CN115637245A

CN115637245A - 一株耐高温木质素降解菌及其应用

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Publication number: CN115637245A
Application number: CN202211367497.1A
Authority: CN
Inventors: 曾伟民; 吴晓燕; 吴学玲; 余肇璟; 王彦楚; 刘阿娟
Original assignee: Central South University
Current assignee: Central South University
Priority date: 2022-11-03
Filing date: 2022-11-03
Publication date: 2023-01-24
Anticipated expiration: 2042-11-03
Also published as: CN115637245B

Abstract

本发明公开了一株耐高温木质素降解菌及其应用，所述降解菌命名为解硫胺素芽孢杆菌LD3(Aneurinibacillus sp.LD3)，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号：CCTCC NO:M 20221533。该菌株在高温(45～55℃)条件且以木质素为单一碳源的培养基中生长良好，对木质素的降解率最高可达61.28％，还能同时分泌木质素过氧化物酶、漆酶和锰过氧化物酶，三种酶活性最高分别为3117.25、1484.5和1770.75U L^‑1。将该菌株应用于餐厨垃圾堆肥中，能够促进木质纤维素组分的降解，提高堆肥产物的质量。该菌株在有机固废资源化方面具有巨大的应用价值。

Description

一株耐高温木质素降解菌及其应用

技术领域：

本发明属于固体废弃物降解处理用微生物技术领域，具体涉及一株耐高温木质素降解菌及其应用。

背景技术：

由于经济的快速增长和人民生活水平的提高，餐厨垃圾的产量正在逐渐增加。餐厨垃圾直接焚烧或倾倒在垃圾填埋场，不仅需要大量占地面积，还会增加二次污染的风险。堆肥最终产生的稳定且无毒的腐殖质可作为肥料重新使用，实现有机固废的减量化、再利用和资源化，已成为处理有机固废的最佳策略。然而，由于餐厨垃圾的高含水量、低孔隙率和低碳氮比，单独使用餐厨垃圾很难有效完成堆肥过程。因此，使用中药渣、木屑、农作物秸秆等材料作为填充剂来实现高效堆肥是非常必要的，但它们主要由难降解的木质纤维素物质组成，导致堆肥周期长、腐熟不完全、终产物质量低等问题。

木质素是一种不规则的、随机交联的酚类聚合物，由三种不同的苯基丙烷单体通过C-C键和醚键连接而成。木质素通过化学键紧紧包裹着纤维素与半纤维素，这严重阻碍了微生物在整个堆肥过程中对纤维素和半纤维素的降解；因此，消除木质素的这种阻碍对于提高堆肥的腐熟度和稳定性至关重要。木质素结构复杂，在自然条件下降解速度缓慢。与传统的物理化学方法相比，生物降解具有特异性强、降解率高、环保、成本低等优点。另外，堆肥无害化的标准之一是高温期(≥50℃)至少持续5天，这可能会影响木质素降解微生物的生长和繁殖。然而，关于耐高温的木质素降解菌及其在堆肥中的应用，文献中的报道很少。因此，从自然界中分离出耐高温的木质素降解细菌，并将其接种到堆肥体系中，对于解决木质纤维素组分难降解和堆肥周期过长至关重要。

发明内容：

本发明的目的是提供一株耐高温木质素降解菌及其应用，用于高温堆肥过程中的木质素降解，进一步提升堆肥的效率。

为解决上述技术问题采用如下技术方案：

所述的耐高温木质素降解菌命名为解硫胺素芽孢杆菌(Aneurinibacillussp.)LD3，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号：CCTCC NO:M 20221533。

所述的耐高温木质素降解菌的应用之一，用于木质素的降解。

进一步地，所述的应用，在45～55℃条件下降解木质素。

所述的耐高温木质素降解菌的应用之二，用于分泌木质素过氧化物酶、漆酶和锰过氧化物酶中的至少一种。

所述的耐高温木质素降解菌的应用之三，用于好氧堆肥。

进一步地，所述的好氧堆肥包括餐厨垃圾、园林绿化垃圾、农业废弃物或中药渣堆肥。

更近一步地，

将培养好的耐高温木质素降解菌培养液添加到餐厨垃圾和木屑的混合物中，再加入复合微生物菌剂后进行好氧堆肥。

堆肥时，通风速率为4～10L/min/kg，每周搅拌至少2次，每次1～2h，堆肥周期至少为42天。

所述的复合微生物菌剂为常规堆肥发酵菌剂，优选包括嗜热子囊菌、曲霉菌、芽孢杆菌和鞘氨醇杆菌，每种菌的活菌数≥2亿cfu/g，进一步优选四种菌比例相同。

具体过程为：

(1)将所述降解菌按5％的接种量接种于250mL木质素培养基中,50℃170r min^-1培养至第4天收集菌液。

木质素培养基：(NH₄)₂SO₄ 2g，MgSO₄ 0.5g，K₂HPO₄ 1.0g，NaCl 0.5g，碱木质素5.0g，蒸馏水定容至1000mL，固体培养基加琼脂20g。

