CN115644166B

CN115644166B - 冷冻保存nk细胞的方法

Info

Publication number: CN115644166B
Application number: CN202211318311.3A
Authority: CN
Inventors: 牟春琳; 秦臻; 李政楠; 张雅楠; 武嘉钊; 王秀娥
Original assignee: Huayu Biotechnology Tianjin Co ltd; Tianjin Huayu Pharmaceutical Co ltd; Huayu Life Technology Tianjin Co ltd
Current assignee: Huayu Biotechnology Tianjin Co ltd; Tianjin Huayu Pharmaceutical Co ltd; Huayu Life Technology Tianjin Co ltd
Priority date: 2022-10-26
Filing date: 2022-10-26
Publication date: 2023-06-09
Anticipated expiration: 2042-10-26
Also published as: CN115644166A

Abstract

本发明涉及生物技术技术领域，具体而言，涉及一种冷冻保存NK细胞的方法。该方法包括：a)将NK细胞用包含血清淀粉样蛋白A的培养基预处理；b)将预处理后的NK细胞与细胞冻存液混合得到混合物，并降低所述混合物的温度至冷冻保存温度。

Description

冷冻保存NK细胞的方法

技术领域

本发明涉及生物技术技术领域，具体而言，涉及一种冷冻保存NK细胞的方法。

背景技术

NK细胞是一类大颗粒淋巴细胞，由瑞典科学家Kiessling等于20世纪70年代发现。NK细胞为机体固有免疫效应细胞，其通过直接溶解和分泌细胞因子等作用杀伤肿瘤细胞，是机体天然免疫的主要细胞。NK细胞可直接杀伤肿瘤细胞，不需要肿瘤特异性抗原识别，无需预先致敏，亦不受主要组织相容性复合物(Majorhistocompatibility complex,MHC)限制，是机体抗肿瘤的第一道天然免疫杀伤防线。但NK细胞只是免疫系统的一小部分,仅占白细胞的15％左右，它在人体内存在的量很少，人类到了25岁以后,免疫力下降，NK细胞数量亦变少，而肿瘤患者及肿瘤术后患者体内NK细胞的数量则更少，活性也更差。临床应用中常常需要对NK细胞进行冻存，由于NK细胞数量的稀少性，如何在冻存过程中提高NK细胞的存活率，并维持其对肿瘤的杀伤活性，是将其应用于自身免疫战胜癌症的关键。

发明内容

本发明的涉及一种冷冻保存NK细胞的方法，包括：

a)将NK细胞用包含血清淀粉样蛋白A的培养基预处理至少1天；

b)将预处理后的NK细胞与细胞冻存液混合得到混合物，并降低所述混合物的温度至冷冻保存温度。

本发明首次发现NK细胞在血清淀粉样蛋白A诱导后冻存，能够有效提高其冻存后的存活率和/或杀伤活性。该方法操作简便，且提升效果显著，具有很好的应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明一个实施例所提供的不同预处理方式对NK细胞冻存后的细胞杀伤活性影响；

图2为本发明一个实施例所提供的不同预处理后的NK细胞中相对SOD蛋白水平和MDA水平；*p<0.05,vs control；**p<0.01,vs control。

具体实施方式

现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。

除非另有说明，用于披露本发明的所有术语(包括技术和科学术语)的意义与本发明所属领域普通技术人员所通常理解的相同。通过进一步的指导，随后的定义用于更好地理解本发明的教导。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

本发明中所使用的术语“含有”、“包含”和“包括”是同义词，其是包容性或开放式的，不排除额外的、未被引述的成员、元素或方法步骤。

本发明中用端点表示的数值范围包括该范围内所包含的所有数值及分数，以及所引述的端点。

本发明中涉及浓度数值，其含义包括在一定范围内的波动。比如，可以在相应的精度范围内波动。比如2％，可以允许±0.1％范围内波动。对于数值较大或无需过于精细控制的数值，还允许其含义包括更大波动。比如100mM，可以允许±1％、±2％、±5％等范围内的波动。涉及分子量，允许其含义包括±10％的波动。

