CN115598346A - Orm1和/或apof在宫颈癌及宫颈高级别上皮内瘤变的诊断及预后中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于疾病诊断、预后和分子生物学技术领域，具体涉及ORM1和/或APOF在宫颈癌及宫颈高级别上皮内瘤变的诊断及预后中的应用。本发明通过DIA等相关技术，从受试者血浆蛋白中成功筛选相关生物标志物，经试验验证，ORM1结合APOF预测健康受试者和宫颈高级别上皮内瘤变以及宫颈癌患者的曲线下面积为0.978，在诊断宫颈高级别上皮内瘤变和及宫颈癌患者时，AUC可达0.982。ORM1的高表达与宫颈癌患者的淋巴结转移、临床分期及预后不良有关。同时，也可将其作为靶点用于筛选宫颈癌和宫颈高级别上皮内瘤变的治疗药物，因此具有良好的实际应用之价值。

Description

ORM1和/或APOF在宫颈癌及宫颈高级别上皮内瘤变的诊断及 预后中的应用

技术领域

本发明属于疾病诊断、预后和分子生物学技术领域，具体涉及ORM1和/或APOF在宫颈癌及宫颈高级别上皮内瘤变的诊断及预后中的应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

宫颈癌是女性最常见的妇科恶性肿瘤，据WHO最新公布的癌症研究数据，2020年全球宫颈癌新发病例数约60万人，死亡病例数约34万人。虽然宫颈癌病因较为明确，是由高危型人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)的持续感染导致的。但是，90％的HPV感染患者在2年内能自动清除体内的HPV病毒，并且从HPV持续感染发展成为宫颈癌的过程缓慢，提示我们HPV感染是宫颈癌发生发展的必要条件，而不是充分条件。大量研究表明，肠道菌群失衡、非编码RNA和外泌体调控、异常甲基化和单核苷酸多态性、宫颈免疫微环境破坏等多种因素参与了宫颈癌的发生及发展。

目前，宫颈癌及宫颈上皮内瘤变的诊断依赖HPV/细胞学(TCT)初筛、阴道镜检查、活组织病理三阶梯方法，耗时长，花费多。在大多数发展中国家，细胞学、阴道镜、组织学诊断医师匮乏，导致宫颈癌及宫颈上皮内瘤变有漏诊及过度诊断的风险。血清学检测是一种客观、简便的诊断方法，目前宫颈癌及宫颈上皮内瘤变的血清学诊断较为匮乏，鳞状上皮细胞癌抗原(SCC)是局部晚期宫颈癌的血清检测学方法，其灵敏度较差，并且在宫颈高级别上皮内瘤变(HSIL)的诊断中没有临床意义。

发明内容

针对上述现有技术的不足，发明人经长期的技术与实践探索，提供ORM1和/或APOF在宫颈癌及宫颈高级别上皮内瘤变的诊断及预后中的应用。本发明基于数据独立采集(Data-independent acquisition,DIA)的定量蛋白质组学技术，从血浆中提供全面的蛋白谱，进一步揭示高级别鳞状上皮内病变与宫颈癌的差异蛋白作为候选生物标志物。此外，本发明通过后续的酶联免疫吸附试验(ELSIA)验证了高级别鳞状上皮内病变和宫颈癌患者的候选生物标志物。基于上述研究成果，从而完成本发明。

为实现上述技术目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一个方面，提供检测ORM1和/或APOF的物质在制备用于诊断、检测、监测或预测宫颈癌及宫颈上皮内瘤变的进展的产品中的应用。