(2)将步骤(1)收集的降解菌培养液以3～8％(V/M)的比例添加到餐厨垃圾和木屑的混合物中，餐厨垃圾和木屑的质量比为3：1，再加入2‰～8‰的复合微生物菌剂后投入发酵罐进行好氧堆肥。

本发明耐高温木质素降解菌在降解木质素中的效果测定方法：

具体为：

(1)将25mg碱木质素溶解在1mL二甲基亚砜中，然后用水稀释，制成0.2、0.5、1、1.5、2和2.5mg mL^-1标准溶液。最后，测量280nm处不同稀释液的吸光度，以绘制碱木质素的标准曲线。

(2)将本发明耐高温木质素降解菌按5％的接种量接种于100mL木质素培养基中,50℃170r min^-1培养10d，每天取1mL菌液，12000g离心10min，取上清。然后稀释上清液，并在280nm处测量吸光度。以未接种降解菌的培养基作为对照。

(3)木质素的降解率按如下公式计算：

公式中，C₁和C₂分别表示对照组和接种降解菌样品中木质素的浓度。

(4)每天取步骤(2)中的培养液3mL，10000rpm离心5min，收集上清液作为粗酶液，测定木质素过氧化物酶(LiP)、漆酶(Lac)和锰过氧化物酶(MnP)的活性方法如下：

木质素过氧化物酶：0.125mol/L，pH＝3.0酒石酸钠缓冲液3.2mL，10mmol/L藜芦醇0.1mL和0.6mL酶液，加入10mmol/L H₂O₂ 0.1mL启动反应，室温下进行反应，测定反应最初3min内波长在310nm处吸光值的增加，每升反应液中每分钟引起1个吸光度增加所需酶量定义为1个活力单位。锰过氧化物：室温下反应体系中含50mmol/L，pH＝4.5乳酸钠缓冲液3.4mL，1.6mmol/LMnSO₄0.1mL和0.4mL酶液，加入1.6mmol/L H₂O₂ 0.1mL启动反应，测定反应最初3min内波长在240nm处吸光值的增加，每升反应液中每分钟引起1个吸光度增加所需酶量定义为1个活力单位。漆酶：室温下反应体系中含0.5mmol/L的ABTS(溶于0.1mmol/L，pH＝5.0的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中)2mL，添加1mL酶液启动反应，测定波长在420nm处吸光值在最初3min内的增加，每升反应液中每分钟引起1个吸光度增加所需酶量定义为1个活力单位。

所述木质素培养基的配方为：(NH₄)₂SO₄ 2g，MgSO₄0.5 g，K₂HPO₄ 1.0g，NaCl 0.5g，碱木质素5.0g，蒸馏水定容至1000mL，固体培养基加琼脂20g。

本发明具备以下有益效果：

本发明提供的耐高温木质素降解菌解硫胺素芽孢杆菌(Aneurinibacillus sp.)LD3，能在高温(45～55℃)条件且以木质素为单一碳源的培养基中生长良好。该降解菌对木质素的降解率最高可达61.28％，还能同时分泌木质素过氧化物酶、漆酶和锰过氧化物酶，三种酶活性最高分别为3117.25、1484.5和1770.75U L^-1。将该菌株应用于餐厨垃圾堆肥中，能够促进木质纤维素组分的降解，提高堆肥产物的质量。该菌株在有机固废资源化方面具有巨大的应用价值。

本发明降解菌命名为Aneurinibacillus sp.LD3，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址为：中国武汉武汉大学；保藏编号：CCTCC NO:M 20221533，保藏时间：2022年9月29日。

附图说明：

图1是5株耐高温木质素降解菌的菌落形态及脱色圈与菌落直径比值。

图2是本发明的耐高温木质素降解菌的生长曲线(a)及基于16S rRNA基因序列构建的系统发育树(b)。

图3是本发明的耐高温木质素降解菌对木质素的降解曲线(a)和酶活分析(b)；其中木质素过氧化物酶：LiP；漆酶：Lac；锰过氧化物酶：MnP。

图4是本发明各理化参数在实验组和对照组堆肥过程中的变化：(a)温度(Ambient：室温)；(b)纤维素；(c)半纤维素；(d)木质素；(e)总氮；(f)总磷。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的上述内容做进一步的详细说明，但不是对本发明的限制。