本发明中，涉及“多个”、“多种”等描述，如无特别限定，指在数量上指大于等于2。

本发明中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。

本发明中，“优选”、“更好”、“更佳”、“为宜”仅为描述效果更好的实施方式或实施例，应当理解，并不构成对本发明保护范围的限制。本发明中，“可选地”、“可选的”、“可选”，指可有可无，也即指选自“有”或“无”两种并列方案中的任一种。如果一个技术方案中出现多处“可选”，如无特别说明，且无矛盾之处或相互制约关系，则每项“可选”各自独立。

本发明所述NK细胞可以为人和动物，优选为人。

本发明涉及一种冷冻保存NK细胞的方法，包括：

a)将NK细胞用包含血清淀粉样蛋白A的培养基预处理；

在一些实施方式中，预处理的时间为至少1天，例如1、2、3、4、5、6、7天。

在一些实施方式中，所述血清淀粉样蛋白A的添加量为0.1μg/mL～1μg/mL，例如0.3μg/mL、0.5μg/mL、0.7μg/mL。

在一些实施方式中，所述培养基包含基础培养基、3v/v％～10v/v％的血清、IL2和IL18。

在一些实施方式中，所述IL2的添加量为500～1000U/mL，例如600U/mL、700U/mL、800U/mL、900U/mL。

在一些实施方式中，所述IL18的添加量为200～600U/mL，例如300U/mL、400U/mL、500U/mL。

在一些实施方式中，所述基础培养基选自X VIVO-15、RPMI1640、AIM-V、α-MEM培养基。

本发明在步骤a)中并不排除与其他培养基配合使用，或者在本发明的培养基中额外添加一些常规的营养补充剂，例如盐类、抗生素、维生素和氨基酸等，氨基酸补充剂可以包括任何氨基酸，包括甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、精氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸和丝氨酸。抗生素例如庆大霉素、青霉素、链霉素、氨苄青霉素、卡那霉素等等。

在本发明中，若非特别限定，则细胞的培养环境均在约为5％的CO₂及约37℃的条件下进行。

血清的浓度可以为4v/v％、5v/v％、6v/v％、7v/v％、8v/v％、9v/v％。在一些实施方式中，所述血清为自体血清。

本文所使用的术语“冷冻保存温度”通常意指如下的温度：从零到-196℃，如从-50℃至-196℃，如从-80℃至-196℃，例如低于-55℃，例如低于-60℃，例如低于-65℃，例如低于-70℃，例如低于-75℃，例如低于-80℃，例如低于-85℃，例如低于-90℃，例如低于-95℃，例如低于-100℃，例如低于-105℃，例如低于-110℃，例如低于-115℃，例如低于-120℃，例如低于-125℃，例如低于-130℃，例如低于-135℃，例如低于-140℃，例如低于-145℃，例如低于-150℃，例如低于-155℃，例如低于-160℃，例如低于-165℃，例如低于-170℃，例如低于-175℃，例如低于-180℃，例如低于-185℃，例如低于-190℃的温度。

在一些实施方式中，所述细胞冻存液包含如下组分中的一种或多种：

羟乙基淀粉、乙酰胺、琼脂、海藻酸盐或酯、异麦芽糖寡糖、1-苯胺、白蛋白、氨基酸、醋酸铵、丁二醇、硫酸软骨素、氯仿、胆碱、二甘醇、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、赤藓糖醇、乙醇、乙二醇、甲酰胺、葡萄糖、甘油、α-甘油磷酸盐或酯、单乙酸甘油、透明质酸、甘氨酸、羟乙基淀粉、肌醇、乳糖、镁离子、钙离子、钠离子、钾离子、麦芽糖、甘露醇、甘露糖、甲醇、甲基乙酰胺、甲基甲酰胺、甲基脲、水凝胶、糊精、葡聚糖、苯酚、普流尼克多元醇、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、脯氨酸、丙二醇、丝氨酸、溴化钠、氯化钠、碘化钠、吡啶N-氧化物、核糖、硝酸钠、蔗糖、海藻糖、硫酸钠、山梨糖醇、三甘醇、乙酸三甲基胺和脲。

