CN115561209A - 一种低光损伤双光子显微成像系统 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种低光损伤双光子显微成像系统，飞秒脉冲激光器(1)出射的激发光经光电调制器(2)调制后可通过第一可移动反射镜(4)及第二可移动反射镜(11)实现第一扫描模块(8)及第二扫描模块(10)之间的切换。第一扫描模块(8)能够以光栅扫描的方式进行生物活体组织的静息态成像；第二扫描模块(10)可实现视频级的快速成像，能够观测生物活体组织中快速变化的神经活动。通过在成像过程中对光电调制器的实时控制，可实现特定像素点处(如：目标细胞)的门控激发，减少激光对被测物的无效照射，以降低光损伤。此双光子成像系统能够减少传统双光子激发的热损伤效应，适用于长时程的活体成像。

Description

一种低光损伤双光子显微成像系统
技术领域
本发明属于光学显微成像技术领域，具体涉及一种低光损伤双光子显微成像系统。
背景技术
双光子荧光显微成像是一种非线性光学成像技术，使用近红外光作为激发光源，在高散射生物样品中具有很好的光穿透能力、较小的光毒性、和很好的三维层析能力。因此，双光子荧光显微成像在生命科学基础研究领域具有不可替代的作用。
双光子荧光显微成像通常采用飞秒脉冲激光作为激发光，发出的高重复频率的超短脉冲光具有很高的瞬时功率，以满足荧光基团双光子激发的要求。然而，由长时程激光照射引发的热效应会影响生物组织的生理状态。研究表明，用平均功率为100mW的飞秒激光对1mm2范围的鼠脑组织进行时长为180秒的照射可使组织温度升高1.8℃。脑组织温度升高可导致脑水肿、蛋白质凝固变性、炎症反应、甚至细胞死亡，造成不可逆的损伤。温度升高还会影响神经元动作电位发放的特征，对实验结果产生影响。然而，在成像中减少激光功率会降低荧光探测的信噪比，影响成像质量。
发明内容
本发明提出一种可降低双光子活体成像光损伤的方法，适用于在活体动物中的长时程成像观测。
本发明采用的技术方案如下：
本申请提出了一种低光损伤双光子显微成像系统，包括：飞秒脉冲激光器(1)、光电调制器(2)、第一反射镜(3)、第一可移动反射镜(4)、第二反射镜(5)、第一扩束装置(6)、第三反射镜(7)、第一扫描模块(8)、第二扩束装置(9)、第二扫描模块(10)、第二可移动反射镜(11)、扫描透镜(12)、套筒透镜(13)、二向色镜(14)、显微镜物镜(15)、窄带滤光片(16)、光电倍增管(17)、信号控制/采集设备(18)、电脑(19)。所述第一扫描模块(8)可实现逐点慢速扫描成像，所述第二扫描模块(10)可实现视频级快速成像，其中：
所述飞秒脉冲激光器(1)出射的激光经所述光电调制器(2)调制后以45°角入射所述第一反射镜(3)，经所述第一反射镜(3)和所述第二反射镜(5)反射后的光束透射通过所述第一扩束装置(6)，经所述第一扩束装置(6)扩束后的光束经所述第三反射镜(7)反射后进入所述第一扫描模块(8)，形成的第一扫描光束透射通过所述扫描透镜(12)、所述套筒透镜(13)和所述二向色镜(14)后，经所述显微镜物镜(15)聚焦于被测物上，并激发所述被测物产生荧光，所述荧光被所述显微镜物镜(15)收集后经所述二向色镜(14)反射，再经所述窄带滤光片(16)滤光后被所述光电倍增管(17)探测，并由所述信号控制/采集设备(18)和所述电脑(19)对所述信号进行采集和处理，最终形成并显示图像；
所述飞秒脉冲激光器(1)出射的激光经所述光电调制器(2)调制后以45°角入射所述第一反射镜(3)，经所述第一反射镜(3)和所述第一可移动反射镜(4)反射后的光束透射通过所述第二扩束装置(9)，经所述第二扩束装置(9)扩束后的光束进入所述第二扫描模块(10)，形成的第二扫描光束经所述第二可移动反射镜(11)反射后透射通过所述扫描透镜(12)、所述套筒透镜(13)和所述二向色镜(14)后，经所述显微镜物镜(15)聚焦于被测物上，并激发所述被测物产生荧光，所述荧光被所述显微镜物镜(15)收集后经所述二向色镜(14)反射，再经所述窄带滤光片(16)滤光后被所述光电倍增管(17)探测，并由所述信号控制/采集设备(18)和所述电脑(19)对所述信号进行采集和处理，最终实现对神经活动的快速成像。
