CN115551827A - 靶向癌症干细胞和防止转移的9-氨基-多西环素肉豆蔻酰衍生物 - Google Patents

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CN115551827A CN202180034377.7A CN202180034377A CN115551827A CN 115551827 A CN115551827 A CN 115551827A CN 202180034377 A CN202180034377 A CN 202180034377A CN 115551827 A CN115551827 A CN 115551827A
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Abstract

公开了靶向癌症干细胞并抑制癌症转移的9‑氨基‑多西环素衍生物。这些化合物选择性靶向CSC，在体内有效抑制肿瘤细胞转移，毒性很小或没有毒性，并最大程度地降低引起抗生素耐药性的风险。在一个实施方案中，将14碳脂肪酸部分共价连接至9‑氨基‑多西环素的游离氨基。所产生的“Doxy‑Myr”偶联物在抑制MCF7CSC的非锚定依赖性生长方面是多西环素强5倍以上。Doxy Myr不影响作为2D单层生长的整个MCF7癌细胞群或正常成纤维细胞的活力，显示出对CSC的引人注目的选择性。Doxy‑Myr对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌没有显示出抗生素活性。具有较长(16碳；棕榈酸)脂肪酸链长度或较短(12碳；月桂酸)脂肪酸链长度的偶联物具有类似的活性。

Description

靶向癌症干细胞和防止转移的9-氨基-多西环素肉豆蔻酰衍 生物
相关申请
本申请要求2020年5月13日提交的美国临时专利申请63/024,216的权益，并通过引用以其整体并入本文。
领域
本公开涉及使用9-氨基-多西环素的衍生物抑制线粒体功能和根除癌症，且特别是抑制癌症干细胞(CSC)和防止转移或降低转移的可能性。
背景
研究人员一直在努力开发新的抗癌治疗方案。传统的癌症疗法(例如，照射、烷化剂(如环磷酰胺)和抗代谢物(如5-氟尿嘧啶))试图通过干扰参与细胞生长和DNA复制的细胞机制，选择性地检出和根除快速生长的癌细胞。其他癌症疗法使用免疫疗法来选择性地结合(例如，单克隆抗体)快速生长的癌细胞上的突变的肿瘤抗原。遗憾地是，在这些疗法后，肿瘤经常在相同或不同的部位复发，这表明并非所有的癌细胞都已被根除。复发可能是由于化疗剂量不足和/或出现对疗法耐药的癌症克隆所致。因此，需要新的癌症治疗策略。
突变分析的进展使得能够对癌症发展过程中发生的基因突变进行深入研究。尽管对基因组蓝图(genomic landscape)有一定的了解，但现代肿瘤学难以鉴定各癌症亚型的主要驱动突变。残酷的现实似乎是，每名患者的肿瘤是独特的，且单个肿瘤可能包含多个不同的克隆细胞。因此，所需要的是强调不同癌症类型之间共性的新方法。靶向肿瘤细胞和正常细胞之间的代谢差异有望成为新的癌症治疗策略。对人乳腺癌样品的转录谱数据分析揭示了超过95种与线粒体生物发生和/或线粒体翻译有关的mRNA转录物升高。此外，95种上调的mRNA中有多于35种编码线粒体核糖体蛋白(MRP)。人乳腺癌干细胞的蛋白质组学分析同样揭示了几种有丝分裂核糖体蛋白以及其他与线粒体生物发生相关的蛋白的显著过表达。
线粒体是动态性极大的细胞器，不断分裂、伸长并相互连接以形成管状网络或碎片颗粒，以满足细胞的需要并适应细胞微环境。线粒体融合和分裂的平衡决定了线粒体的形态、丰度、功能和空间分布，因此会影响大量依赖线粒体的重要生物学过程，如ATP产生、线粒体自噬、凋亡和钙稳态。反过来，线粒体动力学可以通过线粒体代谢、呼吸和氧化应激来调节。因此，分裂和融合活动的不平衡对包括癌症在内的多种病理状况产生负面影响是不足为奇的。癌细胞通常表现为线粒体碎片化，且分裂增强或融合减少通常与癌症相关，但仍需要对线粒体动力学如何影响肿瘤发生的全面机制了解。
完整和增强的代谢功能对于支持癌细胞升高的生物能量和生物合成需求是必要的，特别是当癌细胞向着肿瘤生长和转移扩散进展时。不足为奇的是，通过从多种燃料来源提取能量，依赖线粒体的代谢途径为癌细胞提供了必需的生化平台。
癌症干细胞样细胞是相对较小的肿瘤细胞亚群，其与正常成体干细胞和胚胎干细胞具有共同的典型特征。因此，认为CSC是肿瘤再生和全身器官扩散的“主要生物学原因”，其导致肿瘤复发和远处转移的临床特征，最终导致接受化疗和放疗的癌症患者的治疗失败和过早死亡。证据表明，CSC也在肿瘤发生中发挥作用，因为在临床前动物模型中，分离的CSC在实验上表现为肿瘤起始细胞(TIC)。由于全世界约90％的癌症患者过早死于转移性疾病，因此开发有效靶向和根除CSC的新疗法是非常紧迫和未满足的临床需求。大多数传统疗法没有靶向CSC，并且经常增加CSC在原发肿瘤和远处部位的出现率。
最近，已将能量代谢和线粒体功能与参与CSC的维持和增殖的某些动力学联系在一起，CSC是肿瘤块内的一个独特的细胞亚群，其参与肿瘤发生、转移扩散和对抗癌疗法的耐受。例如，CSC显示了线粒体质量的特殊和独特的增加，以及增强的线粒体生物合成和更高的线粒体蛋白翻译活性。这些行为表明对线粒体功能的严重依赖。与这些观察结果一致，已在多种肿瘤类型的CSC中检测到线粒体代谢功能和OXPHOS升高。
一种新兴的消除CSC的策略是利用细胞代谢。CSC是癌细胞中最有活力的。在这种方法下，使用代谢抑制剂诱导ATP耗竭，并饿死CSC。迄今为止，发明人已经鉴定了具有抗CSC特性并诱导ATP耗竭的具有脱靶线粒体副作用的许多FDA批准的药物，包括例如抗生素多西环素，其作为线粒体蛋白质翻译抑制剂起作用。多西环素是一种长效四环素类似物，目前用于治疗各种形式的感染，如痤疮、玫瑰痤疮和疟疾预防等。在最近的一项Ⅱ期临床研究中，术前口服多西环素(200mg/天，持续14天)可将早期乳腺癌患者的CSC负荷降低17.65％至66.67％，阳性反应率接近90％。
然而，某些局限性限制了单一抗线粒体剂在癌症疗法中的使用，因为在肿瘤块中可以采用适应性机制来克服线粒体功能的缺乏。这些适应性机制包括，例如，在由肿瘤细胞内以及周围微环境的内外因素驱动的代谢可塑性多向过程中，CSC从氧化代谢向替代能量途径转变的能力。值得注意的是，CSC对这种代谢灵活性的控制从治疗的角度来看是有利的。然后，所需的治疗方法要么是防止这些代谢转变，要么是利用这种转变来抑制癌细胞增殖。
此外，描述了也具有一定程度抗生素活性的各种抗癌剂。例如，已鉴定到具有CSC抑制特性的多种重新改造的抗生素。虽然这类化合物有可能作为癌症疗法的一部分使用，但它们引起了关于抗生素耐药性增加的担忧。因此，所需要的是没有抗生素活性的治疗选择方案，且因此不太可能导致抗生素耐药性。
本公开的目的是描述设计用于特异性靶向和根除癌细胞，且特别是CSC的药物化合物。
本公开的另一个目的是描述设计用于特异性靶向参与转移和肿瘤复发的CSC且不具有抗生素活性的药物化合物。
