CN115605264A - 化妆品组合物 - Google Patents
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Abstract
提供了包含栀子属果实提取物的化妆品组合物。
Description
本发明涉及包含栀子属(Gardenia)果实提取物的化妆品组合物。
在现代社会中，数字技术变得越来越普遍，导致暴露于蓝光的情 况增加。
蓝光是一种高能光，并且是可见光光谱的一部分，具有400- 495nm之间的波长。典型的蓝光源包括移动电话、计算机、平板电脑、 电视和灯。大部分曝光来自于发光二极管(LED)。
人们越来越多地通过日常技术暴露在蓝光下。2015年皮尤研究中 心(PewResearch Center)的研究发现，68％的美国成年人拥有智能手 机，45％的成年人拥有平板电脑。该研究还发现技术所有权的水平因 年龄而异；86％的18-29岁的美国人和83％的30-49岁的美国人拥有 智能手机。相反，老年美国人的计算机拥有率较低。
蓝光显然影响皮肤并可损伤细胞。此外，Dong等人证明蓝光扰乱 了人们的昼夜节律，从而影响了人们的睡眠质量。
褪黑素是众所周知的睡眠相关激素，由我们的生物体(脑和皮肤) 以每日周期天然分泌。其产生高峰发生在夜间，并且在我们入睡的能 力和我们的睡眠质量中起关键作用。此外，褪黑素还充当强力抗衰老 剂，这归因于其强抗氧化特性，并且通过其与褪黑素膜受体MT1R的 结合触发生物防御级联。
暴露于蓝光导致褪黑素产生节律紊乱，引起皮肤老化(抗氧化防御 丧失和线粒体损伤)和睡眠相关功能紊乱(难以入睡、夜间醒来若干次、 早晨疲劳)。这导致皮肤的过早老化，皮肤更多地暴露于外部侵袭并且 在人体的静息阶段期间不能自我恢复。
因此，本发明的目的在于提供一种用于防止由暴露于蓝光引起的 负面影响的美容方式。
本发明的化妆品活性剂和化妆品组合物已经解决了该问题。
在第一个方面，本发明提供了包含栀子属果实提取物的化妆品活 性剂。
栀子属植物，也称作栀子(cape jasmine)或danh-danh，其为咖啡 茜草科(familyRubiaceae)的常绿开花植物。它起源于亚洲，并且最常 见的是在越南、中国南方、韩国、中国台湾、日本、缅甸、印度和孟 加拉国野生生长。世界上存在大约250种栀子属(Gardenia)。
在整个本公开中，术语“栀子属”旨在涵盖栀子属的所有物种，包 括栀子(Gardenia jasminoides)、栀子花(Gardenia angustifolia)、栀子 花(Gardeniaaugusta)、栀子仁(Gardenia florida)、大花栀子(Gardenia grandiflora)、水栀子(Gardenia radicans)，Gardenia longisepala、 Gardenia maruba和Gardenia pictorum，且特别是栀子(Gardenia jasminoides J.Ellis)。
传统上，栀子属果实已经用于民间医学的口服应用，用于治疗炎 症、头痛、水肿、发热、肝病和高血压。芳香的花也用于香茶，并且 有时甚至作为美味品生食、腌制或保存在蜂蜜中。目前栀子属植物主 要用作食品添加剂、染料和观赏植物。
栀子属果实由于天然类胡萝卜素色素而具有红色。特别地，它们 包含藏红花酸(crocetin)、藏红花素(crocin)和其它藏红花酸酯。
贯穿于本公开中使用的术语“藏红花素”是指包括苷元藏红花酸、 其二-龙胆二糖苷衍生物藏红花素以及其他藏红花酸单-或二葡糖苷和 任意其他具有8,8'-二阿朴胡萝卜素二酸(8,8'-diapocarotenedioic acid) 核的藏红花酸衍生物。
藏红花酸为藏红花(Crocus sativus L.)的花和栀子(Gardenia jasminoides)果实中发现的天然脱辅基类胡萝卜素二羧酸 (apocarotenoid dicarboxylic acid)。其具有如下结构：
藏红花素是由二糖龙胆二糖和二羧酸藏红花酸形成的二酯。其具 有如下结构：
藏红花素是栀子属果实提取物中的主要组分之一。
藏红花素是特别令人感兴趣的，因为它们是可溶于水的少数类胡 萝卜素之一，这使得它们适合作为食品应用的着色剂。
藏红花素的关键缺点之一在于其众所周知的不稳定性，特别是归 因于在光、降低pH和升高温度的影响下的降解。这一事实使得栀子 属果实提取物和藏红花素的化妆品用途通常即使不是不可能也是困难 的。
因此，重要的是稳定在化妆品活性剂中的栀子属果实提取物。
因此，本发明的化妆品活性剂还包含溶剂，其能够稳定提取物， 特别是其中包含的藏红花素。
令人惊讶地，已经发现，通过添加具有至少为5的pH的低共熔 (eutectic)溶剂可以改善藏红花素的稳定性。该发现已经通过长期稳定 性研究得到证实(参见下面的实施例2)。
因此，本发明的化妆品活性剂中使用的溶剂是具有pH至少为5 的低共熔溶剂。低共熔溶剂允许栀子属果实提取物的良好增溶，并且 还允许其稳定化，特别是其中包含的藏红花素的稳定化。
低共熔溶剂通常是已知的。它们由几种组分组成，每种组分典型 地在特定的浓度范围内，并且具有比单独的组分更低的熔点。
本发明的化妆品活性剂用于局部施用。
已经发现本发明的化妆品活性剂具有几种有利的效果，这已经通 过体外和临床研究得以证明(参见下面的实施例)。
特别地，发现其具有抗衰老性质并改善睡眠质量，特别是对于高 度暴露于蓝光的人。
不受理论的束缚，认为当皮肤暴露于数字压力即蓝光时，本发明 的化妆品活性剂保护皮肤的褪黑素的产生，从而防止皮肤过早老化。