在其中一些实施例中，所述飞秒脉冲激光的脉冲宽度为100fs，重复频率为80MHz，波长可调范围在660-1320nm之间。
在其中一些实施例中，所述第一扫描模块(8)由两个检流计振镜组成。
在其中一些实施例中，所述第一扫描模块(8)为声光偏转器，所述声光偏转器可用于进行无惯性的随机扫描。
在其中一些实施例中，所述第二扫描模块(10)由一个检流计振镜与一个高速共振振镜组成。
在其中一些实施例中，所述第二扫描模块(10)与所述第一扫描模块(8)和扫描透镜(12)之间的光程差一致。
本申请采用的上述技术方案具备下述效果：
本申请提供的低光损伤双光子显微成像系统包括飞秒脉冲激光器(1)、光电调制器(2)、第一反射镜(3)、第一可移动反射镜(4)、第二反射镜(5)、第一扩束装置(6)、第三反射镜(7)、第一扫描模块(8)、第二扩束装置(9)、第二扫描模块(10)、第二可移动反射镜(11)、扫描透镜(12)、套筒透镜(13)、二向色镜(14)、显微镜物镜(15)、窄带滤光片(16)、光电倍增管(17)、信号控制/采集设备(18)及电脑(19)。所述第一扫描模块(8)可实现逐点扫描；所述第二扫描模块(10)可实现视频级快速扫描。本申请提供的低光损伤双光子显微成像系统可通过移动第一可移动反射镜(4)与第二可移动反射镜(11)实现第一扫描模块(8)与第二扫描模块(10)之间的切换。第一扫描模块(8)能够以逐点扫描的方式进行活体生物组织的静息态成像；第二扫描模块(10)可实现视频级的快速成像，用于观测活体生物组织中快速变化的神经活动。通过在成像过程中对光电调制器的实时控制，可实现在特定像素点处(如：目标细胞)的门控激发，减少激光对被测物的无效照射，从而降低光损伤。此双光子成像系统能够减少由脉冲激光照射引起的热损伤，适用于长时程的活体成像。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为本发明实施例提供的低光损伤双光子显微成像系统的结构示意图。
图2a为本发明实施例提供的基于高速振镜的扫描路径示意图。
图2b为本发明实施例提供的共振振镜在扫描过程中的偏转角变化及同步信号示意图。
其中，系统的主要组成部分包括：飞秒脉冲激光器(1)、光电调制器(2)、第一反射镜(3)、第一可移动反射镜(4)、第二反射镜(5)、第一扩束装置(6)、第三反射镜(7)、第一扫描模块(8)、第二扩束装置(9)、第二扫描模块(10)、第二可移动反射镜(11)、扫描透镜(12)、套筒透镜(13)、二向色镜(14)、显微镜物镜(15)、窄带滤光片(16)、光电倍增管(17)、信号控制/采集设备(18)及电脑(19)。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“上”、“下”、“水平”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例对本发明进行进一步地详细说明。
图1为本发明实施例提供的双光子显微成像系统的结构示意图，系统的主要组成部分包括：飞秒脉冲激光器(1)、光电调制器(2)、第一反射镜(3)、第一可移动反射镜(4)、第二反射镜(5)、第一扩束装置(6)、第三反射镜(7)、第一扫描模块(8)、第二扩束装置(9)、第二扫描模块(10)、第二可移动反射镜(11)、扫描透镜(12)、套筒透镜(13)、二向色镜(14)、显微镜物镜(15)、窄带滤光片(16)、光电倍增管(17)、信号控制/采集设备(18)及电脑(19)。所述第一扫描模块(8)可实现逐点扫描；所述第二扫描模块(10)可实现视频级快速扫描。
上述实施例提供的低光损伤双光子显微成像系统的工作原理如下：
所述飞秒脉冲激光器(1)出射的激光经所述光电调制器(2)调制后以45°角入射所述第一反射镜(3)，经所述第一反射镜(3)和所述第二反射镜(5)反射后的光束透射通过所述第一扩束装置(6)，经所述第一扩束装置(6)扩束后的光束经所述第三反射镜(7)反射后进入所述第一扫描模块(8)，形成的第一扫描光束透射通过所述扫描透镜(12)、所述套筒透镜(13)和所述二向色镜(14)后，经所述显微镜物镜(15)聚焦于被测物上，并激发所述被测物产生荧光，所述荧光被所述显微镜物镜(15)收集后经所述二向色镜(14)反射，再经所述窄带滤光片(16)滤光后被所述光电倍增管(17)探测，并由所述信号控制/采集设备(18)和所述电脑(