CN115569190A - 一种多功能纳米酶免疫佐剂及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种多功能纳米酶免疫佐剂及其制备方法和应用,涉及肿瘤药物技术领域。该制备方法包括:将多孔三元金属纳米粒子的溶解液与具有羧基的酸溶液反应制得COOH‑三元金属;将牛血清白蛋白的溶解液与锰盐反应,接着调节体系pH至10‑12,继续反应制得BSA‑Mn复合物;将BSA‑Mn复合物负载于COOH‑三元金属的表面及孔内,即得。该制备方法简单高效,将BSA‑Mn复合物修饰到多孔三元金属纳米粒子的表面及孔内形成的多功能纳米酶免疫佐剂,其粒径小、分散程度高、生物相容性好,利于延长在血液循环中停留的时间,生物安全性好。其在肿瘤部位高度富集,可以增强抗肿瘤免疫记忆且有效预防肿瘤远端转移和复发。
Description
技术领域
本发明涉及肿瘤药物技术领域,具体而言,涉及一种多功能纳米酶免疫佐剂及其制备方法和应用。
背景技术
肿瘤免疫治疗(CIT)是一种新兴的治疗方法,包括免疫检查点阻断、抗肿瘤疫苗、过继细胞转移治疗(ACT)和免疫佐剂等,与传统的治疗手段相比,其疗效持久、抑制肿瘤复发及转移等优势,成为20世纪以来,最具有潜力的肿瘤治疗手段。锰(Mn)作为金属免疫佐剂,可以刺激I型干扰素(IFNs)的产生,促进树突状细胞(DC)成熟,并通过cGAS-STING通路激活提呈抗原,从而极大地辅助抗原的持久免疫原性。尽管锰离子作为免疫佐剂已被认为是潜在的有效治疗方法,但是,锰离子在肿瘤部分的富集仍是一个挑战。此外,实体肿瘤对目前的免疫治疗策略的反应有限或没有反应。由于复杂的肿瘤微环境(TME)可以通过多种机制抑制免疫反应,锰激活的免疫治疗杀伤肿瘤仍存在许多障碍。
鉴于此,特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种多功能纳米酶免疫佐剂及其制备方法和应用。
本发明是这样实现的:
第一方面,本发明提供一种多功能纳米酶免疫佐剂的制备方法,其包括:
将多孔三元金属纳米粒子的溶解液与具有羧基的酸溶液反应制得COOH-三元金属;
将牛血清白蛋白的溶解液与锰盐反应,接着调节体系pH至10-12,继续反应制得BSA-Mn复合物;
将所述BSA-Mn复合物负载于所述COOH-三元金属的表面及孔内,即得。
第二方面,本发明提供一种多功能纳米酶免疫佐剂,其采用如前述实施方式任一项所述的多功能纳米酶免疫佐剂的制备方法制备而成。
第三方面,本发明提供如前述实施方式所述的多功能纳米酶免疫佐剂在制备光热剂、制备治疗肿瘤药物的纳米酶、制备免疫佐剂、制备治疗肿瘤药物或制备肿瘤成像的药物中的应用。
本发明具有以下有益效果:
本申请提供的多功能纳米酶免疫佐剂的制备方法,简单高效,以大介孔、三金属纳米粒子作为载体,同时以牛血清白蛋白作为交联剂增强多孔三元金属纳米粒子的锰载量、提高金属材料的水溶性。将锰络合牛血清白蛋白(BSA-Mn)复合物修饰到多孔三元金属纳米粒子的表面及孔内形成的多功能纳米酶免疫佐剂,不仅粒径小、分散程度高、生物相容性好,利于延长在血液循环中停留的时间,生物安全性好。根据EPR效应,多功能纳米酶免疫佐剂在肿瘤部位高度富集,锰离子的存在赋予了纳米球肿瘤MRI核磁成像的能力,同时在近红外激光照射下有效提高肿瘤细胞的杀伤效果、促进锰离子释放,促进肿瘤部分的免疫细胞浸润及杀伤效果,并且可以增强抗肿瘤免疫记忆且有效预防肿瘤远端转移和复发。本发明提供的多功能纳米酶免疫佐剂可以广泛应用于制备光热剂、制备治疗肿瘤药物的纳米酶、制备免疫佐剂、制备治疗肿瘤药物或制备肿瘤成像的药物。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,应当理解,以下附图仅示出了本发明的某些实施例,因此不应被看作是对范围的限定,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本申请提供的多功能纳米酶免疫佐剂(AuPdRh@Mn纳米材料)生长过程的TEM图:a-d分别对应Au、AuRh、AuPdRh和最终产物AuPdRh@Mn纳米颗粒的TEM图;
