CN115627284A

CN115627284A - 一种黑皮鸡枞菌高产胞外多糖的方法

Info

Publication number: CN115627284A
Application number: CN202211284056.5A
Authority: CN
Inventors: 侯银臣; 杨盛茹; 叶树才; 梁锡坤; 胡君易; 刘志峰; 梁金明
Original assignee: Zhongshan Agricultural Science And Technology Extension Center
Current assignee: Zhongshan Agricultural Science And Technology Extension Center
Priority date: 2022-10-20
Filing date: 2022-10-20
Publication date: 2023-01-20

Abstract

本发明涉及一种黑皮鸡枞菌高产胞外多糖的方法。属于生物技术领域。该方法是以黑皮鸡枞菌原有培养基和羊胎盘水溶性提取物HG‑1为主要发酵原料，以开黑皮鸡枞菌为发酵菌株，黑皮鸡枞菌原有培养基经杀菌、冷却后添加一定比例的经0.22μm无菌滤膜过滤后的羊胎盘水溶性提取物HG‑1，然后在无菌条件下接入发酵菌株进行发酵，发酵结束后，经浓缩、醇沉、去杂、干燥得到黑皮鸡枞菌胞外多糖。通过本发明，与原有条件相比，黑皮鸡枞菌胞外多糖产量提高25%以上，效果显著。

Description

一种黑皮鸡枞菌高产胞外多糖的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种黑皮鸡枞菌高产胞外多糖的方法。

背景技术

鸡枞菌属于担子菌科，是一种珍罕的自然野生食用菌，它以其独特的食用和药用功效被称作“菌中之王”。野生鸡枞菌主要种植地有云南、四川、贵州三地以及长江以南地区，是我国主要药用真菌之一，鸡枞菌除富含机体必要的蛋白质，脂肪外，还含有皂苷、多酚、多糖和黄酮等多种活性物质，这类生理活性物质具有提高人体免疫力、抗肿瘤、抗氧化性等药理作用，因此，经常被用在受损脏腑的修复以及调节身体机能等方面。其中多糖具有明显降血脂和调节机体免疫力的作用，同时备受人们关注的主要原因是其兼具口味鲜美醇香、口感极佳、可食药两用、营养价值高等特点，按照《本草纲目》及《寿世秘典》记载：“本品”无毒、补脾、清心，气味甘、平等特点，对消化不良、止血、止痛有一定的临床应用价值。

鸡枞菌是与白蚁共生一种菌类，其生长条件较为复杂，子实体只能以野生采摘的方式在部分地区特定的季节获取，同时，鸡枞菌人工栽培时间长，易受到外界的影响，制约了种质资源的开发。而液体发酵技术具有可连续化生产、发酵时间短、生产效能高等特点。此外，在发酵过程中，除了产生大量的菌丝和芽胞，还产生了多肽、多糖和氨基酸等活性成分，许多研究结果显示，液态发酵法比人工栽培所产生的多糖要高得多，因而液态发酵技术是一项非常有意义的培养方法，可以有效地促进鸡枞菌的生产、质量和资源的合理利用。已知食用菌多糖常被作为营养强化剂加入食品中增加保健作用，它不但能唤醒T细胞、B细胞、NK细胞，还能刺激细胞因子的产生，激活补体。另外，鸡枞菌多糖对加强小鼠的细胞免疫和体液免疫方面的功能作用最为明显，具有开发自然免疫增效剂的潜力。因此，本专利可以为进一步了解和利用野生鸡枞菌的液态发酵提供更多的资料，从而为鸡枞菌的进一步发展和价值开发打下基础。

经文献分析表明：目前国内外关于鸡枞菌多糖方面已经有了较多的研究，但多集中在鸡枞菌多糖的生物活性方面，鸡枞菌胞外多糖培养基优化方面的研究较少，且均为不同氮源、不同碳源及不同添加量方面的研究，目前尚未有关于生物活性蛋白对其胞外多糖含量影响方面的研究。