所述预测宫颈癌及宫颈上皮内瘤变的进展包括但不限于对淋巴结转移、临床分期以及预后的评估分析。

其中，所述预后至少包括对受试者生存期的评估，所述生存期包括无进展生存期和总生存期。所述受试者可以为宫颈癌患者。

本发明的第二个方面，提供一种用于诊断、检测、监测或预测宫颈癌及宫颈上皮内瘤变的进展的产品，其包含基于免疫技术检测样品中ORM1和/或APOF的表达。

本发明的第三个方面，提供一种用于诊断、检测、监测或预测宫颈癌及宫颈上皮内瘤变的进展的系统，所述系统包括：

i)分析模块，所述分析模块包含用于确定受试者的待测样品中选自上述ORM1和/或APOF表达水平的检测物质，以及；

ii)评估模块，所述评估模块包含：根据i)中确定的所述ORM1和/或APOF的表达水平判断所述受试者情况。

本发明的第四个方面，提供上述ORM1和/或APOF作为靶点用于筛选预防或治疗宫颈癌及宫颈上皮内瘤变的药物的用途。

与现有技术方案相比，上述一个或多个技术方案具有如下有益效果：

上述技术方案通过DIA等相关技术，从受试者血浆蛋白中成功筛选出ORM1和APOF，经试验验证，ORM1结合APOF预测健康受试者和宫颈高级别上皮内瘤变以及宫颈癌患者的曲线下面积(AUC)为0.978，在诊断宫颈高级别上皮内瘤变和及宫颈癌患者时，AUC可达0.982。ORM1的高表达与宫颈癌患者的淋巴结转移、临床分期及预后不良有关，因此ORM1及APOF可以作为宫颈癌和宫颈高级别上皮内瘤变的生物标记物用于相关疾病的诊断和预后评估，同时，也可将其作为靶点用于筛选宫颈癌和宫颈高级别上皮内瘤变的治疗药物，因此具有良好的实际应用之价值。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为本发明实施例中DIA测序整体项目路线图。

图2为本发明实施例中DIA测序差异蛋白的表达；其中，(A)蛋白质定量差异结果柱状图；(B)CC组和CK组差异表达蛋白的火山图；(C)CC组和HSIL组差异表达蛋白的火山图；(D)HSIL和CK组差异表达蛋白的火山图。

图3为本发明实施例中60例DIA标本中ORM1(A)及APOF(B)定量表达图。

图4为本发明ELSIA验证。ELISA法检测ORM1(A)和APOF(B)的表达。(C)ORM1和APOF在识别CK和HSIL/CC时的ROC；(D)ORM1和APOF在鉴别HSIL和CC中的ROC。(E和F)ORM1/APOF高表达宫颈癌患者(20％)与ORM1/APOF低表达(80％)的PFS比较；(G、H)ORM1/APOF高表达子宫颈癌患者(20％)与ORM1低表达子宫颈癌患者(80％)的OS比较。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

如前所述，目前宫颈癌及宫颈上皮内瘤变的血清学诊断较为匮乏，鳞状上皮细胞癌抗原(SCC)是局部晚期宫颈癌的血清检测学方法，其灵敏度较差，并且在宫颈高级别上皮内瘤变(HSIL)的诊断中没有临床意义。

目前，基于数据独立采集的定量蛋白质组学技术是一种用于大规模蛋白质鉴定和定量的有效技术。在数据依赖采集(DDA)模式下，与传统的质谱(MS)方法相比，DIA具有蛋白质组覆盖深度大、定量重复性高、准确性高等优点，已被应用于生物标志物发现、临床研究、基础探索等领域。

有鉴于此，本发明采用DIA方法，从血浆中提供全面的蛋白谱，进一步揭示高级别鳞状上皮内病变与宫颈癌的差异蛋白作为候选生物标志物。此外，本发明通过后续的酶联免疫吸附试验(ELSIA)验证了高级别鳞状上皮内病变和宫颈癌患者的候选生物标志物。

具体的，本发明的一种典型具体实施方式中，提供检测ORM1和/或APOF的物质在制备用于诊断、检测、监测或预测宫颈癌及宫颈上皮内瘤变的进展的产品中的应用。

本发明通过DIA测序技术，筛选获得显著差异表达蛋白ORM1和APOF，进一步通过ELISA法对ORM1和APOF进行了验证，结果表明ORM1联合或者不联合APOF都可成为宫颈高级别上皮内瘤变和宫颈癌的优良诊断指标。进一步的，通过研究ORM1和APOF表达与临床病理因素及生存预后的关系，结果表明ORM1在宫颈癌组织中的表达水平与年龄、组织学、肿瘤分化、临床分期、肿瘤大小、淋巴脉管间隙浸润(LVSI)、深部间质浸润(DSI)无关，而与淋巴结转移(LN)和临床分期有关。但上述临床病理因素与APOF的表达均无相关性。在生存分析方面，ORM1和APOF的表达与无进展生存期(PFS)和总生存期(OS)均不相关，但当我们将前20％的表达定义为高表达，其余80％为低表达时，ORM1与这些宫颈癌患者的PFS和OS相关。

其中，所述ORM1和/或APOF为人源；具体来源于受试者的血液，进一步为血浆。

因此，所述预测宫颈癌及宫颈上皮内瘤变的进展包括但不限于对淋巴结转移、临床分期以及预后的评估分析。

其中，所述预后至少包括对受试者生存期的评估，所述生存期包括无进展生存期和总生存期。所述受试者可以为宫颈癌患者。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种用于诊断、检测、监测或预测宫颈癌及宫颈上皮内瘤变的进展的产品，其包含检测样品中ORM1和/或APOF表达的物质。

