile Pro Gly Gly Cys Thr Ala
35 40 45
Ala Thr Tyr Thr His Thr Tyr Glu Ser His Val Asp Ala
50 55 60
<210> 115
<211> 61
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 超长CDR-H3 K81
<400> 115
Thr Thr Val His Gln Lys Thr Asn Gln Glu Lys His Cys Pro Asp Gly
1 5 10 15
Tyr Asp Tyr Cys Arg Val Thr Glu Asp Gly Tyr Cys Cys Ser Ala Trp
20 25 30
Thr Cys Met His Trp Arg Cys Ala Pro Gly His Lys Glu Tyr Ser Val
35 40 45
Val Ser Thr Thr Tyr Thr Tyr Glu Trp Tyr Val Asp Ala
50 55 60
<210> 116
<211> 61
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 超长CDR-H3 K82
<400> 116
Val Thr Thr His Gln Lys Ser Arg Lys Ile Cys Pro Asp Gly Cys Ile
1 5 10 15
Tyr Ala Cys Ser Cys Arg Glu Glu Trp Arg Cys Thr Val Phe Asp Cys
20 25 30
Val Arg Pro Arg Asp Val Pro Asn Gly Arg Asn Ala Cys Val Ser Thr
35 40 45
Cys Pro Ser Thr Ser Ile Tyr Glu Phe Arg Val Asp Ala
50 55 60
<210> 117
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 超长CDR-H3 K84
<400> 117
Ser Thr Val Tyr Gln Glu Thr Lys Arg Lys Cys Pro Asp Gly Tyr Arg
1 5 10 15
Val Gly Thr Asp Cys Thr Pro Gly Lys Gly Cys Asp Tyr Ala Cys His
20 25 30
Ser Arg Leu Gly Val Arg Trp Gly Gly Asp Gly Arg Asp Gly Gly Arg
35 40 45
Gly Tyr Ile Val Ser Tyr Glu Leu His Ile Asp Ala
50 55 60
<210> 118
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 超长CDR-H3 K86
<400> 118
Thr Thr Val Tyr Gln Lys Thr Gln Lys Pro Thr Asp Gly Tyr Ser Cys
1 5 10 15
Gly Ile Thr Cys Arg Lys Arg Cys Asp Cys Ser Phe Val Gly Tyr Cys
20 25 30
Ala Cys Ser Glu Ser Val Ser Gly Asp Cys Thr Cys Tyr Pro Arg Asp
35 40 45
Ser Ile Pro Tyr Arg His Glu Trp Tyr Val Asp Ala
50 55 60
<210> 119
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 超长CDR-H3 K88
<400> 119
Thr Thr Ile Phe Gln Lys Thr Arg Arg Asn Cys Pro Pro Ser Ser Thr
1 5 10 15
Ser Asp Gly Asp Cys Arg Gly Gly Trp Thr Cys Arg Gly Gly Asp Cys
20 25 30
Ser Arg Trp Arg Gly Tyr Tyr Ser Ser Gly Asn Asn Tyr Cys Cys Tyr
35 40 45
Asp Tyr Thr Asp Thr Tyr Glu Phe Tyr Val Asp Gln
50 55 60
<210> 120
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 超长CDR-H3 K90
<400> 120
Thr Thr Val Arg Gln Lys Thr Ala Lys Ser Cys Pro Trp Gly Tyr Asp
1 5 10 15
Asn Gly His Gly Cys Asn Cys Gly Asn Asp Val Phe Ala Cys Ser Glu
20 25 30
Cys Leu Arg Ser Gly Thr Cys Ser Arg Tyr Gly Arg Tyr Glu Ala Tyr
35 40 45
Ser Tyr Ile Val Thr Tyr Glu Phe Ser Val Asp Ala
50 55 60
<210> 121
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 超长CDR-H3 K91
<400> 121
Ser Thr Val His Gln Lys Thr Arg Gln Ser Cys Pro Asp Asp Tyr Pro
1 5 10 15
Val Lys Cys Glu Arg Gly Cys Gly Arg Glu Arg Cys Gly Asn Cys Gly
20 25 30
Trp Ala Cys Asn Gly Pro Val Gly Ser Pro Thr Cys Ser Tyr Cys Arg
35 40 45
Pro Tyr Ile Tyr Thr Tyr Glu Phe Tyr Val Asp Ala
50 55 60
<210> 122
<211> 59
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 超长CDR-H3 K96
<400> 122
Thr Thr Val Tyr Gln Lys Thr Lys Glu Thr Cys Pro Asp Gly Tyr Ile
1 5 10 15
Trp Ala Glu Arg Cys Pro Gly Gly Trp Thr Ser Cys Arg Asn Ala Cys
20 25 30
Trp Leu Glu Gly Gly Asp Ser Ala Gly Ala Tyr Asp Glu Val Thr Ser
35 40 45
Thr Val His Arg Tyr Glu Phe Tyr Val Asp Thr
50 55
<210> 123
<211> 59
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 超长CDR-H3 K105
<400> 123
Thr Ala Val Tyr Gln Lys Thr Glu Glu Lys Asn Thr Cys Pro Asp Gly
1 5 10 15
His Thr Trp Arg His Gly Tyr Arg Cys Thr Gly Trp Ser Tyr Gly Cys
20 25 30
Phe Arg Gly Ala Gly Asn Asp Cys Ser Asp Phe Gly Gly Asp Arg Ile
35 40 45
Thr Thr Tyr Gly Tyr Glu Trp Tyr Val Glu Asn
50 55
<210> 124
<211> 59
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 超长CDR-H3 K106
<400> 124
Thr Thr Val His Gln Arg Thr Ile Arg Thr Cys Pro Asp Gly Tyr Gly
1 5 10 15
Tyr Gln Asp Ala Cys Gly Arg Trp Gly Gly Cys Val Gly Arg Ala Cys
20 25 30
Cys Ser Ser Gly Gly Ser Gly Cys Cys Asp Gly Ser Cys Gly Thr Met
35 40 45
Tyr Ile Asp Asn Tyr Asp Leu Tyr Val Asp Ala
50 55
<210> 125
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 超长CDR-H3 K111
<400> 125
Gly Ile Val Val Gln Arg Thr Tyr Glu Arg Arg Thr Cys Pro Asp Thr
1 5 10 15
Phe Thr Tyr Lys Asp Gly Cys Arg Arg Gly Gly Thr Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Arg Ser Gly Cys Tyr Asn Val Tyr Cys Asn Tyr His Asp Ala Glu Val
35 40 45
Thr Tyr Ala His Arg Trp Tyr Val Asp Ala
50 55
<210> 126
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 超长CDR-H3 K112
<400> 126
Val Thr Val Gln Gln Gln Thr Lys Leu Glu Tyr Ser Cys Pro Asn Gly
1 5 10 15
Tyr Ser Ser Asp Ala Gly Cys Leu Ala Ala Trp Arg Cys Gly Asp Tyr
20 25 30
Asp Cys Cys Arg Glu Asn Ala Phe Arg Pro Cys Thr Gly Ser Ile Pro
35 40 45
Thr Ser Asn Tyr Glu Trp His Leu Glu Ala
50 55
<210> 127
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 超长CDR-H3 K113
<400> 127
Ser Thr Val His Gln Glu Thr Ile Arg Thr Cys Pro Asp Gly Gly Thr
1 5 10 15
Tyr Ala Arg Asp Cys Gly Arg Glu Cys Ala Ile Cys Gly His Cys Gly
20 25 30
Cys Cys Gln Asn Ala Tyr Arg Arg Asn Trp Glu Thr Cys Asn Thr Tyr
35 40 45
Thr Glu Ser Ile Asn Phe His Ile Asp Ala
50 55
<210> 128
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 超长CDR-H3 K114
<400> 128
Thr Ala Val Val Gln Arg Ser Leu Lys Lys Pro Ser Cys Pro Ser Gly
1 5 10 15
Tyr Thr Leu Trp Gly Asp Cys Glu Gly Asp Asp Gly Gly Glu Gly Gly
20 25 30
Val Cys Arg Cys Trp Arg Pro His Ser Thr Val Ala Thr Pro Thr Tyr
35 40 45
Ala Ser Thr Phe Gln Trp His Val Asp Ala
50 55
<210> 129
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 超长CDR-H3 K116
<400> 129
Thr Thr Val Tyr Gln Lys Thr Asn Thr Glu Arg Ser Cys Pro Glu Trp
1 5 10 15
Val Gln Thr Ser Arg Thr Cys Ile Tyr Arg Ser Arg Cys Gly Gln Tyr
20 25 30
Val Cys Trp Ser Leu Gly Glu Asp Asp Cys Gly Val Thr Cys Thr Asp
35 40 45
Thr Thr Thr Tyr Glu Trp Tyr Val Asp Ala
50 55
<210> 130
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 超长CDR-H3 K117
<400> 130
Ile Thr Val His Gln Glu Thr Ile Arg Thr Cys Pro Asp Ala Trp Arg
1 5 10 15
Ser Ser Ala Thr Cys Arg Gly Ala Tyr Gly Glu Ala Tyr Glu Cys Cys
20 25 30
Pro Ser Gly Ser Ser Met Trp Thr Ser Cys Val Gly Cys Thr Thr Ala
35 40 45
Thr Phe Ser Tyr Asn Leu Tyr Val Glu Ala
50 55
<210> 131
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 超长CDR-H3 K118
<400> 131
Thr Thr Val His Gln Lys Thr Ser Ala Lys Arg Thr Cys Pro Asp Gly
1 5 10 15
Trp Arg Pro Gly Ser Glu Cys Gly Trp Glu Asp Arg Cys Cys Gly Glu
20 25 30
Phe Cys Ser Arg Cys Asp Trp His Gly Gly Trp Arg Ala Tyr Met Glu
35 40 45
Thr Gln Thr Tyr Glu Phe Asn Val Asp Ser
50 55
<210> 132
<211> 57
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 超长CDR-H3 K120
<400> 132
Ser Thr Val His Gln Gln Thr Asn Lys Arg Arg Gln Asn Cys Pro Asp
1 5 10 15
Gly Tyr Lys Tyr Asn Gly Phe Cys Thr Pro Asp Gly Gly Cys Ser Arg
20 25 30
Val Ser Ser Trp Gly Trp Asp Arg Ser Cys Ile Ser Pro Thr Tyr Thr
35 40 45
Tyr Thr Tyr Glu Trp Tyr Val Glu Ala
50 55
<210> 133
<211> 57
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 超长CDR-H3 K121
<400> 133
Thr Thr Val Tyr Gln Ser Thr Arg Lys Thr Ser Arg Asn Cys Pro Asp
1 5 10 15
Gly Gly Ser Pro Ser Val Gln Cys Leu Asp Asp Thr Trp Ala Cys Arg
20 25 30
Ile Val Asp Cys Tyr Asp Asp Gly Thr Tyr Gly Thr Tyr Arg Phe Thr
35 40 45
Asn Thr Tyr Asp Trp Tyr Val Asp Ala
50 55
<210> 134
<211> 57
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 超长CDR-H3 K122
<400> 134
Ser Thr Val Phe Gln His Thr Lys Thr Thr Cys Ser Cys Pro Asp Asn
1 5 10 15
Trp Glu Thr Ser Gly Asp Cys Ala Gly Ser Ser Gly Asp Cys Ser Asp
20 25 30
Cys Thr Cys Trp Arg Leu Gly Tyr Gly Arg Thr Ser Ser Ile Ala Thr
35 40 45
Phe Asn Tyr Glu Trp Tyr Val Glu Ala
50 55
<210> 135
<211> 57
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 超长CDR-H3 K123
<400> 135
Thr Thr Val His Gln Lys Thr Glu Ser His Arg Ser Cys Pro Gly Asp
1 5 10 15
Arg Pro Val Asp Cys Gly Asp Asp Tyr Gly Thr Leu Gly Cys Cys Pro
20 25 30
Phe His Val Gly Cys Gly Thr Trp Arg Cys Ile Glu His Ile Tyr Thr
35 40 45
Tyr Thr Tyr Gln Phe His Val Asp Ala
50 55
<210> 136
<211> 57
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 超长CDR-H3 K124
<400> 136
Thr Thr Val Tyr Gln Ser Thr Arg Lys Thr Ser Arg Asn Cys Pro Asp
1 5 10 15
Gly Gly Ser Pro Ser Val Gln Cys Leu Asp Asp Thr Trp Ala Cys Arg
20 25 30
Ile Val Asp Cys Tyr Ala Thr Val Leu Met Val Pro Ile Val Leu Pro
35 40 45
Thr Leu Tyr Asp Trp Tyr Val Asp Ala
50 55
<210> 137
<211> 57
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 超长CDR-H3 K125
<400> 137
Ala Thr Val His Gln Tyr Thr His Arg Ser Cys Pro Val Gly Tyr Asp
1 5 10 15
Gly Gly Gly Asn Cys Gly Arg Tyr Val Asp Thr Cys Trp Gly Ser Asp
20 25 30
Cys Cys Arg Tyr Arg Arg Gly Ile Asp Tyr Ser Cys Ser Ser Tyr Ser
35 40 45
Ser Ser Tyr Glu Phe Tyr Phe Glu Ala
50 55
<210> 138
<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 超长CDR-H3 K127
<400> 138
Ala Ser Val His Gln Glu Thr Lys Arg Ser Cys Pro Asp Gly Tyr Arg
1 5 10 15
Arg Gly Leu Glu Cys Ser Ala Glu Trp Arg Cys Arg Tyr Tyr Asp Cys
20 25 30
Val Glu Cys Ser Tyr Gly Leu Cys Gly His Ile Thr Arg Tyr Ile Glu
35 40 45
Ser Tyr Ala Trp His Val Asp Thr
50 55
<210> 139
<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 超长CDR-H3 K128
<400> 139
Thr Ala Val His Gln Glu Thr Lys Lys Gln Pro Pro Asn Cys Pro Asp
1 5 10 15
Gly Ser Ser Leu Leu Ser Ser Cys Phe Asp Thr Gly Gly Cys Ser Leu
20 25 30
Tyr Ser Cys Gly Arg Glu Gly Arg Arg Arg Thr Tyr Thr Tyr Ser Tyr
35 40 45
Thr Tyr Glu Trp Tyr Val Asp Ala
50 55
<210> 140
<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 超长CDR-H3 K130
<400> 140
Gly Thr Val His Gln Lys Thr Asn Asp His Thr Arg Cys Pro Asp Gly
1 5 10 15
Tyr Tyr Gln Gly Trp His Met Ser Leu Arg Arg Tyr Val Cys Ala Arg
20 25 30
Asp Gly Tyr Asn Pro Glu Arg Tyr Tyr Val Glu Ala Thr His Thr Tyr
35 40 45
Thr Tyr Glu Phe His Ile Asp Ala
50 55
<210> 141
<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 超长CDR-H3 K131
<400> 141
Thr Thr Val His Gln Gln Thr Asn Thr Lys Asn Cys Pro Thr Trp Cys
1 5 10 15
Gly Phe Ala His Ser Cys Ile Leu Arg Tyr Glu Ala Cys Ser Asp Cys
20 25 30
Asp Cys Ser Gly Gly Ala Gly Asp Tyr Ala Ala Pro Gly Leu Tyr His
35 40 45
Thr Tyr Glu Phe His Val Asp Ala
50 55
<210> 142
<211> 55
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 超长CDR-H3 K134
<400> 142
Ile Ala Val His Gln Glu Thr Lys Arg Ser Cys Pro Gly Gly Tyr Ile
1 5 10 15
Ala Arg Cys Ala Gly Thr Tyr Gly Cys Ser Ala Val Pro Gly Cys Cys
20 25 30
Asp Phe Ser Gly Asp Cys Leu Trp Arg Ala Asp Ser Leu Thr Leu Thr
35 40 45
Tyr Glu Leu His Val Asp Thr
50 55
<210> 143
<211> 55
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 超长CDR-H3 K135
<400> 143
Ala Thr Val His Gln Lys Asn Asn Arg Lys Lys Lys Leu Val Arg Met
1 5 10 15
Val Val Asn Leu Val Ser Ser Val Ser Thr Pro Val Lys Phe Cys Arg
20 25 30
Ile Ser Glu Cys Tyr Glu Asp His Pro Thr Thr Ile Tyr Thr Tyr Thr
35 40 45
Tyr Glu Phe His Val Asp Ala
50 55
<210> 144
<211> 54
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 超长CDR-H3 K136
<400> 144
Thr Thr Val His Gln Thr Thr Asn Arg Lys Lys Thr Cys Pro Asp Asn
1 5 10 15
Tyr Arg Glu Val Asp Gly Cys Asp Pro Tyr Asp Cys Cys Leu Thr Thr
20 25 30
Trp Cys Thr Asn Ser Tyr Cys Thr Arg Tyr Ile Tyr Glu Asp Ser Tyr
35 40 45
Glu Phe Tyr Val Thr Ala
50
<210> 145
<211> 54
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 超长CDR-H3 K137
<400> 145
Ala Thr Val His Gln Lys Thr Thr Glu Lys Lys Thr Cys Pro Asp Gly
1 5 10 15
Gly Glu Pro Ser Val Ile Cys Leu Asp Ala Ser Glu Val Cys Arg Ile
20 25 30
Ser Glu Cys Tyr Glu Asp His Pro Thr Thr Ile Tyr Thr Tyr Thr Tyr
35 40 45
Glu Phe His Val Asp Ala
50
<210> 146
<211> 54
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 超长CDR-H3 K138
<400> 146
Thr Thr Val His Gln Lys Thr Lys Arg Ser Cys Pro Ala Tyr Asp Ser
1 5 10 15
Ser Gly Cys Gly Cys Val Tyr Tyr Ser Pro Trp Asn Ala Cys Ile Cys
20 25 30
Asp Lys Pro Gly Gly Pro Cys Asp Gly Val Asn Pro Ile Thr Ser Tyr
35 40 45
Glu Phe Asn Val Asp Ala
50
<210> 147
<211> 54
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 超长CDR-H3 K139
<400> 147
Thr Ala Val Tyr Gln Lys Thr Ser Glu Ser Gln Arg Thr Cys Pro Ser
1 5 10 15
Trp Cys Ser Leu Tyr Met Cys Gly Gly Tyr Leu Ala Cys Ser Ala Cys
20 25 30
Gly Cys Ala Glu Asn Gly Arg Tyr Gly Asn Gly Ile Thr Tyr Thr Tyr
35 40 45
Glu Trp His Val Asp Ala
50
<210> 148
<211> 52
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 超长CDR-H3 K144
<400> 148
Thr Thr Val His Gln Lys Thr Thr Lys Thr Cys Pro Asp Gly Tyr Val
1 5 10 15
Tyr Asn Asp Pro Cys Asp Cys Trp Gly Arg Arg Asn Tyr Asp Cys Cys
20 25 30
Cys Glu Gly Gly Arg Glu Phe Tyr Thr Phe Val Tyr Ser His Glu Phe
35 40 45
Asn Val His Ser
50
<210> 149
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 超长CDR-H3 K145
<400> 149
Thr Ser Val Leu Gln Ser Thr Lys Lys Gln Lys Ser Cys Pro Asp Gly
1 5 10 15
Leu Ser Tyr Arg Ala Trp Asp Asp Phe Cys Cys Pro Asn Val Gly Arg
20 25 30
Cys Leu Pro Pro Ile Asn Thr Tyr Thr Tyr Thr His Ala Phe His Ile
35 40 45
Glu Ala
50
<210> 150
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 超长CDR-H3 K146
<400> 150
Thr Thr Leu Tyr Gln Asn Thr Arg Lys Lys Gly Gly Cys Pro Glu Gly
1 5 10 15
Thr Thr Tyr Leu Gly Gly Ser Ser Glu Thr Tyr Arg Cys Gly Leu Glu
20 25 30
Gly Arg Met Arg Thr Tyr Ser Tyr Thr Tyr Ser Tyr Glu Trp Tyr Val
35 40 45
Asp Ala
50
<210> 151
<211> 48
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 超长CDR-H3 K150
<400> 151
Thr Ser Val Leu Gln Ser Thr Lys Lys Gln Lys Thr Cys Pro Asp Gly
1 5 10 15
Leu Ser Tyr Arg Ser Trp Asp Gly Phe Cys Cys Pro Lys Val Gly Arg
20 25 30
Cys Leu Pro Thr Ile Asp Ala Tyr Ile Asn Gln Phe His Ile Glu Ala
35 40 45
<210> 152
<211> 48
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 超长CDR-H3 K151
<400> 152
Thr Ser Val Leu Gln Ser Thr Lys Glu Gln Lys Thr Cys Pro Asp Gly
1 5 10 15
Leu Ser Tyr Arg Ser Trp Asp Gly Phe Cys Cys Pro Lys Tyr Gly Arg
20 25 30
Cys Leu Ala Ala Thr Ser Thr Tyr Thr Thr Glu Phe Tyr Ile Glu Ala
35 40 45
<210> 153
<211> 47
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 超长CDR-H3 K153
<400> 153
Gly Ala Val Tyr Gln Lys Thr Asn Glu Gln Ser Ser Cys Pro Asp Gly
1 5 10 15
Trp Arg Asp Thr Gly Thr His Cys Glu Asp Tyr Gly Ser Trp Gly Tyr
20 25 30
Arg Asp Tyr Thr Phe Thr Tyr Thr Tyr Glu Phe His Val His Asn
35 40 45
<210> 154
<211> 47
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 超长CDR-H3 K154
<400> 154
Thr Thr Val His Gln Thr Thr Arg Pro Asn Thr Asp Ser Cys Pro Ser
1 5 10 15
Gly Tyr Ser Thr Thr Leu His Cys Cys Cys Gly Ser Trp Lys Cys Asp
20 25 30
Trp Cys Asp Pro Thr Thr Tyr Lys Tyr Glu Leu Tyr Val Asn Ala
35 40 45
<210> 155
<211> 522
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> scFc
<400> 155
Pro Lys Ser Gly Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Cys Pro Ala Pro
1 5 10 15
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
20 25 30
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
35 40 45
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
50 55 60
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
65 70 75 80
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
85 90 95
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
100 105 110
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
115 120 125
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys
130 135 140
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
145 150 155 160
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
165 170 175
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
180 185 190
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
195 200 205
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Ser Ser Thr Ala Ser Gly Ser
225 230 235 240
Gly Ser Gly Gly Ser Gly Thr Ala Gly Ser Ser Gly Gly Ala Gly Ser
245 250 255
Ser Gly Gly Ser Thr Thr Ala Gly Gly Ser Ala Ser Gly Ser Gly Ser
260 265 270
Thr Gly Ser Gly Thr Gly Gly Ala Ser Ser Gly Gly Ala Ser Gly Ala
275 280 285
Ser Gly Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Cys
290 295 300
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
305 310 315 320
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
325 330 335
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
340 345 350
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
355 360 365
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
370 375 380
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
385 390 395 400
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
405 410 415
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
420 425 430
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
435 440 445
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
450 455 460
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
465 470 475 480
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
485 490 495
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
500 505 510
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
515 520
<210> 156
<211> 556
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C terminal Tag
<400> 156
Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Glu Asn Leu Tyr Phe Gln
1 5 10 15
Gly Ser Gly Ser His His His His His His His His His His Gly Ser
20 25 30
Gly Ser Pro Lys Ser Gly Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Cys Pro
35 40 45
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
50 55 60
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
65 70 75 80
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
85 90 95
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
100 105 110
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
115 120 125
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
130 135 140
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
145 150 155 160
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
165 170 175
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
180 185 190
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
195 200 205
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
210 215 220
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
225 230 235 240
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
245 250 255
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Ser Ser Thr Ala Ser
260 265 270
Gly Ser Gly Ser Gly Gly Ser Gly Thr Ala Gly Ser Ser Gly Gly Ala
275 280 285
Gly Ser Ser Gly Gly Ser Thr Thr Ala Gly Gly Ser Ala Ser Gly Ser
290 295 300
Gly Ser Thr Gly Ser Gly Thr Gly Gly Ala Ser Ser Gly Gly Ala Ser
305 310 315 320
Gly Ala Ser Gly Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro
325 330 335
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
340 345 350
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
355 360 365
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
370 375 380
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
385 390 395 400
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
405 410 415
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
420 425 430
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
435 440 445
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
450 455 460
Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
465 470 475 480
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
485 490 495
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
500 505 510
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
515 520 525
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
530 535 540
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
545 550 555
<210> 157
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K149
<400> 157
Ser Cys Pro Asp Gly Phe Ser Tyr Arg Ser Trp Asp Asp Phe Cys Cys
1 5 10 15
Pro Met Val Gly Arg Cys Leu
20
<210> 158
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K152
<400> 158
Ser Cys Pro Asp Gly Phe Ser Tyr Arg Ser Trp Asp Asp Phe Leu Leu
1 5 10 15
Ser Tyr Gly Trp Glu Cys Leu
20
<210> 159
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K147
<400> 159
Thr Cys Pro Arg Gly Tyr Glu Tyr Val Ser Cys Trp Trp Gly Ala Thr
1 5 10 15
Cys Thr Tyr Gly Gly Arg Cys Ser
20
<210> 160
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K148
<400> 160
Thr Cys Pro Arg Gly Tyr Glu Tyr Val Ser Cys Trp Trp Gly Ala Thr
1 5 10 15
Cys Thr Tyr Gly Gly Arg Cys Ser
20
<210> 161
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K142
<400> 161
Ser Cys Pro Glu Gly Tyr Thr Tyr Val Trp Gly Cys Asp Asp Asp Ser
1 5 10 15
Gly Gly Val Gly Tyr Gly Cys Ala Pro Asn Gly Ala Ser Ser Cys Ser
20 25 30
<210> 162
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K143
<400> 162
Ser Cys Pro Glu Gly Tyr Thr Tyr Val Trp Gly Cys Asp Asp Asp Ser
1 5 10 15
Gly Gly Val Gly Tyr Gly Cys Ala Pro Asn Gly Ala Ser Ser Cys Ser
20 25 30
<210> 163
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K132
<400> 163
Asn Cys Pro Asp Gly Tyr Gly Tyr Gln Arg His Cys Thr Val Gly Glu
1 5 10 15
Asp Cys Thr Glu Arg Cys Cys Asp Asn Tyr Gly Leu Cys Thr
20 25 30
<210> 164
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K133
<400> 164
Asn Cys Pro Ala Gly Tyr Gly Tyr Gln Arg His Cys Thr Val Gly Glu
1 5 10 15
Asp Cys Thr Asp Ser Cys Cys Asp Arg Tyr Gly Leu Cys Thr
20 25 30
<210> 165
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K140
<400> 165
Thr Cys Pro Glu Gly Leu Val Tyr Asn Ser Asp Gln Ser Arg Cys Cys
1 5 10 15
Ala Ala Asp Ser Gly Val Cys Trp
20
<210> 166
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K141
<400> 166
Thr Cys Pro Glu Gly Leu Ile Tyr Asn Ser Asp Gln Ser Arg Cys Cys
1 5 10 15
Ala Ala Asp Ser Gly Val Cys Trp
20
<210> 167
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K126
<400> 167
Ser Cys Pro Ala Asn His Ser Val Arg Asp Met Cys Ser Tyr Gly Pro
1 5 10 15
Asp Asp Cys Gly Arg Ser Cys Cys Thr Asp Gly Ile Tyr Val Arg Arg
20 25 30
Gly Ser Cys Ser
35
<210> 168
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K129
<400> 168
Ser Cys Pro Glu Asn His Ser Val Arg Asp Met Cys Ser Tyr Gly Pro
1 5 10 15
Asp Asp Cys Gly Arg Ser Cys Cys Thr Asp Gly Ile Tyr Val Arg Arg
20 25 30
Gly Ser Cys Ser
35
<210> 169
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K92
<400> 169
Thr Cys Pro Glu Gly Trp Ser Glu Cys Gly Val Ala Ile Tyr Gly Tyr
1 5 10 15
Glu Cys Gly Arg Trp Gly Cys Gly
20
<210> 170
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K93
<400> 170
Gly Cys Pro Glu Gly Trp Ser Glu Cys Gly Val Gly Thr Tyr Gly Tyr
1 5 10 15
Asp Cys Gly Arg Trp Gly Cys Gly
20
<210> 171
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K94
<400> 171
Ala Cys Pro Glu Gly Trp Ser Glu Cys Gly Val Ala Ile Tyr Gly Tyr
1 5 10 15
Asp Cys Gly Arg Trp Gly Cys Gly
20
<210> 172
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K95
<400> 172
Gly Cys Pro Glu Gly Trp Asn Asp Cys Gly Gly Asn Thr Tyr Gly Tyr
1 5 10 15
Asp Cys Gly Arg Trp Gly Cys Gly
20
<210> 173
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K97
<400> 173
Gly Cys Pro Glu Gly Trp Asn Glu Cys Gly Glu Ala Ile Tyr Gly Tyr