在一些实施方式中，所述细胞冻存液包含60v/v％～80v/v％的羟乙基淀粉、7v/v％～13v/v％的DMSO、5v/v％～15v/v％的蔗糖和5v/v％～15v/v％的白蛋白。

在一些实施方式中，所述细胞冻存液还包含维持所述细胞冻存液为大致中性的缓冲剂。

“缓冲剂”是通过其酸-碱共轭物组分的作用抵抗pH变化的溶液。可以根据例如缓冲剂的期望pH(以及微生物生长和代谢特性、微生物培养物培养系统、pH控制和使用的培养基)采用的各种缓冲剂描述于Buffers.AGuide for the Preparation and Use ofBuffers in Biological Systems,Gueffroy,D.,编辑Calbiochem Corporation(1975)中。在一个实施方案中，所述缓冲剂具有约2至约9、或者约3至约8、或者约4至约7、或者约5至约7的范围内的pH。将控制该范围内的pH的缓冲剂的非限制性实例包括MES、MOPS、MOPSO、Tris、HEPES、磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐和铵缓冲剂，以及这些的组合。在一些实施方案中，所述缓冲剂选自3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)游离酸、3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)Na、羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)和碳酸氢钠。本发明所采用的缓冲试剂应当维持所冷冻保护的NK细胞是有功能的pH，这样的pH通常为“大致中性”的，例如6.8～7.6，或者7.0～7.4，或者7.1～7.3左右。

在一些实施方式中，所述NK细胞在所述混合物的含量为1×10^(6～8)个/mL，例如5×10⁶个/mL，1×10⁷个/mL，5×10⁷个/mL。

在一些实施方式中，冻存的温度为-80℃～-196℃。

降低所述混合物的温度至冷冻保存温度可以为本领域技术人员所掌握的任何方法，例如梯度降温，或者直接一步降温至冷冻保存温度。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，优先参考本发明中给出的指引，还可以按照本领域的实验手册或常规条件，还可以参考本领域已知的其它实验方法，或者按照制造厂商所建议的条件。

下述的具体实施例中，涉及原料组分的量度参数，如无特别说明，可能存在称量精度范围内的细微偏差。涉及温度和时间参数，允许仪器测试精度或操作精度导致的可接受的偏差。

下述实施例和对比例中：

人重组血清淀粉样蛋白A(SSA)从Peprotech(Rocky Hill，NJ，USA)购买。

脂多糖(LPS)从北京索莱宝科技有限公司Solarbio购买。

NK细胞无血清培养基X VIVO-15为美国Lonza公司产品。

重组人IL-2和组人IL-18购自北京同立海源生物科技有限公司。

实施例

一、NK细胞的预处理

1.脐带血单个核细胞(PBMC)的分离

通过血细胞分离机采集患者PBMC，将采集的血样转至离心管，700g离心10min，吸取上层血浆培养时备用；用生理盐水将血样标本还原至原体积，混匀；将稀释血缓慢加在Ficol1分离液上，900g离心20min；吸取分液界面乳白色单个核细胞层，用0.9％生理盐水洗涤离心2次；用无血清培养基将PBMC重悬。将细胞通过常规培养方式扩增培养以保证有足够的实验数量。

2.NK细胞培养

将培养后的细胞浓度调整至1×10⁶个/mL，向培养瓶中加入含5％自体血浆、重组人IL-2 700U/mL，重组人IL18 400U/mL、SSA 0.5μg/mL的XVIVO-15培养基，置于5％CO₂及37℃连续培养3天，期间换液1次。

二、NK细胞的冻存

将实施例1培养得到NK细胞离心除去培养基组分，加入平衡液中室温静置10分钟。平衡液：80％磷酸盐缓冲液+10％人血清白蛋白+5％丙二醇+5％乙二醇。

离心、清洗细胞细胞后，将NK细胞加入到预装有冻存液的冻存管中。冻存液：磷酸盐缓冲液配制的70v/v％的羟乙基淀粉+10v/v％的DMSO+10v/v％的蔗糖和10v/v％的白蛋白，细胞浓度为1×10⁷个/mL。静置3～5min后将冻存液迅速放入液氮内进行冻存。

