CN115536730A - 一种穿越血脑屏障的多肽及其制备方法、纳米结构及其制备方法和应用 - Google Patents

一种穿越血脑屏障的多肽及其制备方法、纳米结构及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN115536730A
CN115536730A CN202211142764.5A CN202211142764A CN115536730A CN 115536730 A CN115536730 A CN 115536730A CN 202211142764 A CN202211142764 A CN 202211142764A CN 115536730 A CN115536730 A CN 115536730A
Authority
CN
China
Prior art keywords
polypeptide
configuration
self
amino acid
preparation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202211142764.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN115536730B (zh
Inventor
高洁
杨志谋
李欣欣
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nankai University
Original Assignee
Nankai University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nankai University filed Critical Nankai University
Priority to CN202211142764.5A priority Critical patent/CN115536730B/zh
Priority to CN202310651912.4A priority patent/CN116693605A/zh
Publication of CN115536730A publication Critical patent/CN115536730A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN115536730B publication Critical patent/CN115536730B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1002—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/1016—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aromatic or cycloaliphatic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明提供了一种穿越血脑屏障的多肽及其制备方法、纳米结构及其制备方法和应用，属于生物医药技术领域，所述多肽由花菁染料Cy5.5和短肽连接得到；所述短肽为GFFY、YFFG、GYFF、GFYF或FGFY。本发明提供的多肽用于穿越完整血脑屏障，其生产过程采用Fmoc‑标准固相合成方法，具有成本低、产率高、结构明确、成分单一等优势。同时，该多肽能够从有机溶剂高浓度母液稀释在磷酸盐缓冲溶液中自组装，形成纳米球，纳米球自身可以与BBB上表达的胰岛素受体结合并在其介导下完成对BBB的穿越。

Description

一种穿越血脑屏障的多肽及其制备方法、纳米结构及其制备 方法和应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及一种穿越血脑屏障的多肽及其制备方法、纳米结构及其制备方法和应用。
背景技术