1 5 10 15
Asp Cys Gly Arg Trp Gly Cys Gly
20
<210> 174
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K98
<400> 174
Gly Cys Pro Glu Gly Trp Asn Asp Cys Gly Val Asn Ile Tyr Gly Tyr
1 5 10 15
Asp Cys Gly Arg Trp Gly Cys Gly
20
<210> 175
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K99
<400> 175
Gly Cys Pro Glu Gly Trp Asn Asp Cys Gly Arg Asn Thr Tyr Gly Tyr
1 5 10 15
Asp Cys Gly Arg Trp Gly Cys Gly
20
<210> 176
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K100
<400> 176
Thr Cys Pro Glu Gly Trp Ser Glu Cys Gly Val Ala Ile Tyr Gly Tyr
1 5 10 15
Glu Cys Gly Arg Trp Gly Cys Gly
20
<210> 177
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K101
<400> 177
Ala Cys Pro Glu Gly Trp Ser Glu Cys Gly Val Ala Ile Tyr Gly Tyr
1 5 10 15
Asp Cys Gly Arg Trp Gly Cys Gly
20
<210> 178
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K102
<400> 178
Ala Cys Pro Glu Gly Trp Ser Glu Cys Gly Val Ala Ile Tyr Gly Tyr
1 5 10 15
Asp Cys Gly Arg Trp Gly Cys Gly
20
<210> 179
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K103
<400> 179
Ala Cys Pro Glu Gly Trp Ser Glu Cys Gly Val Ala Ile Tyr Gly Tyr
1 5 10 15
Asp Cys Gly Arg Trp Gly Cys Gly
20
<210> 180
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K104
<400> 180
Ala Cys Pro Glu Gly Trp Ser Glu Cys Gly Val Ala Ile Tyr Gly Tyr
1 5 10 15
Asp Cys Gly Arg Trp Gly Cys Gly
20
<210> 181
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K107
<400> 181
Thr Cys Pro Glu Gly Trp Ser Glu Cys Gly Val Ala Ile Tyr Gly Tyr
1 5 10 15
Asp Cys Gly Arg Trp Gly Cys Gly
20
<210> 182
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K108
<400> 182
Gly Cys Pro Glu Gly Trp Ser Glu Cys Gly Val Gly Thr Tyr Gly Tyr
1 5 10 15
Asp Cys Gly Arg Trp Gly Cys Gly
20
<210> 183
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K109
<400> 183
Ala Cys Pro Glu Gly Trp Ser Glu Cys Gly Val Ala Ile Tyr Gly Tyr
1 5 10 15
Glu Cys Gly Arg Trp Gly Cys Gly
20
<210> 184
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K110
<400> 184
Gly Cys Pro Glu Gly Trp Asn Asp Cys Gly Gly Asn Thr Tyr Gly Tyr
1 5 10 15
Asp Cys Gly Arg Trp Gly Cys Gly
20
<210> 185
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K115
<400> 185
Thr Cys Pro Glu Gly Ser Met Leu Gly Ser Glu Cys Asn Ser His Trp
1 5 10 15
Ser Cys Glu Gly Cys Asp Cys Ala Lys His Cys Thr Trp Gly Gly Arg
20 25 30
Cys Val Asp Cys Ser
35
<210> 186
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K119
<400> 186
Thr Cys Pro Glu Gly Ser Met Leu Gly Ser Glu Cys Asn Ser His Trp
1 5 10 15
Ser Cys Glu Ala Cys Asp Cys Ala Arg His Cys Thr Trp Gly Gly Arg
20 25 30
Cys Val Asp Cys Ser
35
<210> 187
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K27
<400> 187
Pro Cys Arg Asp Asp Ser Ser Tyr Ala Cys Val Cys Arg Trp Thr Arg
1 5 10 15
Gly Cys Ser Gly Thr Asp Cys Ser Gly Cys Thr Pro Asp Ser Asp Ile
20 25 30
Asp Tyr Gly Cys Asp Thr Ile Ala Cys Asn
35 40
<210> 188
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K32
<400> 188
Pro Cys Arg Asp Asp Ser Ser Tyr Ala Cys Val Cys Arg Trp Thr Arg
1 5 10 15
Gly Cys Ser Gly Thr Asp Cys Ser Gly Cys Thr Pro Asp Ser Asp Ile
20 25 30
Asp Tyr Gly Cys Asp Thr Ile Ala Cys Asn
35 40
<210> 189
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K44
<400> 189
Pro Cys Arg Asp Asp Ser Ser Tyr Ala Cys Val Cys Arg Trp Thr Arg
1 5 10 15
Gly Cys Ser Gly Thr Asp Cys Ser Gly Cys Thr Pro Asp Ser Asp Ile
20 25 30
Asp Tyr Gly Cys Asp Thr Ile Ala Cys Asn
35 40
<210> 190
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K52
<400> 190
Thr Cys Pro Asp Gly Thr Ser Ser His Ser Ala Cys Ile Leu Gly Thr
1 5 10 15
Gly Gly Cys Cys Leu Asp Gln Tyr Tyr Arg Arg Gly Ile Cys Gly Arg
20 25 30
Val Asp Ala Cys Tyr
35
<210> 191
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K54
<400> 191
Thr Cys Pro Asp Gly Ser Ser Ser His Ser Ala Cys Lys Leu Gly Thr
1 5 10 15
Gly Gly Cys Cys Leu Asp Gly Tyr Tyr Arg Arg Gly Ile Cys Gly Arg
20 25 30
Val Asp Ala Cys Tyr
35
<210> 192
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K83
<400> 192
Ser Cys Pro Asp Gly Ser Ser Asp Ala Glu Ser Gly Val Cys Ser Gly
1 5 10 15
Cys Cys Arg Gly Trp Asp Cys Cys Ser Phe Glu Val Asp Trp Val Gly
20 25 30
Cys Lys Gly Cys Thr
35
<210> 193
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K85
<400> 193
Ser Cys Pro Asp Gly Ser Ser Asp Ala Glu Ser Gly Val Cys Ser Gly
1 5 10 15
Cys Cys Arg Gly Trp Asp Cys Cys Ser Phe Glu Val Asp Trp Val Gly
20 25 30
Cys Lys Gly Cys Thr
35
<210> 194
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K87
<400> 194
Ser Cys Pro Asp Gly Ser Ser Asp Ala Glu Ser Gly Val Cys Ser Gly
1 5 10 15
Cys Cys Arg Gly Trp Asp Cys Cys Ser Phe Glu Val Asp Trp Val Gly
20 25 30
Cys Lys Gly Cys Thr
35
<210> 195
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K89
<400> 195
Thr Cys Pro Asp Gly Ser Ser Asp Ala Glu Ser Gly Val Cys Ser Gly
1 5 10 15
Cys Cys Gly Gly Trp Asp Cys Cys Ser Phe Lys Val Asp Trp Val Gly
20 25 30
Cys Lys Glu Cys Thr
35
<210> 196
<211> 43
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K13
<400> 196
Pro Cys Arg Asp Val Ala Ser Pro Val Cys Val Cys Arg Trp Ala Glu
1 5 10 15
Gly Cys Ser Gly Thr Asp Cys Ser Glu Cys Thr Pro Asp Pro Asp Arg
20 25 30
Asp Tyr Gly Thr Cys Glu Ile Ile Ala Cys Thr
35 40
<210> 197
<211> 43
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K14
<400> 197
Pro Cys Arg Asp Val Thr Ser Pro Val Cys Val Cys Arg Trp Ala Glu
1 5 10 15
Gly Cys Ser Gly Thr Asp Cys Ser Asp Cys Thr Pro Asp Pro Asp Arg
20 25 30
Asp Tyr Gly Thr Cys Glu Ile Ile Ala Cys Thr
35 40
<210> 198
<211> 43
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K20
<400> 198
Pro Cys Arg Asp Val Thr Ser Pro Val Cys Val Cys Arg Trp Ala Glu
1 5 10 15
Gly Cys Ser Gly Thr Asp Cys Ser Asp Cys Thr Pro Asp Pro Asp Arg
20 25 30
Asp Tyr Gly Thr Cys Glu Ile Ile Ala Cys Thr
35 40
<210> 199
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K29
<400> 199
Ser Cys Pro Asp Asp Tyr Arg Asp Gly Gly Glu Cys Cys Ile Tyr Gly
1 5 10 15
Arg Cys Ser Ala Glu Asp Cys Ser Val Thr Gly Trp Glu Tyr Tyr Gly
20 25 30
Ser Thr Leu Cys Arg
35
<210> 200
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K34
<400> 200
Ser Cys Pro Asp Asp Tyr Arg Asp Gly Gly Glu Cys Cys Ile Tyr Gly
1 5 10 15
Arg Cys Ser Ala Glu Asp Cys Ser Val Thr Gly Trp Glu Tyr Tyr Gly
20 25 30
Ser Thr Leu Cys Arg
35
<210> 201
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K37
<400> 201
Ser Cys Pro Asp Asp Tyr Arg Asp Gly Gly Glu Cys Cys Ile Tyr Glu
1 5 10 15
Arg Cys Ser Ala Glu Asp Cys Ser Val Thr Gly Trp Glu Tyr Tyr Gly
20 25 30
Ser Thr Leu Cys Arg
35
<210> 202
<211> 46
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K46
<400> 202
Ser Cys Pro Asp Asp Tyr Arg Asp Gly Gly Glu Cys Cys Ile Tyr Gly
1 5 10 15
Arg Cys Ser Ala Glu Asp Cys Ser Val Thr Gly Trp Glu Tyr Tyr Gly
20 25 30
Ser Thr Leu Cys Arg Val Pro Tyr Ile Thr Thr Leu Cys Leu
35 40 45
<210> 203
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K59
<400> 203
Asn Cys Pro Asp Gly Tyr Ser Glu Ile Asn Ala Cys Gly Asp Arg Tyr
1 5 10 15
Lys Ala Ser Gly Gly Leu Cys Cys Gly Glu Gly Ala Gly Ala Trp Arg
20 25 30
Cys Trp Glu Cys Ser
35
<210> 204
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K61
<400> 204
His Cys Pro Asp Gly Tyr Ser Asp Ile Tyr Gly Cys Gly His Tyr Tyr
1 5 10 15
Ser Ala Thr Gly Gly His Cys Cys Gly Glu Gly Ala Gly Ala Trp Arg
20 25 30
Cys Trp Glu Cys Ser
35
<210> 205
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K62
<400> 205
Asn Cys Pro Asp Gly Tyr Ser Asp Ile Tyr Gly Cys Gly Asn Arg Tyr
1 5 10 15
Ala Ala Thr Gly Gly His Cys Cys Gly Glu Gly Ala Gly Ala Trp Arg
20 25 30
Cys Trp Glu Cys Ser
35
<210> 206
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K64
<400> 206
His Cys Pro Asp Gly Tyr Ser Asp Ile Tyr Ala Cys Gly His Tyr Tyr
1 5 10 15
Ser Ala Thr Gly Gly His Cys Cys Gly Glu Gly Ala Gly Ala Trp Arg
20 25 30
Cys Trp Glu Cys Ser
35
<210> 207
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K65
<400> 207
His Cys Pro Asp Gly Tyr Ser Asp Ile Tyr Gly Cys Gly His Tyr Tyr
1 5 10 15
Ser Ser Thr Gly Gly His Cys Cys Gly Glu Gly Ala Gly Ala Trp Arg
20 25 30
Cys Trp Glu Cys Ser
35
<210> 208
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K66
<400> 208
His Cys Pro Asp Gly Tyr Ser Asp Ile Tyr Gly Cys Gly His Tyr Tyr
1 5 10 15
Ser Ala Thr Gly Gly His Cys Cys Gly Glu Gly Ala Gly Ala Trp Arg
20 25 30
Cys Trp Glu Cys Ser
35
<210> 209
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K68
<400> 209
Asn Cys Pro Asp Gly Tyr Ser Asn Ile Tyr Asp Cys Gly His Tyr Tyr
1 5 10 15
Ser Ser Ser Gly Gly His Cys Cys Gly Glu Gly Ala Gly Ala Trp Arg
20 25 30
Cys Trp Glu Cys Ser
35
<210> 210
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K71
<400> 210
Ser Cys Pro Asp Gly Tyr Ser Asp Ile Tyr Gly Cys Gly His Tyr Tyr
1 5 10 15
Ser Ser Thr Gly Gly His Cys Cys Gly Glu Gly Ala Gly Ala Trp Arg
20 25 30
Cys Trp Glu Cys Ser
35
<210> 211
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K74
<400> 211
Asn Cys Pro Asp Gly Tyr Ser Asp Ile Lys Gly Cys Gly Asn Ala Tyr
1 5 10 15
Ala Ala Thr Gly Gly His Cys Cys Gly Glu Gly Ala Gly Ala Trp Arg
20 25 30
Cys Trp Glu Cys Ser
35
<210> 212
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K78
<400> 212
Ser Cys Pro Asp Gly Tyr Ser Asp Ile Tyr Gly Cys Gly His Tyr Tyr
1 5 10 15
Ser Ser Thr Gly Gly His Cys Cys Gly Glu Gly Ala Gly Ala Trp Arg
20 25 30
Cys Trp Glu Cys Ser
35
<210> 213
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K79
<400> 213
Asn Cys Pro Phe Gly Tyr Ser Asp Ile Lys Gly Cys Gly Asn Arg Tyr
1 5 10 15
Ala Ala Thr Gly Gly His Cys Cys Gly Glu Gly Ala Gly Ala Trp Arg
20 25 30
Cys Trp Glu Cys Ser
35
<210> 214
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K60
<400> 214
Ser Cys Arg Glu Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Gly Cys Cys Leu Pro Gly
1 5 10 15
Ser Cys Arg Gly Cys Ala Cys Ser Tyr Tyr Asp Trp Leu Lys Cys Pro
20 25 30
Arg Asp Cys Arg
35
<210> 215
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K77
<400> 215
Ser Cys Pro Glu Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Gly Cys Cys Leu Pro Gly
1 5 10 15
Ser Cys Arg Gly Cys Ala Cys Thr Tyr Tyr Asn Val Leu Lys Cys Pro
20 25 30
Arg Asp Cys Arg
35
<210> 216
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K10
<400> 216
Gly Cys Pro Asp Gly Val Ser Val Val Asn Thr Cys Gly Trp Leu Arg
1 5 10 15
Cys Asn Cys Gly Asp Ser Ile Tyr Cys Ser Arg Ser Ala Asp Ser Gly
20 25 30
Met Trp Cys Gly Arg Cys Gly Asp Cys Thr
35 40
<210> 217
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K11
<400> 217
Gly Cys Pro Asp Gly Val Ser Val Val Pro Thr Cys Gly Trp Leu Arg
1 5 10 15
Cys Asn Cys Gly Glu Asp Leu Tyr Cys Ser Arg Ser Asp Glu Gln Gly
20 25 30
Thr Trp Cys Gly Arg Cys Gly Asp Cys Thr
35 40
<210> 218
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K18
<400> 218
Gly Cys Pro Asn Gly Val Thr Arg Val Ala Thr Cys Gly Trp Lys Arg
1 5 10 15
Cys His Cys Gly Glu Asn Ile Tyr Cys Ser Arg Ser Asp Asp Ser Gly
20 25 30
Thr Trp Cys Gly Arg Cys Gly Asp Cys Thr
35 40
<210> 219
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K19
<400> 219
Gly Cys Pro Asn Gly Val Pro Arg Val Thr Thr Cys Gly Trp Lys Arg
1 5 10 15
Cys His Cys Gly Glu Asn Ile Tyr Cys Ser Arg Ser Asp Asp Ser Gly
20 25 30
Thr Trp Cys Gly Arg Cys Gly Asp Cys Thr
35 40
<210> 220
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K21
<400> 220
Gly Cys Pro Asp Gly Val Ser Val Val Asn Thr Cys Gly Trp Asn Arg
1 5 10 15
Cys Asn Cys Gly Asp Thr Thr Phe Cys Ser Arg Ser Asp Asp Ser Gly
20 25 30
Thr Trp Cys Gly Arg Cys Gly Asp Cys Ser
35 40
<210> 221
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K22
<400> 221
Gly Cys Pro Asp Gly Val Ser Val Val Asn Thr Cys Gly Trp Lys Arg
1 5 10 15
Cys Asn Cys Gly Asp Ser Ile Tyr Cys Ser Arg Ser Ala Asp Asp Asp
20 25 30
Gly Trp Cys Gly Arg Cys Gly Asp Cys Thr
35 40
<210> 222
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K23
<400> 222
Gly Cys Pro Asn Gly Val Thr Arg Val Ala Thr Cys Gly Trp Lys Arg
1 5 10 15
Cys His Cys Ser Glu Asn Ile Tyr Cys Ser Arg Ser Asp Asp Ser Gly
20 25 30
Thr Trp Cys Gly Arg Cys Gly Asp Cys Thr
35 40
<210> 223
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K47
<400> 223
Lys Cys Pro Asp Gly Tyr Thr Tyr Ser Gly Asp Cys Gly Ile Cys Asp
1 5 10 15
Asp Cys Gly Gly Arg Thr Ser Arg Ala Tyr Asp Cys Ala Gly Asp Thr
20 25 30
Ser Leu Tyr Met Cys Gly
35
<210> 224
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K55
<400> 224
Lys Cys Pro Asp Gly Tyr Thr Tyr Ser Gly Asp Cys Gly Ile Cys Asp
1 5 10 15
Asp Cys Gly Gly Arg Thr Ser Arg Ala Tyr Asp Cys Ala Gly Asp Thr
20 25 30
Ser Leu Tyr Met Cys Gly
35
<210> 225
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K2
<400> 225
Ser Cys Pro Asp Gly Tyr Thr Tyr Ile Asn Asp Cys Ile Gly Ala Ser
1 5 10 15
Gly Ala Val Ser Arg Tyr Asp Cys Trp Arg Phe Arg Arg Met Asn Gly
20 25 30
Val Cys Ile
35
<210> 226
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K3
<400> 226
Ser Cys Pro Asp Gly Tyr Thr Tyr Ile Val Asp Cys Ile Gly Ala Thr
1 5 10 15
Gly Ala Val Ser Arg Tyr Asp Cys Trp Arg Phe Arg Arg Met Asn Gly
20 25 30
Val Cys Ile
35
<210> 227
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K31
<400> 227
Ser Cys Pro Gly Gly Cys Arg Asp Thr Asp Gly His Asp Tyr Asp His
1 5 10 15
Trp Ser Cys Ala Gly Ser Asp Cys Cys Cys Phe Gly Thr Asp Gly Gly
20 25 30
Cys Gly Arg Trp Gly Ile Tyr Cys Ser
35 40
<210> 228
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K33
<400> 228
Ser Cys Pro Gly Gly Cys Arg Asp Thr Asp Gly His Asp Tyr Asp His
1 5 10 15
Trp Ser Cys Ala Gly Ser Asp Cys Cys Cys Phe Gly Thr Asp Gly Gly
20 25 30
Cys Gly Arg Trp Gly Val Tyr Cys Ser
35 40
<210> 229
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K45
<400> 229
Ser Cys Pro Gly Gly Cys Arg Asp Thr Asp Gly His Asp Tyr Asp His
1 5 10 15
Trp Ser Cys Ala Gly Ser Asp Cys Cys Cys Phe Gly Thr Asp Gly Gly
20 25 30
Cys Gly Arg Trp Gly Ile Tyr Cys Ser
35 40
<210> 230
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K8
<400> 230
Val Cys Pro Asp Gly Phe Asn Trp Gly Tyr Gly Cys Ala Ala Gly Ser
1 5 10 15
Ser Arg Phe Cys Thr Arg His Asp Trp Cys Cys Tyr Asp Glu Arg Ala
20 25 30
Asp Ser His Thr Tyr Gly Phe Cys Thr
35 40
<210> 231
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K9
<400> 231
Asp Cys Pro Asp Gly Phe Asn Trp Gly Tyr Gly Cys Ala Ala Gly Ser
1 5 10 15
Ser Leu His Cys Ala Arg His Asp Trp Cys Cys Tyr Asp Asp Arg Val
20 25 30
Gly Arg Asp Thr Tyr Gly Phe Cys Thr
35 40
<210> 232
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K1
<400> 232
Ser Cys Pro Asp Gly Tyr Ser Asp Cys Leu Val Cys Gly Ala Asp Arg
1 5 10 15
Asp Gly Cys Ser Ser Gly Gly Cys Arg Gly Cys Trp
20 25
<210> 233
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K4
<400> 233
Thr Cys His Asp Pro Ser Gly Gly Thr Trp Glu Arg Ala Asp Gly Ala
1 5 10 15
Thr Ser Cys Pro Gly Thr His Cys Cys Ser
20 25
<210> 234
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K5
<400> 234
Ser Cys Pro Asp Gly Tyr Arg Phe Phe Gln Glu Cys Arg Gly Thr Gly
1 5 10 15
Thr Gly Cys Pro Gly Asp Asp Cys Val Cys Tyr Asp Gly Arg Gly Gly
20 25 30
Phe Arg Trp Arg Asn Gly Cys Thr
35 40
<210> 235
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K6
<400> 235
Ile Cys Pro Asp Asp Glu Arg Arg Arg Trp Gly Cys Ser Asp Asp Ser
1 5 10 15
Glu Gly Cys Ser Asp Ser Asp Cys His Ile Tyr Asp Gly Asp Gly Ser
20 25 30
Val Gly Cys Cys Asp
35
<210> 236
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K7
<400> 236
Ser Cys Pro Asp Gly Tyr Ser Ser Cys Ser Ser Cys Arg Ala Asn Asp
1 5 10 15
Leu Asp Cys Arg Gly Val Asp Cys Val Asn Asp Arg Val Cys Arg
20 25 30
<210> 237
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K12
<400> 237
Thr Cys Pro Pro Gly Leu Ser Asp Ser Asn Ala Cys Pro Val Gly Thr
1 5 10 15
Trp Ala Ser Arg Arg Thr Gly Cys Cys Ser Cys Cys Asp Arg Phe Cys
20 25 30
Gly Gly Tyr Ser Thr Cys Thr
35
<210> 238
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K15
<400> 238
Ala Cys Pro Asp Gly Tyr Phe Tyr Glu Tyr Arg Cys Leu Val Gly Gly
1 5 10 15
Gly Cys Gly Trp Gly Cys Trp
20
<210> 239
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K16
<400> 239
Thr Cys Pro Asp Gly Tyr Ile Ala Asp Gly Gly Cys Arg Lys Ala Gly
1 5 10 15
Ser Trp Cys Ser Ser Val Asp Cys Ala Gly Tyr Gly Glu Asp Gly Asp
20 25 30
Tyr Gly Gly Trp Arg Thr Ser Cys Cys Tyr
35 40
<210> 240
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K17
<400> 240
Lys Cys Pro Asp Gly Tyr Thr Phe Thr Ala Asn Asn Cys Val Thr Ser
1 5 10 15
Ser Val Arg Cys Ser Gly Arg Asn Cys Cys Gly Gly Asp Ser Tyr Gly
20 25 30
Tyr Tyr Ile Gly Ile Gly Gly Ile Cys His
35 40
<210> 241
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K24
<400> 241
Ile Cys Arg Val Asp Tyr Val Asp Ser Ala Thr Cys Thr Trp Asn Cys
1 5 10 15
Asp Cys Cys Arg Ser Arg Lys Ser Asp Cys Cys Ala Tyr Ala Asn Ser
20 25 30
Arg Ser Cys Trp
35
<210> 242
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K25
<400> 242
Arg Cys Pro Asp Asp Phe Gly Asn Thr Cys Arg Cys Ser Lys Gly Thr
1 5 10 15
Cys Pro Cys Gly Glu Asp Ala Cys Cys Gly Thr Asn Gln Tyr Ser Phe
20 25 30
Trp Gly Asp Cys Arg
35
<210> 243
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K26
<400> 243
Ser Cys Pro Tyr Gly Thr Gly Phe Asp Pro Thr Trp Cys Asp Ser Val
1 5 10 15
Leu Pro Cys Arg Arg Asp Gly Cys Trp Thr Thr Val Trp Gly Cys Cys
20 25 30
Glu
<210> 244
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K28
<400> 244
Asp Cys Pro Ala Gly Tyr Lys Gln Val Tyr Gly Cys Ser Ala Gly Asn
1 5 10 15
Cys Gly Cys Arg Gly Asn Gly Cys Cys Asn Ser Gly Ser Cys Gly Thr
20 25 30
Trp Ser Glu Trp Gly Gln Tyr Gly Cys Cys Asn Cys His
35 40 45
<210> 245
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K30
<400> 245
Ser Cys Pro Asp Gly Tyr Thr Asp Ile Asp Gly Cys Ser Trp Arg His
1 5 10 15
Gly Cys Cys Arg Tyr Asp Cys Cys Ser Asp Arg Ser Cys Ser Trp Cys
20 25 30
Val
<210> 246
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K35
<400> 246
Ser Cys Pro Asp Gly Tyr Thr Asp Arg Val Gly Cys Pro Tyr Leu Trp
1 5 10 15
Thr Ser Cys Ala Arg Gly Asp Cys Trp
20 25
<210> 247
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K36
<400> 247
His Cys Arg Asp Gly Tyr Asp Tyr Gly Gly Gly Cys Cys Val Ser Ser
1 5 10 15
Gly Val Tyr Gly Glu Ser Cys Arg Ser Ser Gly Gly Ser Asp Cys Asp
20 25 30
Gln Trp Val Gly Cys Glu
35
<210> 248
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K38
<400> 248
Thr Cys Pro Asp Gly Tyr Glu Tyr Asp Thr Ala Cys Gly His Gly Arg
1 5 10 15
Cys Cys Cys Val Gly Ser Ser Cys Arg
20 25
<210> 249
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K39
<400> 249
Ser Cys Pro Pro Asp Thr Thr Glu His Asp Cys Cys Gly Cys Gly Gly
1 5 10 15
Arg Gly Cys Ala Trp Ser Gly Cys Tyr Arg Lys Gly Tyr Gly Thr Gly
20 25 30
Cys Arg Val Cys Thr
35
<210> 250
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K40
<400> 250
Ser Cys Pro Asp Gly Thr Asp Tyr Ala Tyr Gly Cys Arg Leu Gly Ala
1 5 10 15
Trp Gly Cys Ala Gly Val Gly Cys Cys Arg Gly Gly Ala Val Gly Ala
20 25 30
Trp Gly Cys Tyr
35
<210> 251
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K41
<400> 251
Ser Cys Pro Asp Gly Tyr Asn Asp Val Glu Ala Arg Ala His Arg Ser
1 5 10 15
Glu Cys Ser Pro Asn Asp Cys Leu Arg Asp Gly Leu Gly Val Ala Ser
20 25 30
Gly Cys Ala
35
<210> 252
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K42
<400> 252
Ser Cys Arg Glu Gly Thr Phe Tyr His Ala Val Cys Gly Gly Val Val
1 5 10 15
Arg Cys Gln Val Val Asp Cys Asp Ala Asp Gly Gly Cys Cys Tyr
20 25 30
<210> 253
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K43
<400> 253
Ser Cys Pro Asp Gly Tyr Ser Asp Asp Asp Gly Arg Pro Asp His Trp
1 5 10 15
Ser Cys Met Asp Val Asp Cys Trp Arg Pro Ala Arg Gly Gly Trp Gly
20 25 30
Ser Asn Cys Glu
35
<210> 254
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K48
<400> 254
Arg Cys Pro Ala Gly Tyr Ser Ile Ser Ala Cys Arg Asp Gly Ile Gly
1 5 10 15
Cys Gly Ala Thr Asp Cys Cys Ala Asp Gly Ala Thr Asp Tyr Ala Trp
20 25 30
Gly Trp Glu Cys Lys
35
<210> 255
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K49
<400> 255
Ser Cys Pro Asp Gly Tyr His Phe Ile Glu Pro Cys His Ser Gly Leu
1 5 10 15
Cys Trp Arg Glu Gly Ala Cys Asn Gly Asp Gly Ile Cys Ala Asn Gly
20 25 30
Leu Gly Arg Cys Arg
35
<210> 256
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K50
<400> 256
Ser Cys Pro Asp Tyr Cys Ser Cys Ile Phe Ser Tyr Cys Ser Gly Ala
1 5 10 15
Asp Gly Cys Ser Ser Tyr Gly Tyr Cys Gly
20 25
<210> 257
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K51
<400> 257
Arg Cys Pro Asp Asp Tyr Ser Tyr Arg Ser Arg Gly Trp Ile Gly Ser
1 5 10 15
Asp Cys Gly Gly His Gly Cys Trp Ser Asp Arg Asp Ala Arg Arg Tyr
20 25 30
Asp Val Tyr Gly Asn Cys Asn
35
<210> 258
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K53
<400> 258
Leu Cys Arg Val Glu Glu Cys Cys Lys Asn Gly Val Val Asn Ala Tyr
1 5 10 15
Gly Ile Cys Glu
20
<210> 259
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K56
<400> 259
Ser Cys Pro Asp Gly Tyr Val Tyr Ser Tyr Asp Cys Gly Ile Cys Asp
1 5 10 15
Asp Cys Gly Gly Arg Thr Ser Arg Ala Tyr Asp Cys Ala Gly Asp Thr
20 25 30
Ser Leu Tyr Met Cys Gly
35
<210> 260
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K57
<400> 260
Gly Cys Pro Pro Gly Tyr Lys Ser Gly Val Asp Cys Ser Pro Gly Ser
1 5 10 15
Glu Cys Lys Trp Gly Cys Tyr
20
<210> 261
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K58
<400> 261
Thr Cys Pro Leu Gly Tyr Asp Leu Asn Asp Arg Cys Asp His Phe Asn
1 5 10 15
Thr Cys Arg Val Glu Glu Cys Cys Lys Asn Gly Val Val Asn Ala Tyr
20 25 30
Gly Ile Cys Glu
35
<210> 262
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K63
<400> 262
Ile Cys Pro Asp Asp Tyr Thr Ala Leu Asn Gly Trp Gly Cys Gly Glu
1 5 10 15
Tyr Arg Cys Cys Pro Lys Ser Gly Ala Cys Cys Cys Ser Gly Gly Gly
20 25 30
Val His Leu Leu Gln Ser Cys Ser
35 40
<210> 263
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K67
<400> 263
Ser Cys Pro Ala Gly Cys Gln Asp Glu Cys Gly Ser Ser Glu Asn Cys
1 5 10 15
Tyr Cys Phe Arg Tyr Gly Ile Trp Cys His
20 25
<210> 264
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K69
<400> 264
Arg Cys Pro Glu Asp Tyr Ser Asp Arg Asp His Cys Ser Cys Trp Ala
1 5 10 15
Gly Cys Gly Asp Asp Asp Cys Trp Arg Val Val Ala Gly Trp Arg Cys
20 25 30
Ser
<210> 265
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K70
<400> 265
Ser Cys Pro Leu Gly Tyr Ala Ile Asn Asp Arg Cys Asp Asp Leu Lys
1 5 10 15
Thr Cys Gly Pro Asp Glu Cys Cys Leu Asn Gly Val Val Asn Ala Tyr
20 25 30
Gly Ile Cys Glu
35
<210> 266
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K72
<400> 266
Ser Cys Pro Glu Gly Tyr Glu Gly Ala Pro Asp Cys Gly Ala Phe Asp
1 5 10 15
Tyr Cys Arg Val Asp Asp Cys Cys Cys Arg Ser Gly Tyr Gly Ser Cys
20 25 30
Arg Arg Asp Ser Cys Arg