实施例1：耐高温木质素降解菌的筛选及鉴定

木质素筛选培养基：(NH₄)₂SO₄ 2g，MgSO₄0.5 g，K₂HPO₄ 1.0g，NaCl 0.5g，碱木质素5.0g，蒸馏水定容至1000mL，固体培养基加琼脂20g。

取来自于中南大学本部校园中覆盖树叶木屑的土壤样品10g于90mL的加有玻璃珠的无菌水中，充分振荡30min(170rpm)，获得菌悬液。然后用无菌水对菌悬液进行梯度稀释，取各稀释度为10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6的菌液100μL涂布于固体木质素筛选培养基上,50℃静置培养24h后得到单菌落,挑取不同形态的脱色效果较好的单菌落重复划线纯化。将获得的各个纯培养菌落采用点种法点种在木质素筛选培养基中心，50℃静置培养48h，用直尺测量出菌落脱色圈直径及菌落直径，3次重复取平均值，筛选脱色圈与菌落直径比值大的且脱色圈明显的菌株保存至斜面培养基上。将分离的木质素降解菌接种到液体培养基中培养，每天取1mL菌液12000g离心10min后，弃去上清液，再用1mL不含碱木质素的培养基重悬菌体，漩涡振荡后测定OD600值，绘制生长曲线。

进一步选取脱色圈与菌落直径比值大的菌株进行16S鉴定。取5mL菌液，12000g离心3min，收集菌体，采用天根生化科技的“细菌基因组DNA提取试剂盒”进行基因组DNA提取。用细菌通用引物扩增16S rRNA基因序列。测序得到菌株的16S rRNA基因序列后在EzBioCloud数据库比对相似性，再用MEGA v7.0构建系统发育树。

实验结果：通过多次分离纯化，从中南大学本部校园中覆盖树叶木屑的土壤中筛选到5株耐高温(50℃)木质素降解菌株，分别命名为LD1、LD2、LD3、LD4和LD5。5株菌接种到苯胺蓝培养基上，测定褪色圈直径(D)和菌落直径大小(d)。菌落形态和D/d的结果如图1所示，LD3的D/d最大，为2.62±0.13，相比其他菌株差异显著，证明其产漆酶和过氧化物酶能力较强。紧接着为LD2，D/d为1.47±0.15，另外3株菌的D/d较小，为1.1-1.24。因此，选择菌株LD3来做进一步16S鉴定、木质素降解能力和酶活分析。

将菌株LD3接种到以木质素为单一碳源的培养基(实施例1中的木质素筛选培养基)中50℃进行摇瓶培养，使用使用分光光度计每天测定菌株的OD₆₀₀值，绘制生长曲线，结果如图2a所示。LD3的延迟期较短，随后进入对数期，在第3天进入稳定期，即达到生长的最高峰，OD₆₀₀最高为0.19，12天后由于有机物的消耗，菌体生长进入衰亡期。一些细菌可以降解木质素，但必须添加其他碳源来消化木质素。而尽管生长条件苛刻，本发明中分离的菌株LD3可以利用碱木质素作为其单一碳源和能源，而不需要任何额外的营养物质，这表明菌株LD3具有降解高度顽固性木质素的能力。

提取菌株LD3基因组DNA后扩增16S rRNA片段，再经琼脂糖凝胶电泳验证后送测序公司测序。将获得的16S rRNA基因序列输入到EzBioCloud数据库，和已有模式菌株比对分析序列同源性，结果菌株LD3和AneurinibacillusthermoaerophilusDSM 10154^T(嗜热嗜气解硫胺素芽孢杆菌属)的相似度最高，为98.75％。Stackebrandt&Ebers报道菌株16S rRNA基因序列相似性低于98.7～99％则可认为是新种，高于此阈值则需要通过比对全基因组序列来进一步研究。因此菌株LD3可认为是为Aneurinibacillus(解硫胺素芽孢杆菌)属下面的新种。紧接着用MEGA7.0软件对同源性较近的细菌绘制系统发育树(图2b)。菌株LD3和A.thermoaerophilus DSM 10154^T的亲缘关系最近，因此将LD3命名为解硫胺素芽孢杆菌LD3(Aneurinibacillus sp.)LD3。