实现血脑屏障(BBB)的有效穿越是开发中枢神经系统(CNS)疾病治疗性药物的重大挑战。血脑屏障作为大脑的防御机制严格控制特定营养物质进入CNS，并限制有害生物分子的通过，同时也阻止了几乎所有药物尤其是生物大分子药物进入大脑。传统的侵入性脑递送技术存在自身弊端，通常会带来额外的创伤或危险，非侵入性脑递送策略凭借其安全性愈发引起人们关注。非侵入式技术跨越BBB时主要利用内源性胞吞作用，例如吸附介导的胞吞作用、载体介导的胞吞作用和受体介导的胞吞作用。其中，受体介导的胞吞作用穿越血脑屏障研究最广泛，例如转铁蛋白受体(TfR)、低密度脂蛋白受体(LDLR)家族成员、黑素转铁蛋白(MTf)、CD98重链(CD98hc，也称SLC3A2)。
近年来，随着纳米技术的快速发展，用于穿越BBB进行脑疾病治疗的纳米递送系统显示出巨大潜力。研究较为广泛的脑靶向递送系统是通过表面修饰特异性配体，包括可以与BBB上普遍表达的受体结合的多肽或蛋白等，这些配体在进入系统循环后能够主动识别BBB上的受体，从而实现药物的主动靶向传递。
现在研究较广泛的脑递送系统存在如下问题：
首先，设计及合成步骤复杂，系统构建过程至少包括纳米载体制备、药物装载、表面配体修饰三步，且对药物装载和表面修饰过程的精确控制较难。
其次，在循环过程中由于体内环境复杂，尤其是多种水解酶的存在会使载体表面修饰的配体发生脱靶副作用，造成其在循环过程中大量损失。
再次，由于该纳米递送系统成分不单一，为其穿越BBB的机制或药代动力学研究带来新的挑战；若纳米系统表面修饰所使用的特异性配体为蛋白质时还存在价格高、难保存、免疫原性高等问题。
最后，观察到关于借助BBB上过表达的胰岛素受体介导的穿越BBB的纳米递送系统能够研究就少，而胰岛素受体自身是一个很好的靶标。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种穿越血脑屏障的多肽及其制备方法、纳米结构及其制备方法和应用，本发明提供的多肽用于穿越完整血脑屏障，其生产过程采用Fmoc-标准固相合成方法，具有成本低、产率高、结构明确、成分单一等优势。同时，该多肽能够从有机溶剂高浓度母液稀释在磷酸盐缓冲溶液中自组装，形成纳米球，纳米球自身可以与BBB上表达的胰岛素受体结合并在其介导下完成对BBB的穿越。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种穿越血脑屏障的多肽，所述多肽由花菁染料Cy5.5和短肽连接得到；
所述短肽为GFFY、YFFG、GYFF、GFYF或FGFY；
所述GFFY中氨基酸的构型均为L构型或D构型；
所述YFFG中氨基酸的构型均为L构型；
所述GYFF中氨基酸的构型均为L构型；
所述GFYF中氨基酸的构型均为L构型；
所述FGFY中氨基酸的构型均为L构型。
本发明还提供了一种上述技术方案所述的多肽的制备方法，所述多肽采用FMOC-固相合成方法合成。
优选的，包括以下步骤：
(1)Fmoc-氨基酸的C端与树脂结合；
(2)Fmoc保护基的脱除，洗涤；
(3)下一个Fmoc-氨基酸的C端与树脂上的氨基酸或多肽的N端耦联，洗涤；
(4)重复(2)～(3)步，直到最后一个氨基酸偶联完毕，脱除Fmoc保护基，洗涤；
(5)多肽衍生物从树脂上切除，得到粗产品；
(6)花箐染料Cy5.5与多肽的N端偶联；
(7)使用高效液相色谱对粗产品进行提纯。
本发明还提供了一种上述技术方案所述多肽的自组装多肽。
优选的，所述装多肽通过有机溶液稀释到磷酸盐缓冲液中自组装制得。
本发明还提供了一种上述技术方案所述自组装多肽的制备方法，包括以下步骤：
1)将所述多肽与二甲基亚砜混合，得到母液；
2)将所述步骤1)得到的母液与磷酸盐缓冲液、碳酸钠溶液混合、震荡，得到自组装多肽。
优选的，所述步骤1)多肽的质量与二甲基亚砜的体积比为0.8mg:10～20μL。
优选的，所述步骤2)母液与磷酸盐缓冲液、碳酸钠溶液的体积比为4:194:2；
所述碳酸钠溶液的摩尔浓度为1M。
本发明还提供了上述技术方案所述的多肽在制备穿越血脑屏障药物中的用途。
本发明还提供了上述技术方案所述的自组装多肽在制备穿越血脑屏障药物中的用途。
本发明的有益效果为：
本发明提供的多肽合成简单，通过标准固相合成短肽，液相方法标记花箐染料，所用到的原料为人体每天所必需的氨基酸；组装体可以与血脑屏障上表达的胰岛素受体结合，并在胰岛素受体的介导下穿越血脑屏障；自组装多肽穿越血脑屏障的方式是通过胞吞胞吐的形式。