35
<210> 267
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K73
<400> 267
Arg Cys Pro Asp Asp Tyr Arg Asp Cys Gly His Cys Cys Cys Gln Tyr
1 5 10 15
Gly Cys His Ala Val Gly Cys Trp Arg Arg Gln Gly Gly Gly Phe Glu
20 25 30
Arg Cys Gly
35
<210> 268
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K75
<400> 268
Thr Cys Pro Asp Gly Tyr Glu Phe Gly Lys Asn Cys Pro Asp Gly His
1 5 10 15
Gly Cys Ser Gly Ser Asp Cys Trp Arg Cys Asp Ser Arg Ser Ala Trp
20 25 30
Trp Cys Thr
35
<210> 269
<211> 47
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K76
<400> 269
Ser Cys Lys Gly Gly Thr Asp Cys Gly Ala Gly Cys Cys Ala Asp Gly
1 5 10 15
Asp Pro Cys Ser Ser Gly Arg Cys Arg Ala Trp Ser Ser Thr Leu Arg
20 25 30
Asp Tyr Phe Tyr Tyr Pro Thr Ser Asn Tyr Thr Tyr Ile Cys Asp
35 40 45
<210> 270
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K80
<400> 270
Ser Cys Pro Gly Val Ser Ala Glu Gly Gly Val Cys Cys Ser Gly Thr
1 5 10 15
Ala Cys Thr Val Pro Glu Cys Trp Trp Phe His Gln Gly His Tyr Ser
20 25 30
Ile Pro Gly Gly Cys Thr
35
<210> 271
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K81
<400> 271
His Cys Pro Asp Gly Tyr Asp Tyr Cys Arg Val Thr Glu Asp Gly Tyr
1 5 10 15
Cys Cys Ser Ala Trp Thr Cys Met His Trp Arg Cys Ala
20 25
<210> 272
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K82
<400> 272
Ile Cys Pro Asp Gly Cys Ile Tyr Ala Cys Ser Cys Arg Glu Glu Trp
1 5 10 15
Arg Cys Thr Val Phe Asp Cys Val Arg Pro Arg Asp Val Pro Asn Gly
20 25 30
Arg Asn Ala Cys Val Ser Thr Cys Pro
35 40
<210> 273
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K84
<400> 273
Lys Cys Pro Asp Gly Tyr Arg Val Gly Thr Asp Cys Thr Pro Gly Lys
1 5 10 15
Gly Cys Asp Tyr Ala Cys His
20
<210> 274
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K86
<400> 274
Ser Cys Gly Ile Thr Cys Arg Lys Arg Cys Asp Cys Ser Phe Val Gly
1 5 10 15
Tyr Cys Ala Cys Ser Glu Ser Val Ser Gly Asp Cys Thr Cys Tyr
20 25 30
<210> 275
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K88
<400> 275
Asn Cys Pro Pro Ser Ser Thr Ser Asp Gly Asp Cys Arg Gly Gly Trp
1 5 10 15
Thr Cys Arg Gly Gly Asp Cys Ser Arg Trp Arg Gly Tyr Tyr Ser Ser
20 25 30
Gly Asn Asn Tyr Cys Cys Tyr
35
<210> 276
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K90
<400> 276
Ser Cys Pro Trp Gly Tyr Asp Asn Gly His Gly Cys Asn Cys Gly Asn
1 5 10 15
Asp Val Phe Ala Cys Ser Glu Cys Leu Arg Ser Gly Thr Cys Ser
20 25 30
<210> 277
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K91
<400> 277
Ser Cys Pro Asp Asp Tyr Pro Val Lys Cys Glu Arg Gly Cys Gly Arg
1 5 10 15
Glu Arg Cys Gly Asn Cys Gly Trp Ala Cys Asn Gly Pro Val Gly Ser
20 25 30
Pro Thr Cys Ser Tyr Cys Arg
35
<210> 278
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K96
<400> 278
Thr Cys Pro Asp Gly Tyr Ile Trp Ala Glu Arg Cys Pro Gly Gly Trp
1 5 10 15
Thr Ser Cys Arg Asn Ala Cys Trp
20
<210> 279
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K105
<400> 279
Thr Cys Pro Asp Gly His Thr Trp Arg His Gly Tyr Arg Cys Thr Gly
1 5 10 15
Trp Ser Tyr Gly Cys Phe Arg Gly Ala Gly Asn Asp Cys Ser
20 25 30
<210> 280
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K106
<400> 280
Thr Cys Pro Asp Gly Tyr Gly Tyr Gln Asp Ala Cys Gly Arg Trp Gly
1 5 10 15
Gly Cys Val Gly Arg Ala Cys Cys Ser Ser Gly Gly Ser Gly Cys Cys
20 25 30
Asp Gly Ser Cys Gly
35
<210> 281
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K111
<400> 281
Thr Cys Pro Asp Thr Phe Thr Tyr Lys Asp Gly Cys Arg Arg Gly Gly
1 5 10 15
Thr Leu Leu Asn Ser Arg Ser Gly Cys Tyr Asn Val Tyr Cys Asn
20 25 30
<210> 282
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K112
<400> 282
Ser Cys Pro Asn Gly Tyr Ser Ser Asp Ala Gly Cys Leu Ala Ala Trp
1 5 10 15
Arg Cys Gly Asp Tyr Asp Cys Cys Arg Glu Asn Ala Phe Arg Pro Cys
20 25 30
Thr
<210> 283
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K113
<400> 283
Thr Cys Pro Asp Gly Gly Thr Tyr Ala Arg Asp Cys Gly Arg Glu Cys
1 5 10 15
Ala Ile Cys Gly His Cys Gly Cys Cys Gln Asn Ala Tyr Arg Arg Asn
20 25 30
Trp Glu Thr Cys Asn
35
<210> 284
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K114
<400> 284
Ser Cys Pro Ser Gly Tyr Thr Leu Trp Gly Asp Cys Glu Gly Asp Asp
1 5 10 15
Gly Gly Glu Gly Gly Val Cys Arg Cys Trp
20 25
<210> 285
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K116
<400> 285
Ser Cys Pro Glu Trp Val Gln Thr Ser Arg Thr Cys Ile Tyr Arg Ser
1 5 10 15
Arg Cys Gly Gln Tyr Val Cys Trp Ser Leu Gly Glu Asp Asp Cys Gly
20 25 30
Val Thr Cys Thr
35
<210> 286
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K117
<400> 286
Thr Cys Pro Asp Ala Trp Arg Ser Ser Ala Thr Cys Arg Gly Ala Tyr
1 5 10 15
Gly Glu Ala Tyr Glu Cys Cys Pro Ser Gly Ser Ser Met Trp Thr Ser
20 25 30
Cys Val Gly Cys Thr
35
<210> 287
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K118
<400> 287
Thr Cys Pro Asp Gly Trp Arg Pro Gly Ser Glu Cys Gly Trp Glu Asp
1 5 10 15
Arg Cys Cys Gly Glu Phe Cys Ser Arg Cys Asp
20 25
<210> 288
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K120
<400> 288
Asn Cys Pro Asp Gly Tyr Lys Tyr Asn Gly Phe Cys Thr Pro Asp Gly
1 5 10 15
Gly Cys Ser Arg Val Ser Ser Trp Gly Trp Asp Arg Ser Cys Ile
20 25 30
<210> 289
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K121
<400> 289
Asn Cys Pro Asp Gly Gly Ser Pro Ser Val Gln Cys Leu Asp Asp Thr
1 5 10 15
Trp Ala Cys Arg Ile Val Asp Cys Tyr
20 25
<210> 290
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K122
<400> 290
Thr Cys Ser Cys Pro Asp Asn Trp Glu Thr Ser Gly Asp Cys Ala Gly
1 5 10 15
Ser Ser Gly Asp Cys Ser Asp Cys Thr Cys Trp
20 25
<210> 291
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K123
<400> 291
Ser Cys Pro Gly Asp Arg Pro Val Asp Cys Gly Asp Asp Tyr Gly Thr
1 5 10 15
Leu Gly Cys Cys Pro Phe His Val Gly Cys Gly Thr Trp Arg Cys Ile
20 25 30
<210> 292
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K124
<400> 292
Asn Cys Pro Asp Gly Gly Ser Pro Ser Val Gln Cys Leu Asp Asp Thr
1 5 10 15
Trp Ala Cys Arg Ile Val Asp Cys Tyr Ala
20 25
<210> 293
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K125
<400> 293
Ser Cys Pro Val Gly Tyr Asp Gly Gly Gly Asn Cys Gly Arg Tyr Val
1 5 10 15
Asp Thr Cys Trp Gly Ser Asp Cys Cys Arg Tyr Arg Arg Gly Ile Asp
20 25 30
Tyr Ser Cys Ser
35
<210> 294
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K127
<400> 294
Ser Cys Pro Asp Gly Tyr Arg Arg Gly Leu Glu Cys Ser Ala Glu Trp
1 5 10 15
Arg Cys Arg Tyr Tyr Asp Cys Val Glu Cys Ser Tyr Gly Leu Cys Gly
20 25 30
<210> 295
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K128
<400> 295
Asn Cys Pro Asp Gly Ser Ser Leu Leu Ser Ser Cys Phe Asp Thr Gly
1 5 10 15
Gly Cys Ser Leu Tyr Ser Cys Gly
20
<210> 296
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K130
<400> 296
Arg Cys Pro Asp Gly Tyr Tyr Gln Gly Trp His Met Ser Leu Arg Arg
1 5 10 15
Tyr Val Cys Ala
20
<210> 297
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K131
<400> 297
Asn Cys Pro Thr Trp Cys Gly Phe Ala His Ser Cys Ile Leu Arg Tyr
1 5 10 15
Glu Ala Cys Ser Asp Cys Asp Cys Ser
20 25
<210> 298
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K134
<400> 298
Ser Cys Pro Gly Gly Tyr Ile Ala Arg Cys Ala Gly Thr Tyr Gly Cys
1 5 10 15
Ser Ala Val Pro Gly Cys Cys Asp Phe Ser Gly Asp Cys Leu
20 25 30
<210> 299
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K135
<400> 299
Phe Cys Arg Ile Ser Glu Cys Tyr
1 5
<210> 300
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K136
<400> 300
Thr Cys Pro Asp Asn Tyr Arg Glu Val Asp Gly Cys Asp Pro Tyr Asp
1 5 10 15
Cys Cys Leu Thr Thr Trp Cys Thr Asn Ser Tyr Cys Thr
20 25
<210> 301
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K137
<400> 301
Thr Cys Pro Asp Gly Gly Glu Pro Ser Val Ile Cys Leu Asp Ala Ser
1 5 10 15
Glu Val Cys Arg Ile Ser Glu Cys Tyr
20 25
<210> 302
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K138
<400> 302
Ser Cys Pro Ala Tyr Asp Ser Ser Gly Cys Gly Cys Val Tyr Tyr Ser
1 5 10 15
Pro Trp Asn Ala Cys Ile Cys Asp Lys Pro Gly Gly Pro Cys Asp
20 25 30
<210> 303
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K139
<400> 303
Thr Cys Pro Ser Trp Cys Ser Leu Tyr Met Cys Gly Gly Tyr Leu Ala
1 5 10 15
Cys Ser Ala Cys Gly Cys Ala
20
<210> 304
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K144
<400> 304
Thr Cys Pro Asp Gly Tyr Val Tyr Asn Asp Pro Cys Asp Cys Trp Gly
1 5 10 15
Arg Arg Asn Tyr Asp Cys Cys Cys Glu
20 25
<210> 305
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K145
<400> 305
Ser Cys Pro Asp Gly Leu Ser Tyr Arg Ala Trp Asp Asp Phe Cys Cys
1 5 10 15
Pro Asn Val Gly Arg Cys Leu
20
<210> 306
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K146
<400> 306
Gly Cys Pro Glu Gly Thr Thr Tyr Leu Gly Gly Ser Ser Glu Thr Tyr
1 5 10 15
Arg Cys Gly
<210> 307
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K150
<400> 307
Thr Cys Pro Asp Gly Leu Ser Tyr Arg Ser Trp Asp Gly Phe Cys Cys
1 5 10 15
Pro Lys Val Gly Arg Cys Leu
20
<210> 308
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K151
<400> 308
Thr Cys Pro Asp Gly Leu Ser Tyr Arg Ser Trp Asp Gly Phe Cys Cys
1 5 10 15
Pro Lys Tyr Gly Arg Cys Leu
20
<210> 309
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K153
<400> 309
Ser Cys Pro Asp Gly Trp Arg Asp Thr Gly Thr His Cys Glu
1 5 10
<210> 310
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3凸起结构域 K154
<400> 310
Ser Cys Pro Ser Gly Tyr Ser Thr Thr Leu His Cys Cys Cys Gly Ser
1 5 10 15
Trp Lys Cys Asp Trp Cys Asp
20
<210> 311
<211> 261
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PGT-121 HC
<400> 311
Gln Met Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Ser Gly Ala Ser Ile Ser Asp Ser
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Arg Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Val His Lys Ser Gly Asp Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Asn Leu Ser Leu Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu
65 70 75 80
Ser Leu Val Ala Ala Thr Ala Ala Asp Ser Gly Lys Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Thr Leu His Gly Arg Arg Ile Tyr Gly Ile Val Ala Phe Asn Glu
100 105 110
Trp Phe Thr Tyr Phe Tyr Met Asp Val Trp Gly Asn Gly Thr Gln Val
115 120 125
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
130 135 140
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
145 150 155 160
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
165 170 175
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
180 185 190
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
195 200 205
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
210 215 220
Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr Leu Glu
225 230 235 240
Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ser Gly Gly Ser His His His His His
245 250 255
His His His His His
260
<210> 312
<211> 301
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PGT-121-K149
<400> 312
Gln Met Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Ser Gly Ala Ser Ile Ser Asp Ser
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Arg Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Val His Lys Ser Gly Asp Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Asn Leu Ser Leu Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu
65 70 75 80
Ser Leu Val Ala Ala Thr Ala Ala Asp Ser Gly Lys Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Thr Leu His Gly Arg Arg Ile Tyr Gly Ser Glu Asn Leu Tyr Phe
100 105 110
Gln Gly Ser Cys Pro Asp Gly Phe Ser Tyr Arg Ser Trp Asp Asp Phe
115 120 125
Cys Cys Pro Met Val Gly Arg Cys Leu Ala Pro Arg Asn Gly Ser Glu
130 135 140
Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ser Glu Trp Phe Thr Tyr Phe Tyr Met Asp
145 150 155 160
Val Trp Gly Asn Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
165 170 175
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
180 185 190
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
195 200 205
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
210 215 220
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
225 230 235 240
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
245 250 255
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro
260 265 270
Lys Ser Cys Asp Lys Thr Leu Glu Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ser
275 280 285
Gly Gly Ser His His His His His His His His His His
290 295 300
<210> 313
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> K149
<400> 313
Ser Cys Pro Asp Gly Phe Ser Tyr Arg Ser Trp Asp Asp Phe Cys Cys
1 5 10 15
Pro Met Val Gly Arg Cys Leu Ala Pro Arg Asn
20 25
<210> 314
<211> 304
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PGT-121-K136
<400> 314
Gln Met Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Ser Gly Ala Ser Ile Ser Asp Ser
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Arg Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Val His Lys Ser Gly Asp Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Asn Leu Ser Leu Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu
65 70 75 80
Ser Leu Val Ala Ala Thr Ala Ala Asp Ser Gly Lys Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Thr Leu His Gly Arg Arg Ile Tyr Gly Ser Glu Asn Leu Tyr Phe
100 105 110
Gln Gly Thr Cys Pro Asp Asn Tyr Arg Glu Val Asp Gly Cys Asp Pro
115 120 125
Tyr Asp Cys Cys Leu Thr Thr Trp Cys Thr Asn Ser Tyr Cys Thr Arg
130 135 140
Tyr Ile Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ser Glu Trp Phe Thr Tyr Phe
145 150 155 160
Tyr Met Asp Val Trp Gly Asn Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala
165 170 175
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser
180 185 190
Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
195 200 205
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
210 215 220
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
225 230 235 240
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr
245 250 255
Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg
260 265 270
Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr Leu Glu Glu Asn Leu Tyr Phe
275 280 285
Gln Gly Ser Gly Gly Ser His His His His His His His His His His
290 295 300
<210> 315
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> K136
<400> 315
Thr Cys Pro Asp Asn Tyr Arg Glu Val Asp Gly Cys Asp Pro Tyr Asp
1 5 10 15
Cys Cys Leu Thr Thr Trp Cys Thr Asn Ser Tyr Cys Thr Arg Tyr Ile
20 25 30
<210> 316
<211> 314
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PGT-121-K92
<400> 316
Gln Met Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Ser Gly Ala Ser Ile Ser Asp Ser
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Arg Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Val His Lys Ser Gly Asp Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Asn Leu Ser Leu Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu
65 70 75 80
Ser Leu Val Ala Ala Thr Ala Ala Asp Ser Gly Lys Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Thr Leu His Gly Arg Arg Ile Tyr Gly Ser Glu Asn Leu Tyr Phe
100 105 110
Gln Gly Val Thr Cys Pro Glu Gly Trp Ser Glu Cys Gly Val Ala Ile
115 120 125
Tyr Gly Tyr Glu Cys Gly Arg Trp Gly Cys Gly His Phe Leu Asn Ser
130 135 140
Gly Pro Asn Ile Ser Pro Tyr Val Thr Thr Gly Ser Glu Asn Leu Tyr
145 150 155 160
Phe Gln Gly Ser Glu Trp Phe Thr Tyr Phe Tyr Met Asp Val Trp Gly
165 170 175
Asn Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
180 185 190
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
195 200 205
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
210 215 220
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
225 230 235 240
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
245 250 255
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
260 265 270
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys
275 280 285
Asp Lys Thr Leu Glu Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ser Gly Gly Ser
290 295 300
His His His His His His His His His His
305 310
<210> 317
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> K92
<400> 317
Val Thr Cys Pro Glu Gly Trp Ser Glu Cys Gly Val Ala Ile Tyr Gly
1 5 10 15
Tyr Glu Cys Gly Arg Trp Gly Cys Gly His Phe Leu Asn Ser Gly Pro
20 25 30
Asn Ile Ser Pro Tyr Val Thr Thr
35 40
<210> 318
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> K92
<400> 318
Val Thr Cys Pro Glu Gly Trp Ser Glu Cys Gly Val Ala Ile Tyr Gly
1 5 10 15
Tyr Glu Cys Gly Arg Trp Gly Cys Gly His Phe Leu Asn Ser Gly Pro
20 25 30
Asn Ile Ser Pro Tyr Val Ser Thr
35 40
<210> 319
<211> 312
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PGT-121-K57
<400> 319
Gln Met Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Ser Gly Ala Ser Ile Ser Asp Ser
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Arg Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Val His Lys Ser Gly Asp Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Asn Leu Ser Leu Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu
65 70 75 80
Ser Leu Val Ala Ala Thr Ala Ala Asp Ser Gly Lys Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Thr Leu His Gly Arg Arg Ile Tyr Gly Ser Glu Asn Leu Tyr Phe
100 105 110
Gln Gly Ser Gly Cys Pro Pro Gly Tyr Lys Ser Gly Val Asp Cys Ser
115 120 125
Pro Gly Ser Glu Cys Lys Trp Gly Cys Tyr Ala Val Asp Gly Arg Arg
130 135 140
Tyr Gly Gly Tyr Gly Ala Asp Ser Gly Val Glu Asn Leu Tyr Phe Gln
145 150 155 160
Gly Ser Glu Trp Phe Thr Tyr Phe Tyr Met Asp Val Trp Gly Asn Gly
165 170 175
Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
180 185 190
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
195 200 205
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
210 215 220
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
225 230 235 240
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
245 250 255
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
260 265 270
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
275 280 285
Thr Leu Glu Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ser Gly Gly Ser His His
290 295 300
His His His His His His His His
305 310
<210> 320
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> K57
<400> 320
Ser Gly Cys Pro Pro Gly Tyr Lys Ser Gly Val Asp Cys Ser Pro Gly
1 5 10 15
Ser Glu Cys Lys Trp Gly Cys Tyr Ala Val Asp Gly Arg Arg Tyr Gly
20 25 30
Gly Tyr Gly Ala Asp Ser Gly Val Gly Ser
35 40
<210> 321
<211> 317
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PGT-121-K8
<400> 321
Gln Met Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Ser Gly Ala Ser Ile Ser Asp Ser
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Arg Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Val His Lys Ser Gly Asp Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Asn Leu Ser Leu Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu
65 70 75 80
Ser Leu Val Ala Ala Thr Ala Ala Asp Ser Gly Lys Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Thr Leu His Gly Arg Arg Ile Tyr Gly Ser Glu Asn Leu Tyr Phe
100 105 110
Gln Gly Val Cys Pro Asp Gly Phe Asn Trp Gly Tyr Gly Cys Ala Ala
115 120 125
Gly Ser Ser Arg Phe Cys Thr Arg His Asp Trp Cys Cys Tyr Asp Glu
130 135 140
Arg Ala Asp Ser His Thr Tyr Gly Phe Cys Thr Gly Asn Arg Val Glu
145 150 155 160
Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ser Glu Trp Phe Thr Tyr Phe Tyr Met Asp
165 170 175
Val Trp Gly Asn Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
180 185 190
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
195 200 205
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
210 215 220
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
225 230 235 240
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
245 250 255
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
260 265 270
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro
275 280 285
Lys Ser Cys Asp Lys Thr Leu Glu Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ser
290 295 300
Gly Gly Ser His His His His His His His His His His
305 310 315
<210> 322
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> K8
<400> 322
Val Cys Pro Asp Gly Phe Asn Trp Gly Tyr Gly Cys Ala Ala Gly Ser
1 5 10 15
Ser Arg Phe Cys Thr Arg His Asp Trp Cys Cys Tyr Asp Glu Arg Ala
20 25 30
Asp Ser His Thr Tyr Gly Phe Cys Thr Gly Asn Arg Val
35 40 45
<210> 323
<211> 314
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PGT-121-K60
<400> 323
Gln Met Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Ser Gly Ala Ser Ile Ser Asp Ser
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Arg Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Val His Lys Ser Gly Asp Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Asn Leu Ser Leu Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu
65 70 75 80
Ser Leu Val Ala Ala Thr Ala Ala Asp Ser Gly Lys Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Thr Leu His Gly Arg Arg Ile Tyr Gly Ser Glu Asn Leu Tyr Phe
100 105 110
Gln Gly Lys Ser Cys Arg Glu Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Gly Cys Cys
115 120 125
Leu Pro Gly Ser Cys Arg Gly Cys Ala Cys Ser Tyr Tyr Asp Trp Leu
130 135 140
Lys Cys Pro Arg Asp Cys Arg Gly Thr Ser Glu Glu Glu Asn Leu Tyr
145 150 155 160
Phe Gln Gly Ser Glu Trp Phe Thr Tyr Phe Tyr Met Asp Val Trp Gly
165 170 175
Asn Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
180 185 190
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
195 200 205
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
210 215 220
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
225 230 235 240
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
245 250 255
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
260 265 270
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys
275 280 285
Asp Lys Thr Leu Glu Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ser Gly Gly Ser
290 295 300
His His His His His His His His His His
305 310
<210> 324
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> K60
<400> 324
Lys Ser Cys Arg Glu Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Gly Cys Cys Leu Pro
1 5 10 15
Gly Ser Cys Arg Gly Cys Ala Cys Ser Tyr Tyr Asp Trp Leu Lys Cys
20 25 30
Pro Arg Asp Cys Arg Gly Thr Ser Glu Glu
35 40
<210> 325
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PGT-121 light chain
<400> 325
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Asp Ile Ser Val Ala Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Ser Cys Gly Glu Lys Ser Leu Gly Ser Arg Ala Val
20 25 30
Gln Trp Tyr Gln His Arg Ala Gly Gln Ala Pro Ser Leu Ile Ile Tyr
35 40 45
Asn Asn Gln Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Pro Asp Ser Pro Phe Gly Thr Thr Ala Thr Leu Thr Ile Thr Ser Val
65 70 75 80