多糖代谢途径有多种蛋白酶参与，代谢通路较为复杂。真菌类胞外多糖的代谢途径是单糖在糖基转移酶的作用下从糖核苷酸依次转移到脂类载体上，从而形成重复单元，随后在相关蛋白酶作用下聚合并输出形成多糖。多糖代谢途径中，尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶能够可逆的催化 UTP 和葡萄糖-1-磷酸生成 UDP-葡萄糖和焦磷酸，是葡萄糖代谢途径的关键酶，在多糖代谢中具有重要作用。本发明人一直从事生物活性肽方面的研究，经研究发现羊胎盘盐溶性提取物HG-1对多种生物酶活性具有显著性影响。在黑皮鸡枞菌产胞外多糖研究过程中发现，羊胎盘盐溶性提取物HG-1的添加可显著增加黑皮鸡枞菌胞外多糖产量，为鸡枞菌多糖的进一步利用开发提供了物质基础。

发明内容

本发明的目的在于通过将羊胎盘盐溶性提取物为羊胎盘盐溶后，其中分子量100KDa-150KDa的组分，应用于黑皮鸡枞菌胞外多糖的生产，提供了一种黑皮鸡枞菌高产胞外多糖的方法。

羊胎盘盐溶性提取物HG-1是一种从羊胎盘中提取出来的盐溶性提取物，其具体制备方法为：将羊胎盘清洗、加0.9%盐水、打浆、离心得到上清，然后经分子截留得到的其中分子量在100KDa-150KDa的组分，最后经冷冻干燥得到的一种提取物，命名为羊胎盘盐溶性提取物HG-1。

黑皮鸡枞菌高产胞外多糖的方法，包括如下步骤：

（1）黑皮鸡枞菌培养基：可溶性淀粉25 g/L，牛肉粉2g/L，脱脂麦胚 1 g/L，其余为水，培养基的为pH 6.5，121℃条件下灭菌20min，然后冷却至28℃。

（2）羊胎盘盐溶性提取物HG-1经0.22μm无菌滤膜过滤后加入到经过灭菌和冷却后的黑皮鸡枞菌原有培养基中。

（3）将黑皮鸡枞菌种子液在无菌条件下接入上述混合后的培养基中，然后在28℃，200r/min条件下发酵7天。

（4）发酵结束后，发酵液在4000r/min条件下离心得到上清液，上清液浓缩后加入5倍体积乙醇，4℃条件下静置12h，然后离心得到粗多糖，加入少量的蒸馏水进行溶解，并将4倍体积的四氯仿-正戊醇溶液试剂（正丁醇：三氯甲烷=1:4）加入溶液中，充分震荡10 min，然后4000 r/min离心15 min，再将其上清液分离出来。以上步骤重复4次后，将上清液置于透析袋内，透析24 h，后冷冻干燥获得纯化的黑皮鸡枞菌胞外多糖。

步骤（2）中羊胎盘盐溶性提取物HG-1的添加量为0.1 % - 0.2%。

步骤（3）中黑皮鸡枞菌种子液的添加量为5%-10%。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：黑皮鸡枞菌在原有的发酵条件下，额外添加羊胎盘盐溶性提取物HG-1后，胞外多糖产量提升25%以上，可以大幅度的提升黑皮鸡枞菌液体深层发酵胞外多糖的产量。发酵结束后，收集不同制备条件下的菌丝体，对菌丝体破碎后检测其中的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性发现，检测结果发现添加羊胎盘盐溶性提取物HG-1发酵后菌丝体的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性显著增加，结合国内外相关文献和研究结果分析表明：羊胎盘盐溶性提取物HG-1主要是通过调控尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性从而影响胞外多糖产量的。

具体实施方式

本发明以下将结合实施例作进一步描述，所有实施例中，使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，黑皮鸡枞菌的菌包购自山东远洋农业开发有限公司，子实体长出后，从子实体分离选育得到本发明所使用的黑皮鸡枞菌，其余所用的化学试剂或者原料，均可从商业途径购买得到。