附图说明
图1为Cy5.5-GFFY多肽的高效液相色谱质谱图；
图2为Cy5.5-YFFG多肽的高效液相色谱质谱图；
图3为Cy5.5-GYFF多肽的高效液相色谱质谱图；
图4为Cy5.5-GFYF多肽的高效液相色谱质谱图；
图5为Cy5.5-FGFY多肽的高效液相色谱质谱图；
图6为静脉注射Cy5.5-GFFY、Cy5.5-YFFG、Cy5.5-GYFF、Cy5.5-GFYF和Cy5.5-FGFY不同时间点时的小鼠活体成像图；
图7为静脉注射不同自组装多肽24小时后解剖离体脑的荧光含量及荧光统计结果；
图8为尾静脉注射等量Cy5.5-GFFY和Cy5.5-GDFDFDY6小时后解剖离体脑的荧光含量和统计结果；
图9为自组装多肽与胰岛素受体的蛋白结合常数图；图中所示Cy5.5-GFFY与胰岛素受体蛋白的结合常数为6.47μM，说明Cy5.5-GFFY多肽组装体与胰岛素受体特异性的结合能力；自组装多肽Cy5.5-YFFG,Cy5.5-GYFF,Cy5.5-FGFY和Cy5.5-GFYF与胰岛素受体的结合常数分别为17.7μM、18.7μM、54.2μM和23.0μM，说明Cy5.5-YFFG,Cy5.5-GYFF,Cy5.5-FGFY和Cy5.5-GFYF与胰岛素受体蛋白之间存在不同程度的结合能力；
图10是自组装装多肽Cy5.5-GDFDFDY与胰岛素受体蛋白的结合常数图；图中所示结合常数为6.52μM，说明Cy5.5-GDFDFDY与胰岛素受体之间也存在特异性的结合能力。
图11为自组装多肽Cy5.5-GFFY被脑血管内皮细胞(bEnd.3cells)胞吞胞吐图；按照示意图所示实验流程进行操作，所示细胞共聚焦显微镜的结果显示bEnd.3细胞胞吞自组装多肽Cy5.5-GFFY后会将其外排到培养基中，被胞吐的自组装多肽可以被空白细胞再次胞吞，从而实现血脑屏障的穿越。
具体实施方式
本发明提供了一种穿越血脑屏障的多肽，，所述多肽由花菁染料Cy5.5和短肽连接得到；所述短肽为GFFY、YFFG、GYFF、GFYF或FGFY；
所述GFFY中氨基酸的构型均为L构型或D构型；
所述YFFG中氨基酸的构型均为L构型；
所述GYFF中氨基酸的构型均为L构型；
所述GFYF中氨基酸的构型均为L构型；
所述FGFY中氨基酸的构型均为L构型。
当所述多肽由花菁染料Cy5.5和GFFY连接时，结构如下：
Figure BDA0003854167420000051
当所述多肽由花菁染料Cy5.5和YFFG连接时，结构如下：
Figure BDA0003854167420000052
当所述多肽由花菁染料Cy5.5和GYFF连接时，结构如下：
Figure BDA0003854167420000053
当所述多肽由花菁染料Cy5.5和GFYF连接时，结构如下：
Figure BDA0003854167420000054
当所述多肽由花菁染料Cy5.5和FGFY连接时，结构如下：
Figure BDA0003854167420000061
当所述多肽由花菁染料Cy5.5和GDFDFDY连接时，结构如下：
Figure BDA0003854167420000062
本发明还提供了一种上述技术方案所述的多肽的制备方法，所述多肽采用FMOC-固相合成方法合成。
在本发明中，所述的制备方法优选包括以下步骤：
(1)Fmoc-氨基酸的C端与树脂结合；
(2)Fmoc保护基的脱除，洗涤；
(3)下一个Fmoc-氨基酸的C端与树脂上的氨基酸或多肽的N端耦联，洗涤；
(4)重复(2)～(3)步，直到最后一个氨基酸偶联完毕，脱除Fmoc保护基，洗涤；
(5)多肽衍生物从树脂上切除，得到粗产品；
(6)花箐染料Cy5.5与多肽的N端偶联；
(7)使用高效液相色谱对粗产品进行提纯。
本发明还提供了一种上述技术方案所述多肽的自组装多肽。在本发明中，所述多肽优选通过有机溶液稀释到磷酸盐缓冲液中自组装制得。
本发明还提供了一种上述技术方案所述自组装多肽的制备方法，包括以下步骤：
1)将所述多肽与二甲基亚砜混合，得到母液；
2)将所述步骤1)得到的母液与磷酸盐缓冲液、碳酸钠溶液混合、震荡，得到自组装多肽。