图2为本申请提供的AuPdRh@Mn纳米材料生长过程中的粒径(a)和Zeta电位(b)的变化示意图;
图3为本申请提供的BSA、BSA@Mn和AuPdRh@Mn纳米材料的圆二色谱结果(a)和傅里叶红外光谱结果(b)示意图;
图4为本申请提供的AuPdRh@Mn纳米材料在红外和近红外区的紫外均有吸收峰图;
图5为本申请提供的AuPdRh@Mn纳米材料在近红外二区1205nm激光照射下的光热效果示意图;a对应纳米材料的升温曲线、b对应光热转换效率曲线、c对应四个升温降温循环;
图6为本申请提供的AuPdRh@Mn纳米材料抗肿瘤效果示意图;
图7为本申请提供的AuPdRh@Mn纳米材料肿瘤免疫治疗效果示意图,其中a为cGAS、STING和IFN-α在不同处理组中的mRNA表达水平,b为不同处理组中成熟DC细胞的占比;
图8为本申请提供的AuPdRh@Mn纳米材料MRI核磁成像效果示意图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本申请提供了一种多功能纳米酶免疫佐剂的制备方法,其包括如下步骤:
S1、多孔三元金属纳米粒子的制备。
本申请中的多孔三元金属纳米粒子作为载体,便于对后续的Mn2+进行负载。多孔三元金属纳米粒子的选择有多种,本申请中,优选以AuPdRh纳米粒子作为多孔三元金属纳米粒子。AuPdRh纳米粒子的制备方法也有多种,包括但不限于软膜法、晶种法、水热法等等。
本申请列出了一种典型但非限制性的AuPdRh纳米粒子采用软膜法进行制备的工艺步骤,具体包括:
S101、将DPPC和胆固醇溶解于第二有机溶剂中,旋蒸得到脂质膜。
将DPPC 6-8mg、胆固醇2-4mg溶解于8-12mL的第二有机溶剂中,于50℃-60℃、80-90转的条件下反应10-120min得到脂质膜。其中,第二有机溶剂为氯仿。
S102、加入L-抗坏血酸溶解脂质膜,超声反应得到稳定还原剂。
脂质膜和L-抗坏血酸的体积比为1:1-1.2,其中,L-抗坏血酸的浓度为0.1-1mg/mL;超声反应的时间为10-120min,接着于10000-15000rpm离心取上清。
S103、将稳定还原剂中加入含金氯化物、含钯氯化物和含铑氯化物,反应后离心清洗获得AuPdRh纳米粒子。
具体来说,稳定还原剂、含金氯化物、含钯氯化物和含铑氯化物的体积比为1mL:100-200μL:100-200μL:100-200μL,其中,含金氯化物、含钯氯化物和含铑氯化物的浓度均为1-50mmol/L;加入含金氯化物、含钯氯化物和含铑氯化物后反应5-8h;接着以10000-15000rpm离心10-20min,接着清洗3-4次,获得AuPdRh纳米粒子。
优选地,含金氯化物为氯金酸;含钯氯化物为氯化钯或四氯钯酸钠;含铑氯化物为氯化铑或六氯铑酸钠。
本申请中通过软膜法制备AuPdRh纳米粒子,在制备过程中不使用任何有毒试剂,制备获得的AuPdRh纳米粒子具有很高的生物相容性和纳米粒子产率。AuPdRh纳米粒子的多孔结构具有较高的载药率。AuPdRh纳米粒子外的白蛋白生物矿化表现出良好的生物相容性和稳定性。
S2、将多孔三元金属纳米粒子的溶解液与具有羧基的酸溶液反应制得COOH-三元金属;