实施例1：

（1）黑皮鸡枞菌原有培养基：可溶性淀粉25 g，牛肉粉2g，脱脂麦胚 1 g，纯化水1L，pH 6.5，分装到10个500mL三角瓶中，每瓶100mL，用8层纱布封口，121℃条件下灭菌20min，然后冷却至28℃。

（2）将黑皮鸡枞菌种子液在超净工作台中，无菌条件下接入上述培养基中，然后在28℃，200r/min条件下发酵7天，种子液接种量为5%。

（3）发酵结束后，发酵液在4000r/min条件下离心得到上清液，检测上清液中的总糖和还原糖，黑皮鸡枞菌胞外多糖=总糖-还原糖，经计算胞外多糖含量为381.82±1.36µg/mL，收集菌丝体（即离心后的沉淀部分），对菌丝体破碎后检测其中的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性，其活性为20.45µg/（g·h）。

实施例2：

（1）黑皮鸡枞菌原有培养基：可溶性淀粉25 g，牛肉粉2g，脱脂麦胚 1 g，羊胎盘盐溶性提取物HG-1 0.1mL，纯化水1L，pH 6.5，分装到10个500mL三角瓶中，每瓶100mL，用8层纱布封口，121℃条件下灭菌20min，然后冷却至28℃。

（3）将黑皮鸡枞菌种子液在超净工作台中，无菌条件下接入上述培养基中，然后在28℃，200r/min条件下发酵7天，种子液接种量为5%。

（4）发酵结束后，发酵液在4000r/min条件下离心得到上清液，检测上清液中的总糖和还原糖，黑皮鸡枞菌胞外多糖=总糖-还原糖，经计算胞外多糖含量为382.58±2.06µg/mL，与实施例1相比胞外多糖含量无显著性变化，收集菌丝体（即离心后的沉淀部分），对菌丝体破碎后检测其中的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性，其活性为20.62µg/（g·h），与实施例1相比无显著性变化。

步骤（1）中所述的羊胎盘盐溶性提取物HG-1是一种从羊胎盘中提取出来的盐溶性提取物，其具体制备方法为：将羊胎盘清洗、加0.9%盐水、打浆、离心得到上清，然后经分子截留得到的其中分子量在100KDa-150KDa的组分，最后经冷冻干燥得到的一种提取物，命名为羊胎盘盐溶性提取物HG-1。

实施例3：

（2）羊胎盘盐溶性提取物HG-1经0.22μm无菌滤膜过滤后加入到经过灭菌和冷却后的黑皮鸡枞菌原有培养基中，羊胎盘盐溶性提取物HG-1的添加量为0.1%，每瓶的添加量为0.1mL。

（3）将黑皮鸡枞菌种子液在超净工作台中，无菌条件下接入上述混合后的培养基中，然后在28℃，200r/min条件下发酵7天，种子液接种量为5%。

（4）发酵结束后，发酵液在4000r/min条件下离心得到上清液，检测上清液中的总糖和还原糖，黑皮鸡枞菌胞外多糖=总糖-还原糖，经计算胞外多糖含量为482.91±2.41µg/mL，与实施例1相比胞外多糖含量增加了26.48%。收集菌丝体（即离心后的沉淀部分），对菌丝体破碎后检测其中的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性，其活性为23.73µg/（g·h），与实施例1相比增加了16.04%。

步骤（2）中所述的羊胎盘盐溶性提取物HG-1是一种从羊胎盘中提取出来的盐溶性提取物，其具体制备方法为：将羊胎盘清洗、加0.9%盐水、打浆、离心得到上清，然后经分子截留得到的其中分子量在100KDa-150KDa的组分，最后经冷冻干燥得到的一种提取物，命名为羊胎盘盐溶性提取物HG-1。