在本发明中，所述多肽的质量与二甲基亚砜的体积比优选为0.8mg:10～20μL。在本发明中，所述母液与磷酸盐缓冲液、碳酸钠溶液的体积比优选为4:194:2。在本发明中，所述碳酸钠溶液的摩尔浓度优选为1M。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
在本发明实施例中涉及的制剂的来源如下：
2-Cl-Trt树脂购自天津南开和成科技有限公司，活性1.1mmol/mL；
氨基酸购自吉尔生化(上海)有限公司，纯度98％；
N，N-二异丙基乙胺(DIEPA)，购自阿达玛斯公司(Adamas)，纯度99％；
苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(以下用HBTU表示)，购自吉尔生化(上海)有限公司，纯度98％；
三氟乙酸(TFA)，三异丙基硅烷(TIS)，购自西格马奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)，纯度99％；
无水二氯甲烷(DCM)，购自天津化学试剂公司；
N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，天津化学试剂公司；
甲醇，天津康科德科技公司；
哌啶，天津化学试剂公司；
花箐染料Cy5.5-NHS ester，美国APExBIO；
氨基酸，购自吉尔生化(上海)有限公司，纯度98％；
细胞培养基，美国Gibco公司；
胎牛血清，Biological Industries公司；
BALB/c小白鼠，BALB/c nude裸鼠，6-8周龄，雌性，购自维通利华生物科技有限公司。
在本发明实施例中涉及的设备为：
高效液相色谱仪为德国Lumtech，HPLC；
高效液相色谱质谱联用仪为日本岛津，型号为LC-MS2020；
电子天平为德国arturious，型号为BS124S；
液质联用仪为美国安捷伦，Agilent 6520 Q-TOF LC/MS)。
透射电子显微镜为Talos L120C G2；
冷冻干燥机为北京亚泰科隆，型号为LGJ-1-50；
激光共聚焦显微镜为德国蔡司，型号为LSM 800 with Airyscan；
小动物活体成像系统为美国，型号为IVIS Lumina II或德国，型号为NightOWL ⅡLB983。
实施例1
(1)多肽Cy5.5-GFFY的合成
具体步骤为：
1)称取0.5mmol 2-Cl-Trt树脂于固相合成器中，加入15mL的无水二氯甲烷(DCM)，放置在摇床上摇晃15min，使2-Cl-Trt树脂充分溶胀；
2)用洗耳球把DCM从固相合成器中压除干净；
3)将0.5mmol Fmoc保护的氨基酸(Fmoc-Tyr(tbu)-OH)溶解在10mL的无水DCM里，加入1mmol的DIEA，然后转移到上述固相合成器中，室温摇床上反应1小时；
4)封闭：用洗耳球除去固相合成器中的反应液，然后用10mL无水DCM洗涤，共洗涤5次，每次1分钟；加入20mL封闭液(DCM：DIEPA：甲醇为17：1：2)，室温摇床上反应20分钟；
5)用洗耳球除去固相合成器中的反应液，先用DCM洗涤，共洗涤5次，每次一分钟，再用DMF洗涤，共洗涤5次，每次1分钟；加入10mL含体积百分比为20％的哌啶的DMF，反应35min脱去Fmoc保护基，然后用DMF洗涤5次、每次1分钟，进行下一步反应；
6)加入的第二个Fmoc保护的氨基酸(Fmoc-Phe-OH)1mmol、HBTU 1.5mmol、DIEA2mmol和10mL DMF，把溶解好的氨基酸溶液加入到上述固相合成器中，反应2h；
7)重复步骤5)和6)的方法依次加入Fmoc-Phe-OH和Fmoc-Gly-OH；然后用DMF洗涤5遍，使用20％的哌啶脱去Fmoc保护基，然后用DMF洗涤5次，二氯甲烷洗5遍，进行下一步反应；
8)将按95％TFA，2.5％TIS，2.5％H2O的体积百分比组成的溶液10mL加入到上述固相合成器中，反应30分钟，把产物从2-Cl-Trt树脂上切下，真空浓缩，除去溶剂，得到粗品，之后用HPLC分离提纯；