本公开的另一个目的是鉴定新的抗癌治疗方法和治疗剂，且更具体地，用于防止和/或降低转移和肿瘤复发的可能性。
概述
本方法涉及9-氨基-多西环素衍生物家族，其特异性靶向癌症干细胞，并抑制癌症转移和复发。本文公开的化合物在体内有效抑制肿瘤细胞转移，毒性很小或没有毒性。这些化合物选择性地靶向CSC，同时有效地最大限度降低引发抗生素耐药性的风险，且适用于防止和/或减少转移和复发可能性的治疗用途。在一个实施方案中，14碳脂肪酸部分被共价连接至9-氨基-多西环素的游离氨基。由此产生的“Doxy-Myr”偶联物在抑制MCF7乳腺CSC非锚定依赖性生长的IC50方面是多西环素的5倍以上。Doxy Myr不影响整个MCF7癌细胞群或作为2D单层生长的正常成纤维细胞的活力，显示出对CSC的引人注目的选择性。使用革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌菌株，Doxy-Myr没有显示出针对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗生素活性。因此，本方法的化合物不可能产生一线抗生素多西环素的抗生素耐药性。具有较长(16碳；棕榈酸)或较短(12碳；月桂酸)脂肪酸链长度的偶联物具有类似的活性，但在靶向CSC方面不如Doxy Myr有效。
本方法涉及新的9-氨基-多西环素衍生物的化学合成和生物学活性，其在9位被脂肪酸部分修饰以提高靶向CSC的有效性以及防止转移和降低转移的可能性。本方法的实施方案是具有如下所示通式的化合物或其药学上可接受的盐(例如，一水合物、盐酸盐(hyclate)等)，其中R是C4-C18烷基，且优选直链烷基，且优选饱和烷基。
Figure BDA0003936009640000041
本方法可采用具有通式：
Figure BDA0003936009640000042
的化合物或其药学上可接受的盐的形式，其中R为具有4个至18个碳的直链饱和烷基。在一些实施方案中，R是具有11个至16个碳的直链饱和烷基。例如，在一些实施方案中，化合物可以具有下式：
Figure BDA0003936009640000051
在一些实施方案中，化合物可以具有下式：
Figure BDA0003936009640000052
在一些实施方案中，化合物可以具有下式：
Figure BDA0003936009640000053
在其中化合物为药学上可接受的盐的实施方案中，该盐可以是，例如，一水合物和盐酸盐之一。
本方法可采用具有通式为
Figure BDA0003936009640000054
的化合物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体的药物组合物的形式，其中R是具有4个至18个碳的直链饱和烷基。在一些实施方案中，R可以是具有11个至16个碳的直链饱和烷基。例如，R可以是11、13或15。药学上可接受的载体可包括糖、淀粉、纤维素、赋形剂、油、二醇、多元醇、酯、琼脂和缓冲剂中的一种或更多种。应当理解，本领域普通技术人员可以使用本领域可用的普通手段，在没有过度负担的情况下确定合适的药学上可接受的载体。
在一些实施方案中，药物组合物可用于防止转移、减轻炎症、减少纤维化和减少病毒复制中的一种。
本方法还可以采取防止患者中的转移的方法的形式，该方法包括对患者施用药学有效量的如本文所述化合物。
本方法还可以采取减轻患者中的炎症的方法的形式，该方法包括对患者施用药物有效量的如本文所述化合物。
本方法还可以采取减轻患者中的纤维化的方法的形式，该方法包括对患者施用药物有效量的如本文所述化合物。
本方法还可以采取减少患者中的病毒复制的方法的形式，该方法包括对患者施用药物有效量的如本文所述化合物。
鉴于本说明书、本文所附权利要求书以及通过引用并入本文的申请，这些和其他实施方案对于本领域普通技术人员来说是明显的。
附图简要说明
图1显示了示范性9-氨基-多西环素衍生物的化学结构，(A)Doxy-Myr和(B)Doxy-TPP。
图2显示了本方法实施方案的3D乳腺球形成测定结果。
图3显示了在细胞内发荧光的化合物的对比图像。
图4A和4B显示了用多西环素(“Doxy”)或Doxy-Myr处理MCF7细胞和正常人成纤维细胞(hTERT-BJ1)的细胞活力结果。
图5A-5D显示了用多西环素或Doxy-Myr处理对MCF7 2d单层增殖的结果。
图6A-6C以代表性FACS细胞周期曲线的形式显示了多西环素或Doxy-Myr处理对细胞周期进展的影响的结果。
图7显示了多西环素(实线)、Doxy-Pal(短划线)、Doxy-Laur(交替点划线)和DoxyMyr(长划线)的结果。
图8A-8D显示了不同浓度的多西环素、Doxy-Myr、Doxy-Laur和Doxy-Pal(分别)对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗生素作用。
图9说明了CAM测定转移结果。
描述
以下描述充分详细地解释了本方法的实施方案，以使本方法能够实施。尽管本方法是参照这些具体实施方案进行描述的，但应理解，本方法可以以不同形式体现，并且本描述不应被解释为将任何所附权利要求局限于本文所述的具体实施方案。相反，提供这些实施方案是为了使本公开全面和完整，并将充分地向本领域技术人员传达本方法的范围。
本描述使用了本领域普通技术人员应当理解的各种术语。为避免疑问，作出以下澄清。术语“治疗(treat)”、“治疗(treated)”、“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”包括至少一种与所治疗的状态、病症或疾病(特别是癌症)相关或由其引起的症状的减轻或缓解。在某些实施方案中，治疗包括通过本发明的化合物减轻和/或缓解与正在治疗的癌症相关或由其引起的至少一种症状。在一些实施方案中，治疗包括导致一类细胞死亡，例如可能参与宿主中特定癌症的转移或复发的CSC，并且可以通过防止癌细胞进一步繁殖和/或通过例如剥夺这类细胞产生能量的机制抑制CSC功能来实现。例如，治疗可以是减轻癌症的一种或几种症状，或完全根除癌症。作为另一个实例，本方法可用于抑制癌症中的线粒体代谢、根除(例如，以高于增殖速率的速率杀死)癌症中的CSC、根除癌症中的TIC、根除癌症中的循环肿瘤细胞、抑制癌症的增殖、靶向和抑制CSC、靶向和抑制TIC、靶向和抑制循环肿瘤细胞、防止转移(即降低转移的可能性)、防止复发、使癌症对化疗敏感、使癌症对放疗敏感、使癌症对光疗敏感。
术语“癌症干细胞”和“CSC”是指肿瘤内的癌症细胞亚群，当被移植到动物宿主中时，其具有自我更新、分化和致肿瘤性能力。与“主体”(bulk)癌细胞相比，CSC具有线粒体质量增加、线粒体生物合成增强以及线粒体蛋白翻译激活更高。如本文所用，“循环肿瘤细胞”是一种癌细胞，其从原发肿瘤脱落到血管系统或淋巴管中，并随着血液循环携带到身体各处。CellSearch循环肿瘤细胞检测可用于检测循环肿瘤细胞。