具体来说,将多孔三元金属纳米粒子溶解于第一有机溶剂中获得的多孔三元金属纳米粒子的溶解液,接着加入具有羧基的酸溶液,多孔三元金属纳米粒子与具有羧基的酸溶液的质量比为1:5-20,反应12-24h,反应结束后用第一有机溶剂洗涤多次,再水洗,在10000-13000rpm离心10-20min,分离收集沉淀,即得COOH-三元金属;
其中,第一有机溶剂包括乙醇、甲醇和乙醚中的至少一种。
本申请中,利用具有羧基的酸溶液提供羧基,便于后续与锰离子进行集合,实现将BSA-Mn复合物负载于COOH-三元金属上。本申请中的具有羧基的酸溶液具体为硫辛酸,本申请中硫辛酸不仅仅可以为纳米粒子提供羧基,还可以利用其二硫基团“-S-S-”与纳米粒反应形成Au-S、Pd-S和Rh-S,Au-S、Pd-S和Rh-S可以作为介质,用于将羧基与金属离子相连。
S3、将牛血清白蛋白的溶解液与锰盐反应,接着调节体系pH至10-12,继续反应制得BSA-Mn复合物。
具体来说,牛血清白蛋白和锰盐的用量比为200-300mg:1mL,其中,锰盐的浓度为80-120mM;采用氢氧化钠调节体系pH,牛血清白蛋白和氢氧化钠的用量比为200-300mg:1mL,其中,氢氧化钠溶液的浓度为1.5-2.5M。调节体系pH值后,于35-40℃下反应20-30h,接着将反应物倒入截留分子量为3000-4000的透析袋中,用去离子水透析10-15h,于3-5℃保存。
牛血清白蛋白(BSA)是广泛用于生物医学和制药应用的主要可用白蛋白。本申请中通过将牛血清白蛋白与锰盐进行复合,形成BSA-Mn复合物,其中,牛血清白蛋白具有酰胺键,BSA-Mn复合物通过酰胺键易于包覆在AuPdRh纳米粒子上。若省略了牛血清白蛋白,直接加入锰盐,则无法实现将镁离子负载于AuPdRh纳米粒子上。
S4、将BSA-Mn复合物负载于COOH-三元金属的表面及孔内,即得。
向COOH-三元金属的中加入羧基活化试剂,接着再加入BSA-Mn复合物,搅拌反应,接着固液分离得到多功能纳米酶免疫佐剂。
羧基活化试剂包括质量比为1:1-1.5的N-(3-(二甲氨基)-丙基)-3-乙基碳二胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺;优选地,羧基活化试剂与COOH-三元金属的质量比为8-12:1。羧基活化试剂可以起到活化羧基的作用,使具有羧基的COOH-三元金属更容易与BSA-Mn复合物进行结合和负载。
本申请提供的多功能纳米酶免疫佐剂的制备方法,简单高效,以脂质体为软模版生成的金钯铑镂空纳米球具有超大孔径,同时以牛血清白蛋白作为交联剂增强金钯铑纳米球的锰载量、提高金属材料的水溶性。本发明锰络合牛血清白蛋白(BSA-Mn)复合物修饰的三元金属镂空纳米球(AuPdRh)的多功能纳米酶免疫佐剂,不仅粒径小、分散程度高、生物相容性好,利于延长在血液循环中停留的时间,生物安全性好。根据EPR效应,纳米材料在肿瘤部位高度富集,锰离子的存在赋予了纳米球肿瘤MRI核磁成像的能力,同时在近红外激光照射下有效提高肿瘤细胞的杀伤效果、促进锰离子释放,促进肿瘤部分的免疫细胞浸润及杀伤效果,并且可以增强抗肿瘤免疫记忆且有效预防肿瘤远端转移和复发。本发明提供的多功能纳米酶免疫佐剂可以广泛应用于制备光热剂、制备治疗肿瘤药物的纳米酶、制备免疫佐剂、制备治疗肿瘤药物或制备肿瘤成像的药物。
本申请中所使用的实验试剂的购买厂家如下:
氯金酸(HAuCl4)、六氯乙酸钠(III)(Na3RhCl6)、钯(Na3PdCl4)、抗坏血酸(AA)、胆固醇、N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基羧基二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)均购自Sigma-Aldrich(中国上海)。AVT(上海)医药技术有限公司(上海)合成并纯化了1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)。牛血清白蛋白(BSA)购自北京索拉比奥科技有限公司(北京)。染色液CCK-8(购于Dojindo),RPMI1640培养基粉末(购于GIBCO),链霉素/青霉素双抗(购于GIBCO),胰蛋白酶(购于GIBCO)。细胞株:B16F10细胞株(购于ATCC),HUVEC细胞株(购于ATCC)。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供了一种多功能纳米酶免疫佐剂,其制备方法包括如下步骤:
S1、将7mg DPPC、3mg胆固醇溶解于10mL的氯仿中,于55℃、85转的条件下反应20min得到脂质膜。加入L-抗坏血酸(0.6mg/mL)溶解脂质膜(脂质膜和L-抗坏血酸的体积比为1:1),超声20min,接着于12000rpm离心取上清得到稳定还原剂。按体积比为1mL:150μL:150μL:150μL向稳定还原剂中加入氯金酸(15mmol/L)、氯化钯(15mmol/L)和氯化铑(15mmol/L),反应6h;接着以12000rpm离心20min,接着清洗3次,获得AuPdRh纳米粒子。
S2、将多孔三元金属纳米粒子(AuPdRh纳米粒子)溶解于乙醇中,接着加入10倍AuPdRh纳米粒子质量的硫辛酸,反应20h,反应结束后用乙醇洗涤多次,再水洗,在12000rpm离心15min,分离收集沉淀,即得COOH-三元金属;
S3、将250mg牛血清白蛋白溶于9mL去离子水中,将1mL MnCl2水溶液(100mm)缓慢加入到BSA溶液中搅拌5min,使蛋白质分子隔离并包埋锰离子。然后用1mL NaOH水溶液(2M)调节体系的pH为10,在37℃下反应24h。然后将溶液倒入截留分子量为3500的透析袋中,用去离子水透析12h,净化产物。冰箱4℃保存。
S4、向COOH-三元金属的中加入10倍COOH-三元金属质量的N-(3-(二甲氨基)-丙基)-3-乙基碳二胺盐酸盐和10倍COOH-三元金属质量的N-羟基琥珀酰亚胺,室温搅拌3h。接着再加入BSA-Mn复合物,搅拌反应12h,反应产物用去离子水清洗,在12000rpm离心清洗3次,得到多功能纳米酶免疫佐剂(AuPdRh@Mn纳米材料)。
将实施例1制备获得的多功能纳米酶免疫佐剂进行表征,请参阅图1、图2、图3和图4,可以看出,本实验方法通过合成一种多介孔复合金属材料作为骨架,通过化学键形式结合牛血清白蛋白结合免疫佐剂锰,不仅提高了纳米材料的稳定性和运输能力,同时结合AuPdRh本身的纳米酶催化作用,实现了锰离子靶向递送能力,及肿瘤杀伤效果。
实施例2
本实施例提供了一种多功能纳米酶免疫佐剂,其制备方法包括如下步骤:
S1、将6mg DPPC、2mg胆固醇溶解于8mL的氯仿中,于50℃、80转的条件下反应60min得到脂质膜。加入L-抗坏血酸(0.5mg/mL)溶解脂质膜(脂质膜和L-抗坏血酸的体积比为1:1),超声40min,接着于10000离心取上清得到稳定还原剂。按体积比为1mL:100μL:100μL:100μL向稳定还原剂中加入氯金酸(10mmol/L)、氯化钯(10mmol/L)和氯化铑(10mmol/L),反应8h;接着以10000rpm离心30min,接着清洗4次,获得AuPdRh纳米粒子。
S2、将多孔三元金属纳米粒子(AuPdRh纳米粒子)溶解于乙醇(甲醇和乙醚)中,接着加入5倍AuPdRh纳米粒子质量的硫辛酸,反应12h,反应结束后用乙醇洗涤多次,再水洗,在10000rpm离心20分钟,分离收集沉淀,即得COOH-三元金属;