所述ORM1和/或APOF为人源；所述检测样品中ORM1和/或APOF表达的物质至少包含基于免疫技术对上述蛋白进行定性或定量(包括半定量)检测的物质，如Western Blot、ELISA、胶体金试纸条、蛋白芯片等，在此不做具体限定。

所述样品可以为受试者血液，进一步为血浆。

所述产品可以为检测试剂、检测试剂盒或生物传感器等，在此不做具体限定。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种用于诊断、检测、监测或预测宫颈癌及宫颈上皮内瘤变的进展的系统，所述系统包括：

i)分析模块，所述分析模块包含用于确定受试者的待测样品中选自上述ORM1和/或APOF表达水平的检测物质，以及；

ii)评估模块，所述评估模块包含：根据i)中确定的所述ORM1和/或APOF的表达水平分析所述受试者患病情况。

其中，所述ORM1和/或APOF为人源。所述待测样品为受试者的血液，进一步为血浆。

所述检测物质至少包含基于免疫技术对上述蛋白进行定性或定量(包括半定量)检测的物质，如Western Blot、ELISA、胶体金试纸条、蛋白芯片等，在此不做具体限定。

所述分析所述受试者患病情况至少包括对受试者宫颈癌及宫颈上皮内瘤变的诊断、恶性程度(如淋巴结转移、临床分期)以及宫颈癌患者的预后情况(如总生存期和无进展生存期)进行评估。

本发明的又一具体实施方式中，提供ORM1和/或APOF作为靶点用于筛选预防或治疗宫颈癌及宫颈上皮内瘤变的药物的用途。

本发明的又一具体实施方式中，可以利用候选药物使用前和使用后对ORM1和/或APOF的影响，从而确定候选药物是否可以用于预防或治疗宫颈癌及宫颈上皮内瘤变。

所述药物还包括至少一种药物非活性成分。

所述药物非活性成分可以是药学上通常使用的载体、赋形剂及稀释剂等。而且，根据通常的方法，可以制作成粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂、喷雾剂等的口服剂、外用剂、栓剂及无菌注射溶液形式的剂型使用。

所述可以包含的载体、赋形剂及稀释剂等非药物活性成分在领域内是熟知的，本领域普通技术人员能够确定其符合临床标准。

本发明的又一具体实施方式中，所述载体、赋形剂及稀释剂包括但不限于乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁和矿物油等，在此不做具体限定。

以下结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照销售公司所推荐的条件；在本发明没有特别限定，均可通过商业途径购买得到。

实施例

1.研究方法

(1)DIA识别方法

收集2019年1月至2020年6月山东大学齐鲁医院临床血浆样本125份，其中健康女性志愿者30份(命名CK)，HSIL41份(命名HSIL)，宫颈癌患者54份(命名CC)，分为发现组和验证组。其中20个CK、20个HSIL和20个CC标本采用DIA方法分析这三种状态下的蛋白变化，这60个标本属于发现组。此外，对30个CK、41个HSIL和54个CC进行ELSIA分析以验证所选蛋白。这125例标本为验证组，验证组包含发现组。

血浆采集均在住院后第二天早餐前采集。根据HUPO血浆蛋白质组学项目推荐的标准化方案，立即对样本进行处理。首先将血液收集到EDTA管(BD)中，手动倒置10次，在4℃2000r/min离心10分钟，然后在-80℃保存。同时，每个样品10μl的血清混合作为质控样品。所有患者的临床信息都是从医院的His系统中收集的。所有患者均获得书面知情同意。本研究经山东大学齐鲁医院伦理委员会批准(伦理号:KYLL-2017-560)。

其中，DIA测序整体项目技术路线如下：经样品制备、蛋白质定量和电泳、蛋白质酶解、LC-MS/MS分析等，完成DAI分析工作。首先，使用等量合并后的样品作为pool样品进行HPRP分级，并进行LC-MS/MS(QE–HFX_DDA模式)分析，作为DIA工作的数据库。然后，对各样本分别进行LC-MS/MS(QE–HFX_DDA模式)分析，并采用上述数据库进行定性定量分析，最后采用生物信息学分析工具对数据进行展示与深入挖掘，整体项目路线如图1所示，其主要包括图谱构建和DIA分析两部分：蛋白质提取、肽段酶解、色谱分级、液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)数据DDA采集、液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)数据DIA采集、library的构建、蛋白质DIA数据鉴定和定量分析、差异表达蛋白质筛选、差异表达蛋白质聚类分析、功能注释和通路分析步骤。