已经发现，存在于本发明的化妆品活性剂中的藏红花素不仅保护 天然皮肤褪黑素循环，而且还可以被皮肤微生物区系转化成藏红花酸。 基于微生物组研究(参见下面的实施例3)，藏红花素在培养物中在约 210小时内完全转化成藏红花酸。
不受理论的束缚，申请人认为藏红花酸能够与主要的褪黑素受体 MT1R结合，而藏红花素不能与主要的褪黑素受体MT1R结合。该假 设得到基于MT1R、藏红花素、藏红花酸和褪黑素的晶体结构的分子 建模研究的支持，其从蛋白质数据库(Protein Data Bank)(www.rcsb.ora)检索。每种其他分子与MT1R的分子相互作用的计算 显示藏红花酸具有3.6232的正亲和力得分，这非常接近褪黑素的亲和 力得分(5.6553)，而藏红花素具有-36.4141的负亲和力得分。
因此，认为藏红花酸能够触发皮肤褪黑素受体(MT1)。因此，由 于其被皮肤微生物组活化，本发明的化妆品活性剂可以在皮肤防御和 修复机制中发挥积极作用。
临床测试(参见下面的实施例8)表明，本发明的化妆品活性剂逆转 了可见的衰老征象(与安慰剂相比，皱纹数-21％)。因此，它完全适合 于预防和治愈皮肤过早老化。这一发现也通过小组成员的自我评估得 到证实，在此期间80％的志愿者表示他们的皮肤更水化(安慰剂为 40％)，并且75％的志愿者表示他们的皮肤更光滑(安慰剂为45％)。
更具体地，本发明的化妆品活性剂能够在体外保护线粒体网络和 细胞铺展(参见下面的实施例5和6)。经证实暴露于蓝光会损害线粒体 网络，然而，在本发明的化妆品活性剂的存在下，网络较少断裂。细 胞铺展也受到蓝光的显著影响，但本发明的化妆品活性剂也能够防止 这种影响。
本发明的化妆品活性剂还能够离体降低氧化蛋白质含量(参见下面 的实施例7)。在暴露于蓝光后，人皮肤外植体中的氧化蛋白含量显著 增加。这种作用可以通过本发明的化妆品活性剂逆转。
此外，发现本发明的化妆品活性剂在体外保持褪黑素循环(参见下 面的实施例4)，从而确保在夜间褪黑素释放，且由此保护皮肤免受数 字压力。
进一步发现本发明的化妆品活性剂对睡眠质量具有积极作用，从 而有助于整体健康。
特别地，已经发现局部施用化妆品活性剂减少夜间醒来的次数并 增加入睡的容易度(参见下面实施例8中的临床研究)。认为化妆品活 性剂充当植物褪黑素样分子，从而激活与昼夜节律相关的生物机制。
在本发明的一个实施方案中，低共熔溶剂具有至少5.5，更优选至 少6，且最优选至少7的pH。由于较高的pH，所以改善了栀子属果 实提取物中藏红花素的稳定性。然而，对于皮肤护理应用而言，期望 pH不过高，例如不高于10，更优选不高于9，且最优选不高于8。
本发明的一个实施方案中，低共熔溶剂的组分是天然来源的。由 天然来源的组分形成的低共熔溶剂通常为已知的，并且典型地被描述 为“天然低共熔溶剂”或NaDES。
更优选地，根据ISO16128，低共熔溶剂的组分全部为100％天然 来源。
本发明的一个实施方案中，低共熔溶剂包含甜菜碱、甘油和水。 已经发现，这种低共熔溶剂特别适合于栀子属果实提取物的增溶和稳 定。此外，甜菜碱可以在皮肤护理应用中充当保湿剂。
基于甘油、甜菜碱和水的低共熔溶剂通常是已知的(例如来自 WO2016/162703)。除了避免常规合成有机溶剂的缺点—例如固有的毒 性、高挥发性或缺乏可再生性—之外，它们还具有天然来源的优点。 因此，它们也被描述为“天然低共熔溶剂”或NaDES。
在本发明的一个实施方案中，低共熔溶剂包含约30至约40wt％ 的甜菜碱、约35至约45wt％的甘油和约20至约30wt％的水，更优选 约35wt％的甜菜碱、约40wt％的甘油和约25wt％的水。
在一个特别优选的实施方案中，低共熔溶剂由34.6wt％的甜菜碱、 40.4wt％的甘油和25.0wt％的水组成。该低共熔溶剂具有约7.45的 pH。
不受理论束缚，申请人认为，在基于甜菜碱、甘油和水的低共熔 溶剂的存在下，发生酯交换，由此藏红花素的龙胆二糖苷部分中的至 少一个被甘油-甜菜碱部分替代，形成以下加合物：
该假设已经得到了2D-NMR分析(NOESY和HSQC)的支持。
该衍生物也包括在如上述所定义的术语“藏红花素”中。
在一个可替代选择的实施方案中，低共熔溶剂为戊二醇、甜菜碱 和水的混合物。特别地，低共熔溶剂可以包含约35至约50wt％的戊 二醇、约25至约35wt％的甜菜碱和约20至约35wt％的水，更优选约 44wt％的戊二醇、约29wt％的甜菜碱和约28wt％的水。在一个特别 优选的实施方案中，低共熔溶剂由43.7wt％的戊二醇、28.8wt％的甜 菜碱和27.5wt％的水组成。该低共熔溶剂具有约6.85的pH。
应当选择本发明的化妆品活性剂中栀子属果实提取物的浓度，以 便可以实现上述有利效果。
在本发明的一个实施方案中，化妆品活性剂中栀子属果实提取物 的浓度为约0.01至约10wt％，更优选约0.05至约1wt％，且最优选 约0.1wt％。
为了确保本发明的化妆品活性剂的活性，优选栀子属果实提取物 中相对高含量的藏红花素。正如从可商购的栀子属果实提取物的分析 (参见下面的实施例1)可以观察到的，藏红花素含量可以从一个供应商 到另一个供应商变化。
在本发明的一个实施方案中，栀子属果实提取物包含至少1wt％ 的藏红花素，更优选至少10wt％的藏红花素，且最优选至少25wt％ 的藏红花素。
在另一方面，本发明提供了一种化妆品组合物，其包含本发明的 化妆品活性剂和化妆品可接受的赋形剂。本发明的化妆品组合物旨在 用于局部施用。