S3、将200mg牛血清白蛋白溶于8mL去离子水中,将1mL MnCl2水溶液(80mm)缓慢加入到BSA溶液中搅拌5min,使蛋白质分子隔离并包埋锰离子。然后用1mL NaOH水溶液(1.5M)调节体系的pH为10,在35℃下反应30h。然后将溶液倒入截留分子量为3000的透析袋中,用去离子水透析10h,净化产物。冰箱3-5℃保存。
S4、向COOH-三元金属的中加入8倍COOH-三元金属质量的N-(3-(二甲氨基)-丙基)-3-乙基碳二胺盐酸盐和8倍COOH-三元金属质量的N-羟基琥珀酰亚胺,室温搅拌3h。接着再加入BSA-Mn复合物,搅拌反应12h,反应产物用去离子水清洗,在10000rpm离心清洗3次,得到多功能纳米酶免疫佐剂(AuPdRh@Mn纳米材料)。
实施例3
本实施例提供了一种多功能纳米酶免疫佐剂,其制备方法包括如下步骤:
S1、将8mg DPPC、4mg胆固醇溶解于12mL的氯仿中,于60℃、90转的条件下反应120min得到脂质膜。加入L-抗坏血酸(0.8mg/mL)溶解脂质膜(脂质膜和L-抗坏血酸的体积比为1:1.2),超声60min,接着于15000rpm离心取上清得到稳定还原剂。按体积比为1mL:200μL:200μL:200μL向稳定还原剂中加入氯金酸(20mmol/L)、氯化钯(20mmol/L)和氯化铑(20mmol/L),反应5h;接着以15000rpm离心10min,接着清洗3次,获得AuPdRh纳米粒子。
S2、将多孔三元金属纳米粒子(AuPdRh纳米粒子)溶解于乙醇(甲醇和乙醚)中,接着加入20倍AuPdRh纳米粒子质量的硫辛酸,反应24h,反应结束后用乙醇洗涤多次,再水洗,在13000rpm离心10分钟,分离收集沉淀,即得COOH-三元金属;
S3、将300mg牛血清白蛋白溶于10mL去离子水中,将1mLMnCl2水溶液(120mm)缓慢加入到BSA溶液中搅拌5min,使蛋白质分子隔离并包埋锰离子。然后用1ml NaOH水溶液(2.5M)调节体系的pH为12,在40℃下反应30h。然后将溶液倒入截留分子量为4000的透析袋中,用去离子水透析15h,净化产物。冰箱5℃保存。
S4、向COOH-三元金属的中加入11倍COOH-三元金属质量的N-(3-(二甲氨基)-丙基)-3-乙基碳二胺盐酸盐和11倍COOH-三元金属质量的N-羟基琥珀酰亚胺,室温搅拌3h。接着再加入BSA-Mn复合物,搅拌反应12h,反应产物用去离子水清洗,在15000rpm离心清洗4次,得到多功能纳米酶免疫佐剂(AuPdRh@Mn纳米材料)。
对比例1
本对比例提供了一种AuPdRh纳米粒子,其制备方法请参阅实施例1中步骤S1。
对比例2
本对比例提供了一种BSA-Mn2+复合物,其制备方法请参阅实施例1中步骤S3。
对比例3
本对比例与实施例1基本相同,区别仅在于,本对比例中省略了实施例1步骤S2中的硫辛酸,即省略步骤S2,并且步骤S4变为AuPdRh纳米粒子中加入10倍AuPdRh纳米粒子的EDC和NHS,室温搅拌3h。接着再加入BSA-Mn复合物,搅拌反应12h,反应产物用去离子水清洗,在10000~15000rpm离心清洗3~4次。
实验结果表明:由于BSA-Mn2+复合物无法通过酰胺键与AuPdRh纳米粒子相连,无法承担包裹AuPdRh纳米粒子作用。
对比例4
本对比例与实施例1基本相同,区别仅在于,本对比例中将实施例1步骤S2中的硫辛酸替换为甲酸。
实验结果表明:虽然甲酸中含有羧基,但是其不能将羧基成功接枝至金属粒子上,进而BSA-Mn2+复合物无法通过酰胺键与AuPdRh纳米粒子相连,无法承担包裹AuPdRh纳米粒子作用。
对比例5