本文所用的短语“药学有效量”是指为达到治疗效果，如调节、调整或抑制蛋白激酶活性，如抑制蛋白激酶活性或治疗癌症而需要对宿主或宿主的细胞、组织或器官施用的量。具有本领域普通技术的医生或兽医可以容易地确定所需药物组合物的有效量并开具处方。例如，医生或兽医可在药物组合物中以低于为了达到预期治疗效果所需的剂量水平使用本发明化合物的剂量开始，并逐渐增加剂量，直至达到预期效果。
如本文所用，短语“活性化合物”指本文所述的9-氨基-多西环素衍生化合物，可包括其药学上可接受的盐或同位素类似物。应当理解，可以通过本领域普通技术人员已知的任何合适的方法对受试者施用活性化合物。还应当理解，活性化合物的量及其施用时机可能取决于所治疗的个体受试者(例如，年龄和体重等因素)、施用方式、特定活性化合物的药代动力学性质以及处方医师的判断。因此，由于受试者之间的可变性，本文所述的任何剂量都旨在作为初始指南，且医生可以对化合物的剂量进行滴定以实现医生认为适合受试者的治疗方案。在考虑所需的治疗程度时，医生可以平衡各种因素，如受试者的年龄和体重、既往疾病的存在以及其他疾病的存在。药物制剂可按任何所需施用途径制备，包括但不限于口服、静脉注射或气溶胶施用，如下面更详细讨论的。
本文所用的短语“药学上可接受的载体”是指药学上可接受的材料、组合物或媒介物，例如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或封装材料。每种载体必须是“可接受的”，即与制剂的其他成分相容，且不会对患者造成伤害。一些可用作药学上可接受载体的材料的实例包括：(1)糖，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，如玉米淀粉、马铃薯淀粉；(3)纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；(4)粉状黄蓍胶；(5)麦芽；(6)明胶；(7)滑石；(8)赋形剂，如可可脂和栓剂蜡；(9)油，如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油、大豆油；(10)二醇，如丙二醇；(11)多元醇类，如甘油、山梨醇、甘露醇、聚乙二醇；(12)酯，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)海藻酸；(16)无热原水；(17)等渗盐水；(18)林格氏溶液；(19)乙醇；(20)磷酸盐缓冲液；和(21)药物制剂中使用的其他无毒相容物质。
如本文所用，术语衍生物是从参考化学部分衍生或合成的化学部分。例如，根据本方法的化合物可以被称为9-氨基-多西环素衍生物，并且具有偶联在9位的脂肪酸部分。如本文所用，偶联物是连接两种或更多种化学化合物形成的化合物。例如，多西环素和脂肪酸的偶联物产生具有多西环素部分和来源于脂肪酸的部分的化合物。如本文所用，脂肪酸是具有饱和或不饱和脂肪链的羧酸。脂肪酸的实例包括短链脂肪酸(即，在化学结构中具有5个或更少的碳原子)、中链脂肪酸(在化学结构中具有6个至12个碳原子)和其它长链脂肪酸(即，在化学结构中具有13个至21个碳原子)。饱和脂肪酸的实例包括月桂酸(CH3(CH2)10COOH)、棕榈酸(CH3(CH2)14COOH)、硬脂酸(CH3(CH2)16COOH)和肉豆蔻酸(CH3(CH2)12COOH)。油酸(CH3(CH2)7CH＝CH(CH2)7COOH)是天然的不饱和脂肪酸的实例。应当理解，本方法的化合物涉及9-氨基-多西环素，其在9位与直链饱和脂肪酸偶联，且优选具有5个至19个碳原子，且更优选10个至18个碳原子，且甚至更优选12个至16个碳原子的直链饱和脂肪酸。在优选的实施方案中，直链饱和脂肪酸是肉豆蔻酸，其具有14个碳原子。
本方法涉及新的9-氨基-多西环素衍生物的化学合成和生物学活性，其在9位用脂肪酸部分修饰以提高靶向CSC的有效性以及防止转移和降低转移的可能性。本方法的实施方案是具有通式[1]的化合物或其药学上可接受的盐(例如，一水合物、盐酸盐等)，其中R是C4-C18烷基，且优选直链烷基，且优选饱和烷基。
Figure BDA0003936009640000091
在一个优选的实施方案中，化合物是9-氨基-多西环素衍生物，其中肉豆蔻酸(14碳)部分被共价连接至9-氨基-多西环素的9-位游离氨基。为简明起见，所得化合物在本文中被称为“Doxy Myr”，示为如下化合物[1A]。其他示范性优选的实施方案包括月桂酸(12碳)部分被连接到9位氨基的9-氨基-多西环素衍生物，和棕榈酸(16碳)部分被连接到9位氨基的9-氨基-多西环素衍生物。
Figure BDA0003936009640000101
本文公开了各种数据，使用3D乳腺球测定证明了Doxy-Myr的效力及其对乳腺CSC的非锚定依赖性增殖的抑制作用。总的来说，Doxy-Myr的效力是多西环素的5倍以上。此外，Doxy-Myr表现出更好的细胞内滞留，并特异性地定位于核周膜室内。相反，当MCF7乳腺癌细胞或正常成纤维细胞作为2D单层生长时，Doxy-Myr未显示对细胞活力或增殖有任何影响。这强调了该化合物靶向CSC的3D增殖的独特选择性。在CAM测定中使用MDA-MB-231细胞，发现Doxy Myr有效抑制体内肿瘤细胞转移，很少或没有鸡胚毒性。具有较长烷基链(例如16碳，棕榈酸)和较短烷基链(例如12碳，月桂酸)的其他9-氨基-多西环素偶联物产生了类似的效果。虽然有效，但数据表明，具有14-碳烷基链的偶联物Doxy-Myr在靶向CSC方面最有效。
本文讨论的数据表明，四环素骨架9位上的脂溶性酰胺取代基导致其抗细菌活性丧失。之前公开的构效关系研究表明，四环素骨架9位的化学修饰是可耐受的，导致不同的抗细菌活性，如抗生素替加环素所例证的。四环素的脂溶性似乎在该家族药物的生物效力中发挥关键作用。
9-氨基-多西环素衍生物靶向CSC的生物学性质的改善，以及相关的抗微生物活性的丧失，使得这些新化合物在癌症治疗中极为有用，不引发对抗生素耐药性或对人类微生物群有害影响的担忧。
先前的研究通过使用MDA-MD-231细胞，成功地在小鼠模型中使用母体化合物多西环素防止骨转移。Duivenvoorden WC,
Figure BDA0003936009640000102
SV,Lhoták S,Seidlitz E,Hirte HW,TozerRG,Singh G.Doxycycline decreases tumor burden in a bone metastasis model ofhuman breast cancer.Cancer Res.2002Mar15；62(6):1588-91。然而，该研究并没有检查多西环素对肿瘤生长的影响，而是仅关注骨转移。该研究将多西环素的疗效归因于其对骨的嗜性，以及其作为溶酶体半胱氨酸蛋白酶、组织蛋白酶和MMP的蛋白酶抑制剂的能力，因为多西环素表现为锌螯合剂。