在制备用于人体皮肤的化妆品制剂中常用的任何赋形剂均可用于 本发明。适合的赋形剂包括但不限于可以影响栀子属果实提取物的感 官特性、皮肤渗透和生物利用度的成分。更具体地，它们包括液体， 例如水、油或表面活性剂，包括石油、动物、植物或合成来源的那些， 例如但不限于花生油、大豆油、矿物油、芝麻油、蓖麻油、聚山梨醇 酯、失水山梨醇酯、醚硫酸盐、硫酸盐、甜菜碱、糖苷、麦芽糖苷、 脂肪醇、壬苯酚聚醚、泊洛沙姆、聚氧乙烯、聚乙二醇、右旋糖、甘 油、洋地黄皂苷等。
用于局部施用于皮肤的制剂可以采取任何物理形式。例如，化妆 品组合物且特别是护肤组合物可以为脂质体组合物、混合脂质体、油 质体、非离子表面活性剂脂质体(niosomes)、醇质体(ethosomes)、毫 粒(milliparticles)、微粒、纳米粒和固体-脂质纳米粒、囊泡、胶束、 表面活性剂的混合胶束、表面活性剂-磷脂混合胶束、毫球(millispheres)、微球和纳米球、脂质球、毫胶囊(millicapsules)、微胶 囊和纳米胶囊以及微乳液和纳米乳液的形式，可以加入它们以实现栀 子属果实提取物的更大渗透。
化妆品组合物且特别是护肤组合物可以以任何固体、液体或半固 体形式制备，其用于局部施用于皮肤或通过透皮施用。因此，这些局 部或透皮施用的制剂包括但不限于霜剂、多重乳液，例如但不限于水 包油型和/或水包硅氧烷型乳液、油包水型和/或硅氧烷乳液、水/油/水 或水/硅氧烷/水型乳液和油/水/油或硅氧烷/水/硅氧烷型乳液、微乳液、 乳液和/或溶液、液晶、无水组合物、水性分散体、油、乳、香脂、泡 沫、水性或油性洗剂、水性或油性凝胶、霜剂、水-醇溶液、水-乙二 醇溶液、水凝胶、搽剂、浆液、肥皂、面膜、精华液、多糖膜、软膏、 摩丝、润发油、糊剂、粉末、棒条、笔和喷雾剂或气溶胶(喷雾剂)， 包括驻留型和洗去型制剂。
因此，本发明还提供了护肤组合物，且特别是抗衰老护肤组合物。
上文已经详细描述了本发明的化妆品活性剂的有利效果，并且因 此也描述了本发明的化妆品组合物的有利效果。
化妆品活性剂的具体实施方案也有利地适用于化妆品组合物。
在另一个方面，本发明还提供了一种减少皮肤衰老征象的方法， 所述方法包括将本发明的化妆品活性剂或化妆品组合物局部施用于皮 肤、特别是面部皮肤的步骤。以上已经详细描述了有利的效果，并且 得到下列实施例的进一步支持。
在另一个方面，本发明还提供了一种保护皮肤免受氧化应激的方 法，所述方法包括将本发明的化妆品活性剂或化妆品组合物局部施用 于皮肤、特别是面部皮肤的步骤。以上已经详细描述了有利的效果， 并且得到下列实施例的进一步支持。
在另一个方面，本发明还提供了一种保护皮肤免受蓝光影响的方 法，所述方法包括将本发明的化妆品活性剂或化妆品组合物局部施用 于皮肤、特别是面部皮肤的步骤。以上已经详细描述了有利的效果， 并且得到下列实施例的进一步支持。
在另一个方面，本发明还提供了一种保护个体的褪黑素循环的非 治疗性方法，所述方法包括将本发明的化妆品活性剂或化妆品组合物 局部施用于皮肤、特别是面部皮肤的步骤。以上已经详细描述了有利 的效果，并且得到下列实施例的进一步支持。
在另一个方面，本发明还提供了一种改善个体睡眠的非治疗方法， 所述方法包括将本发明的化妆品活性剂或化妆品组合物局部施用于皮 肤、特别是面部皮肤的步骤。以上已经详细描述了有利的效果，并且 得到下列实施例的进一步支持。
在另一个方面，本发明还涉及栀子属果实提取物在改善个体睡眠 中的用途。
特别地，本发明还涉及本发明的化妆品活性剂或化妆品组合物在 改善个体睡眠中的用途。
通过下列非限制性实施例进一步示例本发明：
实施例1：栀子属果实提取物
栀子属果实提取物商购自几个供应商。
对于本研究，商品提取物得自Indfrag Bioscience Private Limited (“佛罗里达栀子提取物(Gardenia Florida Extract)”，批号GFP-ROE- 14002和GFP-ROE-19001；中国安徽省种植的植物；根据供应商说明 书，该提取物通过水提取、分馏、浓缩、干燥和粉末化从佛罗里达栀 子(Gardenia Florida)果实中获得)和云南瑞宝生物科技股份有限公司(Yunnan Rainbow Bio-tech.Corp.,Ltd)(“栀子黄粉末(Gardenia yellow powder)”，批号ZT180201，2018年7月6日收到；在中国广 西省种植的植物；根据供应商说明书，该提取物通过提取、过滤、精 制、浓缩和喷雾干燥从栀子属果实(Gardenia jasminoides Ellis)获得)。 两种产品均为粉末形式，并且为淡黄色至微红色或褐色。
通过从每个供应商获得的干果实样品的宏观和微观鉴定、HPTLC、 DNA分析(外部供应商：TRU-ID)和HPLC确认产品的真实性。
通过HPLC-UV和LC-TOF进一步分析两个供应商的栀子属果实 提取物以确定它们的组成。发现来自Indfraq的样品包含约10wt％的 藏红花素，而云南瑞宝的样品包含约30wt％。
将商品栀子属果实提取物进一步加工如下：
-研磨
-用水(云南瑞宝)或甲醇/水75:25(Indfrag)提取
-过滤
-用乙醇(70％)吸附和解吸
-浓缩
-与麦芽糖糊精一起喷雾干燥(仅对于云南瑞宝)
然后将由此得到的固体材料溶于期望的溶剂中。
实施例2：稳定性研究
在不同条件下研究了栀子属果实提取物在不同溶剂中的稳定性。
长期稳定性
在室温和40℃下在两种不同的低共熔溶剂中测试长期稳定性：(a) 甜菜碱、乳酸和水的混合物，和(b)甜菜碱、甘油和水的混合物。单独 溶剂的pH分别为(a)3.27和(b)7.45。测试了来自云南瑞宝(a1)和(b1) 以及Indfrag(a2)和(b2)的栀子属果实提取物。
通过在50℃下混合所述组分来制备低共熔溶剂。然后加入0.1wt％ 的栀子属果实提取物(粉末形式)，并将得到的组合物加热至80℃保持 1小时。