本对比例与实施例1基本相同,区别仅在于,本对比例中省略了实施例1步骤S1中脂质体模板的制备,即直接向还原剂L-抗坏血酸溶液中加入氯金酸、氯化钯和氯化铑,搅拌制得AuPdRh纳米粒子。
制备获得的AuPdRh纳米粒子为实心结构,无法装载Mn2+。
实验例一:光热稳定性测试。
将实施例1制备获得的多功能纳米酶免疫佐剂(AuPdRh@Mn2+纳米材料)进行光热转换效果的测试。
测试方法包括:用1208nm激光连续照射AuPdRh@Mn纳米材料水溶液。根据以下公式计算光热转换效率(η)。
其中h代表传热系数,S是容器的表面积。Tmax表示最高温度,TSurr为周围温度,QS表示与激光吸光度相关的热量,I表示入射光功率,A1208表示激光最佳色散的吸光度值。
测试结果请参阅图5,从图5中a可以看出,AuPdRh@Mn2+纳米材料在1205nm激光(1Wcm-2)照射600s后光热效果明显,光热转换效果为39.35%,同时从图5中b可以看出,冷却时间与从冷却阶段获得的温度驱动力的负自然对数为τs为235.97,从图5中c可以看出,通过升温降温四个循环表明AuPdRh@Mn纳米材料具有较好的光热稳定性。
实验例二:抗肿瘤试验。
将实施例1制备获得的多功能纳米酶免疫佐剂(AuPdRh@Mn2+纳米材料)进行抗肿瘤试验。
不同处理组分别包括:无激光照射组和施加1208nm激光照射组。
其中,无激光照射组又分为以PBS作为空白对照组(Control)、给药AuPdRh组(AuPdRh)、给药BSA-Mn2+组(BSA-Mn2+)、给药AuPdRh@Mn2+组(AuPdRh@Mn2+)、在H2O2条件下给药BSA-Mn2+组(BSA-Mn2++H2O2)、在H2O2条件下给药AuPdRh组(AuPdRh+H2O2)、在H2O2条件下给药AuPdRh@Mn2+组(AuPdRh@Mn2++H2O2)。
施加1208nm激光照射组又分为以PBS作为空白对照组(Control)、给药AuPdRh组并施加1208nm激光照射组(AuPdRh)、给药AuPdRh@Mn2+并施加1208nm激光照射组(AuPdRh@Mn2 +)、在H2O2条件下给药AuPdRh并施加1208nm激光照射组(AuPdRh)、在H2O2条件下给药AuPdRh@Mn2+并施加1208nm激光照射组(AuPdRh@Mn2++H2O2)。
其中,在H2O2条件下给药的具体方式是:在培养基中直接添加H2O2,用于模拟肿瘤内源性H2O2环境。
试验方法包括:将B16F10细胞用全营养培养基稀释到1000个/孔接种到96孔板,放置于细胞培养箱中(37℃,4%CO2)培养12小时。分别用含有AuPdRh纳米粒子(100μg/mL)、AuPdRh@Mn2+纳米粒子(μg/mL)培养4小时,再含有或不含有纳米粒子的培养基中加入1nM-1000nM H2O2,与皮肤癌细胞(B16F10)共同培养8小时,施加1208nm激光照射或不施加光照处理,继续培养12小时。更换新鲜培养基,按每孔5mg/mL工作浓度加入CCK试剂溶液,避光培养4小时,酶标仪测定450nm处的吸光值(OD),计算相对肿瘤细胞抑制效果。
试验结果请参阅图6,从图6可以看出,AuPdRh@Mn2+纳米粒子比AuPdRh纳米粒子杀伤性更强。AuPdRh@Mn2+纳米粒子在H2O2条件下给药并施加1208nm激光照射组对皮肤肿瘤的杀伤能力显著提升。
实验例三:肿瘤免疫治疗效果。
将实施例1制备获得的多功能纳米酶免疫佐剂(AuPdRh@Mn纳米材料)进行抗肿瘤试验。
RT-PCR分析来自不同治疗组的预处理DC中cGAS、STING和IFN-α的水平:对照组、MnCl2、AuPdRh、AuPdRh@Mn2+、AuPdRh+1208nm辐照、AuPdRh@Mn2++1208nm辐照。