9)称取1.5mmol 8)中纯品多肽GFFY加入到3mL的DMSO中，使用DIEA调节pH为9-9.5，称取1mmol的花箐染料Cy5.5-NHS ester加入到反应体系中，避光搅拌器上反应过夜。过滤反应液，高效液相色谱进行纯化并通过液质联用仪检测本实施例1得到的多肽Cy5.5-GFFY，氨基酸构型均为L。
实施例2
按照实施例1的合成步骤合成Cy5.5-YFFG，氨基酸构型均为L。
实施例3
按照实施例1的合成步骤合成Cy5.5-GYFF，氨基酸构型均为L。
实施例4
按照实施例1的合成步骤合成Cy5.5-FGFY，氨基酸构型均为L。
实施例5
按照实施例1的合成步骤合成Cy5.5-GFYF，氨基酸构型均为L。
实施例6
按照实施例1的合成步骤合成Cy5.5-GDFDFDY。
实施例7
自组装多肽纳米结构的形成
称取0.8mg的纯品多肽粉末(实施例1～5制备)，加入20μL的二甲基亚砜溶解得到高浓度母液；取4μL的母液稀释到磷酸盐缓冲液中并加入2μL浓度为1M的碳酸钠溶液调节溶液pH(终浓度0.8mg/mL)震荡至完全溶解静置即得。
实施例8
自组装纳米结构的微观形貌
使用电子透射显微镜观察自组装多肽(实施例7制备)的纳米微观结构。取10μL上述多肽自组装溶液滴加到铜网上停留一分钟，使用滤纸从边缘除去多余溶液；滴加10μL磷钨酸在铜网上停留一分钟进行负染色，使用滤纸从边缘除去多余染液；将铜网置于干燥箱中，完全干燥后使用电子透射显微镜进行拍摄。
实施例9
自组装多肽穿越血脑屏障的能力
通过小动物活体成像系统考察实施例的血脑屏障穿越能力。按照花箐染料Cy5.5-NHS 5mg/kg的剂量计算并配置实施例1-5的多肽自组装溶液，注射方式为尾静脉注射，给药体积为200μL。给药完毕记为第0小时(0h)，在尾静脉注射后的不同时间点(4h、8h、24h)进行活体成像，在24h成像完时对小鼠脑进行解剖离体并拍摄统计荧光含量，激发波长为645nm。
从图6中可以看出，不同自组装多肽经尾静脉注射进入小鼠血液循环后呈现全身分布(0h)的特点，随着给药时间的延长，自组装多肽的荧光分布范围和荧光强度变小；在给药后8小时，实施例1-3尤其是实施例1的小鼠脑部成像自组装多肽的荧光信号，实施例4荧光信号几乎全部消失；在给药后第24小时，实施例3呈现微弱的脑部荧光，实施例4和5几乎无荧光；实施例1的小鼠脑部仍然保留了大量的自组装多肽的荧光信号，实施例2小鼠的脑部荧光较强但次于实施例1，这可能与其氨基酸序列反向平行相关。
将尾静脉给药后24小时的小鼠进行人道主义处死，解剖将脑离体进行成像如图7所示，与活体成像的结果一致，在药物代谢24小时后，小鼠脑中的自组装多肽的含量情况是实施例1>实施例2>实施例3>实施例5>实施例4。对脑中的荧光量化统计结果显示，实施例1小鼠脑中的荧光依次是其他组的1.09、1.44、1.53和1.60倍。上述结果表明自组装多肽Cy5.5-GFFY具有最佳的血脑屏障穿越能力。
另外，通过小动物活体成像考察了相同氨基酸组成、不同氨基酸构型组成的实施例1和实施例6的血脑屏障穿越能力。通过尾静脉注射等量的实施例1和实施例6(Cy5.5-NHS5mg/kg)，6小时后将脑离体。从图8中可以看出，两组小鼠的脑部荧光含量较为接近，实施例1的荧光强度略高于实施例6，但无显著性差异。
实施例10
自组装多肽与胰岛素受体蛋白的结合
使用Monolith NT Protein Labeling kit BLUE-NHS对胰岛素受体蛋白(实验中所使用的胰岛素受体蛋白为Human Insulin R/CD220(28-944)Protein,His Tag(MALS&SPRVerified)。Cat No：INR-H52Ha)进行标记。该染料可与蛋白质的伯胺有效反应，形成高度稳定的蛋白质-染料偶联物，按照试剂盒所示步骤溶解染料，染料工作液与蛋白溶液按照体积比1:1室温暗放置反应30分钟标记胰岛素受体蛋白。多余的染料通过已经平衡的分子筛完全洗掉，并补加定量缓冲液使溶液在重力作用下流出后收集荧光标记的蛋白分子。为测试准备了不同浓度梯度(配备起始浓度为1460μM的实施例1、2、3、4、5、6，并依次进行2倍稀释从而得到浓度分别为730μM、365μM、182.5μM、91.25μM……的实施例多肽组装体溶液；然后将不同浓度的组装体溶液与等体积、已标记的胰岛素受体蛋白溶液均匀混合并置于室温暗处孵育5分钟。)的实施例1所述多肽的组装体。将不同浓度梯度的组装体与等体积的已标记的胰岛素受体蛋白在室温下孵育5分钟。最后，数据收集和最终分析在微热量泳动仪(Monolith NT.115)进行，结果如图9-10所示。