其中，质谱方法和LC-MS/MS数据分析具体如下：

DIA分析采纳升流速HPLC系统Easy nLC进行色谱分离。缓冲液：A液为0.1％甲酸水溶液，B液为0.1％甲酸乙腈水溶液(乙腈为84％)。色谱柱以95％的A液平衡。样品进样到Trap Column后经过色谱分析柱25cm tip-column进行梯度分离，流速为300nl/min。一级质谱扫描范围：300-1800m/z，质谱分辨率：60,000(@m/z 200)，AGC target：3e6,Maximum IT：50ms。每次一级MS扫描(full MS scan)后根据Inclusion list采集20个ddMS2扫描(MS2scans)，Isolation window:1.6Th，质谱分辨率：30,000(@m/z 200),AGC target：3e6,Maximum IT：120ms，MS2 Activation Type：HCD，Normalized collision energy：27。

DIA分析采纳升流速HPLC系统Easy nLC进行色谱分离。缓冲液：A液为0.1％甲酸水溶液，B液为0.1％甲酸乙腈水溶液(乙腈为84％)。色谱柱以95％的A液平衡。样品进样到Trap Column后经过色谱分析柱25cm tip-column进行梯度分离，流速为300nl/min。一级质谱扫描范围：300-1650m/z，质谱分辨率：120,000(@m/z 200)，AGC target：3e6,MaximumIT：50ms。MS2采用DIA数据采集模式，设置30个DIA采集窗口，质谱分辨率：15,000(@m/z200),AGC target：3e6，Maximum IT：auto，MS2 Activation Type：HCD，Normalizedcollision energy：30，Spectral data type：profile。

LC-MS/MS数据分析：

DDA数据直接导入Spectronaut软件构建建Spectral Library。采用human_uniprot下载数据库。检索参数设置如下：酶为胰蛋白脢，max miss cleavage site为1，固定修饰为Carbamidomethyl(C)，动态修饰设定为Oxidation(M)和Acetyl(Protein N-term)，数据库检索鉴定到的蛋白必须通过设定的过渡参数FDR<1％。

DIA数据采用Spectronaut软件进行数据处理，数据库与建库所用数据库相同。软件参数设置如下：retention time prediction type设置为dynamic iRT，interferenceon MS2 level correction为enabled，cross run normalization为enabled，所有结果须通过设定的过滤参数QValue cutoff为0.01(相当于FDR<1％).

(2)ELISA验证方法

ELISA试剂盒从酶免生物技术公司(中国江苏盐城)获得，并按照制造商说明书使用。

ORM1 ELSIA试剂盒编号：MM-61510H1。

APOF ELISA试剂盒编号：MM-50834H1。

2.研究结果

(1)设置了三个对比组:CC VS CK；CC VS HSIL；HSIL VS CK。通过单因素方差分析，三组比较时，将倍数变化(FC)≥1.5或≤0.67且p值＜0.05的蛋白定义为显著差异表达蛋白(DEPs)。在本研究中，三个比较组共识别出243个DEPs(图2A)。在分析DEPs时，我们发现与CK相比，CC组共有81个DEPs，其中51个上调蛋白，30个下调蛋白(图2A,B)。CC组与HSIL组比较有60个DEPs，其中上调蛋白13个，下调蛋白47个(图2A,C)。与CC组比较，HSIL组有102个DEPs，其中上调蛋白91个，下调蛋白11个(图2A,D)。以上数据表明，在我们的研究队列中，有可能找到适合诊断HSIL和宫颈癌的生物诊断标志物。