实施例2：耐高温木质素降解菌在降解木质素中的应用

木质素筛选培养基同实施例1。将25mg碱木质素溶解在1mL二甲基亚砜中，然后用水稀释，制成0.2、0.5、1、1.5、2和2.5mg mL^-1标准溶液。最后，测量280nm处不同稀释液的吸光度，以绘制碱木质素的标准曲线。将降解菌LD3按5％的接种量接种于100mL木质素培养基中,50℃170r min^-1培养10d，每天取1mL菌液，12000g离心10min，取上清。然后稀释上清液，并在280nm处测量吸光度。以未接种降解菌的培养基作为对照。木质素的降解率按如下公式计算：

每天取培养液3mL，10000rpm离心5min，收集上清液作为粗酶液，测定木质素过氧化物酶(LiP)、漆酶(Lac)和锰过氧化物酶(MnP)的活性。

实验结果：图3a展示了时间对菌株LD3降解木质素的影响。菌株对碱性木质素的降解率随时间的延长而逐渐增长，前期增长速率较快，到第7天以后增长速度趋于平缓，可能是由于菌株生长进入稳定期，代谢活动减慢。LD3在对碱木质素的降解率在第4天时达到51.91％，之后缓慢增长，维持在61.28％左右，这表明解硫胺素芽孢杆菌LD3(Aneurinibacillus sp.)LD3可能是工业上木质素降解的优良资源。

在菌株LD3的生长过程中检测到LiP、Lac和MnP，酶活变化如图3b所示。三种酶中，LiP的酶活最高，始终在2400U L^-1以上。LiP酶活在初始4天快速增加，达到峰值3117.25U L^-1，然后略有下降。Lac酶活最低(800～1500U L^-1)，呈现出先增长然后略有下降的趋势，在第4天达到最大值1484.5U L^-1。漆酶是多铜氧化酶，可氧化一些底物，如酚类、芳香胺和非酚类底物。漆酶和产漆酶微生物对污染土壤、工业污染物和外源化合物中芳香化合物的生物修复具有重要影响。MnP酶活变化总体呈现先上升后下降的趋势，在第5天和第8天出现2个高峰，分别为1770.75U L^-1和1752.25U L^-1。MnP将Mn²⁺氧化为Mn³⁺，再与有机酸螯合,可以氧化木质素中的酚类结构。细菌中的LiP、Lac和MnP也被许多研究者检测到并分析，但本发明中的这些酶活性都高于他们研究的K.pneumoniae,Streptomyces sp.S6和Bacillussubtilis WPI的酶活。总的来说，整个培养过程中菌株LD3都表现出较高的木质素降解酶活性，这证实了其具有优良的木质素降解能力。

实施例3：耐高温木质素降解菌在好氧堆肥中的应用

将菌株LD3按5％的接种量接种于250mL木质素培养基中,50℃170r min^-1培养至第4天收集菌液。然后将菌液以3～8％(V/M)的比例添加到餐厨垃圾和木屑的混合物中，餐厨垃圾和木屑的质量比为3：1，再加入2～8‰的复合微生物菌剂(秸秆生物反应堆专用酵素菌速腐剂，有效活菌数目≥2亿/克，肥料登记证编号：微生物肥(2003)准字(0107)号，淮安大华生物科技有限公司)后投入发酵罐进行好氧堆肥，此组命名为实验组(LD)，另一组不接种菌株LD3的堆肥组为对照组(CK)。通风速率为4～10L/min/kg，每周搅拌2次，每次1～2h，发酵罐连接着3个温度探针实时记录堆体温度，堆肥周期至少为42天。分别于第0，2，10，17，24，31，42天从2个堆肥体系取样，测定纤维素、半纤维素、木质素、总氮(TN)和总磷(TP)的含量。

实验结果：如图4a所示，堆肥开始后易分解有机物在微生物作用下迅速分解释放大量的热，导致2组的温度迅速升高。LD组在第二天就达到50℃，而CK组则是在第3天达到50℃。LD组的最高温度为59.3℃，高温期维持了14天。而对照组的升温相对慢一些，最高仅为56.7℃，维持了10天的高温期。这是由于接种高温木质素降解菌可有效促进木质纤维素等难降解有机物的降解，从而释放更多的热量。在堆肥后期，所有堆肥的温度趋于稳定，并维持在接近环境温度的水平，这表明堆肥已进入成熟阶段，产品已彻底分解。所有实验组均达到了美国环境署规定的55℃以上的高温必须持续3天以上的标准，保证了堆肥的质量。此外，接种Aneurinibacillus sp.LD3更有利于杀灭堆肥中的寄生卵和病原菌，消除有害于植物生长的有毒物质。