将样品分别在室温和40℃下储存3个月期限。通过测量pH值、 加德纳指数(Gardener index)和在λmax(在250-600nm范围)处的光密度 来评估稳定性。结果如下表中所示：
正如从上文可以看出的，与甜菜碱/乳酸/水混合物相比，栀子属果 实提取物在甜菜碱/甘油/水混合物中明显更稳定。
用于阳光(“阳光测试”)和升温研究的样品
将栀子属果实提取物(粉末形式；来自云南瑞宝)分别溶于(c)水和 (d)由甜菜碱、甘油和水(35:40:25w/w)形成的低共熔溶剂。
通过在50℃下混合所述组分直至完全均匀来制备低共熔溶剂(d)。
对于每种溶剂，加入0.1wt％的栀子属果实提取物并且将得到的组 合物加热至80℃保持1小时。
在T0时，根据CIELAB鉴定样品的颜色：
| L | a* | b* | C | h* | |
| (c)水 | 67.26 | 52.94 | 114.73 | 126.35 | 65.30 |
| (d)甜菜碱/甘油/水(35:40:25w/w) | 70.56 | 49.53 | 120.15 | 129.96 | 67.60 |
阳光(“阳光测试”)
在24小时内用450W/m2(300-800nm)照射样品。在8、12、18和 24小时后，通过测量pH、颜色变化(dE2000)、加德纳指数和在 440nm处的光密度(λmax)来评估样品的稳定性。结果如下表中所示：
正如可以从上文看出的，栀子属果实提取物在由甜菜碱/甘油/水形 成的低共熔溶剂中是完全稳定的，而仅含有水的样品的光密度降低， 伴随着颜色的显著改变。
升温
将样品在24小时内分别加热至100℃和120℃。在8、12、18和 24小时后，通过测量pH、颜色变化(dE2000)、加德纳指数和在 440nm处的光密度(λmax)来评估样品的稳定性。结果如下表中所示：
再次地，水中的样品不如由甜菜碱、甘油和水组成的低共熔溶剂 中的样品稳定。特别地，水中的样品变得浑浊，并且在稍后的时间点 甚至存在沉积物形成。对于两种溶剂，颜色随时间明显变化，但对于 水中的样品，变化更明显。
实施例3：皮肤微生物组将藏红花素转化成藏红花酸(体外)
用浸渍有NaCl的无菌纱布对7名志愿者在5个区域进行皮肤微 生物组的取样：前额、脸颊、鼻、颈部、前臂。将所有样品合并得到 代表性皮肤微生物群组合物。
将由此得到的微生物组在液体培养基(缓冲的HT培养基)中在 30℃在藏红花素存在下培养。定期收集上清液并通过HPLC-MS分析 以检测藏红花素和藏红花酸。
结果如下表中所示：
| 时间 | 0h | 18h | 42h | 66h | 90h | 162h | 186h | 210h |
| 藏红花素浓度* | 100％ | 100％ | 47.5％ | 2.9％ | 0.1％ | -- | -- | -- |
| 藏红花酸浓度* | -- | -- | 0.7％ | 7.9％ | 30.5％ | 65.3％ | 101.3％ | 101.3％ |
*检测到的最大浓度％
正如从上文可以看出的，皮肤表面上存在的微生物组在几天内将 藏红花素转化成藏红花酸。
实施例4：褪黑素释放评估(体外)
在人感觉神经元和原代角质形成细胞的体外共培养模型中测试蓝 光对褪黑素释放的影响。
细胞培养
感觉神经元衍生自hiPS(人诱导多能干细胞)细胞，其本身得自人 成纤维细胞。将hiPS以每孔250,000个细胞的密度接种到分化培养基 中涂覆有
(Corning，参考号：354277，批号：72005017)的 6-孔板中，所述分化培养基由补充10％敲除血清替代物(KSR，Life Technologies，参考号：10828028，批号：1896527)、0.1μM视黄酸 (Sigma，参考号：R4643，批号：SLBF3638V)、中枢分化途径抑制剂 和1％青霉素-链霉素抗生素的混合物(PS，Panbiotech，参考号：P06- 07100，批号：7631018)的DMEM-F12(Panbiotech，参考号：P04- 41450，批号：2730618)组成。将细胞在37℃和5％CO2下维持在培 养物中6天。每2天更换一次培养基。
培养6天后，在37℃下使用Accutase(Sigma Aldrich参考号： A6964，批号：SLBT9789V)将细胞解离10分钟。通过加入培养基终 止反应。将细胞悬浮液以1200rpm离心5min。通过用台盼蓝(trypan blue)进行细胞计数来确定细胞活力，并将细胞以100,000个细胞/孔的 密度接种到之前使用的相同分化培养基中涂覆有
薄层的24- 孔板中的。
培养9天后，用感觉神经元的成熟培养基替换该培养基。该成熟 培养基由补充1％N2(Life Technologies，参考号：11520536，批号：2004543)、10ng/mL BDNF(PanBiotech，参考号：CB-1115002，批 号：051861)、10ng/mL GDNF(PeproTech，参考号：450-10，批号：H170806)、10ng/mL NT3(PeproTech，参考号：450-03，批号： H171010)、10ng/mL NGF(Sigma，参考号：N1408，批号： SLBW7063)和1％抗生素PS的DMEM-F12组成。将细胞维持在37℃和5％CO2的培养中。每隔2-3天更换一次培养基。
培养14天后，将角质形成细胞加入到平板上部的分化的hiPS细 胞层中。