Glu Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys His Ile Trp Asp Ser Arg
85 90 95
Val Pro Thr Lys Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Thr Leu Thr Val Leu
100 105 110
Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser
115 120 125
Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp
130 135 140
Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro
145 150 155 160
Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn
165 170 175
Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys
180 185 190
Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val
195 200 205
Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210 215
<210> 326
<211> 52
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 从PGT-121分离的K8
<400> 326
Gly Val Cys Pro Asp Gly Phe Asn Trp Gly Tyr Gly Cys Ala Ala Gly
1 5 10 15
Ser Ser Arg Phe Cys Thr Arg His Asp Trp Cys Cys Tyr Asp Glu Arg
20 25 30
Ala Asp Ser His Thr Tyr Gly Phe Cys Thr Gly Asn Arg Val Glu Asn
35 40 45
Leu Tyr Phe Gln
50
<210> 327
<211> 47
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 从PGT-121分离的K57
<400> 327
Gly Ser Gly Cys Pro Pro Gly Tyr Lys Ser Gly Val Asp Cys Ser Pro
1 5 10 15
Gly Ser Glu Cys Lys Trp Gly Cys Tyr Ala Val Asp Gly Arg Arg Tyr
20 25 30
Gly Gly Tyr Gly Ala Asp Ser Gly Val Glu Asn Leu Tyr Phe Gln
35 40 45
<210> 328
<211> 49
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 从PGT-121分离的K60
<400> 328
Gly Lys Ser Cys Arg Glu Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Gly Cys Cys Leu
1 5 10 15
Pro Gly Ser Cys Arg Gly Cys Ala Cys Ser Tyr Tyr Asp Trp Leu Lys
20 25 30
Cys Pro Arg Asp Cys Arg Gly Thr Ser Glu Glu Glu Asn Leu Tyr Phe
35 40 45
Gln
<210> 329
<211> 49
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 从PGT-121分离的K92
<400> 329
Gly Val Thr Cys Pro Glu Gly Trp Ser Glu Cys Gly Val Ala Ile Tyr
1 5 10 15
Gly Tyr Glu Cys Gly Arg Trp Gly Cys Gly His Phe Leu Asn Ser Gly
20 25 30
Pro Asn Ile Ser Pro Tyr Val Thr Thr Gly Ser Glu Asn Leu Tyr Phe
35 40 45
Gln
<210> 330
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 从PGT-121分离的K136
<400> 330
Gly Thr Cys Pro Asp Asn Tyr Arg Glu Val Asp Gly Cys Asp Pro Tyr
1 5 10 15
Asp Cys Cys Leu Thr Thr Trp Cys Thr Asn Ser Tyr Cys Thr Arg Tyr
20 25 30
Ile Glu Asn Leu Tyr Phe Gln
35
<210> 331
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 从PGT-121分离的K149
<400> 331
Gly Ser Cys Pro Asp Gly Phe Ser Tyr Arg Ser Trp Asp Asp Phe Cys
1 5 10 15
Cys Pro Met Val Gly Arg Cys Leu Ala Pro Arg Asn Gly Ser Glu Asn
20 25 30
Leu Tyr Phe Gln
35
<210> 332
<211> 304
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 645 Fab HC-K8
<400> 332
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ile Ile Trp Ala Ser Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Thr Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
65 70 75 80
Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ser Val Cys Pro Asp Gly Phe Asn Trp Gly
85 90 95
Tyr Gly Cys Ala Ala Gly Ser Ser Arg Phe Cys Thr Arg His Asp Trp
100 105 110
Cys Cys Tyr Asp Glu Arg Ala Asp Ser His Thr Tyr Gly Phe Cys Thr
115 120 125
Gly Asn Arg Val Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ser Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr
145 150 155 160
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr Val Pro Gly Tyr Ser Thr Ala Pro
165 170 175
Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
180 185 190
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser
195 200 205
Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
210 215 220
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
225 230 235 240
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
245 250 255
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr
260 265 270
Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys
275 280 285
Val Glu Pro Lys Ser Cys His His His His His His His His His His
290 295 300
<210> 333
<211> 299
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 645 Fab HC-K57
<400> 333
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ile Ile Trp Ala Ser Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Thr Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
65 70 75 80
Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ser Ser Gly Cys Pro Pro Gly Tyr Lys Ser
85 90 95
Gly Val Asp Cys Ser Pro Gly Ser Glu Cys Lys Trp Gly Cys Tyr Ala
100 105 110
Val Asp Gly Arg Arg Tyr Gly Gly Tyr Gly Ala Asp Ser Gly Val Glu
115 120 125
Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ser Gly Gly Gly Ser Lys Asn Thr Val Tyr
130 135 140
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
145 150 155 160
Ala Arg Thr Val Pro Gly Tyr Ser Thr Ala Pro Tyr Phe Asp Leu Trp
165 170 175
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
180 185 190
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
195 200 205
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
210 215 220
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
225 230 235 240
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
245 250 255
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
260 265 270
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
275 280 285
Cys His His His His His His His His His His
290 295
<210> 334
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> K57
<400> 334
Gly Cys Pro Pro Gly Tyr Lys Ser Gly Val Asp Cys Ser Pro Gly Ser
1 5 10 15
Glu Cys Lys Trp Gly Cys Tyr Ala Val Asp Gly Arg Arg Tyr Gly Gly
20 25 30
Tyr Gly Ala Asp Ser Gly Val
35
<210> 335
<211> 301
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 645 Fab HC-K60
<400> 335
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ile Ile Trp Ala Ser Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Thr Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
65 70 75 80
Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ser Lys Ser Cys Arg Glu Gly Tyr Ile Asp
85 90 95
Gly Gly Gly Cys Cys Leu Pro Gly Ser Cys Arg Gly Cys Ala Cys Ser
100 105 110
Tyr Tyr Asp Trp Leu Lys Cys Pro Arg Asp Cys Arg Gly Thr Ser Glu
115 120 125
Glu Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ser Gly Gly Gly Ser Lys Asn Thr
130 135 140
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
145 150 155 160
Tyr Cys Ala Arg Thr Val Pro Gly Tyr Ser Thr Ala Pro Tyr Phe Asp
165 170 175
Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
180 185 190
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
195 200 205
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
210 215 220
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
225 230 235 240
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
245 250 255
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
260 265 270
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro
275 280 285
Lys Ser Cys His His His His His His His His His His
290 295 300
<210> 336
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> K60
<400> 336
Lys Ser Cys Arg Glu Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Gly Cys Cys Leu Pro
1 5 10 15
Gly Ser Cys Arg Gly Cys Ala Cys Ser Tyr Tyr Asp Trp Leu Lys Cys
20 25 30
Pro Arg Asp Cys Arg Gly Thr Ser Glu Glu
35 40
<210> 337
<211> 303
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 645 Fab HC-K92
<400> 337
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ile Ile Trp Ala Ser Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Thr Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
65 70 75 80
Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ser Gly Ser Val Thr Cys Pro Glu Gly Trp
85 90 95
Ser Glu Cys Gly Val Ala Ile Tyr Gly Tyr Glu Cys Gly Arg Trp Gly
100 105 110
Cys Gly His Phe Leu Asn Ser Gly Pro Asn Ile Ser Pro Tyr Val Thr
115 120 125
Thr Gly Ser Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ser Gly Gly Gly Ser Lys
130 135 140
Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala
145 150 155 160
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr Val Pro Gly Tyr Ser Thr Ala Pro Tyr
165 170 175
Phe Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
180 185 190
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr
195 200 205
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
210 215 220
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
225 230 235 240
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
245 250 255
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
260 265 270
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val
275 280 285
Glu Pro Lys Ser Cys His His His His His His His His His His
290 295 300
<210> 338
<211> 291
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 645 Fab HC-K136
<400> 338
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ile Ile Trp Ala Ser Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Thr Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
65 70 75 80
Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ser Thr Cys Pro Asp Asn Tyr Arg Glu Val
85 90 95
Asp Gly Cys Asp Pro Tyr Asp Cys Cys Leu Thr Thr Trp Cys Thr Asn
100 105 110
Ser Tyr Cys Thr Arg Tyr Ile Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala
130 135 140
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr Val Pro Gly Tyr Ser
145 150 155 160
Thr Ala Pro Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
165 170 175
Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser
180 185 190
Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys
195 200 205
Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu
210 215 220
Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu
225 230 235 240
Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr
245 250 255
Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val
260 265 270
Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys His His His His His His His
275 280 285
His His His
290
<210> 339
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> K136
<400> 339
Ser Thr Cys Pro Asp Asn Tyr Arg Glu Val Asp Gly Cys Asp Pro Tyr
1 5 10 15
Asp Cys Cys Leu Thr Thr Trp Cys Thr Asn Ser Tyr Cys Thr Arg Tyr
20 25 30
Ile
<210> 340
<211> 289
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 645 Fab HC-K149
<400> 340
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ile Ile Trp Ala Ser Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Thr Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
65 70 75 80
Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ser Gly Ser Cys Pro Asp Gly Phe Ser Tyr
85 90 95
Arg Ser Trp Asp Asp Phe Cys Cys Pro Met Val Gly Arg Cys Leu Ala
100 105 110
Pro Arg Asn Gly Ser Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
130 135 140
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr Val Pro Gly Tyr Ser Thr Ala
145 150 155 160
Pro Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
165 170 175
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
180 185 190
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
195 200 205
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
210 215 220
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
225 230 235 240
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
245 250 255
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
260 265 270
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys His His His His His His His His His
275 280 285
His
<210> 341
<211> 53
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 从645 Fab分离的K8
<400> 341
Gly Ser Val Cys Pro Asp Gly Phe Asn Trp Gly Tyr Gly Cys Ala Ala
1 5 10 15
Gly Ser Ser Arg Phe Cys Thr Arg His Asp Trp Cys Cys Tyr Asp Glu
20 25 30
Arg Ala Asp Ser His Thr Tyr Gly Phe Cys Thr Gly Asn Arg Val Glu
35 40 45
Asn Leu Tyr Phe Gln
50
<210> 342
<211> 48
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 从645 Fab分离的K57
<400> 342
Gly Ser Ser Gly Cys Pro Pro Gly Tyr Lys Ser Gly Val Asp Cys Ser
1 5 10 15
Pro Gly Ser Glu Cys Lys Trp Gly Cys Tyr Ala Val Asp Gly Arg Arg
20 25 30
Tyr Gly Gly Tyr Gly Ala Asp Ser Gly Val Glu Asn Leu Tyr Phe Gln
35 40 45
<210> 343
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 从645 Fab分离的K60
<400> 343
Gly Ser Lys Ser Cys Arg Glu Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Gly Cys Cys
1 5 10 15
Leu Pro Gly Ser Cys Arg Gly Cys Ala Cys Ser Tyr Tyr Asp Trp Leu
20 25 30
Lys Cys Pro Arg Asp Cys Arg Gly Thr Ser Glu Glu Glu Asn Leu Tyr
35 40 45
Phe Gln
50
<210> 344
<211> 52
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 从645 Fab分离的K92
<400> 344
Gly Ser Gly Ser Val Thr Cys Pro Glu Gly Trp Ser Glu Cys Gly Val
1 5 10 15
Ala Ile Tyr Gly Tyr Glu Cys Gly Arg Trp Gly Cys Gly His Phe Leu
20 25 30
Asn Ser Gly Pro Asn Ile Ser Pro Tyr Val Thr Thr Gly Ser Glu Asn
35 40 45
Leu Tyr Phe Gln
50
<210> 345
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 从645 Fab分离的K136
<400> 345
Gly Ser Thr Cys Pro Asp Asn Tyr Arg Glu Val Asp Gly Cys Asp Pro
1 5 10 15
Tyr Asp Cys Cys Leu Thr Thr Trp Cys Thr Asn Ser Tyr Cys Thr Arg
20 25 30
Tyr Ile Glu Asn Leu Tyr Phe Gln
35 40
<210> 346
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 从645 Fab分离的K149
<400> 346
Gly Ser Gly Ser Cys Pro Asp Gly Phe Ser Tyr Arg Ser Trp Asp Asp
1 5 10 15
Phe Cys Cys Pro Met Val Gly Arg Cys Leu Ala Pro Arg Asn Gly Ser
20 25 30
Glu Asn Leu Tyr Phe Gln
35
<210> 347
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> K149A
<220>
<221> DISULFID
<222> (2)..(15)
<220>
<221> DISULFID
<222> (16)..(22)
<400> 347
Ser Cys Pro Asp Gly Phe Ser Tyr Arg Ser Trp Asp Asp Phe Cys Cys
1 5 10 15
Pro Met Val Gly Arg Cys Leu Ala Pro Arg Asn
20 25
<210> 348
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> K149B
<220>
<221> DISULFID
<222> (2)..(16)
<220>
<221> DISULFID
<222> (15)..(22)
<400> 348
Ser Cys Pro Asp Gly Phe Ser Tyr Arg Ser Trp Asp Asp Phe Cys Cys
1 5 10 15
Pro Met Val Gly Arg Cys Leu Ala Pro Arg Asn
20 25
<210> 349
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> K92
<400> 349
Thr Cys Pro Glu Gly Trp Ser Glu Cys Gly Val Ala Ile Tyr Gly Tyr
1 5 10 15
Glu Cys Gly Arg Trp Gly Cys Gly His Phe Leu Asn Ser Gly Pro Asn
20 25 30
Ile Ser Pro Tyr Val Thr Thr Gly Ser
35 40
<210> 350
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> K149
<400> 350
Ser Cys Pro Asp Gly Phe Ser Tyr Arg Ser Trp Asp Asp Phe Cys Cys
1 5 10 15
Pro Met Val Gly Arg Cys Leu Ala Pro Arg Asn Gly Ser
20 25
<210> 351
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hC3nb1
<400> 351
Gln Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Leu Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Thr Ile Asn Arg Ser Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Lys Asn Met Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met His Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Thr Gly Trp Ser Pro Gln Thr Asp Asn Glu Tyr Asn Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 352
<211> 49
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> K57
<400> 352
Ser Gly Gly Gly Ser Gly Cys Pro Pro Gly Tyr Lys Ser Gly Val Asp
1 5 10 15
Cys Ser Pro Gly Ser Glu Cys Lys Trp Gly Cys Tyr Ala Val Asp Gly
20 25 30
Arg Arg Tyr Gly Gly Tyr Gly Ala Asp Ser Gly Val Ser Gly Gly Gly
35 40 45
Ser
<210> 353
<211> 171
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hC3nb1 - K57环1
<400> 353
Gln Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Ser Gly Cys Pro Pro Gly Tyr Lys Ser Gly Val Asp Cys Ser
20 25 30
Pro Gly Ser Glu Cys Lys Trp Gly Cys Tyr Ala Val Asp Gly Arg Arg
35 40 45
Tyr Gly Gly Tyr Gly Ala Asp Ser Gly Val Ser Gly Gly Gly Ser Gly
50 55 60
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Leu Asn
65 70 75 80
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
85 90 95
Ala Thr Ile Asn Arg Ser Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
100 105 110
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Lys Asn Met Val Tyr
115 120 125
Leu Gln Met His Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
130 135 140
Ala Ala Gly Thr Gly Trp Ser Pro Gln Thr Asp Asn Glu Tyr Asn Tyr
145 150 155 160
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
165 170
<210> 354
<211> 171
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hC3nb1 - K57环2
<400> 354
Gln Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Leu Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Ser Gly Gly Gly Ser Gly Cys
35 40 45
Pro Pro Gly Tyr Lys Ser Gly Val Asp Cys Ser Pro Gly Ser Glu Cys
50 55 60
Lys Trp Gly Cys Tyr Ala Val Asp Gly Arg Arg Tyr Gly Gly Tyr Gly
65 70 75 80
Ala Asp Ser Gly Val Ser Gly Gly Gly Ser Lys Glu Arg Glu Phe Val
85 90 95
Ala Thr Ile Asn Arg Ser Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
100 105 110
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Lys Asn Met Val Tyr
115 120 125
Leu Gln Met His Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
130 135 140
Ala Ala Gly Thr Gly Trp Ser Pro Gln Thr Asp Asn Glu Tyr Asn Tyr
145 150 155 160
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
165 170
<210> 355
<211> 170
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hC3nb1 - K57环2 delta脯氨酸
<400> 355
Gln Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Leu Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Ser Gly Gly Gly Ser Gly Cys Pro
35 40 45
Pro Gly Tyr Lys Ser Gly Val Asp Cys Ser Pro Gly Ser Glu Cys Lys
50 55 60
Trp Gly Cys Tyr Ala Val Asp Gly Arg Arg Tyr Gly Gly Tyr Gly Ala
65 70 75 80
Asp Ser Gly Val Ser Gly Gly Gly Ser Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala
85 90 95
Thr Ile Asn Arg Ser Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
100 105 110
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Lys Asn Met Val Tyr Leu
115 120 125
Gln Met His Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
130 135 140
Ala Gly Thr Gly Trp Ser Pro Gln Thr Asp Asn Glu Tyr Asn Tyr Trp
145 150 155 160
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
165 170
<210> 356
<211> 172
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hC3nb1 - K57环3
<400> 356
Gln Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Leu Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Thr Ile Asn Arg Ser Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Cys Pro Pro Gly Tyr Lys Ser Gly
65 70 75 80
Val Asp Cys Ser Pro Gly Ser Glu Cys Lys Trp Gly Cys Tyr Ala Val
85 90 95
Asp Gly Arg Arg Tyr Gly Gly Tyr Gly Ala Asp Ser Gly Val Ser Gly
100 105 110
Gly Gly Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Lys Asn Met Val
115 120 125
Tyr Leu Gln Met His Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr
130 135 140
Cys Ala Ala Gly Thr Gly Trp Ser Pro Gln Thr Asp Asn Glu Tyr Asn
145 150 155 160
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
165 170
<210> 357
<211> 166
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hC3nb1- K57 C-term
<400> 357
Gln Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Leu Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Thr Ile Asn Arg Ser Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Lys Asn Met Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met His Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Thr Gly Trp Ser Pro Gln Thr Asp Asn Glu Tyr Asn Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Cys Pro Pro Gly Tyr Lys Ser Gly Val Asp Cys Ser Pro Gly Ser Glu
130 135 140
Cys Lys Trp Gly Cys Tyr Ala Val Asp Gly Arg Arg Tyr Gly Gly Tyr
145 150 155 160
Gly Ala Asp Ser Gly Val
165
<210> 358
<211> 65
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> K57 超长CDR-H3
<400> 358
Thr Thr Val His Gln Arg Thr Ile Lys Ser Gly Cys Pro Pro Gly Tyr
1 5 10 15
Lys Ser Gly Val Asp Cys Ser Pro Gly Ser Glu Cys Lys Trp Gly Cys
20 25 30
Tyr Ala Val Asp Gly Arg Arg Tyr Gly Gly Tyr Gly Ala Asp Ser Gly
35 40 45
Val Gly Ser Thr Tyr Thr His Glu Phe Tyr Val Asp Ala Trp Gly Gln
50 55 60
Gly
65
<210> 359
<211> 198
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> K57 超长CDR-H3-hC3nb1
<400> 359
Thr Thr Val His Gln Arg Thr Ile Lys Ser Gly Cys Pro Pro Gly Tyr
1 5 10 15
Lys Ser Gly Val Asp Cys Ser Pro Gly Ser Glu Cys Lys Trp Gly Cys
20 25 30
Tyr Ala Val Asp Gly Arg Arg Tyr Gly Gly Tyr Gly Ala Asp Ser Gly
35 40 45
Val Gly Ser Thr Tyr Thr His Glu Phe Tyr Val Asp Ala Trp Gly Gln
50 55 60
Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Gln Val Gln Leu Val
65 70 75 80
Glu Thr Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
85 90 95
Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Leu Asn Ala Met Gly Trp Phe
100 105 110
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Thr Ile Asn Arg
115 120 125
Ser Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr
130 135 140
Ile Ser Arg Asp Asn Gly Lys Asn Met Val Tyr Leu Gln Met His Ser
145 150 155 160
Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Ala Gly Thr Gly
165 170 175
Trp Ser Pro Gln Thr Asp Asn Glu Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
180 185 190
Gln Val Thr Val Ser Ser
195
<210> 360
<211> 193
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hC3nb1- K57 超长CDR-H3
<400> 360
Gln Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Leu Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Thr Ile Asn Arg Ser Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Lys Asn Met Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met His Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Thr Gly Trp Ser Pro Gln Thr Asp Asn Glu Tyr Asn Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser
115 120 125
Thr Thr Val His Gln Arg Thr Ile Lys Ser Gly Cys Pro Pro Gly Tyr
130 135 140
Lys Ser Gly Val Asp Cys Ser Pro Gly Ser Glu Cys Lys Trp Gly Cys
145 150 155 160
Tyr Ala Val Asp Gly Arg Arg Tyr Gly Gly Tyr Gly Ala Asp Ser Gly
165 170 175
Val Gly Ser Thr Tyr Thr His Glu Phe Tyr Val Asp Ala Trp Gly Gln
180 185 190
Gly
<210> 361
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 361
Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 362
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 362
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 363
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 363
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
1 5
<210> 364
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 364
Asp Lys Thr His Thr Ser
1 5
<210> 365
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 365
Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 366
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 366
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 367
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 367
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 368
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 368
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Ser
20
<210> 369
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 369
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25
<210> 370