19)对所述信号进行采集和处理，最终形成并显示图像；所述飞秒脉冲激光器(1)出射的激光经所述光电调制器(2)调制后以45°角入射所述第一反射镜(3)，经所述第一反射镜(3)和所述第一可移动反射镜(4)反射后的光束透射通过所述第二扩束装置(9)，经所述第二扩束装置(9)扩束后的光束进入所述第二扫描模块(10)，形成的第二扫描光束经所述第二可移动反射镜(11)反射后透射通过所述扫描透镜(12)、所述套筒透镜(13)和所述二向色镜(14)后，经所述显微镜物镜(15)聚焦于被测物上，并激发所述被测物产生荧光，所述荧光被所述显微镜物镜(15)收集后经所述二向色镜(14)反射，再经所述窄带滤光片(16)滤光后被所述光电倍增管(17)探测，并由所述信号控制/采集设备(18)和所述电脑(19)对所述信号进行采集和处理，最终实现对神经活动的快速成像。
可以理解，首先应用第一扫描模块(8)进行结构成像，并应用图像分割算法对获取的结构图像进行图像分割以确定探测目标的像素位置；然后移入第一可移动反射镜(4)及第二可移动反射镜(11)切换为第二扫描模块(10)；根据被测目标的像素位置和共振振镜的像素时钟信号，在成像过程中对光电调制器进行实时控制，以实现精准的门控激发，即，只在目标像素点处(如：神经细胞)进行激发，减少了对被测物的无效照射，从而降低激光照射带来的热损伤效应。
在其中一些实施例中，所述第一扫描模块(8)由两个检流计振镜组成。
在其中一些实施例中，所述第一扫描模块(8)可以用声光偏转器(Acousto-OpticDeflector，AOD)进行替换，AOD可进行无惯性的随机扫描。
在其中一些实施例中，所述第二扫描模块(10)由一个检流计振镜和一个高速共振振镜组成。
本发明提供的低光损伤双光子显微成像系统，通过移动第一可移动反射镜(4)和第二可移动反射镜(11)实现第一扫描模块(8)与第二扫描模块(10)之间的切换。第一扫描模块(8)能够以逐点扫描的方式进行生物活体组织的静息态成像；第二扫描模块(10)可实现视频级快速成像，可用于观测生物活体组织中快速变化的神经活动或其它生理活动。
本发明提供的双光子显微成像系统，能够降低在成像过程中由激光照射对活体生物组织带来的热损伤。
下面以活体鼠脑成像为例，详细描述该系统的工作原理：
静息态成像：首先移除第一可移动反射镜(4)和第二可移动反射镜(11)(不接入光路中)，所述飞秒脉冲激光器(1)出射的激光经光电调制器(2)调制后以45°入射角入射第一反射镜(3)，经第一反射镜(3)反射后垂直向上的光束经第二反射镜(5)反射后平行传播，并经第一扩束装置(6)进行扩束。扩束后的光束经第三反射镜(7)反射后垂直向下，并通过第一扫描模块(8)进行扫描，扫描光束经扫描透镜(12)和套筒透镜(13)后透射通过二向色镜(14)并进入显微镜物镜(15)，显微镜物镜将扫描光束聚焦于被测物上。以鼠脑成像为例，使用钙离子指示剂(GCaMP6f)标记神经元，该探针在920nm波长有较好的双光子吸收截面，被激发后发射以510nm为中心波长的荧光。荧光被显微镜物镜(15)收集后，经二向色镜(14)反射，并经窄带滤光片(16)滤光后被光电倍增管(17)探测，探测后得到的信号被信号控制/采集设备(18)和电脑(19)采集/处理后得到图像。此成像过程可获得一副神经细胞结构图像。应用图像分割算法对此图像进行二进制分割以确定目标神经元的像素位置，如图2a中的图像。(图2a为利用第一扫描模块获取的图像，白线代表第二扫描模块中快速扫描的路径，图左所示为光电调制器的电压控制信号，图中圆圈内为待测神经元。)
神经钙信号成像：移入第一可移动反射镜(4)和第二可移动反射镜(11)并保持与静息态结构成像相同的聚焦深度和成像区域。经第一反射镜(3)反射后垂直向上的光束经第一可移动反射镜(4)反射后平行传播，并经第二扩束装置(9)进行扩束，扩束后的光束进入第二扫描模块(10)进行扫描，形成的第二扫描光束经第二可移动反射镜(11)反射后再依次经过扫描透镜(12)、套筒透镜(13)后透射通过二向色镜(14)再经显微镜物镜(15)聚焦于被测物上，并激发被测物产生荧光；荧光经显微镜物镜(15)收集后由二向色镜(14)反射，经窄带滤光片(16)滤光后被光电倍增管(17)探测，最后由信号控制/采集设备(18)与电脑(19)进行信号采集和处理，实现对神经活动的成像测量。