将来源于30岁供体的皮肤外植体的角质形成细胞预先在角质形成 细胞生长培养基(Lonza，参考号：192152，批号723883)中循环扩增， 然后通过胰蛋白酶解离并冷冻。将这些角质形成细胞解冻，并通过细 胞计数测定细胞活力。将角质形成细胞以每孔30,000个细胞接种在由 2/3的感觉神经元培养基和1/3的角质形成细胞生长培养基组成的培养 基中。将细胞维持在37℃和5％CO2下培养。每隔2-3天更换一次培 养基。
开发了基于使用谷氨酸和温度升高(“日”阶段)的循环方案。此外， 用包含50％FCS的培养基进行震击以使细胞周期同步(Ramanathan等 人，Monitoring Cell-autonomous Circadian Clock Rhythms of Gene Expression Using LuciferaseBioluminescence Reporters,Journal of Visualized Experiments,2012,67:p.1-9；Buhr等人，Temperature as a universal resetting cue for mammalian circadianoscillators,Science, 2010,330(6002):379-385；Balsalobre等人，A Serum ShockInduces Circadian Gene Expression in Mammalian Tissue Culture Cells,Cell,1998,93:929-937)。
从这一天开始，将培养物每天8小时置于允许模拟一日阶段的条 件下(谷氨酸10nM和39.5℃的温度)。
在共培养的第15天，在“日”阶段的前2小时期间，在细胞存在下 温育富含FCS的培养基(50％FCS和50％培养基2/3成熟培养基(用于 感觉神经元)和1/3生长培养基(用于角质形成细胞))。将该FCS震击应 用于所有细胞(置于日/夜交替和无交替对照中)。
在共培养的第17天，对细胞施加另一次FCS震击。将栀子属果 实提取物(来自Indfrag)在培养基中以0.004％(w/v)稀释，并在“日”阶 段施用于细胞。在同一天，“夜晚”阶段前30min，将共培养物的细胞 暴露于蓝光。
从这一天开始，在每次更换培养基的情况下温育0.004％(w/v)的 栀子属果实提取物。将培养物维持在相同条件下，并在“夜晚”阶段前 30min每天用蓝光处理。
为了分析，在“夜晚”期前30min以及转变为“夜晚”期后2h、5h 和8h采集培养物上清液的样品，并储存在-80℃。该方法在第17、18 天(即最后一次FCS震击后24h)和第19天(即最后一次FCS震击后 48h)进行。将这些培养物上清液样品解冻，并进行ELISA测定以计量 释放的褪黑素的量(Bluegene，参考号ABIN511419)。
培养20天后，用PBS洗涤细胞一次，并进行MTT测试以验证细 胞活力。
统计分析
结果通过Kruskal-Wallis ANOVA进行统计学分析，然后进行 Mann Whitney U非参数检验。结果的显著性表示为p<0.05，具有*， p<0.01，具有**，和p<0.001，具有*＊*。
结果
图1显示了在不同时间点的褪黑素释放，其中x-轴表示最后一次 FCS震击后经过的时间。
在未处理的对照(图1中的“未处理的”)中，细胞的同步化诱导24 小时后褪黑素释放的循环。与“日”阶段前30分钟的水平相比，褪黑素 的量在2、5和8小时后显著增加。
并行地，在每个“日”阶段结束时，对另一种共培养物诱导蓝光压 力，以便在睡眠前再现对数字仪器的暴露。发现这种条件(图1中的 “对照蓝光”)显示出不同的响应：在第18天，即最后一次FCS震击后 24h，无褪黑素释放增加。这种差异在统计学上是显著的。这些结果表 明蓝光压力干扰或延迟褪黑素释放的循环。
在相同的培养条件下，用0.004％的栀子属果实提取物和蓝光(图 1中的“活性成分0.004％”)处理第三共培养物。发现该处理导致与未处 理的对照非常相似的褪黑素释放循环。
将褪黑素释放研究的结果概述在下表中：
正如可以清楚地看出的，未处理的条件(“未处理的”)和用0.004％ 的栀子属果实提取物和蓝光(0.004％活性成分)处理的条件在夜间后2、 5和8小时，即分别在最后一次FCS震击后26、29和32小时显示出 显著增加。在处理后第二天(第19天)，褪黑素的增加较小但仍然显著。
用蓝光而不是提取物(“对照蓝光”)处理的样品具有比两种其他条 件显著更低的褪黑素释放。
总之，发现0.004％的栀子属果实提取物能够保护细胞免受蓝光暴 露的影响。特别地，它允许保持褪黑素释放水平及其循环。
实施例5：线粒体网络分析和细胞铺展(体外)-研究1
线粒体网络和细胞铺展均为细胞衰老的生物标志。
细胞培养和处理
将来自57岁女性供体的人真皮原代成纤维细胞解冻并在烧瓶中在 专用于上皮细胞培养的CnT-Prime培养基(CellnTec)中扩增几天。在 开始本测定前24h，将细胞分成3组：
-第1组未处理；
-第2组用0.002％(w/v)的栀子属果实提取物(来自云南瑞宝，在 培养基中稀释)处理；和
-第3组用0.004％(w/v)的栀子属果实提取物(来自云南瑞宝，在 培养基中稀释)处理。
然后，用MitoTracker Green染料加载细胞15min。用PBS洗涤 细胞，分离并在10％血清培养基中以2000个细胞/孔接种到具有超大 Y显微图案的CYTOO板中。
1.5h后，一旦细胞附着并在显微图案上铺展，则用包含较少血清 的培养基替换该培养基，该包含较少血清的培养基还包含与先前施用 于各组的相同浓度的栀子属果实提取物。然后将细胞在37℃与 5％CO2下温育2h期限。
处理2h后，用LEDS(参比Kingbright KA-3529AQB25Z4S)在 447nm下以20J/cm2照射细胞1小时，相当于在10cm距离下屏幕暴 露1个月(28天)的剂量。