相比之下，本方法表明，多西环素和9-氨基-多西环素衍生物(如Doxy-Myr)通过靶向CSC的3D非锚定依赖性生长作为转移抑制剂。该机制与骨转移是完全不同的分子机制。因此，基于这些功能观察，将肿瘤球称为转移球可能更合适，以更好地反映3D非锚定依赖性生长与转移之间的密切关系。
通过其脱靶副作用，即抑制小线粒体核糖体的能力，多西环素被知晓起CSC增殖抑制剂的作用。通常情况下，多西环素被用作广谱抗生素，具有抑菌特性，以对抗大量的致病原，包括革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌。因此，发明人试图优化多西环素靶向CSC的能力，同时将其抗生素活性降至最低，以获得一种新的化学实体来选择性靶向CSC。
本方法的实施方案使用9-氨基-多西环素(如下所示)作为支架。9-氨基-多西环素化合物，正式名称为(4S,5S,6R,12aS)-9-氨基-4-(二甲氨基)-3,5,10,12,12a-五羟基-6-甲基-1,11-二氧代-4a,5,5a,6-四氢-4H-并四苯-2-甲酰胺，是一种合成化学品，常用于合成药物化合物和其他有机化合物。(本领域称为D-环的)9位的胺基是本方法化合物的有用取代位置，并使偶联物具有很少到没有抗生素活性。
Figure BDA0003936009640000111
根据本方法，可在D-环上的伯胺处进行取代。在第一个实施方案中，发明人在该位置将直链饱和14-碳脂肪酸部分(肉豆蔻酸)共价连接到9-氨基-多西环素。该化合物被称为Doxy-Myr。出于比较目的，发明人还将以三苯基膦(TPP)封端的6碳间隔臂合成至9-氨基-多西环素的同一位置，称为Doxy-TPP。图1显示了这些9-氨基-多西环素衍生物的化学结构。
作为膜靶向信号的脂肪酸部分的加入(如肉豆蔻酸)导致Doxy-Myr在膜室(如细胞质膜、内质网(ER)、高尔基体和/或线粒体)内的滞留增加。相比之下，TPP部分预期增加化合物的膜电位，并使化合物靶向CSC中的线粒体。
为了确定Doxy-Myr和Doxy-TPP化合物的功能活性，发明人使用3D乳腺球形成测定来评估每种化合物抑制MCF7 CSC的非锚定依赖性增殖的能力。图2显示了多西环素和Doxy-Myr的结果。Doxy-Myr的效力是多西环素的5倍以上，IC50为3.46μM。相比之下，多西环素具有18.1μM的IC50。这表明Doxy-Myr对于靶向CSC的3D非锚定依赖性增殖更有效。Doxy-TPP并不比多西环素本身更有效，因此未进行Doxy-TPP的进一步测定。Doxy TPP的数据未显示。
进一步评估证明，与多西环素相比，Doxy-Myr在细胞内具有更好的滞留。多西环素和Doxy-Myr是发荧光的(Ex.390-425nm/Em.520-560nm)，允许目视比较细胞滞留。图3显示了化合物在单层MCF7细胞中发荧光的图像。可见，与多西环素和单独用媒介物处理的细胞相比，Doxy-Myr更容易在单层MCF7细胞中被检出和滞留。Doxy-Myr荧光显示核周染色模式，与其在细胞内膜室中的分配和滞留一致。该观察结果可以从机理上解释其增强的效力。未观察到Doxy-Myr的核染色，表明该化合物绝大部分被排除在核之外。
已证明本方法的实施方案对正常成纤维细胞无毒。例如，已发现Doxy-Myr实施方案在2D单层的MCF7细胞或正常人成纤维细胞中无毒。MCF7细胞和正常人成纤维细胞(hTERT-BJ1)被处理3天，以评估毒性。
图4A和图4B显示了用多西环素(“Doxy”)或Doxy-Myr处理MCF7细胞和正常人成纤维细胞(hTERT-BJ1)的细胞活力结果。接着细胞生长为2D单层，并被处理3天。在试验浓度下，Doxy-Myr不影响作为2D单层生长的MCF7细胞或正常成纤维细胞的活力。由此可见，在5μM至20μM的浓度范围内，多西环素和Doxy-Myr对任一细胞系的细胞活力均无明显影响。
还使用MCF7细胞单层测定了对细胞增殖和细胞周期的潜在2D效应。图5A-5D显示了使用xCELLigence评估的用多西环素或Doxy-Myr处理MCF7 2d单层的结果。结果相对于对照(无治疗)显示。图5A和5B显示了多西环素的结果，而图5C和5D显示了Doxy-Myr的结果。可见，与对照(无治疗)相比，用多西环素或Doxy-Myr处理均未抑制MCF7细胞的增殖。
图6A-6C以代表性FACS细胞周期曲线的形式显示了多西环素或Doxy-Myr处理对细胞周期进程的影响结果。MCF7细胞在多西环素(图6B)或Doxy-Myr(图6C)存在下(浓度为10μM)以2D单层培养72小时。并行处理单独媒介物对照(图6A)。相对于母体化合物多西环素，Doxy-Myr对降低MCF7细胞2D单层的细胞周期进程没有任何显著影响。
这些结果表明，总体而言，Doxy-Myr并未显著降低2D单层MCF7细胞的细胞活力、增殖或细胞周期进程。这表明Doxy-Myr对3D非锚定依赖性生长条件下的细胞增殖的影响是特异性的。
相对于多西环素，本方法的实施方案具有改善的CSC抑制效果。数据表明，这种效果取决于直链饱和烷基链的长度。合成并评估了在9位分别与月桂酸(12碳链，“Doxy-Laur”)和棕榈酸(16碳链，“Doxy-Pal”)偶联的9-氨基-多西环素的实施方案，如下化合物[1B]和[1C]所示。发现两种9-氨基-多西环素偶联物靶向CSC的效力均低于Doxy-Myr。
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使用MCF7细胞，采用3D乳腺球测定比较多西环素、Doxy-Myr、Doxy-Laur和Doxy-Pal的功能抑制活性。图7显示了多西环素(实线)、Doxy-Pal(短划线)、Doxy-Laur(交替点划线)和Doxy Myr(长划线)的结果。结果显示，与多西环素相比，所有三种9-氨基-多西环素偶联物具有提高的抑制活性。可见，Doxy-Myr具有3.46μM的IC50，Doxy-Laur具有5.8μM的IC50，Doxy-Pal具有10.4μM的IC50，多西环素具有3.46μM的IC50。图7表明，本方法的实施方案在抑制CSC的增殖方面是有效的，并且9-氨基-多西环素的肉豆蔻酰衍生物是最有效的。效力的等级顺序为：Doxy-Myr＞Doxy-Laur＞Doxy-Pal＞多西环素，未观察到链长与活性之间的直接相关性。因此，与14-碳肉豆蔻酸部分的偶联似乎是本方法实施方案的最佳链长修饰。
本方法的实施方案似乎缺乏对常见革兰氏阴性和革兰氏阳性菌的抗生素活性。抗生素活性的缺乏会降低或消除对可能发展抗生素耐药性的担忧，这可能是抗癌治疗关于使用一线抗生素(如多西环素)时的担忧。多西环素是一种成熟的确立已久的抗生素，其常规用于治疗性靶向革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌感染。对本方法的9-氨基-多西环素的脂肪酸衍生物的抗生素活性进行了评价。