第二扫描模块(10)中的共振振镜在每次换行启动时，驱动电路会输出5V的电压信号(如图2b所示)用于计算产生像素时钟，像素时钟可用于对光电调制器的精准控制，使激光只在扫描到目标被测物(如图2a中圆圈标记的神经细胞)的像素位置处才打开，从而减少激光在活体生物组织上的照射时间，降低光损伤。
本申请提供的低光损伤双光子显微成像系统可通过移动第一可移动反射镜(4)与第二可移动反射镜(11)实现第一扫描模块(8)与第二扫描模块(10)之间的切换。第一扫描模块(8)能够以逐点扫描的方式进行活体生物组织的静息态成像；第二扫描模块(10)可实现视频级的快速成像，用于观测活体生物组织中快速变化的神经活动。通过在成像过程中对光电调制器的实时控制，可实现在特定像素点处(如：目标细胞)的门控激发，减少激光对被测物的无效照射，从而降低光损伤。
以上仅为本申请的实施例，并不用于限制本申请。对于本领域技术人员来说，本申请可以有其它的更改和变化。凡在本申请的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本申请的权利要求范围之内。

Claims (6)

1.一种低光损伤双光子显微成像系统，其特征在于，包括：飞秒脉冲激光器(1)、光电调制器(2)、第一反射镜(3)、第一可移动反射镜(4)、第二反射镜(5)、第一扩束装置(6)、第三反射镜(7)、第一扫描模块(8)、第二扩束装置(9)、第二扫描模块(10)、第二可移动反射镜(11)、扫描透镜(12)、套筒透镜(13)、二向色镜(14)、显微镜物镜(15)、窄带滤光片(16)、光电倍增管(17)、信号控制/采集设备(18)及电脑(19)，所述第一扫描模块(8)可实现逐点扫描；所述第二扫描模块(10)可实现视频级快速扫描，其中：
所述飞秒脉冲激光器(1)出射的激光经所述光电调制器(2)调制后以45°角入射所述第一反射镜(3)，经所述第一反射镜(3)和所述第二反射镜(5)反射后的光束透射通过所述第一扩束装置(6)，经所述第一扩束装置(6)扩束后的光束经所述第三反射镜(7)反射后进入所述第一扫描模块(8)，形成的第一扫描光束透射通过所述扫描透镜(12)、所述套筒透镜(13)和所述二向色镜(14)后，经所述显微镜物镜(15)聚焦于被测物上，并激发所述被测物产生荧光，所述荧光被所述显微镜物镜(15)收集后经所述二向色镜(14)反射，再经所述窄带滤光片(16)滤光后被所述光电倍增管(17)探测，并由所述信号控制/采集设备(18)和所述电脑(19)对所述信号进行采集和处理，最终形成并显示图像；
所述飞秒脉冲激光器(1)出射的激光经所述光电调制器(2)调制后以45°角入射所述第一反射镜(3)，经所述第一反射镜(3)和所述第一可移动反射镜(4)反射后的光束透射通过所述第二扩束装置(9)，经所述第二扩束装置(9)扩束后的光束进入所述第二扫描模块(10)，形成的第二扫描光束经所述第二可移动反射镜(11)反射后透射通过所述扫描透镜(12)、所述套筒透镜(13)和所述二向色镜(14)后，经所述显微镜物镜(15)聚焦于被测物上，并激发所述被测物产生荧光，所述荧光被所述显微镜物镜(15)收集后经所述二向色镜(14)反射，再经所述窄带滤光片(16)滤光后被所述光电倍增管(17)探测，并由所述信号控制/采集设备(18)和所述电脑(19)对所述信号进行采集和处理，最终实现对神经活动的快速成像。
2.根据权利要求1所述的低光损伤双光子显微成像系统，其特征在于，所述飞秒脉冲激光的脉冲宽度为100fs，重复频率为80MHz，波长可调范围在660-1320nm之间。
3.根据权利要求1所述的低光损伤双光子显微成像系统，其特征在于，所述第一扫描模块(8)由两个检流计振镜组成。
4.根据权利要求1所述的低光损伤双光子显微成像系统，其特征在于，所述第一扫描模块(8)为声光偏转器，所述声光偏转器可进行无惯性的随机扫描。
5.根据权利要求1所述的低光损伤双光子显微成像系统，其特征在于，所述第二扫描模块(10)由一个检流计振镜与一个高速共振振镜组成。
6.根据权利要求1所述的低光损伤双光子显微成像系统，其特征在于，所述第二扫描模块(10)与所述第一扫描模块(8)和扫描透镜(12)之间的光程差一致。
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