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 370
Ala Ala Ala Gly Ser Gly Gly Ala Ser Ala Ser
1 5 10
<210> 371
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 371
Ala Ala Ala Gly Ser Gly Xaa Gly Gly Gly Ser Gly Ala Ser Ala Ser
1 5 10 15
<210> 372
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 372
Ala Ala Ala Gly Ser Gly Xaa Gly Gly Gly Ser Xaa Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gly Ala Ser Ala Ser
20
<210> 373
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(17)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 373
Ala Ala Ala Gly Ser Gly Xaa Gly Gly Gly Ser Xaa Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Xaa Gly Gly Gly Ser Gly Ala Ser Ala Ser
20 25
<210> 374
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(17)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(22)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 374
Ala Ala Ala Gly Ser Gly Xaa Gly Gly Gly Ser Xaa Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Xaa Gly Gly Gly Ser Xaa Gly Gly Gly Ser Gly Ala Ser Ala Ser
20 25 30
<210> 375
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 375
Ala Ala Ala Gly Ser Gly Xaa Ser Gly Ala Ser Ala Ser
1 5 10
<210> 376
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 376
Pro Gly Gly Asn Arg Gly Thr Thr Thr Thr Arg Arg Pro Ala Thr Thr
1 5 10 15
Thr Gly Ser Ser Pro Gly Pro Thr Gln Ser His Tyr
20 25
<210> 377
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 377
Ala Thr Thr Thr Gly Ser Ser Pro Gly Pro Thr
1 5 10
<210> 378
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 378
Ala Thr Thr Thr Gly Ser
1 5
<210> 379
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 379
Glu Pro Ser Gly Pro Ile Ser Thr Ile Asn Ser Pro Pro Ser Lys Glu
1 5 10 15
Ser His Lys Ser Pro
20
<210> 380
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 380
Gly Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
1 5 10 15
<210> 381
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 381
Gly Gly Gly Gly Ile Ala Pro Ser Met Val Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 382
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 382
Gly Gly Gly Gly Lys Val Glu Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 383
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 383
Gly Gly Gly Gly Ser Met Lys Ser His Asp Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 384
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 384
Gly Gly Gly Gly Asn Leu Ile Thr Ile Val Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 385
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 385
Gly Gly Gly Gly Val Val Pro Ser Leu Pro Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 386
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 386
Gly Gly Glu Lys Ser Ile Pro Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 387
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 387
Arg Pro Leu Ser Tyr Arg Pro Pro Phe Pro Phe Gly Phe Pro Ser Val
1 5 10 15
Arg Pro
<210> 388
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 388
Tyr Pro Arg Ser Ile Tyr Ile Arg Arg Arg His Pro Ser Pro Ser Leu
1 5 10 15
Thr Thr
<210> 389
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 389
Thr Pro Ser His Leu Ser His Ile Leu Pro Ser Phe Gly Leu Pro Thr
1 5 10 15
Phe Asn
<210> 390
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 390
Arg Pro Val Ser Pro Phe Thr Phe Pro Arg Leu Ser Asn Ser Trp Leu
1 5 10 15
Pro Ala
<210> 391
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 391
Ser Pro Ala Ala His Phe Pro Arg Ser Ile Pro Arg Pro Gly Pro Ile
1 5 10 15
Arg Thr
<210> 392
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 392
Ala Pro Gly Pro Ser Ala Pro Ser His Arg Ser Leu Pro Ser Arg Ala
1 5 10 15
Phe Gly
<210> 393
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 393
Pro Arg Asn Ser Ile His Phe Leu His Pro Leu Leu Val Ala Pro Leu
1 5 10 15
Gly Ala
<210> 394
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 394
Met Pro Ser Leu Ser Gly Val Leu Gln Val Arg Tyr Leu Ser Pro Pro
1 5 10 15
Asp Leu
<210> 395
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 395
Ser Pro Gln Tyr Pro Ser Pro Leu Thr Leu Thr Leu Pro Pro His Pro
1 5 10 15
Ser Leu
<210> 396
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 396
Asn Pro Ser Leu Asn Pro Pro Ser Tyr Leu His Arg Ala Pro Ser Arg
1 5 10 15
Ile Ser
<210> 397
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 397
Leu Pro Trp Arg Thr Ser Leu Leu Pro Ser Leu Pro Leu Arg Arg Arg
1 5 10 15
Pro
<210> 398
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 398
Pro Pro Leu Phe Ala Lys Gly Pro Val Gly Leu Leu Ser Arg Ser Phe
1 5 10 15
Pro Pro
<210> 399
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 399
Val Pro Pro Ala Pro Val Val Ser Leu Arg Ser Ala His Ala Arg Pro
1 5 10 15
Pro Tyr
<210> 400
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 400
Leu Arg Pro Thr Pro Pro Arg Val Arg Ser Tyr Thr Cys Cys Pro Thr
1 5 10 15
Pro
<210> 401
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 401
Pro Asn Val Ala His Val Leu Pro Leu Leu Thr Val Pro Trp Asp Asn
1 5 10 15
Leu Arg
<210> 402
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 402
Cys Asn Pro Leu Leu Pro Leu Cys Ala Arg Ser Pro Ala Val Arg Thr
1 5 10 15
Phe Pro
<210> 403
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链接头
<400> 403
Asp Lys Thr His Thr Cys Ala Ala
1 5
<210> 404
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链接头
<400> 404
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10
<210> 405
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链接头
<400> 405
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Thr Cys Pro Pro Cys
1 5 10 15
Pro Ala
<210> 406
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链接头
<400> 406
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Thr Cys Pro Pro Cys
1 5 10 15
Pro Ala Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
20 25
<210> 407
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链接头
<400> 407
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Gly Lys Pro Thr Leu
1 5 10 15
Tyr Asn Ser Leu Val Met Ser Asp Thr Ala Gly Thr Cys Tyr
20 25 30
<210> 408
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链接头
<400> 408
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Gly Lys Pro Thr His
1 5 10 15
Val Asn Val Ser Val Val Met Ala Glu Val Asp Gly Thr Cys Tyr
20 25 30
<210> 409
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链接头
<400> 409
Asp Lys Thr His Thr Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
<210> 410
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链接头
<400> 410
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp
1 5 10 15
Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Ala
20 25
<210> 411
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链接头
<400> 411
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Ser Cys Pro Ala
1 5 10
<210> 412
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 刚性接头
<400> 412
Gly Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala
1 5 10
<210> 413
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 刚性接头
<400> 413
Pro Pro Pro Pro
1
<210> 414
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 白蛋白结合肽
<400> 414
Asp Leu Cys Leu Arg Asp Trp Gly Cys Leu Trp
1 5 10
<210> 415
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 白蛋白结合肽
<400> 415
Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp
1 5 10
<210> 416
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 白蛋白结合肽
<400> 416
Met Glu Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp Gly Asp
1 5 10 15
<210> 417
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 白蛋白结合肽
<400> 417
Gln Arg Leu Met Glu Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp
1 5 10 15
Glu Asp Asp Glu
20
<210> 418
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 白蛋白结合肽
<400> 418
Gln Gly Leu Ile Gly Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp
1 5 10 15
Gly Arg Ser Val
20
<210> 419
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 白蛋白结合肽
<400> 419
Gln Gly Leu Ile Gly Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp
1 5 10 15
Gly Arg Ser Val Lys
20
<210> 420
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 白蛋白结合肽
<400> 420
Glu Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp Glu Asp Asp
1 5 10 15
<210> 421
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 白蛋白结合肽
<400> 421
Arg Leu Met Glu Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp Glu
1 5 10 15
Asp Asp
<210> 422
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 白蛋白结合肽
<400> 422
Met Glu Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp Glu Asp Asp
1 5 10 15
<210> 423
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 白蛋白结合肽
<400> 423
Met Glu Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp Glu Asp
1 5 10 15
<210> 424
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 白蛋白结合肽
<400> 424
Arg Leu Met Glu Asp Ile Cys Leu Ala Arg Trp Gly Cys Leu Trp Glu
1 5 10 15
Asp Asp
<210> 425
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 白蛋白结合肽
<400> 425
Glu Val Arg Ser Phe Cys Thr Arg Trp Pro Ala Glu Lys Ser Cys Lys
1 5 10 15
Pro Leu Arg Gly
20
<210> 426
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 白蛋白结合肽
<400> 426
Arg Ala Pro Glu Ser Phe Val Cys Tyr Trp Glu Thr Ile Cys Phe Glu
1 5 10 15
Arg Ser Glu Gln
20
<210> 427
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 白蛋白结合肽
<400> 427
Glu Met Cys Tyr Phe Pro Gly Ile Cys Trp Met
1 5 10
<210> 428
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CA645 Fab轻链(gL5)
<400> 428
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Pro Ser Val Trp Ser Asn
20 25 30
Phe Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Glu Ala Ser Lys Leu Thr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gly Gly Tyr Ser Ser Ile
85 90 95
Ser Asp Thr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr
100 105 110
Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu
115 120 125
Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro
130 135 140
Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly
145 150 155 160
Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
165 170 175
Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His
180 185 190
Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val
195 200 205
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 429
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CA645 VL domain (gL5)
<400> 429
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Pro Ser Val Trp Ser Asn
20 25 30
Phe Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Glu Ala Ser Lys Leu Thr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gly Gly Tyr Ser Ser Ile
85 90 95
Ser Asp Thr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 430
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-L1
<400> 430
Gln Ser Ser Pro Ser Val Trp Ser Asn Phe Leu Ser
1 5 10
<210> 431
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-L2
<400> 431
Glu Ala Ser Lys Leu Thr Ser
1 5
<210> 432
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-L3
<400> 432
Gly Gly Gly Tyr Ser Ser Ile Ser Asp Thr Thr
1 5 10
<210> 433
<211> 224
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CA645 Fab重链(gH5)
<400> 433
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ile Ile Trp Ala Ser Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Thr Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Thr Val Pro Gly Tyr Ser Thr Ala Pro Tyr Phe Asp Leu Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
<210> 434
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CA645 VH domain (gH5)
<400> 434
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ile Ile Trp Ala Ser Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Thr Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Thr Val Pro Gly Tyr Ser Thr Ala Pro Tyr Phe Asp Leu Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 435
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H1
<400> 435
Gly Ile Asp Leu Ser Asn Tyr Ala Ile Asn
1 5 10
<210> 436
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H2
<400> 436
Ile Ile Trp Ala Ser Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Thr Trp Ala Lys Gly
1 5 10 15
<210> 437
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-H3
<400> 437
Thr Val Pro Gly Tyr Ser Thr Ala Pro Tyr Phe Asp Leu
1 5 10
<210> 438
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CA645 VH domain (gH1)
<400> 438
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ile Ile Trp Ala Ser Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Thr Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Thr Thr Val Tyr Leu Gln Met
65 70 75 80
Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr
85 90 95
Val Pro Gly Tyr Ser Thr Ala Pro Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 439
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CA645 VH domain (gH37)
<400> 439
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ile Ile Trp Ala Ser Gly Thr Thr Ala Tyr Ala Thr Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Thr Val Pro Gly Tyr Ser Thr Ala Pro Tyr Phe Asp Leu Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 440
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CA645 VH domain (gH47)
<400> 440
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ile Ile Trp Ala Ser Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Thr Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
85 90 95
Thr Val Pro Gly Tyr Ser Ala Ala Pro Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 441
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CA645 VL domain (gL1)
<400> 441
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Pro Ser Val Trp Ser Asn
20 25 30
Phe Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Glu Ala Ser Lys Leu Thr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gly Gly Tyr Ser Ser Ile
85 90 95
Ser Asp Thr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 442
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CA645 VL domain (gL4)
<400> 442
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Pro Ser Val Trp Ser Asn
20 25 30
Phe Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Glu Ala Ser Lys Leu Thr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gly Gly Tyr Ser Ser Ile
85 90 95
Ser Asp Thr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 443
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CA645-Cys VL domain (gL5)
<400> 443
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Pro Ser Val Trp Ser Asn
20 25 30
Phe Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Glu Ala Ser Lys Leu Thr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gly Gly Tyr Ser Ser Ile
85 90 95
Ser Asp Thr Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 444
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CA645-Cys VH domain (gH5)
<400> 444
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ile Ile Trp Ala Ser Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Thr Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Thr Val Pro Gly Tyr Ser Thr Ala Pro Tyr Phe Asp Leu Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 445
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CA645-Cys VL (gL4)
<400> 445
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Pro Ser Val Trp Ser Asn
20 25 30
Phe Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Glu Ala Ser Lys Leu Thr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gly Gly Tyr Ser Ser Ile
85 90 95
Ser Asp Thr Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr
100 105 110
<210> 446
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 446
ggactcggcc acmtaytact g 21
<210> 447
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 447
gctcgagacg gtgaycag 18
<210> 448
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 448
ccatctcatc cctgcgtgtc tccgactcag taaggagaac ggactcggcc acmtaytact 60
g 61
<210> 449
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 449
cctctctatg ggcagtcggt gatgctcgag acggtgayca g 41
<210> 450
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> K92凸起结构域
<400> 450
Thr Cys Pro Glu Gly Trp Ser Glu Cys Gly Val Ala Ile Tyr Gly Tyr
1 5 10 15
Glu Cys Gly Arg Trp Gly Cys Gly His Phe Leu Asn Ser Gly Pro Asn
20 25 30
Ile Ser Pro Tyr Val Ser Thr
35
<210> 451
<211> 639
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 大鼠血清白蛋白- K57位点1
<400> 451
Arg Gly Val Phe Arg Arg Glu Ala His Lys Ser Glu Ile Ala His Arg
1 5 10 15
Phe Lys Asp Leu Gly Glu Gln His Phe Lys Gly Leu Val Leu Ile Ala
20 25 30
Phe Ser Gln Tyr Leu Gln Lys Cys Pro Tyr Glu Glu His Ile Lys Leu
35 40 45
Val Gln Glu Val Thr Asp Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Asn
50 55 60
Ala Ser Gly Gly Gly Ser Gly Cys Pro Pro Gly Tyr Lys Ser Gly Val
65 70 75 80
Asp Cys Ser Pro Gly Ser Glu Cys Lys Trp Gly Cys Tyr Ala Val Asp
85 90 95
Gly Arg Arg Tyr Gly Gly Tyr Gly Ala Asp Ser Gly Val Ser Gly Gly
100 105 110
Gly Ser Glu Asn Cys Asp Lys Ser Ile His Thr Leu Phe Gly Asp Lys
115 120 125
Leu Cys Ala Ile Pro Lys Leu Arg Asp Asn Tyr Gly Glu Leu Ala Asp
130 135 140
Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His
145 150 155 160
Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Pro Phe Gln Arg Pro Glu Ala Glu
165 170 175
Ala Met Cys Thr Ser Phe Gln Glu Asn Pro Thr Ser Phe Leu Gly His
180 185 190
Tyr Leu His Glu Val Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu
195 200 205
Leu Leu Tyr Tyr Ala Glu Lys Tyr Asn Glu Val Leu Thr Gln Cys Cys
210 215 220
Thr Glu Ser Asp Lys Ala Ala Cys Leu Thr Pro Lys Leu Asp Ala Val
225 230 235 240
Lys Glu Lys Ala Leu Val Ala Ala Val Arg Gln Arg Met Lys Cys Ser
245 250 255
Ser Met Gln Arg Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala
260 265 270
Arg Met Ser Gln Arg Phe Pro Asn Ala Glu Phe Ala Glu Ile Thr Lys
275 280 285
Leu Ala Thr Asp Val Thr Lys Ile Asn Lys Glu Cys Cys His Gly Asp
290 295 300
Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Glu Leu Ala Lys Tyr Met Cys
305 310 315 320
Glu Asn Gln Ala Thr Ile Ser Ser Lys Leu Gln Ala Cys Cys Asp Lys
325 330 335
Pro Val Leu Gln Lys Ser Gln Cys Leu Ala Glu Ile Glu His Asp Asn
340 345 350
Ile Pro Ala Asp Leu Pro Ser Ile Ala Ala Asp Phe Val Glu Asp Lys
355 360 365
Glu Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Thr
370 375 380
Phe Leu Tyr Glu Tyr Ser Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Ser Leu
385 390 395 400
Leu Leu Arg Leu Ala Lys Lys Tyr Glu Ala Thr Leu Glu Lys Cys Cys
405 410 415
Ala Glu Gly Asp Pro Pro Ala Cys Tyr Gly Thr Val Leu Ala Glu Phe
420 425 430
Gln Pro Leu Val Glu Glu Pro Lys Asn Leu Val Lys Thr Asn Cys Glu
435 440 445
Leu Tyr Glu Lys Leu Gly Glu Tyr Gly Phe Gln Asn Ala Val Leu Val
450 455 460
Arg Tyr Thr Gln Lys Ala Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu
465 470 475 480
Ala Ala Arg Asn Leu Gly Arg Val Gly Thr Lys Cys Cys Thr Leu Pro
485 490 495
Glu Ala Gln Arg Leu Pro Cys Val Glu Asp Tyr Leu Ser Ala Ile Leu
500 505 510
Asn Arg Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Glu Lys Val
515 520 525
Thr Lys Cys Cys Ser Gly Ser Leu Val Glu Arg Arg Pro Cys Phe Ser
530 535 540
Ala Leu Thr Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Lys Ala Glu
545 550 555 560
Thr Phe Thr Phe His Ser Asp Ile Cys Thr Leu Pro Asp Lys Glu Lys
565 570 575
Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Ala Glu Leu Val Lys His Lys Pro
580 585 590
Lys Ala Thr Glu Asp Gln Leu Lys Thr Val Met Gly Asp Phe Ala Gln
595 600 605
Phe Val Asp Lys Cys Cys Lys Ala Ala Asp Lys Asp Asn Cys Phe Ala
610 615 620
Thr Glu Gly Pro Asn Leu Val Ala Arg Ser Lys Glu Ala Leu Ala
625 630 635
<210> 452
<211> 640
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人血清白蛋白- K57位点1
<400> 452
Arg Gly Val Phe Arg Arg Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg
1 5 10 15
Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala
20 25 30
Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu
35 40 45
Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser
50 55 60
Ala Ser Gly Gly Gly Ser Gly Cys Pro Pro Gly Tyr Lys Ser Gly Val
65 70 75 80
Asp Cys Ser Pro Gly Ser Glu Cys Lys Trp Gly Cys Tyr Ala Val Asp
85 90 95
Gly Arg Arg Tyr Gly Gly Tyr Gly Ala Asp Ser Gly Val Ser Gly Gly
100 105 110
Gly Ser Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys
115 120 125
Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp
130 135 140
Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His
145 150 155 160
Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp
165 170 175
Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys
180 185 190
Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu
195 200 205
Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys
210 215 220
Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu
225 230 235 240
Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala
245 250 255
Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala
260 265 270
Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys
275 280 285
Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp
290 295 300
Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys
305 310 315 320
Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys
325 330 335
Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu
340 345 350
Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys
355 360 365
Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met
370 375 380
Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu
385 390 395 400
Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys
405 410 415
Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe
420 425 430
Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu
435 440 445
Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val
450 455 460
Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu
465 470 475 480
Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro
485 490 495
Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu
500 505 510
Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val
515 520 525
Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser
530 535 540
Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu
545 550 555 560
Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg
565 570 575
Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro
580 585 590
Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala
595 600 605
Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala
610 615 620
Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu
625 630 635 640
<210> 453
<211> 639
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 大鼠血清白蛋白- K92位点1
<400> 453