在每个孔中加入Hoechst 15分钟以染色细胞核。更新培养基以洗 去Hoechst，并将细胞在具有活性成分的CnT-引发的培养基中温育。
图像采集
在Leica显微镜上进行实时成像。在活体成像结束时，固定细胞 并用鬼笔环肽555染色F-肌动蛋白。在来自Perkin Elmer的 Operetta HCS平台上获取图像。
网络分析
一旦检测到线粒体网络，则计算单细胞网络的所有细丝的长度之 和，以确定“网络总长度”，其是来自同一孔的所有单细胞之间的平均 值。线粒体网络可以分成连续连接的细丝组：该基础单元称为“树”。 在每个孔中检测到的所有单细胞之间平均每个网络的树的数量以及它 们的总长度。
每个树被分成在每一端由结点或端点界定的“分枝”。这些分枝通 过测量它们在每个单细胞的整个网络中的平均值和最大长度(“平均分 支长度”)来表征。
细胞铺展分析
进行专门的图像分析以检测显微图案上的单细胞并测量其面积。 对具有高于1800μm2的面积的正确铺展的细胞计数。
统计分析
结果采用多元比较的普通ANOVA进行统计分析。结果的显著性 表示为p<0.05，具有*，p<0.01，具有**，和p<0.001，具有*＊*。
结果：线粒体网络
在文献中，已经描述了蓝光暴露可导致细胞氧化并最终影响线粒 体网络(Rascalou等人，Mitochondrial damage and cytoskeleton reorganization in humandermal fibroblasts exposed to artificial visible light similar to screen-emitted light,Journal of Dermatological Science,2018,91:195-205)。网络越片段化，则细胞就越受干扰。
在本研究的第一部分中，通过网络分段分析来分析线粒体网络， 其结果显示在图2中。发现未处理的条件显示出清晰且确定的线粒体 网络(图2a)。在暴露于蓝光后，网络由于氧化应激而断裂和扩散(图 2b)。在0.002％的栀子属果实提取物存在下，网络显然较少片段化(图 2c)。在0.004％的栀子属果实提取物存在下，这种保护作用甚至更明 显(图2d)。
然后对该网络进行数值分割以进行定量分析。评估了各种参数， 包括网络的总长度、树的数量、分枝的数量和它们的平均长度。
将结果概述在下表中：
正如从上文可以观察到的，蓝光压力导致线粒体网络总长度的显 著减少。该结果证实了文献的数据。然而，在栀子属果实提取物存在 下，观察到对网络的显著保护分别为+68％(p<0.001)和+98％(p<0.001)。
网络总长度自动链接到树和分枝的数量：如果网络减少，则树和 分枝的数量增加，并且其各自的平均长度减小。
正如所预期的，发现蓝光压力诱导树和分枝数量的显著增加，以 及树长度和分枝长度的平均值的显著降低。此外，栀子属果实提取物 表现出显著的保护作用，分别将树的数量减少58％和73％(p<0.001)， 并且分别将分枝数量减少60％和68％(p<0.001)。
结果：细胞铺展
在本研究的第二部分，分析了细胞的铺展及其面积。这种铺展与 细胞上引起的压力密切相关：当细胞受到压力时，其细胞质收缩。
将结果概述在下表中：
发现在暴露于蓝光后，铺展细胞的百分比显著降低。这同样适用 于平均细胞面积。然而，在栀子属果实提取物存在下，观察到显著的 保护作用，分别在0.002％和0.004％下使铺展细胞的百分比增加 +165％(p<0.001)和+149％(p<0.001)。在0.002％和0.004％的提取物下， 细胞面积分别改良了+183％和+175％(p<0.001)。
实施例6：线粒体网络分析(体外)-研究2
在由35wt％的甜菜碱、40wt％的甘油和25wt％的水组成的天然 低共熔溶剂(NaDES)中，相对于单独的NaDES，对0.0015％的栀子属 果实提取物重复实施例5中所述的线粒体网络分析。将结果概述在下 表中：
正如从上文可以观察到的，NaDES中的栀子属果实提取物能够提 供对网络的显著保护：与未处理的光压力条件相比，它能够使树的数 量减少-38％，并使平均树长度增加+66％。对于分枝参数观察到相同 的趋势：NaDES中的栀子属果实提取物能够将分枝数量减少-14％， 并将分枝的平均长度增加19％。
另一方面，单独的天然低共熔溶剂对蓝光压力没有保护作用。
实施例7：蛋白质氧化分析(离体)
蛋白质氧化是细胞衰老的另一种生物标志。
培养和处理
在来自35岁白种人女性的腹部整形术中制备12个平均直径为12mm(±1mm)的人皮肤外植体(参考号：P2159-AB35，光型III)。使 外植体在BEM培养基(Bio-EC的外植体培养基)中在37℃下在加湿的 5％-CO2气氛中保持存活。
将外植体分成如下4组(每组3个外植体)：
-未处理的对照：暴露于光节律的外植体
-蓝光对照：暴露于光节律和蓝光压力的外植体
-0.002％的栀子属果实提取物(来自Indfrag)：暴露于光节律和蓝 光压力的外植体，其中局部施用0.002％的栀子属果实提取物
-0.004％的栀子属果实提取物：暴露于光节律和蓝光压力的外植 体，其中局部施用0.004％的栀子属果实提取物
通过将商购材料(云南瑞宝)在磷酸缓冲盐水溶液(PBS)中以相应的 浓度(w/v)稀释来制备栀子属果实提取物。
从研究的第0天至第4天，将皮肤外植体暴露于光循环，目的在 于模拟昼夜节律，并根据以下模式暴露于蓝光照射：
-从下午7点至上午7点(12小时)：使用呈现接近太阳辐射的发射 光谱的SlimStyle W021/02灯(Dayvia)。将外植体暴露于日光。在日光 暴露期间，将皮肤外植体保存在BEM培养基中。