从图9可以看出，实施例1、2、3、4、5组装体与胰岛素受体的结合常数分别为6.47、17.7、18.7、54.2和23.0μM。这些结果表明实施例自组装多肽尤其是实施例1与胰岛素受体具有较强的结合能力，在进入血液循环后可以通过与血脑屏障上过表达的胰岛素受体结合并在其介导下穿越血脑屏障到达脑。
从图10可以看出，实施例6组装体与胰岛素受体的结合常数为6.52μM，表明当氨基酸F、F和Y的构型为D构型时多肽组装体仍然与胰岛素受体之间存在特异性的结合能力。
实施例11
脑微血管内皮细胞对自组装多肽的胞吞和胞吐
使用小鼠脑微血管内皮细胞(bEnd.3 cells)并借助激光共聚焦显微镜考察了自组装多肽穿越血脑屏障的方式。简言之，(1)将生长状态良好的bEnd.3细胞接种到孔板中，加入含实施例1自组装多肽(100μM)的培养基孵育细胞(1stbatch)8小时；(2)弃去培养液，使用无菌PBS洗涤细胞并更换新鲜空白培养基，继续培养8小时并收集培养基；(3)将收集的培养基用于培养空白细胞(2ndbatch)8小时；(4)观察1stbatch和2ndbatch细胞分别被孵育8小时后，胞内的自组装多肽实施例1荧光含量。
如图11所示，使用实施例1组装体孵育1stbatch细胞8小时后，细胞内部呈现大量荧光信号，即自组装多肽孵育细胞8小时可以被bEnd.3细胞大量摄取；此外，也观察到在2ndbatch细胞内部也出现较多的荧光信号，这表明被bEnd.3细胞胞吞的自组装多肽可以被细胞胞吐到细胞外，并且能够再次被新的空白细胞胞吞摄取。基于此，自组装多肽实施例1通过与胰岛素受体结合，以胞吞胞吐的方式完成血脑屏障的穿越。
由以上实施例可知，本发明提供的多肽自组装形成的纳米球可以与胰岛素受体蛋白结合，在其经尾静脉注射进入体内时可以通过与血脑屏障上过表达的胰岛素受体结合并在其介导下穿越血脑屏障到达脑组织。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种穿越血脑屏障的多肽，其特征在于，所述多肽由花菁染料Cy5.5和短肽连接得到；
所述短肽为GFFY、YFFG、GYFF、GFYF或FGFY；
所述GFFY中氨基酸的构型均为L构型或D构型；
所述YFFG中氨基酸的构型均为L构型；
所述GYFF中氨基酸的构型均为L构型；
所述GFYF中氨基酸的构型均为L构型；
所述FGFY中氨基酸的构型均为L构型。
2.一种权利要求1所述的多肽的制备方法，其特征在于，所述多肽采用FMOC-固相合成方法合成。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)Fmoc-氨基酸的C端与树脂结合；
(2)Fmoc保护基的脱除，洗涤；
(3)下一个Fmoc-氨基酸的C端与树脂上的氨基酸或多肽的N端耦联，洗涤；
(4)重复(2)～(3)步，直到最后一个氨基酸偶联完毕，脱除Fmoc保护基，洗涤；
(5)多肽衍生物从树脂上切除，得到粗产品；
(6)花箐染料Cy5.5与多肽的N端偶联；
(7)使用高效液相色谱对粗产品进行提纯。
4.一种权利要求1所述多肽的自组装多肽。
5.根据权利要求4所述的自组装多肽，其特征在于，所述多肽通过有机溶液稀释到磷酸盐缓冲液中自组装制得。
6.一种权利要求4或5所述自组装多肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将所述多肽与二甲基亚砜混合，得到母液；
2)将所述步骤1)得到的母液与磷酸盐缓冲液、碳酸钠溶液混合、震荡，得到自组装多肽。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)多肽的质量与二甲基亚砜的体积比为0.8mg:10～20μL。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2)母液与磷酸盐缓冲液、碳酸钠溶液的体积比为4:194:2；
所述碳酸钠溶液的摩尔浓度为1M。
9.权利要求1所述的多肽在制备穿越血脑屏障药物中的用途。