Arg Gly Val Phe Arg Arg Glu Ala His Lys Ser Glu Ile Ala His Arg
1 5 10 15
Phe Lys Asp Leu Gly Glu Gln His Phe Lys Gly Leu Val Leu Ile Ala
20 25 30
Phe Ser Gln Tyr Leu Gln Lys Cys Pro Tyr Glu Glu His Ile Lys Leu
35 40 45
Val Gln Glu Val Thr Asp Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Asn
50 55 60
Ala Ser Gly Gly Gly Ser Thr Cys Pro Glu Gly Trp Ser Glu Cys Gly
65 70 75 80
Val Ala Ile Tyr Gly Tyr Glu Cys Gly Arg Trp Gly Cys Gly His Phe
85 90 95
Leu Asn Ser Gly Pro Asn Ile Ser Pro Tyr Val Ser Thr Ser Gly Gly
100 105 110
Gly Ser Glu Asn Cys Asp Lys Ser Ile His Thr Leu Phe Gly Asp Lys
115 120 125
Leu Cys Ala Ile Pro Lys Leu Arg Asp Asn Tyr Gly Glu Leu Ala Asp
130 135 140
Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His
145 150 155 160
Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Pro Phe Gln Arg Pro Glu Ala Glu
165 170 175
Ala Met Cys Thr Ser Phe Gln Glu Asn Pro Thr Ser Phe Leu Gly His
180 185 190
Tyr Leu His Glu Val Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu
195 200 205
Leu Leu Tyr Tyr Ala Glu Lys Tyr Asn Glu Val Leu Thr Gln Cys Cys
210 215 220
Thr Glu Ser Asp Lys Ala Ala Cys Leu Thr Pro Lys Leu Asp Ala Val
225 230 235 240
Lys Glu Lys Ala Leu Val Ala Ala Val Arg Gln Arg Met Lys Cys Ser
245 250 255
Ser Met Gln Arg Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala
260 265 270
Arg Met Ser Gln Arg Phe Pro Asn Ala Glu Phe Ala Glu Ile Thr Lys
275 280 285
Leu Ala Thr Asp Val Thr Lys Ile Asn Lys Glu Cys Cys His Gly Asp
290 295 300
Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Glu Leu Ala Lys Tyr Met Cys
305 310 315 320
Glu Asn Gln Ala Thr Ile Ser Ser Lys Leu Gln Ala Cys Cys Asp Lys
325 330 335
Pro Val Leu Gln Lys Ser Gln Cys Leu Ala Glu Ile Glu His Asp Asn
340 345 350
Ile Pro Ala Asp Leu Pro Ser Ile Ala Ala Asp Phe Val Glu Asp Lys
355 360 365
Glu Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Thr
370 375 380
Phe Leu Tyr Glu Tyr Ser Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Ser Leu
385 390 395 400
Leu Leu Arg Leu Ala Lys Lys Tyr Glu Ala Thr Leu Glu Lys Cys Cys
405 410 415
Ala Glu Gly Asp Pro Pro Ala Cys Tyr Gly Thr Val Leu Ala Glu Phe
420 425 430
Gln Pro Leu Val Glu Glu Pro Lys Asn Leu Val Lys Thr Asn Cys Glu
435 440 445
Leu Tyr Glu Lys Leu Gly Glu Tyr Gly Phe Gln Asn Ala Val Leu Val
450 455 460
Arg Tyr Thr Gln Lys Ala Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu
465 470 475 480
Ala Ala Arg Asn Leu Gly Arg Val Gly Thr Lys Cys Cys Thr Leu Pro
485 490 495
Glu Ala Gln Arg Leu Pro Cys Val Glu Asp Tyr Leu Ser Ala Ile Leu
500 505 510
Asn Arg Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Glu Lys Val
515 520 525
Thr Lys Cys Cys Ser Gly Ser Leu Val Glu Arg Arg Pro Cys Phe Ser
530 535 540
Ala Leu Thr Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Lys Ala Glu
545 550 555 560
Thr Phe Thr Phe His Ser Asp Ile Cys Thr Leu Pro Asp Lys Glu Lys
565 570 575
Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Ala Glu Leu Val Lys His Lys Pro
580 585 590
Lys Ala Thr Glu Asp Gln Leu Lys Thr Val Met Gly Asp Phe Ala Gln
595 600 605
Phe Val Asp Lys Cys Cys Lys Ala Ala Asp Lys Asp Asn Cys Phe Ala
610 615 620
Thr Glu Gly Pro Asn Leu Val Ala Arg Ser Lys Glu Ala Leu Ala
625 630 635
<210> 454
<211> 640
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人血清白蛋白- K92位点1
<400> 454
Arg Gly Val Phe Arg Arg Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg
1 5 10 15
Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala
20 25 30
Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu
35 40 45
Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser
50 55 60
Ala Ser Gly Gly Gly Ser Thr Cys Pro Glu Gly Trp Ser Glu Cys Gly
65 70 75 80
Val Ala Ile Tyr Gly Tyr Glu Cys Gly Arg Trp Gly Cys Gly His Phe
85 90 95
Leu Asn Ser Gly Pro Asn Ile Ser Pro Tyr Val Ser Thr Ser Gly Gly
100 105 110
Gly Ser Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys
115 120 125
Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp
130 135 140
Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His
145 150 155 160
Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp
165 170 175
Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys
180 185 190
Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu
195 200 205
Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys
210 215 220
Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu
225 230 235 240
Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala
245 250 255
Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala
260 265 270
Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys
275 280 285
Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp
290 295 300
Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys
305 310 315 320
Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys
325 330 335
Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu
340 345 350
Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys
355 360 365
Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met
370 375 380
Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu
385 390 395 400
Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys
405 410 415
Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe
420 425 430
Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu
435 440 445
Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val
450 455 460
Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu
465 470 475 480
Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro
485 490 495
Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu
500 505 510
Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val
515 520 525
Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser
530 535 540
Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu
545 550 555 560
Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg
565 570 575
Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro
580 585 590
Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala
595 600 605
Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala
610 615 620
Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu
625 630 635 640
<210> 455
<211> 639
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 大鼠血清白蛋白- K57位点2
<400> 455
Arg Gly Val Phe Arg Arg Glu Ala His Lys Ser Glu Ile Ala His Arg
1 5 10 15
Phe Lys Asp Leu Gly Glu Gln His Phe Lys Gly Leu Val Leu Ile Ala
20 25 30
Phe Ser Gln Tyr Leu Gln Lys Cys Pro Tyr Glu Glu His Ile Lys Leu
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Val Gln Glu Val Thr Asp Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Asn
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Cys Ala Ile Pro Lys Leu Arg Asp Asn Tyr Gly Glu Leu Ala Asp Cys
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Leu His Glu Val Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu
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165 170 175
Glu Ser Gly Gly Gly Ser Gly Cys Pro Pro Gly Tyr Lys Ser Gly Val
180 185 190
Asp Cys Ser Pro Gly Ser Glu Cys Lys Trp Gly Cys Tyr Ala Val Asp
195 200 205
Gly Arg Arg Tyr Gly Gly Tyr Gly Ala Asp Ser Gly Val Ser Gly Gly
210 215 220
Gly Ser Ser Asp Lys Ala Ala Cys Leu Thr Pro Lys Leu Asp Ala Val
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Lys Glu Lys Ala Leu Val Ala Ala Val Arg Gln Arg Met Lys Cys Ser
245 250 255
Ser Met Gln Arg Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala
260 265 270
Arg Met Ser Gln Arg Phe Pro Asn Ala Glu Phe Ala Glu Ile Thr Lys
275 280 285
Leu Ala Thr Asp Val Thr Lys Ile Asn Lys Glu Cys Cys His Gly Asp
290 295 300
Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Glu Leu Ala Lys Tyr Met Cys
305 310 315 320
Glu Asn Gln Ala Thr Ile Ser Ser Lys Leu Gln Ala Cys Cys Asp Lys
325 330 335
Pro Val Leu Gln Lys Ser Gln Cys Leu Ala Glu Ile Glu His Asp Asn
340 345 350
Ile Pro Ala Asp Leu Pro Ser Ile Ala Ala Asp Phe Val Glu Asp Lys
355 360 365
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370 375 380
Phe Leu Tyr Glu Tyr Ser Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Ser Leu
385 390 395 400
Leu Leu Arg Leu Ala Lys Lys Tyr Glu Ala Thr Leu Glu Lys Cys Cys
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Gln Pro Leu Val Glu Glu Pro Lys Asn Leu Val Lys Thr Asn Cys Glu
435 440 445
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450 455 460
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485 490 495
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Asn Arg Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Glu Lys Val
515 520 525
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530 535 540
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545 550 555 560
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580 585 590
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595 600 605
Phe Val Asp Lys Cys Cys Lys Ala Ala Asp Lys Asp Asn Cys Phe Ala
610 615 620
Thr Glu Gly Pro Asn Leu Val Ala Arg Ser Lys Glu Ala Leu Ala
625 630 635
<210> 456
<211> 640
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人血清白蛋白- K57位点2
<400> 456
Arg Gly Val Phe Arg Arg Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg
1 5 10 15
Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala
20 25 30
Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu
35 40 45
Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser
50 55 60
Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu
65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val
115 120 125
Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr
130 135 140
Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu
145 150 155 160
Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln
165 170 175
Ala Ser Gly Gly Gly Ser Gly Cys Pro Pro Gly Tyr Lys Ser Gly Val
180 185 190
Asp Cys Ser Pro Gly Ser Glu Cys Lys Trp Gly Cys Tyr Ala Val Asp
195 200 205
Gly Arg Arg Tyr Gly Gly Tyr Gly Ala Asp Ser Gly Val Ser Gly Gly
210 215 220
Gly Ser Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu
225 230 235 240
Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala
245 250 255
Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala
260 265 270
Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys
275 280 285
Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp
290 295 300
Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys
305 310 315 320
Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys
325 330 335
Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu
340 345 350
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Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe
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<223> 大鼠血清白蛋白- K92位点2
<400> 457
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<220>
<223> 大鼠血清白蛋白- K57位点3
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Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe
325 330 335
Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu
340 345 350
Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala
355 360 365
Ala Ser Gly Gly Gly Ser Thr Cys Pro Glu Gly Trp Ser Glu Cys Gly
370 375 380
Val Ala Ile Tyr Gly Tyr Glu Cys Gly Arg Trp Gly Cys Gly His Phe
385 390 395 400
Leu Asn Ser Gly Pro Asn Ile Ser Pro Tyr Val Ser Thr Ser Gly Gly
405 410 415
Gly Ser Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe
420 425 430
Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu
435 440 445
Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val
450 455 460
Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu
465 470 475 480
Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro
485 490 495
Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu
500 505 510
Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val
515 520 525
Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser
530 535 540
Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu
545 550 555 560
Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg
565 570 575
Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro
580 585 590
Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala
595 600 605
Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala
610 615 620
Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu
625 630 635 640
<210> 463
<211> 639
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 大鼠血清白蛋白- K57位点4
<400> 463
Arg Gly Val Phe Arg Arg Glu Ala His Lys Ser Glu Ile Ala His Arg
1 5 10 15
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
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210 215 220
Met Ser Gln Arg Phe Pro Asn Ala Glu Phe Ala Glu Ile Thr Lys Leu
225 230 235 240
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245 250 255
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275 280 285
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325 330 335
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340 345 350
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450 455 460
Arg Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Glu Lys Val Thr
465 470 475 480
Lys Cys Cys Ser Gly Ser Leu Val Glu Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala
485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
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530 535 540
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545 550 555 560
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565 570 575
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Thr Glu Gly Pro Asn Leu Val Ala Arg Ser Lys Glu Ala Leu Ala
625 630 635
<210> 464
<211> 640
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人血清白蛋白- K57位点4
<400> 464
Arg Gly Val Phe Arg Arg Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg
1 5 10 15
Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala
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245 250 255
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Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu
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Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala
355 360 365
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370 375 380
Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu
385 390 395 400
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Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu
625 630 635 640
<210> 465
<211> 639
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 大鼠血清白蛋白- K92位点4
<400> 465
Arg Gly Val Phe Arg Arg Glu Ala His Lys Ser Glu Ile Ala His Arg
1 5 10 15
Phe Lys Asp Leu Gly Glu Gln His Phe Lys Gly Leu Val Leu Ile Ala
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195 200 205
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Met Ser Gln Arg Phe Pro Asn Ala Glu Phe Ala Glu Ile Thr Lys Leu
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Pro Ala Asp Leu Pro Ser Ile Ala Ala Asp Phe Val Glu Asp Lys Glu
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Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Thr Phe
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<210> 466
<211> 640
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人血清白蛋白- K92位点4
<400> 466
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1 5 10 15
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Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln
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Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser
195 200 205
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Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu
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Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu
245 250 255
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Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro
275 280 285
Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met
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Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp
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Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe
325 330 335
Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu
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Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala
355 360 365
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435 440 445
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450 455 460
Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr
465 470 475 480
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485 490 495
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595 600 605
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610 615 620
Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu
625 630 635 640
<210> 467
<211> 365
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 大鼠IgG1重链恒定区位点1 - K149
<400> 467
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195 200 205
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210 215 220
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355 360 365
<210> 468
<211> 365
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 大鼠IgG1重链恒定区位点2 - K149
<400> 468
Ala Glu Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Thr Ala
1 5 10 15
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165 170 175
Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Leu His Gln Asp Trp
180 185 190
Leu Asn Gly Arg Thr Phe Arg Cys Lys Val Thr Ser Ala Ala Phe Pro
195 200 205
Ser Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Pro Glu Ser Gly Gly Gly Gly
210 215 220
Ser Ser Cys Pro Asp Gly Phe Ser Tyr Arg Ser Trp Asp Asp Phe Cys
225 230 235 240
Cys Pro Met Val Gly Arg Cys Leu Ala Pro Arg Asn Ser Gly Gly Gly
245 250 255
Gly Ser Gly Arg Thr Gln Val Pro His Val Tyr Thr Met Ser Pro Thr
260 265 270
Lys Glu Glu Met Thr Gln Asn Glu Val Ser Ile Thr Cys Met Val Lys
275 280 285
Gly Phe Tyr Pro Pro Asp Ile Tyr Val Glu Trp Gln Met Asn Gly Gln
290 295 300
Pro Gln Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Pro Pro Thr Met Asp Thr Asp Gly
305 310 315 320
Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Asn Val Lys Lys Glu Lys Trp Gln
325 330 335
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340 345 350
His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
355 360 365
<210> 469
<211> 365
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 大鼠IgG1重链恒定区位点3 - K149
<400> 469
Ala Glu Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Thr Ala
1 5 10 15
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20 25 30
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130 135 140
Ile Ser Gln Asp Asp Pro Glu Val His Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp
145 150 155 160
Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Arg Pro Pro Glu Glu Gln Phe Asn
165 170 175
Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Leu His Gln Asp Trp
180 185 190
Leu Asn Gly Arg Thr Phe Arg Cys Lys Val Thr Ser Ala Ala Phe Pro
195 200 205
Ser Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Pro Glu Gly Arg Thr Gln Val
210 215 220
Pro His Val Tyr Thr Met Ser Pro Thr Lys Glu Glu Met Thr Gln Asn
225 230 235 240
Glu Val Ser Ile Thr Cys Met Val Lys Gly Phe Tyr Pro Pro Asp Ile
245 250 255
Tyr Val Glu Trp Gln Met Asn Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Cys Pro
260 265 270
Asp Gly Phe Ser Tyr Arg Ser Trp Asp Asp Phe Cys Cys Pro Met Val
275 280 285
Gly Arg Cys Leu Ala Pro Arg Asn Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gln
290 295 300
Pro Gln Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Pro Pro Thr Met Asp Thr Asp Gly
305 310 315 320
Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Asn Val Lys Lys Glu Lys Trp Gln
325 330 335
Gln Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn
340 345 350
His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
355 360 365
<210> 470
<211> 365
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 大鼠IgG1重链恒定区位点4 - K149
<400> 470
Ala Glu Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Thr Ala
1 5 10 15
Leu Lys Ser Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ala Leu Ser Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Gly Leu Tyr Thr Leu
50 55 60
Thr Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Thr Val
65 70 75 80
Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys
85 90 95
Ile Val Pro Arg Asn Cys Gly Gly Asp Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr
100 105 110
Gly Ser Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Ile Ser Gln Asp Asp Pro Glu Val His Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp
145 150 155 160
Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Arg Pro Pro Glu Glu Gln Phe Asn
165 170 175
Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Leu His Gln Asp Trp
180 185 190
Leu Asn Gly Arg Thr Phe Arg Cys Lys Val Thr Ser Ala Ala Phe Pro
195 200 205
Ser Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Pro Glu Gly Arg Thr Gln Val
210 215 220
Pro His Val Tyr Thr Met Ser Pro Thr Lys Glu Glu Met Thr Gln Asn
225 230 235 240
Glu Val Ser Ile Thr Cys Met Val Lys Gly Phe Tyr Pro Pro Asp Ile
245 250 255
Tyr Val Glu Trp Gln Met Asn Gly Gln Pro Gln Glu Asn Tyr Lys Asn
260 265 270
Thr Pro Pro Thr Met Asp Thr Asp Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser
275 280 285
Cys Pro Asp Gly Phe Ser Tyr Arg Ser Trp Asp Asp Phe Cys Cys Pro
290 295 300
Met Val Gly Arg Cys Leu Ala Pro Arg Asn Ser Gly Gly Gly Gly Ser
305 310 315 320
Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Asn Val Lys Lys Glu Lys Trp Gln
325 330 335
Gln Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn
340 345 350
His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
355 360 365
<210> 471
<211> 369
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人IgG1重链恒定区位点1 - K149
<400> 471
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Cys Pro Asp Gly Phe Ser Tyr
210 215 220
Arg Ser Trp Asp Asp Phe Cys Cys Pro Met Val Gly Arg Cys Leu Ala
225 230 235 240
Pro Arg Asn Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
245 250 255
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
260 265 270
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
275 280 285
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
290 295 300
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
305 310 315 320
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
325 330 335
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
340 345 350
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
355 360 365
Lys
<210> 472
<211> 369
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人IgG1重链恒定区位点2 - K149
<400> 472