tSNE的代表性热图显示了来自DC细胞(CD11c+)的成熟标记物(CD80、CD86),来源于流式细胞术数据,每个点对应一个单个细胞。
试验方法包括:将B16F10细胞按照合适的比例接种到6孔板,放置于细胞培养箱中(37℃,4%CO2)培养12小时。在含有MnCl2、AuPdRh、AuPdRh@Mn2+或不含有纳米粒子的培养基中与皮肤癌细胞共培养8小时,施加1208nm光照或不施加光照处理3-5min,继续培养12-24小时。PBS清洗两次,胰酶消化并收集不同处理组的细胞,用PBS再清洗一次。直CD11c+、CD80和CD86的抗体与细胞避光共孵育2小时,直接流式细胞仪上机检测荧光强度并计算。重复上述细胞培养和处理的实验,用PBS清洗两次且尽可能的吸出PBS,每孔加入1mL RNA提取试剂(TRIZOL)和氯仿,提取RNA,检测CGAS、STING和IFN-α的mRNA表达水平。
试验结果请参阅图7,从图7可以看出,从流式细胞数据AuPdRh@Mn2++1208nm laser组表达CD11c+、CD80、CD86阳性的细胞占比最大。说明AuPdRh@Mn纳米材料在光照的情况下,通过激活STING-cGAS信号通路激活抗肿瘤免疫。
实验例四:核磁成像。
将实施例1制备获得的多功能纳米酶免疫佐剂(AuPdRh@Mn纳米材料)进行核磁成像。
实验方法包括:AuPdRh@Mn2+水溶以0mg/mL,0.1mg/mL,0.4mg/mL,0.6mg/mL,0.7mg/mL,0.8mg/mL和0.1mg/mL浓度置于核磁共振成像(Magnetic Resonance Imaging,MRI)成像装置中,进行造影成像并计算强度系数。
实验结果请参阅图8,从图8可以看出,AuPdRh@Mn纳米离子具有优异的核磁造影成像潜力。
综上所述,本申请提供的多功能纳米酶免疫佐剂的制备方法,简单高效,以脂质体为软模版生成的金钯铑镂空纳米球具有超大孔径,同时以牛血清白蛋白作为交联剂增强金钯铑纳米球的锰载量、提高金属材料的水溶性。本发明锰络合牛血清白蛋白(BSA-Mn)复合物修饰的三元金属镂空纳米球(AuPdRh)的多功能纳米酶免疫佐剂,不仅粒径小、分散程度高、生物相容性好,利于延长在血液循环中停留的时间,生物安全性好。根据EPR效应,纳米材料在肿瘤部位高度富集,锰离子的存在赋予了纳米球肿瘤MRI核磁成像的能力,同时在近红外激光照射下有效提高肿瘤细胞的杀伤效果、促进锰离子释放,促进肿瘤部分的免疫细胞浸润及杀伤效果,并且可以增强抗肿瘤免疫记忆且有效预防肿瘤远端转移和复发。本发明提供的多功能纳米酶免疫佐剂可以广泛应用于制备光热剂、制备治疗肿瘤药物的纳米酶、制备免疫佐剂、制备治疗肿瘤药物或制备肿瘤成像的药物。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,对于本领域的技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种多功能纳米酶免疫佐剂的制备方法,其特征在于,其包括:
将多孔三元金属纳米粒子的溶解液与具有羧基的酸溶液反应制得COOH-三元金属;
将牛血清白蛋白的溶解液与锰盐反应,接着调节体系pH至10-12,继续反应制得BSA-Mn复合物;
将所述BSA-Mn复合物负载于所述COOH-三元金属的表面及孔内,即得。
2.根据权利要求1所述的多功能纳米酶免疫佐剂的制备方法,其特征在于,所述多孔三元金属纳米粒子与所述具有羧基的酸溶液的质量比为1:5-20;
优选地,所述牛血清白蛋白和所述锰盐的用量比为200-300mg:1ml,其中,所述锰盐的浓度为80-120mM;
优选地,采用氢氧化钠调节所述体系pH,所述牛血清白蛋白和所述氢氧化钠的用量比为200-300mg:1ml,其中,所述氢氧化钠溶液的浓度为1.5-2.5M。