实施例4：

（3）将黑皮鸡枞菌种子液在超净工作台中，无菌条件下接入上述混合后的培养基中，然后在28℃，200r/min条件下发酵7天，种子液接种量为10%。

（4）发酵结束后，发酵液在4000r/min条件下离心得到上清液，检测上清液中的总糖和还原糖，黑皮鸡枞菌胞外多糖=总糖-还原糖，经计算胞外多糖含量为493.12±2.08µg/mL，与实施例1相比胞外多糖含量增加了29.15%。收集菌丝体（即离心后的沉淀部分），对菌丝体破碎后检测其中的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性，其活性为24.25µg/（g·h），与实施例1相比增加了18.58%。

实施例5：

（2）羊胎盘盐溶性提取物HG-1经0.22μm无菌滤膜过滤后加入到经过灭菌和冷却后的黑皮鸡枞菌原有培养基中，羊胎盘盐溶性提取物HG-1的添加量为0.15%，每瓶的添加量为0.15mL。

（4）发酵结束后，发酵液在4000r/min条件下离心得到上清液，检测上清液中的总糖和还原糖，黑皮鸡枞菌胞外多糖=总糖-还原糖，经计算胞外多糖含量为501.68±1.98µg/mL，与实施例1相比胞外多糖含量增加了31.39%。收集菌丝体（即离心后的沉淀部分），对菌丝体破碎后检测其中的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性，其活性为25.78µg/（g·h），与实施例1相比增加了26.06% 。

实施例6：

（2）羊胎盘盐溶性提取物HG-1经0.22μm无菌滤膜过滤后加入到经过灭菌和冷却后的黑皮鸡枞菌原有培养基中，羊胎盘盐溶性提取物HG-1的添加量为0.2%，每瓶的添加量为0.2mL。

（4）发酵结束后，发酵液在4000r/min条件下离心得到上清液，检测上清液中的总糖和还原糖，黑皮鸡枞菌胞外多糖=总糖-还原糖，经计算胞外多糖含量为527.59±2.48µg/mL，与实施例1相比胞外多糖含量增加了38.17%。收集菌丝体（即离心后的沉淀部分），对菌丝体破碎后检测其中的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性，其活性为26.55µg/（g·h），与实施例1相比增加了29.83% 。

Claims

1.羊胎盘盐溶性提取物在黑皮鸡枞菌高产胞外多糖中的应用，其特征在于，所述羊胎盘盐溶性提取物为羊胎盘盐溶后，其中分子量100KDa-150KDa的组分。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，黑皮鸡枞菌高产胞外多糖的方法为，将羊胎盘盐溶性提取物和黑皮鸡培养基灭菌后混合组成混合培养基，黑皮鸡枞菌种子液在无菌条件下无菌条件下接入混合培养基中发酵，羊胎盘盐溶性提取物的质量百分比为0.1 % -0.2%，黑皮鸡枞菌种子液的质量百分比为5%-10%，发酵结束后，离心得到上清液，上清液浓缩后反复加入溶剂重新进行溶解、分离，重复若干次后冷冻干燥获得纯化的黑皮鸡枞菌胞外多糖。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述黑皮鸡枞菌培养基包括可溶性淀粉25g/L，牛肉粉2g/L，脱脂麦胚 1 g/L，其余为纯化水。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述羊胎盘盐溶性提取物经0.22μm无菌滤膜过滤后加入到经过灭菌和冷却后的黑皮鸡枞菌培养基中。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，发酵温度为28℃， 200r/min条件下发酵7天。

6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，发酵结束后，发酵液在4000r/min条件下离心得到上清液，上清液浓缩后加入5倍体积乙醇，4℃条件下静置12h，然后离心得到粗多糖，加入蒸馏水进行溶解，并将4倍体积的正丁醇：三氯甲烷=1:4的溶剂加入溶液中，震荡10min，然后4000 r/min离心15 min，再将其上清液分离出来，以上步骤重复4次后，将上清液置于透析袋内，透析24 h，后冷冻干燥获得纯化的黑皮鸡枞菌胞外多糖。

7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述羊胎盘盐溶性提取物的制备方法为：将羊胎盘清洗、加0.9%盐水、打浆、离心得到上清，然后经分子截留得到的其中分子量在100KDa-150KDa的组分，最后经冷冻干燥得到。