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Cys Pro Asp Gly Phe Ser Tyr Arg Ser
225 230 235 240
Trp Asp Asp Phe Cys Cys Pro Met Val Gly Arg Cys Leu Ala Pro Arg
245 250 255
Asn Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
260 265 270
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
275 280 285
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
290 295 300
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
305 310 315 320
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
325 330 335
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
340 345 350
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
355 360 365
Lys
<210> 473
<211> 369
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人IgG1重链恒定区位点3 - K149
<400> 473
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Ser Gly Gly Gly Gly
260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
Gly Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
305 310 315 320
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
325 330 335
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
340 345 350
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
355 360 365
Lys
<210> 474
<211> 369
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人IgG1重链恒定区位点4 - K149
<400> 474
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Gly Gly
275 280 285
Gly Gly Ser Ser Cys Pro Asp Gly Phe Ser Tyr Arg Ser Trp Asp Asp
290 295 300
Phe Cys Cys Pro Met Val Gly Arg Cys Leu Ala Pro Arg Asn Ser Gly
305 310 315 320
Gly Gly Gly Ser Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
325 330 335
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
340 345 350
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
355 360 365
Lys
<210> 475
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小家鼠（Mus musculus）免疫球蛋白重链前导序列
<400> 475
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser
<210> 476
<211> 186
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hC3nb1-K8
<400> 476
Gln Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Leu Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Thr Ile Asn Arg Ser Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Thr Val Gln Gln Lys
65 70 75 80
Thr His Gln Val Cys Pro Asp Gly Phe Asn Trp Gly Tyr Gly Cys Ala
85 90 95
Ala Gly Ser Ser Arg Phe Cys Thr Arg His Asp Trp Cys Cys Tyr Asp
100 105 110
Glu Arg Ala Asp Ser His Thr Tyr Gly Phe Cys Thr Gly Asn Arg Val
115 120 125
Thr Asn Thr Tyr Glu Phe His Ala Asp Ala Lys Asn Met Val Tyr Leu
130 135 140
Gln Met His Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
145 150 155 160
Ala Gly Thr Gly Trp Ser Pro Gln Thr Asp Asn Glu Tyr Asn Tyr Trp
165 170 175
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
180 185
<210> 477
<211> 63
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> K8 CDR-H3
<400> 477
Thr Val Gln Gln Lys Thr His Gln Val Cys Pro Asp Gly Phe Asn Trp
1 5 10 15
Gly Tyr Gly Cys Ala Ala Gly Ser Ser Arg Phe Cys Thr Arg His Asp
20 25 30
Trp Cys Cys Tyr Asp Glu Arg Ala Asp Ser His Thr Tyr Gly Phe Cys
35 40 45
Thr Gly Asn Arg Val Thr Asn Thr Tyr Glu Phe His Ala Asp Ala
50 55 60
<210> 478
<211> 184
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hC3nb1-K57
<400> 478
Gln Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Leu Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Thr Ile Asn Arg Ser Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Thr Thr Val His Gln
65 70 75 80
Arg Thr Ile Lys Ser Gly Cys Pro Pro Gly Tyr Lys Ser Gly Val Asp
85 90 95
Cys Ser Pro Gly Ser Glu Cys Lys Trp Gly Cys Tyr Ala Val Asp Gly
100 105 110
Arg Arg Tyr Gly Gly Tyr Gly Ala Asp Ser Gly Val Gly Ser Thr Tyr
115 120 125
Thr His Glu Phe Tyr Val Asp Ala Lys Asn Met Val Tyr Leu Gln Met
130 135 140
His Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Ala Gly
145 150 155 160
Thr Gly Trp Ser Pro Gln Thr Asp Asn Glu Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln
165 170 175
Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
180
<210> 479
<211> 182
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hC3nb1-K92
<400> 479
Gln Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Leu Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Thr Ile Asn Arg Ser Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Ser Ile Val His Gln
65 70 75 80
Lys Ala His Thr Ser Val Thr Cys Pro Glu Gly Trp Ser Glu Cys Gly
85 90 95
Val Ala Ile Tyr Gly Tyr Glu Cys Gly Arg Trp Gly Cys Gly His Phe
100 105 110
Leu Asn Ser Gly Pro Asn Ile Ser Pro Tyr Val Ser Thr His Lys Tyr
115 120 125
Glu Trp Tyr Val Asp Ala Lys Asn Met Val Tyr Leu Gln Met His Ser
130 135 140
Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Ala Gly Thr Gly
145 150 155 160
Trp Ser Pro Gln Thr Asp Asn Glu Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
165 170 175
Gln Val Thr Val Ser Ser
180
<210> 480
<211> 171
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hC3nb1-K149
<400> 480
Gln Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Leu Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Thr Ile Asn Arg Ser Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Thr Ser Val Leu Gln
65 70 75 80
Ser Thr Lys Pro Gln Lys Ser Cys Pro Asp Gly Phe Ser Tyr Arg Ser
85 90 95
Trp Asp Asp Phe Cys Cys Pro Met Val Gly Arg Cys Leu Ala Pro Arg
100 105 110
Asn Thr Tyr Thr Thr Glu Phe Thr Ile Glu Ala Lys Asn Met Val Tyr
115 120 125
Leu Gln Met His Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
130 135 140
Ala Ala Gly Thr Gly Trp Ser Pro Gln Thr Asp Asn Glu Tyr Asn Tyr
145 150 155 160
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
165 170
<210> 481
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> K57凸起结构域 peptide
<400> 481
Gly Cys Pro Pro Gly Tyr Lys Ser Gly Val Asp Cys Ser Pro Gly Ser
1 5 10 15
Glu Cys Lys Trp Gly Cys Tyr Ala Val Asp Gly Arg Arg Tyr Gly Gly
20 25 30
Tyr Gly Ala Asp Ser Gly Val Gly Ser
35 40
<210> 482
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 482
ctcgcggccc agccggccat ggccactact gtgcaccaaa aaaca 45
<210> 483
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 483
ctcgcggccc agccggccat ggccactact gtgcaccaaa gaacc 45
<210> 484
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 484
ctcgcggccc agccggccat ggccactact gtgcaccaaa aaacg 45
<210> 485
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 485
ctcgcggccc agccggccat ggccactact gtgcaccaac aaact 45
<210> 486
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 486
ctcgcggccc agccggccat ggccactact gtgcaccaac agacc 45
<210> 487
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 487
ctcgcggccc agccggccat ggccactact gtggtccaga aaaca 45
<210> 488
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 488
ctcgcggccc agccggccat ggccactact gtagtccaac gaaca 45
<210> 489
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 489
tgatgggcgg ccgcggcatc gacgtaccat tcgta 35
<210> 490
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 490
tgatgggcgg ccgcggtatc gacgtaccat tcgta 35
<210> 491
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 491
tgatgggcgg ccgcggcttc gacgtacaat tcgta 35
<210> 492
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 492
tgatgggcgg ccgcggcatt gacgtagaat tcgta 35
<210> 493
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 493
tgatgggcgg ccgcggcctc gatgtcaaat tcgta 35
<210> 494
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 494
tgatgggcgg ccgcggtttc gacgtggtat tcgta 35
<210> 495
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 495
gttggccgat tcattaatgc ag 22
<210> 496
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 496
acagacagcc ctcatagtta gc 22
<210> 497
<211> 62
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-血清白蛋白超长CDR-H3
<400> 497
Thr Thr Val His Gln Lys Thr Thr Arg Gln Thr Ser Cys Pro Asp Gly
1 5 10 15
Tyr Ile Ala Gly Asp Ser Ser Cys Tyr Arg Trp Arg Cys Arg Gly Asn
20 25 30
Asn Cys Cys Lys Tyr Gly Glu Asn Arg Leu Leu Asn Tyr Tyr Asp Tyr
35 40 45
Thr Cys Val Pro Tyr Arg Asp Thr Tyr Glu Trp Tyr Val Asp
50 55 60
<210> 498
<211> 63
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-血清白蛋白超长CDR-H3
<400> 498
Thr Thr Val His Gln Gln Thr His Gln Asp Gln Thr Cys Pro Asp Gly
1 5 10 15
Tyr Thr Arg Thr Asn Tyr Tyr Cys Arg Arg Asp Gly Cys Gly Ser Trp
20 25 30
Cys Asn Gly Ala Glu Arg Gln Gln Pro Cys Ile Arg Gly Pro Cys Cys
35 40 45
Cys Asp Leu Thr Tyr Arg Thr Ala Tyr Glu Tyr His Val Glu Thr
50 55 60
<210> 499
<211> 54
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-血清白蛋白超长CDR-H3
<400> 499
Thr Thr Val His Gln Gln Thr Gln Lys His Cys Pro Asp Asp Asp Thr
1 5 10 15
Asp Arg Asp Gly Cys Ser Arg Pro Asp Ser Arg Gly Gly Ser Gly Cys
20 25 30
Gly Ser Tyr Gly Arg Tyr Gly Asp Gln Gly Gly Ala Cys Cys Pro Leu
35 40 45
Thr Tyr Glu Phe Asp Val
50
<210> 500
<211> 55
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-血清白蛋白超长CDR-H3
<400> 500
Thr Thr Val His Gln Gln Thr Gln Glu Arg Cys Pro Asp Asp Tyr Thr
1 5 10 15
Asp Arg Gly Gly Cys Ser Ile Pro Tyr Asn Cys Gly Gly Ser Arg Cys
20 25 30
Cys Ala Tyr Gly Arg Asn Gly Gly Tyr Gly Gly Ile Ser Cys Ser Arg
35 40 45
Thr Tyr Glu Phe Tyr Val Asn
50 55
<210> 501
<211> 55
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-血清白蛋白超长CDR-H3
<400> 501
Thr Thr Val His Gln Gln Thr Gln Glu Arg Cys Pro Asp Asp Tyr Thr
1 5 10 15
Asp Arg Gly Gly Cys Ser Ile Pro Tyr Asn Cys Gly Gly Ser Arg Cys
20 25 30
Cys Ala Tyr Gly Arg Asn Gly Gly Tyr Gly Gly Asn Thr Cys Ser Arg
35 40 45
Thr Tyr Glu Leu Tyr Val Glu
50 55
<210> 502
<211> 55
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-血清白蛋白超长CDR-H3
<400> 502
Thr Thr Val His Gln Gln Thr Gln Glu Arg Cys Pro Asp Asp Tyr Thr
1 5 10 15
Asp Arg Gly Gly Cys Ser Ile Pro Tyr Thr Cys Gly Gly Ser Arg Cys
20 25 30
Cys Ala Tyr Gly Arg Asn Gly Gly Tyr Gly Gly Val Ser Cys Ser Arg
35 40 45
Thr Tyr Glu Phe Tyr Val Asn
50 55
<210> 503
<211> 55
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-血清白蛋白超长CDR-H3
<400> 503
Thr Thr Val His Gln Gln Thr Gln Glu Arg Cys Pro Asp Asp Tyr Thr
1 5 10 15
Asp Arg Gly Gly Cys Ser Ile Pro Tyr Asn Cys Gly Gly Ser Arg Cys
20 25 30
Cys Ala Tyr Gly Arg Asn Gly Gly Tyr Gly Gly Ile Ser Cys Ser Arg
35 40 45
Thr Tyr Glu Trp Tyr Val Asp
50 55
<210> 504
<211> 55
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-血清白蛋白超长CDR-H3
<400> 504
Thr Thr Val His Gln Gln Thr Gln Glu Arg Cys Pro Asp Asp Tyr Thr
1 5 10 15
Asp Arg Gly Gly Cys Ser Ile Pro Tyr Ser Cys Gly Asp Ser Arg Cys
20 25 30
Cys Ala Tyr Gly Arg Asn Gly Gly Tyr Gly Gly Val Ser Cys Ser Arg
35 40 45
Thr Tyr Glu Phe Tyr Val Asn
50 55
<210> 505
<211> 55
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-血清白蛋白超长CDR-H3
<400> 505
Thr Thr Val His Gln Gln Thr Gln Glu Arg Cys Pro Asp Asp Tyr Thr
1 5 10 15
Asp Arg Gly Gly Cys Ser Ile Pro Tyr Asn Cys Gly Gly Ser Arg Cys
20 25 30
Cys Ala Tyr Gly Arg Tyr Gly Asp Tyr Gly Gly Ile Ser Cys Ser Arg
35 40 45
Thr Tyr Glu Phe Tyr Val Asn
50 55
<210> 506
<211> 55
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-血清白蛋白超长CDR-H3
<400> 506
Thr Thr Val His Gln Gln Thr Gln Glu Arg Cys Pro Asp Asp Tyr Thr
1 5 10 15
Asp Arg Gly Gly Cys Ser Ile Pro Tyr Asn Cys Gly Gly Ser Arg Cys
20 25 30
Cys Ala Tyr Gly Arg Asn Gly Gly Tyr Gly Gly Val Ser Cys Ser Arg
35 40 45
Thr Tyr Glu Phe Tyr Val Asn
50 55
<210> 507
<211> 55
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-血清白蛋白超长CDR-H3
<400> 507
Thr Thr Val His Gln Gln Thr Gln Glu Arg Cys Pro Asp Asn Tyr Thr
1 5 10 15
Asp Arg Gly Gly Cys Ser Ile Pro Tyr Ser Cys Gly Asp Ser Arg Cys
20 25 30
Cys Ala Tyr Gly Arg Asn Gly Gly Tyr Gly Gly Val Ser Cys Ser Arg
35 40 45
Thr Tyr Glu Phe Tyr Val Asn
50 55
<210> 508
<211> 55
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-血清白蛋白超长CDR-H3
<400> 508
Thr Thr Val His Gln Gln Thr Gln Glu Arg Cys Pro Asp Asn Tyr Thr
1 5 10 15
Asp Arg Gly Gly Cys Ser Ile Pro Tyr Thr Cys Gly Gly Ser Arg Cys
20 25 30
Cys Ala Tyr Gly Arg Asn Gly Gly Tyr Gly Gly Val Ser Cys Ser Arg
35 40 45
Thr Tyr Glu Phe Tyr Val Asn
50 55
<210> 509
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-血清白蛋白超长CDR-H3凸起结构域
<400> 509
Ser Cys Pro Asp Gly Tyr Ile Ala Gly Asp Ser Ser Cys Tyr Arg Trp
1 5 10 15
Arg Cys Arg Gly Asn Asn Cys Cys Lys Tyr Gly Glu Asn Arg Leu Leu
20 25 30
Asn Tyr Tyr Asp Tyr Thr Cys Val Pro Tyr Arg Asp Thr
35 40 45
<210> 510
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-血清白蛋白超长CDR-H3凸起结构域
<400> 510
Thr Cys Pro Asp Gly Tyr Thr Arg Thr Asn Tyr Tyr Cys Arg Arg Asp
1 5 10 15
Gly Cys Gly Ser Trp Cys Asn Gly Ala Glu Arg Gln Gln Pro Cys Ile
20 25 30
Arg Gly Pro Cys Cys Cys Asp Leu Thr Tyr Arg Thr Ala
35 40 45
<210> 511
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-血清白蛋白超长CDR-H3凸起结构域
<400> 511
His Cys Pro Asp Asp Asp Thr Asp Arg Asp Gly Cys Ser Arg Pro Asp
1 5 10 15
Ser Arg Gly Gly Ser Gly Cys Gly Ser Tyr Gly Arg Tyr Gly Asp Gln
20 25 30
Gly Gly Ala Cys Cys Pro Leu Thr
35 40
<210> 512
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-血清白蛋白超长CDR-H3凸起结构域
<400> 512
Arg Cys Pro Asp Asp Tyr Thr Asp Arg Gly Gly Cys Ser Ile Pro Tyr
1 5 10 15
Asn Cys Gly Gly Ser Arg Cys Cys Ala Tyr Gly Arg Asn Gly Gly Tyr
20 25 30
Gly Gly Ile Ser Cys Ser Arg Thr
35 40
<210> 513
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-血清白蛋白超长CDR-H3凸起结构域
<400> 513
Arg Cys Pro Asp Asp Tyr Thr Asp Arg Gly Gly Cys Ser Ile Pro Tyr
1 5 10 15
Asn Cys Gly Gly Ser Arg Cys Cys Ala Tyr Gly Arg Asn Gly Gly Tyr
20 25 30
Gly Gly Asn Thr Cys Ser Arg Thr
35 40
<210> 514
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-血清白蛋白超长CDR-H3凸起结构域
<400> 514
Arg Cys Pro Asp Asp Tyr Thr Asp Arg Gly Gly Cys Ser Ile Pro Tyr
1 5 10 15
Thr Cys Gly Gly Ser Arg Cys Cys Ala Tyr Gly Arg Asn Gly Gly Tyr
20 25 30
Gly Gly Val Ser Cys Ser Arg Thr
35 40
<210> 515
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-血清白蛋白超长CDR-H3凸起结构域
<400> 515
Arg Cys Pro Asp Asp Tyr Thr Asp Arg Gly Gly Cys Ser Ile Pro Tyr
1 5 10 15
Asn Cys Gly Gly Ser Arg Cys Cys Ala Tyr Gly Arg Asn Gly Gly Tyr
20 25 30
Gly Gly Ile Ser Cys Ser Arg Thr
35 40
<210> 516
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-血清白蛋白超长CDR-H3凸起结构域
<400> 516
Arg Cys Pro Asp Asp Tyr Thr Asp Arg Gly Gly Cys Ser Ile Pro Tyr
1 5 10 15
Ser Cys Gly Asp Ser Arg Cys Cys Ala Tyr Gly Arg Asn Gly Gly Tyr
20 25 30
Gly Gly Val Ser Cys Ser Arg Thr
35 40
<210> 517
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-血清白蛋白超长CDR-H3凸起结构域
<400> 517
Arg Cys Pro Asp Asp Tyr Thr Asp Arg Gly Gly Cys Ser Ile Pro Tyr
1 5 10 15
Asn Cys Gly Gly Ser Arg Cys Cys Ala Tyr Gly Arg Tyr Gly Asp Tyr
20 25 30
Gly Gly Ile Ser Cys Ser Arg Thr
35 40
<210> 518
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-血清白蛋白超长CDR-H3凸起结构域
<400> 518
Arg Cys Pro Asp Asp Tyr Thr Asp Arg Gly Gly Cys Ser Ile Pro Tyr
1 5 10 15
Asn Cys Gly Gly Ser Arg Cys Cys Ala Tyr Gly Arg Asn Gly Gly Tyr
20 25 30
Gly Gly Val Ser Cys Ser Arg Thr
35 40
<210> 519
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-血清白蛋白超长CDR-H3凸起结构域
<400> 519
Arg Cys Pro Asp Asn Tyr Thr Asp Arg Gly Gly Cys Ser Ile Pro Tyr
1 5 10 15
Ser Cys Gly Asp Ser Arg Cys Cys Ala Tyr Gly Arg Asn Gly Gly Tyr
20 25 30
Gly Gly Val Ser Cys Ser Arg Thr
35 40
<210> 520
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-血清白蛋白超长CDR-H3凸起结构域
<400> 520
Arg Cys Pro Asp Asn Tyr Thr Asp Arg Gly Gly Cys Ser Ile Pro Tyr
1 5 10 15
Thr Cys Gly Gly Ser Arg Cys Cys Ala Tyr Gly Arg Asn Gly Gly Tyr
20 25 30
Gly Gly Val Ser Cys Ser Arg Thr
35 40
<210> 521
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-C5 超长CDR-H3
<400> 521
Thr Thr Val His Gln Lys Thr Lys Lys Thr Cys Pro Leu Gly Tyr Asn
1 5 10 15
Leu Asn Asp Arg Cys Asp His Phe Asn Thr Cys Arg Val Glu Lys Cys
20 25 30
Cys Gln Asn Gly Val Val Asn Ala Tyr Gly Ile Cys Glu Tyr Ala Gly
35 40 45
Gly Asn Ala Thr Tyr Thr Tyr Gln Trp Tyr Val His
50 55 60
<210> 522
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-C5 超长CDR-H3
<400> 522
Thr Thr Val His Gln Arg Thr Lys Lys Thr Cys Pro Leu Gly Tyr Ala
1 5 10 15
Ile Asn Asp Arg Cys Asp Asp Leu Lys Thr Cys Gly Pro Asp Glu Cys
20 25 30
Cys Leu Asn Gly Val Val Asn Ala Tyr Gly Ile Cys Glu Tyr Glu Gly
35 40 45
Glu Ser Ala Thr His Thr Tyr Glu Trp Tyr Val Asp
50 55 60
<210> 523
<211> 55
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-C5 超长CDR-H3
<400> 523
Thr Thr Val His Gln Lys Thr Glu Pro Ser Cys Pro Tyr Gly Tyr Ile
1 5 10 15
Tyr Thr Gly Gly Cys His Thr Thr Tyr Gly Cys Gly Asn Tyr Val Cys
20 25 30
Tyr Pro Gly Ser Gly Pro Pro Arg Val Gly Asp Val Ser Val Ser Tyr
35 40 45
Thr Tyr Glu Trp Tyr Val Asp
50 55
<210> 524
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-C5 超长CDR-H3
<400> 524
Thr Thr Val His Gln Arg Thr Lys Lys Thr Cys Pro Leu Gly Tyr Asp
1 5 10 15
Leu Asn Asp Arg Cys Asp His Phe Asn Thr Cys Arg Val Glu Glu Cys
20 25 30
Cys Lys Asn Gly Val Val Asn Ala Tyr Gly Ile Cys Glu Tyr Ala Gly
35 40 45
Gly Ser Ala Thr Tyr Thr Tyr Glu Leu Tyr Val Glu
50 55 60
<210> 525
<211> 62
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-C5 超长CDR-H3
<400> 525
Thr Thr Val Val Gln Lys Thr Gln Lys Ser Glu Ala Leu Cys Pro Asp
1 5 10 15
Gly Tyr Thr Arg Ser Gly Arg Pro Gly Cys Tyr Tyr Gly Cys Pro Asp
20 25 30
Ser Thr Cys Cys Ser Arg Thr Arg Thr Leu His Val Ser Glu His Cys
35 40 45
Ile Ala Pro Ala Tyr Thr Tyr Asn Tyr Glu Trp Tyr Val Asp
50 55 60
<210> 526
<211> 54
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-C5 超长CDR-H3
<400> 526
Thr Thr Val His Gln Arg Thr Leu Lys Asn Arg Asn Cys Pro Asp Gly
1 5 10 15
Tyr Gly Tyr Gln Arg His Cys Thr Val Gly Glu Asp Cys Thr Glu Gly
20 25 30
Cys Cys Asp Asn Tyr Gly Arg Cys Thr Thr Tyr Thr Asp Thr Tyr Thr
35 40 45
Tyr Glu Leu Tyr Val Glu
50
<210> 527
<211> 62
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-C5 超长CDR-H3
<400> 527
Thr Thr Val His Gln Lys Thr Asn Arg Gln Glu Ser Cys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Gly Asp Arg Thr Ile Cys Glu Arg Ser Trp Ser Cys Gly Gly Tyr
20 25 30
His Cys Ser Ala Tyr Asp Thr Trp Gly Ala Gly Gly Ser Ser Asp Cys
35 40 45
Gly Thr Cys Thr Tyr Thr Tyr Thr Tyr Glu Trp Tyr Val Asp
50 55 60
<210> 528
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-C5 超长CDR-H3
<400> 528
Thr Thr Val His Gln Arg Thr Lys Lys Thr Cys Pro Leu Gly Tyr Asp
1 5 10 15
Leu Asn Asp Arg Cys Asp His Phe Asn Thr Cys Arg Val Glu Glu Cys
20 25 30
Cys Lys Asn Gly Val Val Asn Ala Tyr Gly Ile Cys Glu Tyr Ala Gly
35 40 45
Gly Ser Ala Thr Tyr Thr Tyr Lys Trp Tyr Val Asp
50 55 60
<210> 529
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-C5 超长CDR-H3
<400> 529
Thr Thr Val His Gln Arg Thr Val Lys Ser Gly Arg Pro Pro Gly Thr
1 5 10 15
Val Ala Gly Val His Cys Ser Pro Gly Ser Asp Cys Ser Trp Gly Cys
20 25 30
Tyr Asp Arg Asp Asp Arg Arg Val Asp Gly Ala Gly Ala Asp Ser Gly
35 40 45
Leu Gly Ser Thr Ser Thr Tyr Glu Phe Tyr Val Asn
50 55 60
<210> 530
<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-C5 超长CDR-H3
<400> 530
Thr Thr Val His Gln Gln Thr Asn Leu Arg Gln Arg Ser Cys Pro Asp
1 5 10 15
Gly Tyr Lys Asp Asn Arg Phe Cys Ser Pro Asp Gly Gly Cys Ser Ala
20 25 30
Val Ser His Trp Gly Trp Asp Ser Ser Cys Val Ser Tyr Thr Tyr Thr
35 40 45
Asp Thr Tyr Glu Trp Tyr Val Asp
50 55
<210> 531
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-C5 超长CDR-H3
<400> 531
Thr Thr Val His Gln Arg Thr Val Lys Ser Gly Cys Pro Thr Gly Thr
1 5 10 15
Val Ala Gly Val His Cys Ser Pro Gly Ser Asp Cys Ser Trp Gly Cys
20 25 30
Tyr Asp Lys Asp Asp Arg Arg Val Asp Gly Ala Gly Val Ala Ser Gly
35 40 45
Leu Gly Ser Thr Tyr Thr Tyr Glu Phe Tyr Val Asn
50 55 60
<210> 532
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-C5 超长CDR-H3
<400> 532
Thr Thr Val His Gln Arg Thr Ile Lys Ser Gly Cys Pro Pro Gly Tyr
1 5 10 15
Lys Ser Gly Val Asp Cys Ser Pro Gly Ser Glu Cys Lys Trp Gly Cys
20 25 30
Tyr Ala Val Asp Gly Arg Arg Tyr Gly Gly Tyr Gly Ala Asp Ser Gly
35 40 45
Val Gly Ser Thr Tyr Thr His Glu Phe Tyr Val Asn
50 55 60
<210> 533
<211> 61
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-C5 超长CDR-H3
<400> 533
Thr Thr Val Val Gln Arg Thr His Lys Thr Thr Ser Cys Pro Asp Gly
1 5 10 15
Tyr His Phe Ile Glu Pro Cys His Ser Gly Leu Cys Trp Arg Glu Gly
20 25 30
Ala Cys Asn Gly Asp Gly Ile Cys Ala Asn Gly Leu Gly Arg Cys Arg
35 40 45
Thr Val Ser Glu Thr Ser Thr Tyr Glu Leu Tyr Val Glu
50 55 60
<210> 534
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-C5 超长CDR-H3
<400> 534
Thr Thr Val His Gln Arg Thr Val Lys Ser Gly Cys Pro Thr Gly Thr
1 5 10 15
Val Ala Gly Val His Cys Ser Pro Gly Ser Asp Cys Ser Trp Gly Cys
20 25 30
Tyr Asp Lys Asp Asp Arg Arg Val Asp Gly Ala Gly Ala Ala Ser Gly
35 40 45
Leu Gly Ser Thr Tyr Thr Tyr Glu Tyr His Val Glu
50 55 60
<210> 535
<211> 61
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-C5 超长CDR-H3
<400> 535
Thr Thr Val His Gln Lys Thr Arg Ser Arg Cys Pro Asp Gly Cys Phe
1 5 10 15
Leu Ser Ser Tyr Cys Pro Val Gly Tyr Ala Cys Ser Gly Phe Ala Cys
20 25 30
Cys Asp Cys Gly Gly Tyr Asp Tyr Ala Gly Gly Val Arg Gly Gly Arg
35 40 45
Cys Ser Val Arg Ser Thr Thr Tyr Glu Trp Tyr Val Asp
50 55 60
<210> 536
<211> 56
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-C5 超长CDR-H3
<400> 536
Thr Thr Val His Gln Gln Thr Asn Lys Arg Arg Gln Asn Cys Pro Asp
1 5 10 15
Gly Tyr Lys Tyr Asn Gly Phe Cys Thr Pro Asp Gly Gly Cys Ser Arg
20 25 30
Val Ser Ser Trp Gly Trp Asp Arg Ser Cys Ile Ser Pro Thr Tyr Thr
35 40 45
Tyr Thr Tyr Glu Trp Tyr Val Asp
50 55
<210> 537
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-C5 超长CDR-H3
<400> 537
Thr Thr Val His Gln Arg Thr Val Lys Ser Gly Cys Pro Pro Gly Thr
1 5 10 15
Val Ala Gly Val His Cys Ser Pro Gly Ser Asp Cys Ser Trp Gly Cys
20 25 30
Tyr Asp Arg Asp Asp Arg Arg Val Asp Gly Ala Gly Ala Asp Ser Gly
35 40 45
Leu Gly Ser Thr Ser Thr Tyr Glu Phe Tyr Val Asn
50 55 60
<210> 538
<211> 61
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-C5 超长CDR-H3
<400> 538
Thr Thr Val Val Gln Arg Thr His Lys Lys Thr Ser Cys Pro Asp Gly
1 5 10 15
Tyr His Phe Ile Glu Pro Cys His Ser Gly Leu Cys Trp Arg Glu Gly
20 25 30
Ala Cys Asn Gly Asp Gly Ile Cys Ala Asn Gly Leu Gly Arg Cys Arg
35 40 45
Thr Val Ser Glu Thr Ser Thr Tyr Glu Phe Tyr Val Asn
50 55 60
<210> 539
<211> 61
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-C5 超长CDR-H3
<400> 539
Thr Thr Val Val Gln Arg Thr His Lys Thr Thr Ser Cys Pro Asp Gly
1 5 10 15
Tyr His Phe Ile Glu Pro Cys His Ser Gly Leu Cys Trp Arg Glu Gly
20 25 30
Ala Cys Asn Gly Asp Gly Ile Cys Ala Asn Gly Leu Gly Arg Cys Arg
35 40 45
Thr Val Ser Glu Thr Ser Thr Tyr Glu Trp Tyr Val Asp
50 55 60
<210> 540
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-C5 超长CDR-H3
<400> 540
Thr Thr Val His Gln Arg Thr Val Lys Ser Gly Cys Pro Thr Gly Thr
1 5 10 15
Val Ala Gly Val His Cys Ser Pro Gly Ser Asp Cys Ser Trp Gly Cys
20 25 30
Tyr Asp Ala Asp Asp Arg Arg Val Asp Gly Tyr Gly Ala Asp Ser Gly