比较例设置

方法同实施例实施例，区别仅在于：

比较例1中，将SSA替换为LPS；

比较例2中，NK细胞培养过程中不添加SSA。

实验例

1.不同预处理方式对NK细胞成活率的影响

将上述三组预处理方式的细胞分别冻存30d和180d后各取出5只，用台盼蓝染色检测NK平均成活率，结果如表1所示。

表1

从表1可以看出，随着冻存时间延长，实施例组的细胞存活率仅有轻度降低，无显著性差异。而比较例的两组均出现显著性降低，且与实施例相比，细胞成活率具有显著性差异(p<0.05)。

2.NK细胞杀伤活性比较

将分离自同一样本，且经过上述三组不同预处理方式的细胞冻存180d后各取出1只，各取出一部分细胞检测NK细胞成活率，并按照成活率换算活的NK细胞比例，以保证按效靶比检测杀伤活性时各组的活的NK细胞数量相同。由于这些NK细胞分离自同一样本，因而初始细胞杀伤活性相同。

杀伤实验方法：

白色不透底96孔板，按效靶比(E/T ratio)为1:1、5:1、10:1、20:1，分别加入的活的NK细胞和对数期肿瘤细胞(K562-Luc)，肿瘤细胞数每孔固定为5000个，即NK细胞数分别为5000、25000、50000、100000，同时设置相应数量的肿瘤细胞空白组和NK细胞空白组，每组细胞设置三个重复孔，调整每孔细胞体积为100uL，细胞混匀后静置培养24小时。

Bright-Lumi按1：1体积比加入白色96孔板的培养基中，酶标仪直接读取Luminescent发光值。

按化学发光值计算细胞杀伤效率，计数公式如下：

1-(混合组发光值-空白NK组发光值)/空白肿瘤组发光值×100％；

检测结果如图1所示。可见相比于比较例1和比较例2组，实施例组具有明显升高的杀伤活性。

讨论

为探究SSA提高NK细胞冻存效果的原因，申请人检测了各种细胞预处理培养后(冻存前)的细胞匀浆中的超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)相对变化水平。

实验结果如图2所示。实施例组性对于比较例1和比较例2组，具有显著升高的SOD含量，且MDA水平降低，说明抗氧化能力的提升可能是使得其冻存效果提升的原因之一。抗氧化能力的提升能有效降低细胞冻存后所造成的损伤，SSA和LPS虽然均为炎性物质，但诱导NK细胞抗氧化能力的水平有显著差异，这可能是导致二者效果差异的原因之一。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。

Claims

1.冷冻保存NK细胞的方法，包括：

a) 将NK细胞用包含血清淀粉样蛋白A的培养基预处理；所述血清淀粉样蛋白A的添加量为0.1μg/mL~1μg/mL；所述培养基包含基础培养基、3v/v%~10 v/v %的血清、IL2和IL18；所述IL2的添加量为500U/mL~1000U/mL，所述IL18的添加量为200 U/mL~600U/mL；

b) 将预处理后的NK细胞与细胞冻存液混合得到混合物，并降低所述混合物的温度至冷冻保存温度；

所述细胞冻存液包含60 v/v%~80 v/v% 的羟乙基淀粉、7 v/v%~13 v/v%的DMSO、5v/v%~15v/v%的蔗糖和5v/v%~15v/v%的白蛋白。

2.根据权利要求1所述的冷冻保存NK细胞的方法，所述基础培养基选自X VIVO-15、RPMI1640、AIM-V、α-MEM培养基。

3.根据权利要求1所述的冷冻保存NK细胞的方法，所述血清为自体血清。

4.根据权利要求1所述的冷冻保存NK细胞的方法，所述细胞冻存液还包含维持所述细胞冻存液为中性的缓冲剂。

5.根据权利要求1所述的冷冻保存NK细胞的方法，所述NK细胞在所述混合物的含量为1×10^(6~8)个/mL。

6.根据权利要求1所述的冷冻保存NK细胞的方法，冻存的温度为-80℃~-196℃。