图8A-8D显示了不同浓度的多西环素、Doxy-Myr、Doxy-Laur和Doxy-Pal(分别)对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗生素作用。正如预期的那样，在大多数评估浓度下，多西环素能有效抑制革兰氏阴性(大肠杆菌)和革兰氏阳性(金黄色葡萄球菌)微生物的生长。然而，与此形成鲜明对比的是，在相同浓度范围内，Doxy-Myr、Doxy-Laur和Doxy-Pal未表现出任何抗生素活性。因此，根据本方法的对9-氨基-多西环素的化学修饰去除了任何抗生素活性，却同时增加了靶向和抑制CSC的特异性。
本方法的实施方案抑制癌细胞转移，无显著毒性。这些功能效应已经在体内进行了实验性评价。使用MDA-MB-231细胞和确立已久的鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)测定定量测量肿瘤生长和转移。将MDA-MB-231乳腺癌细胞用于体内研究，因为它们不依赖雌激素，本质上更具侵袭性，形成更大的肿瘤，且迁移性、侵袭性和转移性明显更强。因此，它们是用于同时评估肿瘤生长和自发转移的更好的体内模型。多西环素已被证明有效抑制MDA-MB-231细胞的3D非锚定依赖性生长，使其成为评估本方法实施方案的理想选择。
将1×106个MDA-MB-231细胞的接种物加至每个鸡蛋的CAM(第E9天)，然后将鸡蛋随机分组。在第E10天，可检测到肿瘤，且然后每天用单独媒介物(PBS中的1％ DMSO)、多西环素或Doxy-Myr治疗，持续8天。药物施用8天后，在第E18天对所有肿瘤进行称重，并收集下层CAM以评估转移细胞的数量，用针对人Alu序列的特异性引物进行qPCR分析。
多西环素和Doxy-Myr对MDA-MB-231癌细胞转移均有显著影响。图9图示了CAM测定的转移结果。结果相对于对照(无治疗)显示。可见，多西环素抑制了44％至57.5％的转移。相比之下，在与多西环素相同的测试浓度下，Doxy-Myr抑制了85％至87％的转移。这表明，在阻止转移或降低转移可能性方面，Doxy-Myr明显比多西环素更有效。
此外，在CAM测定中观察到多西环素和Doxy-Myr很少到没有胚胎毒性。Doxy-Myr具有抗转移剂的疗效，其选择性抑制肿瘤转移，无显著毒性或抗生素活性。下表1总结了CAM测定的毒性分析。
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表1.多西环素和Doxy-Myr的鸡胚毒性。
尽管本文公开的数据主要基于乳腺癌(例如MCF7和hTERT-BJ1细胞系)，但本方法的化合物对其他类型的癌症具有疗效。在先前的工作中，发明人证明，在来自几种肿瘤类型的多种细胞系中，线粒体生物合成抑制剂成功抑制了肿瘤球的形成。下表4列出了已显示对线粒体生物合成抑制剂敏感的癌细胞系。鉴于这些结果，本方法对多种癌症类型有效。
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表2.线粒体生物合成抑制剂对多种癌症类型有效。
以上段落证明具有脂肪酸部分的9-氨基-多西环素衍生物作为抗癌治疗剂的疗效，且更具体地说，用于防止转移或降低转移的可能性。除了抑制转移和根除CSC外，本方法的化合物还具有抗炎剂、抗纤维化剂和抗病毒剂的疗效。多西环素最初被证明是细菌中蛋白质合成的抑制剂。因此，作为脱靶副作用，它还抑制哺乳动物细胞中的蛋白质合成。
由于其能够抑制蛋白质合成，这也使得多西环素能够通过减少IL-6和其他细胞因子(包括IL-1β和TNF-α等)的合成和分泌，发挥抗炎作用。此外，多西环素还抑制纤维化，因为它还可减少胶原的合成和分泌。最后，多西环素还抑制登革热病毒和其他病毒的病毒复制，因为它们是由蛋白质组成的。
根据本方法的化合物，如Doxy-Myr，与多西环素有许多相同的特性，但Doxy-Myr是一种更有效的蛋白质合成抑制剂。有趣的是，Doxy-Myr在细胞中的核周定位模式使人想起内质网(ER)，其是炎性细胞因子、胶原亚型和病毒刺突糖蛋白(spike glycoprotein)的主要蛋白质合成位点。因此，Doxy-Myr降低转移的效力增加，也可以通过其对CSC中蛋白质合成的影响来解释。
重要的是，通过抑制病毒复制，Doxy-Myr在对抗病毒感染中的用途可能具有更广泛的适用性，特别是在新兴的病毒大流行中(例如当前的2020年COVID-19疫情)，特别是在尚未获得疫苗或尚未开发疫苗的情况下。
应当理解，本方法的一些实施方案可以采取药物组合物的形式，例如用于防止转移和/或降低转移可能性的组合物。本方法的药物组合物在任何药学上可接受的载体中包括9-氨基-多西环素衍生物(包括其盐)作为活性化合物。如果需要溶液，水可以作为水溶性化合物或盐的首选载体。就水溶性而言，有机媒介物，如甘油、丙二醇、聚乙二醇或其混合物，可能是适合的。此外，在不偏离本方法的情况下，可以使用增加水溶性的方法。在后一种情况下，有机媒介物可以含有大量的水。然后任一种情况下的溶液可以用本领域技术人员已知的合适方式灭菌，且例如通过0.22微米过滤器过滤。灭菌后，可将溶液分装到适当的容器，如去热原玻璃瓶中。任选地通过无菌方法进行分装。然后，可将已灭菌的盖放在小瓶上，如有需要，可将小瓶内容物冻干。本方法并不局限于特定的施用方式，另有说明除外。
除了活性化合物之外，本方法的药物制剂可以包含本领域已知的其他添加剂。例如，一些实施方案可以包括pH调节剂，例如酸(如盐酸)和碱或缓冲剂(如乙酸钠、硼酸钠、柠檬酸钠、葡萄糖酸钠、乳酸钠和磷酸钠)。一些实施方案可以包括抗微生物防腐剂，例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯和苯甲醇。当将制剂置于为多剂量使用而设计的小瓶中时，通常会包括抗微生物防腐剂。本文所述的药物制剂可以使用本领域公知的技术进行冻干。
在涉及口服施用活性化合物的实施方案中，药物组合物可以采取胶囊、片剂、丸剂、粉剂、溶液、混悬剂等形式。含有各种赋形剂(如柠檬酸钠、碳酸钙和磷酸钙)的片剂可与淀粉(如马铃薯或木薯淀粉)等各种崩解剂和某些复合硅酸盐以及粘合剂(例如聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、明胶和阿拉伯胶)一起使用。此外，出于压片目的，可以包括润滑剂，如硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠和滑石粉。相似类型的固体组合物可以用作软填充和硬填充明胶胶囊中的填料。这方面的材料还包括乳糖(lactose or milk sugar)，以及高分子量聚乙二醇。当水混悬剂和/或酏剂需要口服施用时，本公开主题的化合物可以与各种甜味剂、调味剂、着色剂、乳化剂和/或助悬剂以及水、乙醇、丙二醇、甘油等稀释剂和其各种类似的组合相结合。