而木质纤维素作为好氧堆肥的主要原材料，其分解速率直接影响堆肥腐熟度及产品肥效。2个堆肥体系中纤维素含量变化呈相似的趋势，即在堆肥前一周变化较小，之后随着堆肥的进行逐渐降低，且LD组的纤维素含量始终低于对照组(图4b)。微生物一般优先利用蛋白质、单糖等较易分解的有机物，当这些组分被消耗后微生物才开始通过代谢调节作用转而以较难降解的物质为营养源，因此堆肥前期纤维素含量变化不大。之后，堆肥中的纤维素含量降低可能是由于半纤维素和木质素的降解导致屏障系统减弱。堆肥结束时，2组纤维素含量较初始时降低了22.3％-31.6％，其中LD组的纤维素含量降低的最多，为31.6％。这说明接种高温木质素降解菌可以促进堆肥物料中纤维素的分解。

在整个堆肥过程中，2组的半纤维素含量呈连续下降的趋势(图4c)。在堆肥的前10天，CK和LD组的半纤维素含量快速下降，分别从14.7％下降到14.07％和12.38％，这可能和高温期微生物活性较高有关。到堆肥的第42天，CK组和LD组的半纤维素含量分别减少了3.51％和4.64％。说明接种功能微生物可以提高微生物的活性，从而提高微生物对半纤维素的利用。

堆肥过程中木质素的含量变化和纤维素及半纤维素的变化有所不同，结果如图4d所示。在堆肥的前两周，木质素的含量保持平稳，甚至略有增加(CK组)。这可能由于木质素本身结构十分复杂，木质素基础单体之间的连接无规律可循，能降解木质素的微生物十分有限，导致堆肥升温期和高温期的易分解物质的降解速度高于木质素。在整个堆肥过程中LD组的木质素含量始终低于对照组，这可以解释为木质素降解酶活性较高导致的。堆肥结束时，LD组的木质素含量为16.76％，而CK组为18.44％。简言之，通过接种功能微生物进行群落调控可以显著提高餐厨垃圾堆肥中木质纤维素等难降解物质的分解，从而促进堆肥的腐熟，提高堆肥产品质量。

氮元素是植物和微生物自身物质组成的基本单元，因此，堆肥产品中总氮含量对土壤中微生物活性及植物的生长具有极其重要的意义。图4e显示了堆肥过程中总氮含量的变化。堆肥的前两周，微生物在高温条件下对有机态氮的利用及水溶性氮随水分流失，造成氮素损失，总氮含量迅速下降。之后，由于堆肥体系的有机质不断分解，物料总重量减轻，造成总氮相对含量随之上升。堆肥结束时，LD组的总氮含量高于CK组，说明接种微生物可以减少氮素损失，可能是由于LD组的有机组分比对照组减少的更多。

堆肥过程中总磷、速效磷、有机磷和无机磷等多种形态磷会相互转化，但不会因挥发而造成磷含量的降低。图4f展示了2个堆肥体系中总磷含量随时间的变化。总磷含量在堆肥的前3周快速增加，之后趋于稳定。堆肥初期有机质随着温度上升、微生物活性提高而快速分解，产生大量有机酸，有机磷酸盐含量随之上升，因此总磷含量快速增加。堆肥结束时，CK和LD组的总磷含量分别为16.52和18.24g kg^-1。和初始总磷含量相比，分别增加了14.8％和26.75％。LD组的总磷含量较对照组相比显著增加和这组中的相应的有机质含量大幅减少有关。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一株耐高温木质素降解菌，其特征在于：名称为解硫胺素芽孢杆菌(Aneurinibacillus sp.)LD3,保藏编号：CCTCC NO:M 20221533。

2.权利要求1所述的耐高温木质素降解菌的应用，其特征在于，用于木质素的降解。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，在45～55℃条件下降解木质素。

4.权利要求1所述的耐高温木质素降解菌的应用，其特征在于，用于分泌木质素过氧化物酶、漆酶和锰过氧化物酶中的至少一种。

5.权利要求1所述的耐高温木质素降解菌的应用，其特征在于，用于好氧堆肥。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，

所述的好氧堆肥包括餐厨垃圾、园林绿化垃圾、农业废弃物或中药渣堆肥。

7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：堆肥时，通风速率为4～10L/min/kg，每周搅拌至少2次，每次1～2h，堆肥周期至少为42天。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：复合微生物菌剂为常规堆肥发酵菌剂，优选包括嗜热子囊菌、曲霉菌、芽孢杆菌和鞘氨醇杆菌，每种菌的活菌数≥2亿cfu/g，进一步优选四种菌比例相同。