35 40 45
Val Gly Ser Pro Tyr Thr Tyr Glu Tyr His Val Glu
50 55 60
<210> 541
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-C5 超长CDR-H3
<400> 541
Thr Thr Val His Gln Arg Thr Ile Lys Ser Gly Cys Pro Pro Gly Tyr
1 5 10 15
Lys Ser Gly Val Asp Cys Ser Pro Gly Ser Glu Cys Lys Trp Gly Cys
20 25 30
Tyr Ala Val Asp Gly Arg Arg Tyr Gly Gly Tyr Gly Ala Asp Ser Gly
35 40 45
Val Gly Ser Thr Tyr Thr His Glu Tyr His Val Glu
50 55 60
<210> 542
<211> 61
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-C5 超长CDR-H3
<400> 542
Thr Thr Val Val Gln Arg Thr His Lys Thr Thr Ser Cys Pro Asp Gly
1 5 10 15
Tyr His Phe Ile Glu Pro Cys His Ser Gly Leu Cys Trp Arg Glu Gly
20 25 30
Ala Cys Asn Gly Asp Gly Ile Cys Ala Asn Gly Leu Gly Arg Cys Arg
35 40 45
Thr Val Ser Glu Thr Ser Thr Tyr Glu Phe Tyr Val Asn
50 55 60
<210> 543
<211> 54
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-C5 超长CDR-H3
<400> 543
Thr Thr Val His Gln Arg Thr Leu Lys Asn Arg Asn Cys Pro Asp Gly
1 5 10 15
Tyr Gly Tyr Gln Arg His Cys Thr Val Gly Glu Asp Cys Thr Asp His
20 25 30
Cys Cys Asp Ala Tyr Gly Leu Cys Thr Ser Tyr Thr Tyr Thr Tyr Thr
35 40 45
Tyr Glu Trp Tyr Val Asp
50
<210> 544
<211> 54
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-C5 超长CDR-H3
<400> 544
Thr Thr Val His Gln Arg Thr Leu Lys Asn Arg Asn Cys Pro Asp Gly
1 5 10 15
Tyr Gly Tyr Gln Arg His Cys Thr Val Gly Glu Asp Cys Thr Asp Ser
20 25 30
Cys Cys Asp Arg Tyr Gly Leu Cys Thr Thr Ser Thr Glu Thr Tyr Thr
35 40 45
Tyr Glu Leu Tyr Val Glu
50
<210> 545
<211> 54
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-C5 超长CDR-H3
<400> 545
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1 5 10 15
Tyr Gly Tyr Gln Arg His Cys Thr Val Gly Glu Glu Cys Thr Asp Ser
20 25 30
Cys Cys Asp Arg Tyr Gly Leu Cys Thr Thr Ser Thr Glu Thr Tyr Thr
35 40 45
Tyr Glu Trp Tyr Val Asp
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<213> 人工序列
<220>
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<400> 546
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1 5 10 15
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20 25 30
Cys Lys Asn Gly Val Val Asn Ala Tyr Gly Ile Cys Glu Tyr Ala Gly
35 40 45
Gly Ser Ala Thr Tyr Thr Tyr Glu Trp Tyr Val Glu
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<213> 人工序列
<220>
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1 5 10 15
Tyr Gly Tyr Gln Arg His Cys Thr Val Gly Glu Asp Cys Thr Asp Ser
20 25 30
Cys Cys Asp Arg Tyr Gly Leu Cys Thr Thr Ser Thr Glu Thr Tyr Thr
35 40 45
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<213> 人工序列
<220>
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1 5 10 15
Tyr Gly Tyr Gln Arg His Cys Thr Val Gly Glu Asp Cys Thr Asp Ser
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Cys Cys Asp Arg Tyr Gly Leu Cys Thr Thr Ser Thr Glu Thr Tyr Thr
35 40 45
Tyr Glu Trp Tyr Val Asp
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<213> 人工序列
<220>
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1 5 10 15
Tyr Gly Tyr Gln Arg His Cys Thr Val Gly Glu Asp Cys Thr Asp Ser
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Cys Cys Asp Arg Tyr Gly Leu Cys Thr Thr Ser Thr Glu Thr Tyr Thr
35 40 45
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<213> 人工序列
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Tyr Gly Tyr Gln Arg His Cys Thr Val Gly Glu Asp Cys Thr Glu Arg
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Cys Cys Asp Asn Tyr Gly Leu Cys Thr Ser Tyr Thr Asp Thr Tyr Thr
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Thr Thr Val His Gln Lys Thr Lys Lys Thr Cys Pro Arg Gly Tyr His
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Cys Leu Asn Gly Val Val Asn Thr Tyr Gly Ile Cys Glu Tyr Glu Gly
35 40 45
Gly Ser Ala Thr Tyr Thr Tyr Glu Trp Tyr Val Asp
50 55 60
<210> 555
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-C5 超长CDR-H3
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Thr Thr Val His Gln Lys Thr Lys Lys Thr Cys Pro Arg Gly Tyr His
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<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-C5 超长CDR-H3
<400> 560
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<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-C5 超长CDR-H3
<400> 561
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<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-C5 超长CDR-H3
<400> 562
Thr Thr Val His Gln Gln Thr Thr Lys Lys Ser Ser Cys Pro Asp Gly
1 5 10 15
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<220>
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<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-C5 超长CDR-H3
<400> 564
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-C5 超长CDR-H3
<400> 565
Thr Thr Val His Gln Arg Thr Ile Lys Ser Gly Cys Pro Pro Gly Tyr
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-C5 超长CDR-H3
<400> 566
Thr Thr Val Val Gln Arg Thr Lys Arg Thr Cys Pro Glu Gly Leu Val
1 5 10 15
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50
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<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-C5 超长CDR-H3
<400> 567
Thr Thr Val His Gln Arg Thr Thr Lys Arg Cys Pro Ser Asn Asn Glu
1 5 10 15
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<211> 62
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-C5 超长CDR-H3
<400> 568
Thr Thr Val Val Gln Arg Thr Arg Lys Ile Val Thr Cys Pro Asp Gly
1 5 10 15
Tyr Ser Tyr Ser Glu Gly Cys Gly Lys Gly Asp Asp Cys Gly Gly Val
20 25 30
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<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-C5 超长CDR-H3
<400> 569
Thr Thr Val His Gln Arg Thr Ala Lys Arg Cys Pro Ser Asn Asn Glu
1 5 10 15
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Tyr Ala Cys Arg Asp Ser Tyr Glu Trp Tyr Val Asp
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-C5 超长CDR-H3
<400> 570
Thr Thr Val His Gln Arg Thr Ile Lys Ser Gly Cys Pro Pro Gly Tyr
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20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
<210> 571
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-C5 超长CDR-H3
<400> 571
Thr Thr Val His Gln Arg Thr Ile Lys Ser Gly Cys Pro Pro Gly Tyr
1 5 10 15
Lys Ser Gly Val Asp Cys Ser Pro Gly Ser Glu Cys Lys Trp Gly Cys
20 25 30
Tyr Ala Val Asp Gly Arg Arg Tyr Gly Gly Tyr Gly Ala Asp Ser Gly
35 40 45
Val Gly Ser Thr Tyr Thr His Glu Trp Tyr Val Asp
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<210> 572
<211> 43
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-C5 超长CDR-H3凸起结构域
<400> 572
Thr Cys Pro Leu Gly Tyr Asn Leu Asn Asp Arg Cys Asp His Phe Asn
1 5 10 15
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20 25 30
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35 40
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-C5 超长CDR-H3凸起结构域
<400> 573
Thr Cys Pro Leu Gly Tyr Ala Ile Asn Asp Arg Cys Asp Asp Leu Lys
1 5 10 15
Thr Cys Gly Pro Asp Glu Cys Cys Leu Asn Gly Val Val Asn Ala Tyr
20 25 30
Gly Ile Cys Glu Tyr Glu Gly Glu Ser Ala Thr
35 40
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<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-C5 超长CDR-H3凸起结构域
<400> 574
Ser Cys Pro Tyr Gly Tyr Ile Tyr Thr Gly Gly Cys His Thr Thr Tyr
1 5 10 15
Gly Cys Gly Asn Tyr Val Cys Tyr Pro Gly Ser Gly Pro Pro Arg Val
20 25 30
Gly Asp Val Ser Val Ser
35
<210> 575
<211> 43
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-C5 超长CDR-H3凸起结构域
<400> 575
Thr Cys Pro Leu Gly Tyr Asp Leu Asn Asp Arg Cys Asp His Phe Asn
1 5 10 15
Thr Cys Arg Val Glu Glu Cys Cys Lys Asn Gly Val Val Asn Ala Tyr
20 25 30
Gly Ile Cys Glu Tyr Ala Gly Gly Ser Ala Thr
35 40
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<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-C5 超长CDR-H3凸起结构域
<400> 576
Leu Cys Pro Asp Gly Tyr Thr Arg Ser Gly Arg Pro Gly Cys Tyr Tyr
1 5 10 15
Gly Cys Pro Asp Ser Thr Cys Cys Ser Arg Thr Arg Thr Leu His Val
20 25 30
Ser Glu His Cys Ile Ala Pro Ala
35 40
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<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-C5 超长CDR-H3凸起结构域
<400> 577
Asn Cys Pro Asp Gly Tyr Gly Tyr Gln Arg His Cys Thr Val Gly Glu
1 5 10 15
Asp Cys Thr Glu Gly Cys Cys Asp Asn Tyr Gly Arg Cys Thr Thr Tyr
20 25 30
Thr Asp
<210> 578
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-C5 超长CDR-H3凸起结构域
<400> 578
Ser Cys Pro Gly Ser Ser Gly Asp Arg Thr Ile Cys Glu Arg Ser Trp
1 5 10 15
Ser Cys Gly Gly Tyr His Cys Ser Ala Tyr Asp Thr Trp Gly Ala Gly
20 25 30
Gly Ser Ser Asp Cys Gly Thr Cys Thr
35 40
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<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-C5 超长CDR-H3凸起结构域
<400> 579
His Cys Ser Pro Gly Ser Asp Cys Ser Trp Gly Cys Tyr Asp Arg Asp
1 5 10 15
Asp Arg Arg Val Asp Gly Ala Gly Ala Asp Ser Gly Leu Gly Ser Thr
20 25 30
Ser Thr
<210> 580
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-C5 超长CDR-H3凸起结构域
<400> 580
Ser Cys Pro Asp Gly Tyr Lys Asp Asn Arg Phe Cys Ser Pro Asp Gly
1 5 10 15
Gly Cys Ser Ala Val Ser His Trp Gly Trp Asp Ser Ser Cys Val Ser
20 25 30
<210> 581
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-C5 超长CDR-H3凸起结构域
<400> 581
His Cys Ser Pro Gly Ser Asp Cys Ser Trp Gly Cys Tyr Asp Lys Asp
1 5 10 15
Asp Arg Arg Val Asp Gly Ala Gly Val Ala Ser Gly Leu Gly Ser Thr
20 25 30
<210> 582
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-C5 超长CDR-H3凸起结构域
<400> 582
Gly Cys Pro Pro Gly Tyr Lys Ser Gly Val Asp Cys Ser Pro Gly Ser
1 5 10 15
Glu Cys Lys Trp Gly Cys Tyr Ala Val Asp Gly Arg Arg Tyr Gly Gly
20 25 30
Tyr Gly Ala Asp Ser Gly Val Gly Ser Thr
35 40
<210> 583
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-C5 超长CDR-H3凸起结构域
<400> 583
Ser Cys Pro Asp Gly Tyr His Phe Ile Glu Pro Cys His Ser Gly Leu
1 5 10 15
Cys Trp Arg Glu Gly Ala Cys Asn Gly Asp Gly Ile Cys Ala Asn Gly
20 25 30
Leu Gly Arg Cys Arg Thr Val Ser Glu Thr Ser Thr
35 40
<210> 584
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-C5 超长CDR-H3凸起结构域
<400> 584
Gly Cys Pro Thr Gly Thr Val Ala Gly Val His Cys Ser Pro Gly Ser
1 5 10 15
Asp Cys Ser Trp Gly Cys Tyr Asp Lys Asp Asp Arg Arg Val Asp Gly
20 25 30
Ala Gly Ala Ala Ser Gly Leu Gly Ser Thr
35 40
<210> 585
<211> 46
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-C5 超长CDR-H3凸起结构域
<400> 585
Arg Cys Pro Asp Gly Cys Phe Leu Ser Ser Tyr Cys Pro Val Gly Tyr
1 5 10 15
Ala Cys Ser Gly Phe Ala Cys Cys Asp Cys Gly Gly Tyr Asp Tyr Ala
20 25 30
Gly Gly Val Arg Gly Gly Arg Cys Ser Val Arg Ser Thr Thr
35 40 45
<210> 586
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-C5 超长CDR-H3凸起结构域
<400> 586
Asn Cys Pro Asp Gly Tyr Lys Tyr Asn Gly Phe Cys Thr Pro Asp Gly
1 5 10 15
Gly Cys Ser Arg Val Ser Ser Trp Gly Trp Asp Arg Ser Cys Ile Ser
20 25 30
Pro Thr
<210> 587
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-C5 超长CDR-H3凸起结构域
<400> 587
Gly Cys Pro Pro Gly Thr Val Ala Gly Val His Cys Ser Pro Gly Ser
1 5 10 15
Asp Cys Ser Trp Gly Cys Tyr Asp Arg Asp Asp Arg Arg Val Asp Gly
20 25 30
Ala Gly Ala Asp Ser Gly Leu Gly Ser Thr Ser Thr
35 40
<210> 588
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-C5 超长CDR-H3凸起结构域
<400> 588
Ser Cys Pro Asp Gly Tyr His Phe Ile Glu Pro Cys His Ser Gly Leu
1 5 10 15
Cys Trp Arg Glu Gly Ala Cys Asn Gly Asp Gly Ile Cys Ala Asn Gly
20 25 30
Leu Gly Arg Cys Arg Thr Val Ser Glu Thr Ser Thr
35 40
<210> 589
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-C5 超长CDR-H3凸起结构域
<400> 589
Gly Cys Pro Thr Gly Thr Val Ala Gly Val His Cys Ser Pro Gly Ser
1 5 10 15
Asp Cys Ser Trp Gly Cys Tyr Asp Ala Asp Asp Arg Arg Val Asp Gly
20 25 30
Tyr Gly Ala Asp Ser Gly Val Gly Ser Pro
35 40
<210> 590
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-C5 超长CDR-H3凸起结构域
<400> 590
Asn Cys Pro Asp Gly Tyr Gly Tyr Gln Arg His Cys Thr Val Gly Glu
1 5 10 15
Asp Cys Thr Asp His Cys Cys Asp Ala Tyr Gly Leu Cys Thr Ser
20 25 30
<210> 591
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-C5 超长CDR-H3凸起结构域
<400> 591
Asn Cys Pro Asp Gly Tyr Gly Tyr Gln Arg His Cys Thr Val Gly Glu
1 5 10 15
Asp Cys Thr Asp Ser Cys Cys Asp Arg Tyr Gly Leu Cys Thr Thr Ser
20 25 30
Thr Glu Thr
35
<210> 592
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-C5 超长CDR-H3凸起结构域
<400> 592
His Cys Thr Val Gly Glu Glu Cys Thr Asp Ser Cys Cys Asp Arg Tyr
1 5 10 15
Gly Leu Cys Thr Thr Ser Thr Glu Thr
20 25
<210> 593
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-C5 超长CDR-H3凸起结构域
<400> 593
Asn Cys Pro Asp Gly Tyr Gly Tyr Gln Arg His Cys Thr Val Gly Glu
1 5 10 15
Asp Cys Thr Glu Arg Cys Cys Asp Asn Tyr Gly Leu Cys Thr Ser Tyr
20 25 30
Thr Asp Thr
35
<210> 594
<211> 43
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-C5 超长CDR-H3凸起结构域
<400> 594
Thr Cys Pro Leu Gly Tyr Asp Leu Asn Tyr Arg Cys Asp His Phe Asn
1 5 10 15
Thr Cys Arg Val Glu Glu Cys Cys Lys Asn Gly Val Val Asn Ala Tyr
20 25 30
Gly Ile Cys Glu Tyr Ala Gly Gly Ser Ala Thr
35 40
<210> 595
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-C5 超长CDR-H3凸起结构域
<400> 595
Thr Cys Pro Ser Gly Cys Ser Trp Phe Ser Gly Cys Trp Asp Thr Tyr
1 5 10 15
Arg Cys Gly Pro Ser Val Cys Cys Arg Asp Gly Arg Tyr Gly Cys Ala
20 25 30
Ala Ile Ile Cys Arg Asp Thr
35
<210> 596
<211> 43
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-C5 超长CDR-H3凸起结构域
<400> 596
Thr Cys Pro Arg Gly Tyr His Tyr Asn Asp Arg Cys Glu Phe Phe Asn
1 5 10 15
Thr Cys Arg Val Glu Glu Cys Cys Leu Asn Gly Val Val Asn Thr Tyr
20 25 30
Gly Ile Cys Glu Tyr Glu Gly Gly Ser Ala Thr
35 40
<210> 597
<211> 43
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-C5 超长CDR-H3凸起结构域
<400> 597
Thr Cys Pro Arg Gly Tyr His Tyr Asn Asp Arg Cys Asp Phe Phe Asn
1 5 10 15
Thr Cys Arg Val Glu Glu Cys Cys Leu Asn Gly Val Val Asn Thr Tyr
20 25 30
Gly Ile Cys Glu Tyr Glu Gly Gly Ser Ala Thr
35 40
<210> 598
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-C5 超长CDR-H3凸起结构域
<400> 598
Ser Cys Pro Asp Gly Tyr Gly Tyr Gly Asp Gly Tyr Cys Tyr Asp Ser
1 5 10 15
Gly Cys Ser Ala Ser Asp Cys Tyr Gly Val Asp Ala Leu Tyr Ser Tyr
20 25 30
Gly His Cys Gly Cys Ser Ile Tyr Thr Glu Arg Pro Arg
35 40 45
<210> 599
<211> 43
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-C5 超长CDR-H3凸起结构域
<400> 599
Ser Cys Pro Leu Gly Tyr Ala Ile Asn Asp Arg Cys Asp Asp Leu Lys
1 5 10 15
Thr Cys Gly Pro Asp Glu Cys Cys Leu Asn Gly Val Val Asn Ala Tyr
20 25 30
Gly Ile Cys Glu Tyr Glu Gly Glu Ser Ala Thr
35 40
<210> 600
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-C5 超长CDR-H3凸起结构域
<400> 600
Arg Cys Pro Ser Asn Asn Glu Asp Ala Thr Ala Cys Arg Tyr Ser Ser
1 5 10 15
Val Cys Gly Asp Tyr Val Cys Glu Gly Leu Ser Glu Ser Tyr Ala Gln
20 25 30
Gly Trp Gly Ala Cys Arg Arg Tyr Ala Cys Arg Asp Ser
35 40 45
<210> 601
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-C5 超长CDR-H3凸起结构域
<400> 601
Asn Cys Pro Asp Gly Tyr Glu Tyr Asn Gly Phe Cys Thr Pro Asp Gly
1 5 10 15
Gly Cys Ser Arg Val Ser Asn Trp Gly Trp Asp Arg Ser Cys Ile Ser
20 25 30
Pro Thr
<210> 602
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-C5 超长CDR-H3凸起结构域
<400> 602
Ser Cys Pro Asp Gly Tyr Cys Asp Cys Asn Gly Cys Gly Tyr Gly Asn
1 5 10 15
Gly Cys Ser Arg Gly Gly Cys Phe Asp Phe Arg Leu Tyr Ser Gly Tyr
20 25 30
Ser Ala Asp Ile Val Val Ser Thr Thr
35 40
<210> 603
<211> 43
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-C5 超长CDR-H3凸起结构域
<400> 603
Ser Cys Pro Asp Gly Trp Gly His Ser Asp Asp Cys Asn Cys Ala Cys
1 5 10 15
Ser Ala Asn Ala Tyr Ala Cys Cys Lys Arg Asp Trp Leu Leu Pro Gly
20 25 30
Pro Ser Cys Glu Cys Ser Thr Tyr Cys Val Ser
35 40
<210> 604
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-C5 超长CDR-H3凸起结构域
<400> 604
Ser Cys Pro Asp Gly Trp Ser Asp Cys His Gly Ser Cys Asp Gly Val
1 5 10 15
Gly Cys Thr Gly Ser Asp Cys Val Arg Tyr Asn Ala Arg Gly Tyr Gly
20 25 30
Arg His Ala Cys Ser Gly
35
<210> 605
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-C5 超长CDR-H3凸起结构域
<400> 605
Gly Cys Pro Pro Gly Tyr Lys Ser Gly Val Asp Cys Ser Pro Gly Ser
1 5 10 15
Glu Cys Lys Trp Gly Cys Tyr Ala Val Asp Gly Arg Arg Tyr Gly Gly
20 25 30
Tyr Gly Ala Asp Ser Gly Val Gly Ser Thr
35 40
<210> 606
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-C5 超长CDR-H3凸起结构域
<400> 606
Thr Cys Pro Glu Gly Leu Val Tyr Asn Ser Asp Gln Ser Arg Cys Cys
1 5 10 15
Ala Ala Asp Ser Gly Val Cys Trp Glu Tyr Trp Arg Gly Glu Arg Val
20 25 30
Thr Arg Gly Phe Thr
35
<210> 607
<211> 43
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-C5 超长CDR-H3凸起结构域
<400> 607
Thr Cys Pro Asp Gly Tyr Ser Tyr Ser Glu Gly Cys Gly Lys Gly Asp
1 5 10 15
Asp Cys Gly Gly Val His Cys Cys Ala Asn Gly Gly Val Thr Cys Trp
20 25 30
Tyr Arg His Cys Cys Ser Thr Gly Thr Asp Thr
35 40
<210> 608
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-C5 超长CDR-H3凸起结构域
<400> 608
Arg Cys Pro Ser Asn Asn Glu Glu Ala Thr Ala Cys Arg Tyr Ser Ser
1 5 10 15
Val Cys Gly Asp Tyr Val Cys Glu Gly Leu Ser Glu Ser Tyr Ala Gln
20 25 30
Gly Trp Gly Ala Cys Arg Arg Tyr Ala Cys Arg Asp Ser
35 40 45
<210> 609
<211> 43
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-C5 超长CDR-H3凸起结构域
<400> 609
Ser Gly Cys Pro Pro Gly Tyr Lys Ser Gly Val Asp Cys Ser Pro Gly
1 5 10 15
Ser Glu Tyr Lys Trp Gly Cys Tyr Ala Val Asp Gly Arg Arg Tyr Gly
20 25 30
Gly Tyr Gly Ala Asp Ser Gly Val Gly Ser Thr
35 40

Claims (56)

1.一种分离的抗体片段，其中所述片段是牛超长CDR-H3的凸起结构域或其与目标抗原结合的部分。
2.根据权利要求1所述的分离的抗体片段，所述片段包含至少两个、或至少四个、或至少六个、或至少八个、或至少十个半胱氨酸残基。
3.根据权利要求1或2所述的分离的抗体片段，所述片段包含至少一个、或至少两个、或至少三个、或至少四个、或至少五个二硫键。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的分离的抗体片段，所述片段在其N末端包含(Z1)X1C X2基序，其中：
a.Z1存在或不存在，且当Z1存在时，Z1表示1个氨基酸或2、3、4或5个独立选择的氨基酸；以及
b.X1为任意氨基酸残基，优选地选自由以下组成的列表：丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、组氨酸、赖氨酸、缬氨酸、精氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和天冬氨酸；以及
c.C为半胱氨酸；以及
d.X2为选自由以下组成的列表的氨基酸：脯氨酸、精氨酸、组氨酸、赖氨酸、甘氨酸和丝氨酸。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的分离的抗体片段，其包含(AB)n和/或(BA)n基序，其中A为任意氨基酸残基，B为选自由以下组成的组的芳族氨基酸：酪氨酸(Y)、苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)和组氨酸(H)，并且其中n为1、2、3或4。
6.根据前述权利要求中任一项所述的分离的抗体片段，其长度为5个氨基酸或更多、长度为10个氨基酸或更多、长度为15个氨基酸或更多、长度为20个氨基酸或更多、长度为25个氨基酸或更多、长度为30个氨基酸或更多、长度为35个氨基酸或更多、长度为40个氨基酸或更多、长度为45个氨基酸或更多，并且其长度为至多55个氨基酸。
7.根据前述权利要求中任一项所述的分离的抗体片段，其长度为5至55个、或15至50个、或20至45个、或25至40个氨基酸。
8.根据前述权利要求中任一项所述的分离的抗体片段，其包含作为天然存在序列的变体的序列。
9.根据前述权利要求中任一项所述的分离的抗体片段，其进一步包含在两个氨基酸之间的桥接部分。
10.根据权利要求9所述的分离的抗体片段，其中所述桥接部分包含选自由以下组成的组的特征：二硫键、酰胺键(内酰胺)、硫醚键、芳环、不饱和脂族烃链、饱和脂族烃链和三唑环。
11.根据前述权利要求中任一项所述的分离的抗体片段，其完全为牛的。
12.根据权利要求1至10中任一项所述的分离的抗体片段，其为嵌合的。
13.根据权利要求1至10中任一项所述的分离的抗体片段，其为合成的。
14.根据前述权利要求中任一项所述的分离的抗体片段，其中所述目标抗原是补体的成分C5。
15.根据权利要求14所述的分离的抗体片段，其具有选自由以下组成的列表的序列：SEQ ID NO:157至SEQ ID NO:310、SEQ ID NO:313、SEQ ID NO:315、SEQ ID NO:317、SEQ IDNO:318、SEQ ID NO:320、SEQ ID NO:322、SEQ ID NO:324、SEQ ID NO:326至SEQ ID NO:331、SEQ ID NO:334、SEQ ID NO:336、SEQ ID NO:339、SEQ ID NO:341至SEQ ID NO:350、SEQ ID NO:352和SEQ ID NO:572至SEQ ID NO:609、或与上述序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％相似性或同一性的任一序列。
16.根据权利要求1至13中任一项所述的分离的抗体片段，其中所述目标抗原为人血清白蛋白。
17.根据权利要求16所述的分离的抗体片段，其具有序列SEQ ID NO:510。
18.一种多肽，其包含至少一个权利要求1至17中任一项所定义的分离的抗体片段。
19.一种多肽，其包含至少两个权利要求1至17中任一项所定义的分离的抗体片段，其中所述抗体片段连接在一起，任选地通过接头连接在一起，例如，通过可裂解接头连接在一起。
20.根据权利要求19所述的多肽，其中所述至少两个分离的抗体片段结合相同的抗原。
21.根据权利要求19所述的多肽，其中所述至少两个分离的抗体片段结合不同的抗原。
22.根据权利要求18至21中任一项所述的多肽，其中所述多肽包含在两个氨基酸之间的至少一个桥接部分。
23.根据权利要求1至17中任一项所述的分离的抗体片段或根据权利要求18至22中任一项所述的多肽，其中所述片段或多肽融合至一个或多个效应分子，任选地通过接头融合，例如，通过可裂解接头融合。
24.根据权利要求23所述的分离的抗体片段或多肽，其中所述效应分子是抗体。
25.根据权利要求24所述的分离的抗体片段或多肽，其中所述效应分子是完全IgG。
26.根据权利要求24所述的分离的抗体片段或多肽，其中所述效应分子选自由以下组成的列表：Fab、VHH、VH、VL、scFv和dsscFv。
27.根据权利要求24至26中任一项所述的分离的抗体片段或多肽，其中所述效应分子包含白蛋白结合结构域。
28.根据权利要求23所述的分离的抗体片段或多肽，其中所述效应分子是白蛋白或包含白蛋白结合结构域的蛋白。
29.根据权利要求27或28所述的分离的抗体片段或多肽，其中所述白蛋白结合结构域包含：SEQ ID NO:435作为CDR-H1，SEQ ID NO:436作为CDR-H2，SEQ ID NO:437作为CDR-H3，SEQ ID NO:430作为CDR-L1，SEQ ID NO:431作为CDR-L2以及SEQ ID NO:432作为CDR-L3；或选自SEQ ID NO:434和SEQ ID NO:444的重链可变结构域和选自SEQ ID NO:429和SEQ IDNO:443的轻链可变结构域。
30.一种药物组合物，其包含权利要求1至17中任一项或权利要求23至2829中任一项所定义的分离的抗体片段或权利要求18至29中任一项所定义的多肽，与一种或多种药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载剂组合。
31.权利要求1至17中任一项或权利要求23至29中任一项所定义的分离的抗体片段或权利要求18至29中任一项所定义的多肽，其用于疗法。
32.一种多核苷酸，其编码权利要求1至17中任一项或权利要求23至29中任一项所定义的分离的抗体片段或权利要求18至29中任一项所定义的多肽。
33.一种载体，其包含权利要求32所述的多核苷酸。
34.一种宿主细胞，其包含权利要求32或33分别所述的多核苷酸或载体。
35.一种产生权利要求1至17中任一项或权利要求23至29中任一项所定义的分离的抗体片段或权利要求18至29中任一项所定义的多肽的方法，所述方法包括从权利要求34所定义的宿主细胞表达权利要求1至17中任一项或权利要求23至29中任一项所定义的分离的抗体片段或权利要求18至29中任一项所定义的多肽。
36.一种产生权利要求1至17中任一项或权利要求23至29中任一项所定义的分离的抗体片段或权利要求18至29中任一项所定义的多肽的方法，所述方法包括化学合成的步骤。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述化学合成包括掺入具有放射性同位素的偶联剂的步骤。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述放射性同位素是α发射放射性同位素，优选地是砹211。
39.一种产生权利要求1至17中任一项或权利要求23至29中任一项所定义的分离的抗体片段或权利要求18至29中任一项所定义的多肽的方法，所述方法包括：
a)用免疫原性组合物使牛免疫，以及
b)分离抗原特异性记忆B细胞，以及
c)对CDR-H3的cDNA或其部分测序，以及
d)表达或合成超长CDR-H3的凸起结构域或其部分，
其中所述免疫原性组合物包含目标抗原或其免疫原性部分、或编码其的DNA。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述方法进一步包括筛选步骤，例如，筛选与所述目标抗原结合的步骤，并且其中，任选地，所述筛选步骤之前是将超长CDR-H3或超长CDR-H3的凸起结构域或其部分重新格式化为筛选格式的步骤。
41.根据权利要求40所述的方法，其中将超长CDR-H3或超长CDR-H3的凸起结构域或其部分重新格式化为筛选格式的步骤包括将超长CDR-H3或超长CDR-H3的凸起结构域或其部分融合至载体，任选地通过接头融合至载体，例如，通过可裂解接头融合至载体。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述载体是Fc多肽。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述Fc多肽是scFc。
44.一种文库，其包含至少一个权利要求1至17中任一项所定义的分离的抗体片段。
45.根据权利要求44所述的文库，其是合成文库。
46.根据权利要求44所述的文库，其是噬菌体文库。
47.根据权利要求46所述的文库，其是天然文库。
48.根据权利要求46所述的文库，其是免疫文库。
49.根据权利要求47或48所述的文库，其中所述文库是从牛制备的。
50.一种噬菌体展示文库，其包含多个重组噬菌体；
所述多个重组噬菌体各自包含M13衍生的表达载体，其中所述M13衍生的表达载体包含编码权利要求1至17中任一项所定义的分离的抗体片段的多核苷酸序列，任选地所述分离的抗体片段展示在超长CDR-H3的全长序列内。
51.根据权利要求50所述的噬菌体展示文库，其中编码任选地展示在超长CDR-H3的全长序列内的所述分离的抗体片段的所述多核苷酸序列直接或通过间隔体融合至编码M13噬菌体的pIII外壳蛋白的序列。
52.一种生成超长CDR-H3序列的噬菌体展示文库的方法，所述方法包括：
a)用免疫原性组合物使牛免疫，以及
b)自PBMC或次级淋巴器官分离总RNA，以及
c)扩增所述超长CDR-H3的cDNA序列，以及
d)将c)中获得的序列融合至噬菌粒载体内编码M13噬菌体的pIII蛋白的序列，以及
e)用步骤d)中获得的噬菌粒载体与辅助噬菌体共感染组合来转化宿主细菌，以及
f)培养步骤e)中获得的细菌，以及
g)自细菌的培养基回收噬菌体，
其中所述免疫原性组合物包含目标抗原或其免疫原性部分、或编码其的DNA。
53.根据权利要求52所述的生成超长CDR-H3序列的噬菌体展示文库的方法，其中步骤c)包括：
a)使用在CDR-H3两侧、退火至VH的保守框架3和框架4的引物进行初级PCR，以扩增所有CDR-H3序列，以及
b)使用茎引物进行第二轮PCR，以从初级PCR特异性扩增超长序列。
54.根据权利要求53所述的生成超长CDR-H3序列的噬菌体展示文库的方法，其中步骤a)所用的引物包含SEQ ID NO:446和SEQ ID NO:447或由其组成，和/或步骤b)所用的引物选自由SEQ ID NO:482至SEQ ID NO:494组成的组。
55.一种产生权利要求1至17中任一项所定义的结合目标抗原的分离的抗体片段的方法，所述方法包括：
a)例如，按照权利要求52至54中任一项所述生成超长CDR-H3序列的噬菌体展示文库；以及
b)针对目标抗原增富集噬菌体展示文库，以产生结合目标抗原的富集的噬菌体群；以及
c)对来自步骤b)获得的富集的噬菌体群的超长CDR-H3进行测序；以及
d)表达或合成步骤c)获得的超长CDR-H3衍生的分离的抗体片段。
56.一种产生权利要求1至17中任一项所定义的结合目标抗原的分离的抗体片段的方法，所述方法包括：
a)生成权利要求1至17中任一项所定义的分离的抗体片段的噬菌体展示文库；以及
b)针对目标抗原富集噬菌体展示文库，以产生结合目标抗原的富集的噬菌体群；以及
c)对来自步骤b)获得的富集的噬菌体群的分离的抗体片段进行测序；以及
d)表达或合成步骤c)获得的分离的抗体片段。
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