(2)确定ORM1和APOF为感兴趣的两个重要蛋白分子，DIA表达模式如图3所示。

(3)ELSIA验证：为了验证DIA技术识别的蛋白的表达模式，我们用ELISA法对ORM1和APOF进行了验证，结果反映了它们在血浆蛋白水平上的表达。ELISA检测30例健康志愿者、41例HSIL和54例宫颈癌患者。我们的结果表明，APOF和ORM1在DIA和ELISA的相对表达模式中表现出几乎相同。结果(图4A)显示，ORM1在HSIL中的血浆表达量最高，其次为宫颈癌，在健康志愿者中表达量最低(1092±7.3vs 952.2±6.9vs 859.2±7.4ng/ml,P<0.001)。CC组APOF高于HSIL组(415.4±4.6vs 402.2±4.5ng/ml；P＝0.0485)和CK(415.4±4.6vs364.2±10.8ng/ml；P<0.001)。HSIL患者的APOF也高于CK(P＝0.0006)(图4B)。受试者工作特征曲线(ROC)如图4C和图4D所示，ORM1结合APOF预测CK和HSIL+CC的曲线下面积(AUC)为0.978，在诊断HSIL和CC时，AUC可达0.982。单独检测ORM1与联合检测ORM1+APOF的AUC相近，单独检测APOF的AUC不理想。这些数据表明ORM1联合或者不联合APOF可能成为HSIL和宫颈癌的优良诊断指标。

(4)ORM1/APOF表达与临床病理因素及生存预后的关系

我们对宫颈癌患者相关病理因素进行卡方检验和Kaplan-Meier分析，探讨ORM1/APOF表达与临床病理因素及生存预后的关系。由于部分患者未进行后续手术或失访等因素，共43例宫颈癌患者行卡方检验，35例行Kaplan-Meier分析。将表达前50％的宫颈癌患者定义为高表达，其余为低表达。结果见表1和图4E,F。我们发现ORM1在宫颈癌组织中的表达水平与年龄、组织学、肿瘤分化、临床分期、肿瘤大小、淋巴脉管间隙浸润(LVSI)、深部间质浸润(DSI)无关，而与淋巴结转移(LN)和临床分期有关。但上述临床病理因素与APOF的表达均无相关性。在生存分析方面，ORM1和APOF的表达与无进展生存期(PFS)和总生存期(OS)均不相关，但当我们将前20％的表达定义为高表达，其余80％为低表达时，ORM1与这些宫颈癌患者的PFS和OS相关(图4E,G)。

表1ORM1/APOF表达与临床病理因素的关系

综上，ORM1结合APOF预测CK和HSIL+CC的曲线下面积(AUC)为0.978，在诊断HSIL和CC时，AUC可达0.982。ORM1的高表达与宫颈癌患者的淋巴结转移、临床分期及预后不良有关。ORM1及APOF可以作为宫颈癌和宫颈高级别上皮内瘤变的生物标记物。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.检测ORM1和/或APOF的物质在制备用于诊断、检测、监测或预测宫颈癌及宫颈上皮内瘤变的进展的产品中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述ORM1和/或APOF为人源。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述ORM1和/或APOF来源于受试者的血液，进一步为血浆。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述预测宫颈癌及宫颈上皮内瘤变的进展包括对淋巴结转移、临床分期以及预后的评估分析；

其中，所述预后至少包括对受试者生存期的评估，所述生存期包括无进展生存期和总生存期；所述受试者为宫颈癌患者。

5.一种用于诊断、检测、监测或预测宫颈癌及宫颈上皮内瘤变的进展的产品，其特征在于，其包含检测样品中ORM1和/或APOF表达的物质。

6.如权利要求5所述的产品，其特征在于，所述ORM1和/或APOF为人源；所述检测样品中ORM1和/或APOF表达的物质至少包含基于免疫技术对上述蛋白进行定性或定量检测的物质。

7.如权利要求5所述的产品，其特征在于，所述样品为受试者血液，进一步为血浆；

所述产品为检测试剂、检测试剂盒或生物传感器。

8.一种用于诊断、检测、监测或预测宫颈癌及宫颈上皮内瘤变的进展的系统，其特征在于，所述系统包括：

i)分析模块，所述分析模块包含用于确定受试者的待测样品中选自上述ORM1和/或APOF表达水平的检测物质，以及；

ii)评估模块，所述评估模块包含：根据i)中确定的所述ORM1和/或APOF的表达水平分析所述受试者患病情况。

9.如权利要求8所述的系统，其特征在于，所述ORM1和/或APOF为人源；所述待测样品为受试者的血液，进一步为血浆；

所述检测物质至少包含基于免疫技术对上述蛋白进行定性或定量检测的物质；

分析所述受试者患病情况至少包括对受试者宫颈癌及宫颈上皮内瘤变的诊断、恶性程度(包括淋巴结转移、临床分期)以及宫颈癌患者的预后情况(包括总生存期和无进展生存期)进行评估。

10.ORM1和/或APOF作为靶点用于筛选预防或治疗宫颈癌及宫颈上皮内瘤变的药物的用途。

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