-从上午7点至上午10点(3小时)：使用
装置(BioEC) 将外植体在1mLHBSS培养基中暴露于63.75J/cm2剂量的蓝光。在蓝 光暴露的整个时间期间，将未处理的对照外植体在黑暗中保持在1mL HBSS中。在暴露结束时，将所有外植体放回2mL BEM培养基中。
-从上午10点到下午7点(9小时)：将皮肤外植体在BEM培养基 中避光保存。
对于最后两组，基于每个外植体2μl(2mg/cm2)局部施用栀子属果 实提取物，并在第1、2、3和4天(在蓝光暴露之前)使用小刮刀涂布。 未处理的对照外植体除了更新培养基之外没有接受任何处理。
在第1、2和3天，在光照循环的每个黑暗阶段结束时，更新一半 培养基(每孔1.2ml)。
在第4天，在最后一次蓝光照射后立即收集来自每种条件的3个 外植体并切成两部分。将一部分在缓冲福尔马林中固定，而将另一部 分冷冻在-80℃下。
氧化的蛋白质的免疫染色
在用DNPH(2,4-二硝基苯肼，Millipore，参考号90448)预温育并 用在PBS、BSA0.3％中以1:250稀释的抗-DNP抗体(Millipore，参考 号90451)在37℃下温育1h后，用生物素/抗生蛋白链菌素扩增系统在 冷冻切片上染色氧化的蛋白质，并用VIP(过氧化物酶的紫色底 物)(Vector，参考号SK-4600)显示。
手动进行免疫染色并通过显微镜观察进行评估。
图像分析：色指数定量
使用两个开源光学成像软件程序定量氧化的蛋白质的染色强度。 在GIMP-GNU图像处理程序(GIMP-GNU Image Manipulation Program)中打开显微照片(jpeg格式)。选择相当于染色的强至浅粉红 色信号，复制并粘贴到新图像中并保存为jpeg文件，该jpeg文件仅 由所选择的染色组成。随后使用ImageJ程序打开该图像。选择真皮 内的区域进行分析。然后，创建切片的直方图，将图像中的像素总数 分成跨越可见光谱的255个颜色类别。通过从每个显微照片中切割并 求和适当的计数来确定相当于强粉红色至浅粉红色的峰。或者，可以 将相当于峰的数字粘贴到Excel电子表格中并求和。
然后将色素沉着指数除以表面积(以任意单位表示，A.U.)。
统计分析
通过Kruskal-Wallis ANOVA，然后通过Mann Whitney U非参 数检验对结果进行统计分析。结果的显著性表示为p<0.05，具有*， p<0.01，具有**，和p<0.001，具有*＊*。
结果
将结果概述在下表中：
正如上文可以观察到的，暴露于蓝光导致氧化的蛋白质的显著增 加(+93％，p<0.01)。另一方面，在栀子属果实提取物存在下，观察到 对蓝光的明显防护，这通过在0.002％和0.004％的提取物的情况下氧 化的蛋白质分别减少-81％(p<0.05)和-86％(p<0.01)来证明。
实施例8：临床研究
制剂
对于下文所述的临床研究，使用具有以下INCI配方的化妆品制 剂：
水(AQUA)/水(WATER)、鲸蜡醇、硬脂酸甘油酯、硬脂酸PEG- 75酯、鲸蜡醇聚醚-20(CETEH-20)、硬脂醇聚醚-20、新戊酸异癸酯、 栀子属果实提取物、苯氧基乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸 丙酯、对羟基苯甲酸乙酯、聚二甲基硅氧烷、香料、水杨酸苄酯、芳樟醇、D-柠檬烯。
在安慰剂组合物中，不含栀子属果实提取物。
更详细地：
小组
对40名女性志愿者进行临床研究，年龄在18至50岁之间，平均 年龄为35±9岁。纳入标准要求志愿者在她们的面部上有皱纹并且每天 在屏幕(数字设备)前面至少4小时，其中在晚上连续2小时，数字设备 的亮度为100％。告知志愿者使用该产品的可能不利影响和进行评估 的技术条件。他们愿意签署同意书，该同意书是根据赫尔辛基宣言(Declaration of Helsinki)和1988年12月20日的公共卫生法典(Code de la SantéPublique)撰写的。
在本研究期间，志愿者每天两次(早晚)涂抹含有0.002％栀子属果 实提取物(来自Indfrag)的面霜或安慰剂，持续56天。通过使用 
(Canfield)分析对皱纹数量进行量化来分析产品的抗衰老特性， 并通过每日日志分析睡眠周期的质量。
通过
的皱纹数量分析
使用
(第6代)在D0、D28和D56得到面部的数字照片。 在每次采集时使用图像的叠加可视化在数据处理屏幕上进行直接重新 定位的控制。
允许用不同类型的照明拍摄图片并非常快速地捕 获图像。在多光谱成像和分析下拍摄的一系列照片允许捕获影响皮肤 外观的视觉信息。
在本研究中，分析了鱼尾纹皱纹。
根据日志的睡眠质量分析
志愿者填写每日日志以收集关于其蓝光暴露来源、蓝光暴露期限、 疲倦状态、入睡容易度、夜间觉醒次数、皮肤对产品的反应类型和皮 肤反应强度的数据。
自我评估
在本研究期间产品施用27天和55天后，根据志愿者在Eval& Go(https://www.evalandgo.com/)上完成的在线问卷进行产品的感觉感 受、功效和化妆品质量的评估。
统计分析
首先，通过Shapiro-Wilk检验(α＝0.05)验证高斯定律。皱纹减少 的数据不遵循高斯定律；因此，进行非参数统计分析。为了与D0进 行比较，使用配对和非参数Wilcoxon检验(如果p<0.05则为显著性结 果)。关于两种产品(活性成分和安慰剂)之间的比较，使用Mann Whitney检验进行未配对和非参数分析(如果p<0.05则为显著性结果)。
为了分析自我评估问卷和每日日志结果，进行卡方检验(二分法分 析，其在于比较相关答案的数量)。