本文提供的其他实施方案包括本文公开的活性化合物的脂质体制剂。用于形成脂质体混悬液的技术是本领域熟知的。当化合物为水溶性盐时，使用常规脂质体技术，可将其掺入脂质囊泡中。在这种情况下，由于活性化合物的水溶性，活性化合物可以基本上夹带在脂质体的亲水中心或核心内。所用的脂质层可以具有任何常规的组成，并且可以含有胆固醇或可以不含胆固醇。当目的活性化合物不溶于水时，再次采用常规的脂质体形成技术，将盐基本上夹带在形成脂质体结构的疏水脂质双层内。在任何一种情况下，所产生的脂质体可以通过使用标准超声和均质化技术来减小尺寸。可以将包含本文公开的活性化合物的脂质体制剂冻干以产生冻干物，其可用药学上可接受的载体(如水)复溶以再生脂质体混悬液。
就药物组合物而言，本文所述活性化合物的药物有效量将由医疗从业人员确定，并且将取决于患者的状况、体型和年龄以及递送途径。在一个非限制性实施方案中，约0.1mg/kg至约200mg/kg的剂量具有治疗功效，其中重量比是活性化合物的重量(包括使用盐的情况下)与受试者的重量之比。在一些实施方案中，剂量可以是提供活性化合物的血清浓度高达1μM至5μM、10μM、20μM、30μM或40μM所需的活性化合物的量。在一些实施方案中，可采用约1mg/kg至约10mg/kg，而在一些实施方案中可采用约10mg/kg至约50mg/kg的剂量进行口服施用。通常，肌内注射可采用约0.5mg/kg至5mg/kg的剂量。在一些实施方案中，静脉内或口服施用的剂量可以是约1μmol/kg至约50μmol/kg，或者任选地，约22μmol/kg至约33μmol/kg的化合物。口服剂型可以包括任何适当量的活性化合物，包括例如5mg至50mg、100mg、200mg或500mg/片剂或其他固体剂型。
药物组合物可以使用作为游离碱或作为盐的活性化合物。常见的盐包括一水合物和盐酸盐，后者可有助于提高溶解度。提供了示范性药物组合物，其仅意味着是非限制性实例。在胶囊形式中，组合物可以包括50mg或100mg作为碱的活性化合物。其他成分可以包括明胶、硬脂酸镁、虫胶釉(shellac glaze)、十二烷基硫酸钠、淀粉、喹啉黄(E104)、赤藓红(E127)、专利蓝V(E131)、二氧化钛(E171)、氧化铁黑(E172)和丙二醇。缓释片剂可以包括60mg或120mg的活性化合物和分别3.6mg或7.2mg的钠，以及非活性成分，其包括乳糖一水合物；微晶纤维素；十二烷基硫酸钠；氯化钠；滑石；无水乳糖；玉米淀粉；交联聚维酮；硬脂酸镁；和纤维素聚合物涂层。应当理解，在不脱离本方法的情况下，可以使用其他药物组合物，本方法旨在不限于任何特定制剂。
在一些实施方案中，本方法可以采取治疗方法的形式，其包括对需要其的患者施用药物有效量的一种或更多种药物组合物及药学上可接受的载体。例如，本方法可用于根除可能引起转移的CSC群体，从而防止或降低原始CSC群体的转移和复发的可能性。
以下段落描述了与本文所述数据相关的材料和方法。MCF7和MDA-MB-231细胞获自美国典型培养物保藏中心(ATCC)。hTERT-BJ1成纤维细胞如Ozsvari B、Fiorillo M、Bonuccelli G、Cappello AR、Frattaruolo L、Sotgia F、Trowbridge R、Foster R、LisantiMP.Mitoriboscins：Mitochondrial-based therapeutics targeting cancer stem cells(CSCs),bacteria and pathogenic yeast.Oncotarget.2017Jul 7；8(40):67457-67472中所述。细胞在补充有10％胎牛血清(FCS)、谷氨酰胺和Pen/Strep的DMEM中培养。
9-氨基-多西环素衍生物(例如，Doxy-Myr、Doxy-Pal、Doxy-Laur等)是定制合成的。使用常规肽合成方法将每个游离脂肪酸共价连接至9-氨基-多西环素。通过NMR和质谱的联合，对期望反应产物进行了色谱鉴定、纯化，并验证了化学结构。化学化合物的IUPAC名称如下：
·多西环素：(4S,5S,6R,12aS)-4-(二甲氨基)-3,5,10,12,12a-五羟基-6-甲基-1,11-二氧代-4a,5,5a,6-四氢-4H-并四苯-2-甲酰胺
·9-氨基-多西环素：(4S,5S,6R,12aS)-9-氨基-4-(二甲氨基)-3,5,10,12,12a-五羟基-6-甲基-1,11-二氧代-4a,5,5a,6-四氢-4H-并四苯-2-甲酰胺。请注意，尽管9-氨基-多西环素可商业化获得(如Frontier Scientific,Logan,UT,作为商品A14590,HCl)，但其合成基本上如先前在Barden T.C,Buckwalter B.L,Testa R.T,Petersen P.J,Lee V.J.“Glycylcyclines”.3.9-Aminodoxycyclinecarboxamides.J.Med.Chem.1994,37,3205-3211中所述。
·Doxy-Myr：(4S,5S,6R,12aS)-4-(二甲氨基)-3,5,10,12,12a-五羟基-6-甲基-1,11-二氧代-9-(十四酰基氨基)-4a,5,5a,6-四氢-4H-并四苯-2-甲酰胺
·Doxy-Laur：(4S,5S,6R,12aS)-4-(二甲氨基)-9-(十二酰基氨基)-3,5,10,12,12a-五羟基-6-甲基-1,11-二氧代-4a,5,5a,6-四氢-4H-并四苯-2-甲酰胺
·多西环素-Pal：(4S,5S,6R,12aS)-4-(二甲氨基)-9-(十六酰基氨基)-3,5,10,12,12a-五羟基-6-甲基-1,11-二氧代-4a,5,5a,6-四氢-4H-并四苯-2-甲酰胺
用于生成上述数据的化合物由从AlfaAesar购买的多西环素水合物合成。按照(4S,5S,6R,12aS)-4-(二甲氨基)-3,5,10,12,12a-五羟基-6-甲基-1,11-二氧代-9-(十四酰基氨基)-4a,5,5a,6-四氢-4H-并四苯-2-甲酰胺的通用方法合成9-氨基-多西环素衍生物。以下举例说明了该反应，且下文讨论了使用肉豆蔻酸(R＝CH3(CH2)12)产生Doxy-Myr的各个步骤。应当理解，Doxy-Laur是使用月桂酸(R＝CH3(CH2)10)合成的，而Doxy-Pal是使用棕榈酸(R＝CH3(CH2)14)合成的。此外，Doxy-TPP是使用R＝PH3P+(CH2)5合成的。
Figure BDA0003936009640000211
步骤(a)：在氮气氛和室温下，向在浓H2SO4(5.5ml)中搅拌的盐酸多西环素水合物(1.0g，2.16mmol)溶液中加入NaNO3(0.29g，3.41mmol)，并将混合物搅拌3小时。将所得深棕色油倒入冰冷的乙醚(140ml)中，在氮气氛下收集沉淀物，用乙醚洗涤并在真空下干燥，以得到9-硝基多西环素粗品。
步骤(b)：将9-硝基多西环素粗品(1.0g，2.04mmol)在室温、氮气氛下溶于甲醇(30ml)中，加入PtO2(0.12g)，并将该混悬液在氢气氛下搅拌2小时。通过硅藻土垫过滤除去催化剂，在氮气氛下将滤液倒入乙醚(240ml)中，且收集沉淀物并真空干燥，以得到9-氨基多西环素粗品(0.89g，1.94mmol)。
步骤(c)：将在DCM(12ml)和DMF(4ml)的混合物中的9-氨基多西环素粗品(0.70g，1.5mol)、肉豆蔻酸(0.36g，1.5mol)、HBTU(0.85g，2.25mmol)和NMM(0.33ml，3.0mmol)在氮气氛下于室温搅拌72小时。减压蒸发溶剂。所得残余物用乙腈(40ml)研碎，通过过滤收集沉淀，用乙腈(10ml)、二乙醚(20ml)清洗并真空下干燥。将粗品溶于DMSO中，并通过制备型HPLC纯化以得到(4S,5S,6R,12aS)-4-(二甲氨基)-3,5,10,12,12a-五羟基-6-甲基-1,11-二氧代-9-(十四酰基氨基)-4a,5,5a,6-四氢-4H-并四苯-2-甲酰胺(1)，(0.086g)。1H-NMR(MeOD)0.89(dd，3H)，1.14-1.48(m，20H)，1.54(d，3H)，1.61-1.79(m，2H)，2.38-2.53(dd，2H)，2.49-2.61(m，2H)，2.65(m，8H)，3.68(dd，1H)，3.94(m，1H)，6.93(d，1H)，8.14(d，1H)。LC-MS 670.2[M+H]+，RT 2.78min。
对于Doxy-Laur，(4S,5S,6R,12aS)-4-(二甲氨基)-9-(十二酰基氨基)-3,5,10,12,12a-五羟基-6-甲基-1,11-二氧代-4a,5,5a,6-四氢-4H-并四苯-2-甲酰胺(2)。LC-MS642.1[M+H]+，RT 2.42min。
对于Doxy-Pal，(4S,5S,6R,12aS)-4-(二甲氨基)-9-(十六酰基氨基)-3,5,10,12,12a-五羟基-6-甲基-1,11-二氧代-4a,5,5a,6-四氢-4H-并四苯-2-甲酰胺(3)。LC-MS698.2[M+H]+，RT 3.02min。
对于Doxy-TPP，[6-[(5R,6S,7S,10aS)-9-氨基甲酰基-7-(二甲氨基)-1,6,8,10a,11-五羟基-5-甲基-10,12-二氧代-5a,6,6a,7-四氢-5H-并四苯-2-基]氨基]-6-氧代-己基]-三苯基草酸鏻(4)。LC-MS 409.7[M1/2]+，RT 1.53min。
对于3D乳腺球测定，使用酶解聚(1x胰蛋白酶-EDTA，Sigma Aldrich)和人工解聚(25号针)制备MCF7细胞的单细胞悬液。然后将细胞在非粘附的条件下以500个细胞/cm2的密度铺板在涂覆有甲基丙烯酸-2-羟乙酯)(poly-HEMA,Sigma)的培养皿中的乳腺球培养基(DMEM-F12/B27/EGF(20ng/ml)/PenStrep)中。细胞生长5天，并维持在37℃、大气压下、5％(v/v)二氧化碳/空气的加湿培养箱中。培养5天后，使用目镜分划板计数＞50μm的球体，并计算形成球体的铺板细胞的百分比，且将其称为乳腺球形成百分比，针对至单独媒介物处理的对照归一化。乳腺球测定分三次进行，并独立重复三次。
荧光成像：将用多西环素或Dosy-Myr(两者均为10μM)或媒介物对照处理的MCF7细胞孵育72小时后拍摄荧光图像。使用GFP通道，采用EVOS细胞成像系统(Thermo FisherScientific,Inc.)对细胞培养物成像。由于成像前未使用任何荧光染料，因此，信号的任何变化完全是由于多西环素化合物的自发荧光性质所致。
细胞活力测定：磺酰罗丹明(SRB)测定基于对细胞蛋白质含量的测量。将在96孔板(8000个细胞/孔)中处理72小时后，用10％三氯乙酸(TCA)在冷藏室中固定1小时，并于室温下干燥过夜。然后，将细胞用SRB孵育15分钟，用1％的醋酸清洗2次，并风干至少1小时。最后，将蛋白结合染料溶解在10mM Tris,pH为8.8的溶液中，并使用酶标仪于540nm处读取。
细胞增殖：简言之，将MCF7细胞或hTERT-BJ1成纤维细胞接种到每个孔中(10,000个细胞/孔)，并用以通过测量细胞诱导的电阻抗(Acea Biosciences Inc.)、使用RTCA(实时细胞分析)评估多西环素和Doxy-Myr的疗效。该方法允许量化细胞反应的发生和动力学。实验独立重复几次，每种条件下使用四份样品。
细胞周期分析：在用多西环素、Doxy-Myr或单独媒介物处理的MCF7细胞上进行。简而言之，胰蛋白酶化后，在避光条件下，将重悬的细胞与10ng/ml的Hoechst溶液(ThermoFisher Scientific)在37℃孵育40分钟。40分钟后，清洗细胞并重悬在PBS Ca/Mg中，以便在Attune NxT流式细胞仪(Thermo Scientific)上采集。对每个条件的10,000个事件进行分析。将门控细胞人为地归类到细胞周期阶段。
细菌生长测定：简而言之，使用标准测定系统评估抗生素活性。使用刃天青(R7017；Sigma-Aldrich,Inc.)作为探针，在96孔板中，使用大肠杆菌(E.coli)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)的标准菌株，通过实验测定了多西环素类似物的抗生素活性。使用肉汤微量稀释法(针对快速生长的需氧微生物或兼性微生物的参考敏感性试验)测定所研究化合物的最低抑菌浓度(MIC)。根据美国临床和实验室标准协会(CLSI)指南进行测定。测试化合物和阳性对照(多西环素，Sigma Aldrich#D1822)储备溶液在DMSO中以25mM制备，并在96孔透明板(VWR#734-2781)中、在阳离子调节的Mueller-Hinton肉汤(MHB，Sigma Aldrich#90922)中连续稀释(从200μM 2倍稀释至1.56μM)至终体积50μL/孔。将金黄色葡萄球菌(ATCC 29213)和大肠杆菌(ATCC 25922)培养物在Mueller Hinton琼脂(MHA，SigmaAldrich#70191)中于37℃生长过夜。然后使每个菌株的单菌落在MHB中于37℃生长过夜直到OD600为约0.6-0.8，并进一步稀释到MHB中至106菌落形成单位(CFU)/mL的浓度，这相当于OD600约0.01。然后，将50μL稀释接种物转移到先前制备的含有测试化合物、阴性对照(MHB中的1％ DMSO)和阳性对照(多西环素)的96孔板的孔中。最终孔体积为100μL，测试化合物的终浓度为100μM至0.78μM，且最终微生物浓度为5×105CFU/mL。随后，将一个阴性对照孔的10μL铺板到含有MHA的培养皿中，以检查CFU和培养物的纯度。将平板在37℃孵育24小时，之后向孔中加入20μL刃天青溶液(0.2mg/mL)，然后在37℃孵育1h30 min。在酶标仪(BMGFLUOstar Omega)中测量OD570和OD600。测定OD570和OD600之间的比值，且MIC代表抑制细菌生长的化合物的最低浓度(OD570/OD600比值低于对阴性对照孔测定的平均比值)。MIC值由三个独立实验确定。
肿瘤生长、转移和胚胎毒性的测定：这些异种移植物测定是在没有任何重大修改的情况下进行的。
a)鸡胚的制备。将受精的白来杭鸡鸡蛋在37.5℃和50％相对湿度条件下孵育9天。在此时(E9)，通过在蛋壳上钻一个小洞到气囊中使绒毛尿囊膜(CAM)脱落，并在CAM上方的蛋壳中切开一个1cm2的窗口。
b)肿瘤细胞的扩增和移植。将MDA-MB-231肿瘤细胞系培养在补充有10％ FBS和1％青霉素/链霉素的DMEM培养基中。在第E9天，用胰蛋白酶使细胞脱附，用完全培养基清洗，并悬浮在移植物培养基中。将1×106个细胞的接种物加到每个鸡蛋的CAM上(E9)，然后将鸡蛋随机分组。
c)肿瘤生长测定。在第18天(E18)，从每个鸡蛋中取出CAM的上部，在PBS中清洗，然后直接转移到多聚甲醛中(固定48h)并称重。对于肿瘤生长测定，每组至少收集和分析10份肿瘤样品(n>10)。
d)转移测定。在第E18天，采集下部CAM的1cm2部分，以评估每组8个样品(n＝8)中的转移细胞数。从CAM中提取基因组DNA(商业试剂盒)，并使用人Alu序列的特异性引物通过qPCR进行分析。通过
Figure BDA0003936009640000241
CFX Maestro软件直接管理，每个组的每个样品的Cq、平均Cq和相对转移量的计算。对所有数据进行单因素方差分析和事后检验。
e)胚胎耐受性测定。每次施用前，通过对死亡胚胎数评分来评估治疗耐受性。
统计分析：使用学生t检验确定统计学意义，将小于0.05的值视为有意义。数据显示为平均值±SEM，另有说明除外。
描述本方法实施方案使用的术语仅仅是为了描述特定的实施方案，并不旨在限制。如在本说明和所附权利要求书所使用的，单数形式“一个/种(a，an)”和“所述/该(the)”也包括复数形式，除非上下文另有明确说明。从下面的详细说明中可以明显看出，本方法包含了许多替代方案、修改和等效方案。
应当理解，尽管术语“第一”、“第二”、“第三”、“a)”、“b)”和“c)”等可以在本文用于描述本方法的各种要素，而权利要求不受这些术语限制。这些术语仅用于区分本方法的一个要素和另一个要素。因此，在不脱离本方法的指导的情况下，下面讨论的第一要素可以被称为一个要素方面，类似地，第三要素也可以被称为一个要素方面。因此，术语“第一”、“第二”、“第三”、“a)”、“b)”、“c)”等并不一定旨在向相关联的要素传达顺序或其他层次，而是仅用于标识目的。操作(或步骤)的顺序不限于权利要求中给出的顺序。
除非另有定义，本文使用的所有(包括技术和科学术语)具有与本领域技术人员通常理解的含义相同的含义。还应当理解，应当将诸如在常用词典中定义的那些术语解释为具有与它们在本申请和相关领域的上下文中的含义一致的含义，并且应当不以理想化或过度正式的意义来解释，除非本文明确地如此定义。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献均通过引用以其整体并入。如果术语有冲突，则以本说明书为准。
还有，如本文使用的，“和/或”是指并涵盖一个或更多个相关所列项目的任一个和所有可能的组合，以及当在替代方案(“或”)中解释时缺乏组合。
除非上下文另有规定，否则特别期望的是本文所描述的本方法的各种特征可以任意组合使用。此外，本方法还设想在一些实施方案中，可以排除或省略关于示范性实施方案描述的任何特征或特征的组合。
如本文所用，应将过渡短语“主要由……组成”(和语法变体)解释为包括本权利要求的所列举的材料或步骤“以及实质上不影响权利要求的基本和新型特征的材料或步骤”。因此，不应将本文使用的术语“基本上由……组成”解释为等同于“包括”。
本文所用的术语“约”当指可测量的值，例如，例如量或浓度等时，意指包括指定量的±20％，±10％、±5％、±1％、±0.5％或甚至±0.1％的变化。本文提供的可测量值的范围可以包括任何其他范围和/或其中的单个值。
因此，已经描述了本方法的某些实施方案，应当理解，所附权利要求的范围不受以上说明中阐述的特定细节的限制，因为在不脱离如在下文中要求的其精神或范围的情况下，其许多明显的变化是可能的。

Claims (18)

1.一种具有以下通式的化合物：
Figure FDA0003936009630000011
其中R包括具有4个至18个碳的直链饱和烷基，
或其药学上可接受的盐。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中R包括具有11个至16个碳的直链饱和烷基。
3.根据权利要求1所述的化合物，其中所述化合物是
Figure FDA0003936009630000012
或其药学上可接受的盐。
4.根据权利要求1所述的化合物，其中所述化合物是
Figure FDA0003936009630000013
或其药学上可接受的盐。
5.根据权利要求1所述的化合物，其中所述化合物是
Figure FDA0003936009630000021
或其药学上可接受的盐。
6.根据权利要求1所述的化合物，其包含药学上可接受的盐，且其中所述盐为一水合物和盐酸盐之一。
7.一种用于防止转移的药物组合物，所述组合物包含具有以下通式的化合物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体：
Figure FDA0003936009630000022
其中R包括具有4个至18个碳的直链饱和烷基。
8.根据权利要求7所述的药物组合物，其中R包括具有11个至16个碳的直链饱和烷基。
9.根据权利要求7所述的药物组合物，其中所述化合物是
Figure FDA0003936009630000023
或其药学上可接受的盐。
10.根据权利要求7所述的药物组合物，其中所述化合物是
Figure FDA0003936009630000024
或其药学上可接受的盐。
11.根据权利要求7所述的药物组合物，其中所述化合物是
Figure FDA0003936009630000031
或其药学上可接受的盐。
12.根据权利要求7所述的药物组合物，其包含药学上可接受的盐，且其中所述盐为一水合物和盐酸盐之一。
13.根据权利要求7所述的药物组合物，其中所述药学上可接受的载体包括糖、淀粉、纤维素、赋形剂、油、二醇、多元醇、酯、琼脂和缓冲剂的至少一种。
14.根据权利要求7-13中任一项所述的药物组合物，用于防止转移、减轻炎症、减少纤维化和减少病毒复制中的一种。
15.一种防止患者中的转移的方法，所述方法包括向所述患者施用药学有效量的权利要求7-13中任一项所述的药物组合物。
16.一种减轻患者中的炎症的方法，所述方法包括向所述患者施用药学有效量的权利要求7-13中任一项所述的药物组合物。
17.一种减少患者中的纤维化的方法，所述方法包括向所述患者施用药学有效量的权利要求7-13中任一项所述的药物组合物。
18.一种减少患者中的病毒复制的方法，所述方法包括向所述患者施用药学有效量的权利要求7-13中任一项所述的药物组合物。
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