3.根据权利要求1所述的多功能纳米酶免疫佐剂的制备方法,其特征在于,所述多孔三元金属纳米粒子的溶解液是将所述多孔三元金属纳米粒子溶解于第一有机溶剂中获得的,所述第一有机溶剂包括乙醇、甲醇和乙醚中的至少一种;
优选地,所述多孔三元金属纳米粒子的溶解液和所述具有羧基的酸溶液的反应时间为12-24h,反应结束后用所述第一有机溶剂洗涤多次,再水洗,经离心分离收集沉淀,即得所述COOH-三元金属;
优选地,所述离心分离包括以10000-13000rpm离心10-20分钟;
优选地,所述具有羧基的酸溶液为硫辛酸。
4.根据权利要求1所述的多功能纳米酶免疫佐剂的制备方法,其特征在于,所述多孔三元金属纳米粒子为AuPdRh纳米粒子;
优选地,所述AuPdRh纳米粒子的制备方法包括:将DPPC和胆固醇溶解于第二有机溶剂中,旋蒸得到脂质膜,加入L-抗坏血酸溶解所述脂质膜,超声反应得到稳定还原剂,将所述稳定还原剂中加入含金氯化物、含钯氯化物和含铑氯化物,反应后离心清洗获得所述AuPdRh纳米粒子。
5.根据权利要求4所述的多功能纳米酶免疫佐剂的制备方法,其特征在于,所述DPPC、所述胆固醇和所述第二有机溶剂的用量比为6-8mg:2-4mg:8-12mL;
优选地,所述第二有机溶剂为氯仿;
优选地,所述旋蒸包括于50℃-60℃、80-90转的条件下反应10-120min;
优选地,所述脂质膜和所述L-抗坏血酸的体积比为1:1-1.2,其中,所述L-抗坏血酸的浓度为0.1-1mg/mL;
优选地,所述超声反应的时间为10-120min,接着于10000-15000rpm离心取上清。
6.根据权利要求4所述的多功能纳米酶免疫佐剂的制备方法,其特征在于,所述稳定还原剂、所述含金氯化物、含钯氯化物和含铑氯化物的体积比为1mL:100-200μL:100-200μL:100-200μL,其中,所述含金氯化物、含钯氯化物和含铑氯化物的浓度均为1-50mmol/L;
优选地,所述含金氯化物为氯金酸;
优选地,所述含钯氯化物为氯化钯或四氯钯酸钠;
优选地,所述含铑氯化物为氯化铑或六氯铑酸钠;
优选地,加入所述含金氯化物、含钯氯化物和含铑氯化物后反应5-8h;
优选地,所述离心清洗包括于以10000-15000rpm离心10-20min,接着清洗3-4次。
7.根据权利要求1所述的多功能纳米酶免疫佐剂的制备方法,其特征在于,在制备所述BSA-Mn复合物中,调节体系pH值后,于35-40℃下反应20-30h,接着将反应物倒入截留分子量为3000-4000的透析袋中,用去离子水透析10-15h,于3-5℃保存。
8.根据权利要求1所述的多功能纳米酶免疫佐剂的制备方法,其特征在于,将所述BSA-Mn复合物负载于所述COOH-三元金属包括:向所述COOH-三元金属的中加入羧基活化试剂,接着再加入所述BSA-Mn复合物,搅拌反应,接着固液分离得到多功能纳米酶免疫佐剂;
优选地,所述羧基活化试剂包括质量比为1:1-1.5的N-(3-(二甲氨基)-丙基)-3-乙基碳二胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺;
优选地,所述羧基活化试剂与所述COOH-三元金属的质量比为18-22:1。
9.一种多功能纳米酶免疫佐剂,其特征在于,其采用如权利要求1-8任一项所述的多功能纳米酶免疫佐剂的制备方法制备而成。
10.如权利要求9所述的多功能纳米酶免疫佐剂在制备光热剂、制备治疗肿瘤药物的纳米酶、制备免疫佐剂、制备治疗肿瘤药物或制备肿瘤成像的药物中的应用。
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