10.权利要求4或5所述的自组装多肽在制备穿越血脑屏障药物中的用途。
CN202211142764.5A 2022-09-20 2022-09-20 一种穿越血脑屏障的多肽及其制备方法、纳米结构及其制备方法和应用 Active CN115536730B (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211142764.5A CN115536730B (zh) 2022-09-20 2022-09-20 一种穿越血脑屏障的多肽及其制备方法、纳米结构及其制备方法和应用
CN202310651912.4A CN116693605A (zh) 2022-09-20 2022-09-20 一种穿越血脑屏障的多肽及其制备方法、纳米结构及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211142764.5A CN115536730B (zh) 2022-09-20 2022-09-20 一种穿越血脑屏障的多肽及其制备方法、纳米结构及其制备方法和应用

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310651912.4A Division CN116693605A (zh) 2022-09-20 2022-09-20 一种穿越血脑屏障的多肽及其制备方法、纳米结构及其制备方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN115536730A true CN115536730A (zh) 2022-12-30
CN115536730B CN115536730B (zh) 2023-08-15

Family

ID=84726999

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202211142764.5A Active CN115536730B (zh) 2022-09-20 2022-09-20 一种穿越血脑屏障的多肽及其制备方法、纳米结构及其制备方法和应用
CN202310651912.4A Pending CN116693605A (zh) 2022-09-20 2022-09-20 一种穿越血脑屏障的多肽及其制备方法、纳米结构及其制备方法和应用

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310651912.4A Pending CN116693605A (zh) 2022-09-20 2022-09-20 一种穿越血脑屏障的多肽及其制备方法、纳米结构及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (2) CN115536730B (zh)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104587480A (zh) * 2015-02-02 2015-05-06 首都医科大学 一种穿越血脑屏障的纳米材料及其制备方法与应用
CN106674328A (zh) * 2016-12-30 2017-05-17 天津世传生物科技有限公司 具有脑靶向功能的多肽分子及其制备方法和应用
CN106916228A (zh) * 2017-01-13 2017-07-04 华南理工大学 可穿透血脑屏障的自组装串联穿膜肽纳米颗粒抗菌剂及其制备方法与应用
CN109666973A (zh) * 2018-11-21 2019-04-23 北京大学 一种穿过血脑屏障的肽库及其筛选方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104587480A (zh) * 2015-02-02 2015-05-06 首都医科大学 一种穿越血脑屏障的纳米材料及其制备方法与应用
CN106674328A (zh) * 2016-12-30 2017-05-17 天津世传生物科技有限公司 具有脑靶向功能的多肽分子及其制备方法和应用