结果：皱纹数量减少
发现与D0相比，用含有0.002％的栀子属果实提取物的面霜处理 导致鱼尾纹区域中的皱纹数量在统计学上显著减少-26％。
此外，证明了在施用56天后，含有0.002％的栀子属果实提取物 的面霜与安慰剂之间也存在-21％的统计学显著差异。实际上，安慰剂 霜剂在施用56天后对皱纹没有任何影响。
结果：改善的睡眠周期
在本研究期间，每日日志用于跟踪夜间醒来的次数以及志愿者入 睡的容易程度。
为此，问卷包含以下三个问题，志愿者在56天期间每天必须回答 这些问题：
-你夜间醒了吗？->是或否
-你醒了多少次？
-你是否容易入睡->是或否
在施用28天后，发现施用含有0.002％栀子属果实提取物的面霜 的志愿者中只有31.1％在夜间醒来至少一次，而68.9％在夜间从未醒 来。对于安慰剂，49.5％的志愿者在夜间醒来至少一次，而只有50.5％ 在夜间从未醒来。这种差异具有统计学显著性。
在施用56天后，发现从第29天到第56天，施用含有0.002％栀 子属果实提取物的面霜的志愿者中只有29％在夜间醒来至少一次，而 71％在夜间从未醒来。对于安慰剂，49.6％的志愿者在夜间至少醒来 至少一次，而仅50.4％在夜间从未醒来。这种差异也具有统计学显著 性。
因此，显示与安慰剂相比，栀子属果实提取物能够显著降低夜间 醒来的频率。
第二个问题允许量化研究期间夜间醒来的次数。据发现，施用安 慰剂的志愿者在前28天平均醒来23次，在总共56天中醒来41.1次。 另一方面，施用含有0.002％栀子属果实提取物的面霜的志愿者在前 28天平均仅醒来3次，在总共56天平均醒来7.5次。因此，与安慰剂 相比，栀子属果实提取物在28天和56天后分别导致醒来次数显著减 少-87％和-82％。
这些结果表明，栀子属果实提取物能够减少夜间醒来的次数，从 而改善睡眠质量。
对于第三个问题，评估入睡的容易程度。使用二分法分析显示， 平均而言，90.6％的施用含有0.002％栀子属果实提取物的面霜的志愿 者容易入睡，而仅84.8％的使用安慰剂的志愿者在施用1个月后才认 为有这样的结果。2个月后，各自的百分比为89.8％和85.8％。所有 这些差异再次是显著的。
基于志愿者年龄的数据分析
基于测试的志愿者年龄的进一步分析结果。为此，分别评估年轻 组(18-35岁)和老年组(35-50岁)。
关于皱纹的减少，发现本发明的栀子属果实提取物(0.002％)对老 年组的志愿者比对年轻组的志愿者更有效：对于老年组，施用2个月 后观察到皱纹数显著减少-25％。与安慰剂相比，这种效果也是显著的， 安慰剂仅导致-5％的减少。
对于每晚醒来的频率(第一个问题)，结果如下表中所示：
正如可以从上述观察到的，与安慰剂相比，本发明的栀子属果实 提取物(0.002％)导致年轻组的志愿者在夜间醒来的次数显著更少。老 年组显示出相同的趋势，但功效略低。
对于夜间的平均醒来次数(第二个问题)，观察到年轻组的显著和 急剧减少，在28天和56天后与安慰剂相比分别减少-83％和-82％。 对于老年组，观察到相同的趋势；然而，栀子属果实提取物与安慰剂 之间的差异不显著。
此外，关于入睡的容易性，发现本发明的栀子属果实提取物对于 年轻的组比对于老年组更有效。
Claims (15)
1.化妆品活性剂，包含栀子属果实提取物和溶剂，其中所述溶剂为具有至少5的pH的低共熔溶剂。
2.根据权利要求1的化妆品活性剂，其中所述低共熔溶剂具有至少5.5、更优选至少6且最优选至少7的pH。
3.根据权利要求1或2的化妆品活性剂，其中所述低共熔溶剂的组分是天然来源的。
4.根据权利要求1至3中任一项的化妆品活性剂，其中所述低共熔溶剂包含甜菜碱、甘油和水。
5.根据权利要求4的化妆品活性剂，其中所述低共熔溶剂包含约30至约40wt％的甜菜碱、约35至约45wt％的甘油和约20至约30wt％的水，更优选约35wt％的甜菜碱、约40wt％的甘油和约25wt％的水。
6.根据权利要求1至5中任一项的化妆品活性剂，其中所述化妆品活性剂中栀子属果实提取物的浓度为约0.01至约10wt％，更优选约0.05至约1wt％，且最优选约0.1wt％。
7.根据权利要求1至6中任一项的化妆品活性剂，其中所述栀子属果实提取物包含至少1wt％的藏红花素，更优选至少10wt％的藏红花素，并且最优选至少25wt％的藏红花素。
8.化妆品组合物，包含根据权利要求1至7中任一项的化妆品活性剂和化妆品可接受的赋形剂。
9.根据权利要求8的化妆品组合物，其为皮肤护理组合物，且特别是抗衰老皮肤护理组合物。
10.减少皮肤衰老征象的方法，包括将根据权利要求1至7中任一项的化妆品活性剂或根据权利要求8或9的化妆品组合物局部施用于皮肤、特别是面部皮肤的步骤。
11.保护皮肤免受氧化应激的方法，包括将根据权利要求1至7中任一项的化妆品活性剂或根据权利要求8或9的化妆品组合物局部施用于皮肤、特别是面部皮肤的步骤。
12.保护皮肤免受蓝光影响的方法，包括将根据权利要求1至7中任一项的化妆品活性剂或根据权利要求8或9的化妆品组合物局部施用于皮肤、特别是面部皮肤的步骤。
13.保护个体的褪黑素循环的非治疗性方法，包括将根据权利要求1至7中任一项的化妆品活性剂或根据权利要求8或9的化妆品组合物局部施用于皮肤、特别是面部皮肤的步骤。
14.改善个体睡眠的非治疗性方法，包括将根据权利要求1至7中任一项的化妆品活性剂或根据权利要求8或9的化妆品组合物局部施用于皮肤、特别是面部皮肤的步骤。
15.栀子属果实提取物在改善个体睡眠中的用途。
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