CN106916228A (zh) * 2017-01-13 2017-07-04 华南理工大学 可穿透血脑屏障的自组装串联穿膜肽纳米颗粒抗菌剂及其制备方法与应用
CN109666973A (zh) * 2018-11-21 2019-04-23 北京大学 一种穿过血脑屏障的肽库及其筛选方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FENG WU等: "Biomacromolecule-Functionalized AIEgens for Advanced Biomedical Studies", SMALL *
SHAODAN MA等: "Robust drug bioavailability and safety for rheumatoid arthritis therapy using D-amino acids-based supramolecular hydrogels", MATERIALS TODAY BIO *

Also Published As

Publication number Publication date
CN116693605A (zh) 2023-09-05
CN115536730B (zh) 2023-08-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN113599504B (zh) 一种无载体蛋白质胞内递送前药及其制备方法与应用
JP6880073B2 (ja) マルチアーム重合標的抗がんコンジュゲート
EP3405429B1 (en) Formation of functionalized nanoparticles by supramolecular co-assembly
CN108948152A (zh) 一种两亲性穿膜肽键合物、其制备方法及用途
CN107129522B (zh) 一种硫辛酸修饰的固有无序蛋白纳米载体及其制备方法和应用
CN112972424B (zh) 一种抗肿瘤多肽纳米药物及其制备方法和应用
WO2022077815A1 (zh) 用于肿瘤主动靶向治疗的亲和体-细胞毒素偶联物及其纳米颗粒、制备方法、应用
KR102279429B1 (ko) 멀티 암 표적 항암 콘쥬게이트
CN111228508B (zh) 一种多靶点抗肿瘤的多肽药物偶联物及其制备方法与应用
CN113599531A (zh) Pcm多肽组合kala多肽的红细胞仿生纳米材料的应用及其制备方法
CN111233976B (zh) 一种肿瘤靶向多肽及其在制备多肽药物偶联物中的应用
CN115536730B (zh) 一种穿越血脑屏障的多肽及其制备方法、纳米结构及其制备方法和应用
CN109512784A (zh) 一种磁性靶向制剂的制备
CN118203646B (zh) 靶向蛋白降解嵌合体分子自组装纳米材料及制备方法与应用
Heck Chemical design of a supramolecular protein nanoplatform for therapeutic applications
CN115554272B (zh) 一种纳米颗粒的制备方法及其应用
TWI826233B (zh) 葡萄糖胺衍生物奈米微粒及其製備方法與用途
CN113549128B (zh) 含氟烷基链连接的多肽及其在多肽胞内递送中的应用
CN113214353B (zh) 两亲性寡肽结构物质
CN112279890B (zh) 一种两亲性多肽、制备方法及应用
CN116036041B (zh) 多价靶向蛋白降解前药和形成的纳米粒、其制备方法及用途
US20230210994A1 (en) Cell-penetrating conjugate systems
WO2024041372A1 (zh) 一种用于有效递送核酸的分支链结构多肽载体及其变化形式
KR102006632B1 (ko) 일산화탄소 방출용 하이드로겔 조성물 및 그 제조방법
CN115232195A (zh) 寡肽二维纳米材料及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant