CN115536550B - 一种基于氰基二苯乙烯骨架的细胞脂滴荧光成像探针分子及其应用 - Google Patents

一种基于氰基二苯乙烯骨架的细胞脂滴荧光成像探针分子及其应用 Download PDF

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Abstract

一种基于氰基二苯乙烯骨架的细胞脂滴荧光成像探针分子及其应用，属于生物成像技术领域。该探针分别化学名称为(Z)‑2‑(4‑(二乙氨基)苯基)‑3‑(4‑((Z)‑2‑(4‑(二乙胺基)苯基)‑2‑异氰基乙烯基)‑2,5‑二甲氧基苯基)丙烯腈，简称Lipi‑DSBOMe，其结构式如下所示。本发明还公开了该荧光探针在细胞脂滴多模态荧光成像中的应用。实验证实本发明的荧光探针Lipi‑DSBOMe是一种具有高荧光亮度和成像信噪比、高脂滴染色选择性和光稳定性、低细胞毒性和饱和受激发射强度、以及极性敏感发射特性等优点的脂滴荧光探针，具有巨大的应用前景。

Description

一种基于氰基二苯乙烯骨架的细胞脂滴荧光成像探针分子及 其应用
技术领域
本发明属于生物成像技术领域，具体涉及一种基于氰基二苯乙烯骨架的细胞脂滴荧光成像探针分子及其在细胞脂滴多模态荧光成像方面的应用。
背景技术
脂滴是一种球形细胞器，广泛存在于绝大部分的真核细胞中。脂滴内部是由甘油三酯和胆固醇酯等组成的中性脂质核，外面包裹着磷脂单层膜，膜上嵌有多种调节脂滴功能的蛋白。脂滴是从内质网的双层膜结构间以出芽的方式脱落进入细胞质中，形成尺寸约30-60nm的新生脂滴。这些新生脂滴会在细胞质中多种酶的作用下逐渐成熟变大。在过去的很长一段时间内，脂滴只是被当成细胞内的惰性脂肪堆积颗粒。直到近些年对脂滴的研究逐渐深入，脂滴才被发现是细胞中一种重要的细胞器，参与了细胞中很多重要的生理活动如膜的合成和转运，蛋白质的储存和降解以及发炎等。脂滴的功能失调还会导致多种代谢类疾病的发生，如肥胖症、糖尿病、脂肪肝、动脉粥样硬化和癌症等。因此，脂滴的研究成为了近年来细胞生物学中最热门的方向之一。
为了观察脂滴和研究脂滴复杂的生理功能，荧光成像模式如共聚焦成像、波长扫描成像和新兴的受激发射损耗(STED)超分辨成像等近年来被广泛应用。然而，单一荧光探针分子实现细胞脂滴多模态荧光成像的报道极为少见，这主要是由于不同的荧光成像模式对荧光探针分子具有不同的需求。例如，高的脂滴染色选择性是基础，通常三维共聚焦成像对染色选择性还会具有更高的要求。波长扫描成像要求荧光探针分子具有极性依赖的发光特性从而对不同极性的环境做出响应。STED超分辨成像要求荧光探针分子具有高的光稳定性和低的饱和受激发射强度。因此，开发能够满足不同成像需求的荧光探针分子用于细胞脂滴多模态荧光成像是极具挑战的迫切需求。
发明内容
针对现有细胞脂滴成像荧光探针分子技术方面的不足，本发明要解决的问题是提供一种基于氰基二苯乙烯骨架的细胞脂滴荧光成像探针分子及其在细胞脂滴多模态荧光成像方面的应用。
本发明所述的一种基于氰基二苯乙烯骨架的细胞脂滴荧光成像探针分子，其特征在于：该荧光成像探针分子为给受体结构，其化学结构如式(I)所示：
本发明所述的基于氰基二苯乙烯骨架的细胞脂滴荧光成像探针分子的化学名称为(Z)-2-(4-(二乙氨基)苯基)-3-(4-((Z)-2-(4-(二乙胺基)苯基)-2-异氰基乙烯基)-2,5-二甲氧基苯基)丙烯腈，简称为Lipi-DSBOMe。系本发明首次制备得到的荧光分子，并被应用于细胞脂滴荧光成像探针分子，其制备反应式如下：
针对现有细胞脂滴荧光成像探针分子的不足，本发明在开发新型脂滴成像荧光探针分子方面选择了基于氰基二苯乙烯骨架的荧光分子。本发明中在氰基二苯乙烯骨架上分别引入胺基和甲氧基给体以及氰基受体，制备得到的具有给受体结构的荧光分子在展现大斯托克斯位移的同时，还具有较强的溶剂化效应。氰基的引入显著提高了该荧光探针分子的光稳定性，胺基的引入可以调节荧光探针分子染色脂滴的特异性，甲氧基的引入则调节了该探针分子的吸收发射波长，使其可以被商用显微镜通常配备的激发光高效激发。在荧光成像应用方面，高的荧光亮度、脂滴染色选择性以及光稳定性使得该探针分子可以实现高质量的三维共聚焦成像；极性依赖的发光特性使得该探针分子可以通过波长扫描成像准确地测定不同细胞中脂滴的极性；高的光稳定性和低的饱和受激发射强度使得该探针分子能够在STED超分辨成像中以超高的分辨率(42nm)定量地测量油酸刺激下脂滴尺寸的变化。因此，荧光探针分子Lipi-DSBOMe的开发为细胞脂滴多模态荧光成像提供了高效的、强有力的工具。
本发明所述细胞脂滴荧光探针分子Lipi-DSBOMe在共聚焦成像、波长扫描成像和STED超分辨成像等多模态荧光成像(实施例5-9)中的应用。
本发明所述细胞包括HeLa细胞、HepG2细胞和HT22细胞。
本发明制备的细胞脂滴荧光探针分子Lipi-DSBOMe是具有高荧光亮度、大斯托克斯位移、高的脂滴染色选择性、高光稳定性和低饱和受激发射强度的可用于共聚焦成像、波长扫描成像和STED超分辨成像的多功能荧光探针分子。
实验结果证实，本发明所述的荧光探针分子Lipi-DSBOMe具有高的脂滴染色选择性，通过与脂滴商用染料BODIPY和Nile Red对比发现，该探针分子能够高效地染色脂滴，而两种商用染料除了染色脂滴外还会染色细胞中其它的结构。通过MTT测试证实，该探针分子基本没有细胞毒性。该探针分子还具有超高的光稳定性，可用于脂滴的3D共聚焦成像和STED超分辨成像。此外，该探针分子在不同极性的溶剂中展现出不同的最大发射波长，能够通过波长扫描成像对不同细胞中脂滴极性进行准确测量。因此，荧光探针分子Lipi-DSBOMe可作为脂滴多模态荧光成像探针分子对细胞脂滴复杂的生理功能进行研究，对不同细胞器靶向的荧光探针分子设计具有指导意义。它可以为脂滴细胞生物学的研究提供新的视野，促进脂滴细胞生物学的发展。
总之，本发明所述的探针分子Lipi-DSBOMe是一种全新的荧光探针分子，与其它脂滴荧光探针分子相比，该探针分子因其多功能性可同时实现脂滴的多模态荧光成像，从而提供细胞脂滴的多维度信息。鉴于上述特点，其在细胞脂滴荧光成像方面的应用具有广阔前景。
附图说明
图1：本发明实施例1中制备的荧光探针分子Lipi-DSBOMe的核磁氢谱；
图2：本发明实施例1中制备的荧光探针分子Lipi-DSBOMe的核磁碳谱；
图3：本发明实施例1中制备的荧光探针分子Lipi-DSBOMe在甲苯(toluene)中的吸收-发射光谱；
其中，左侧虚线部分为吸收光谱，右侧实线部分为发射光谱。
图4：用不同浓度的荧光探针分子Lipi-DSBOMe染色HeLa细胞24小时后细胞的存活率柱形图；
图5：荧光探针分子Lipi-DSBOMe与脂滴荧光探针分子BODIPY在HeLa细胞中共定位照片；
其中，第一张照片是470nm激光激发下480-520nm成像通道内BODIPY的照片；第二张照片是470nm激光激发下600-640nm成像通道内Lipi-DSBOMe的照片；第三张照片是前两张荧光照片和明场照片的叠加；第四张照片是前两个荧光通道的皮尔森相关系数(R＝0.83)。标尺：10μm。
图6：荧光探针分子Lipi-DSBOMe和脂滴荧光探针分子Nile Red在HeLa细胞中光稳定性的量化图；
其中，上半部分分别是荧光探针分子Lipi-DSBOMe和Nile Red在染色HeLa细胞后在同一区域连续成像50张照片中的第1、25和50张照片；下半部分分别是这50张照片的相对荧光强度随成像张数的变化趋势曲线。标尺：5μm。
图7：荧光探针分子Lipi-DSBOMe染色HeLa细胞中脂滴的三维共聚焦照片；
其中，从上到下分别是俯视图和侧视图。
图8：荧光探针分子Lipi-DSBOMe染色HepG2和HT22细胞中脂滴的波长扫描成像照片；
其中，左半部分图为在HT22和HepG2细胞中选定的扫描区域，用方框圈出；右半部分为选定区域对应的原位发射光谱图，经Gaussian拟合得到最大发射峰值。标尺：10μm。
图9：荧光探针分子Lipi-DSBOMe染色HeLa细胞中脂滴的共聚焦成像及STED超分辨成像照片；
其中，第一张图是在共聚焦模式下拍摄的照片，第二张图是在STED超分辨成像模式下拍摄的照片。标尺：2μm。
具体实施方式
实施例1：
(Z)-2-(4-(二乙氨基)苯基)-3-(4-((Z)-2-(4-(二乙胺基)苯基)-2-异氰基乙烯基)-2,5-二甲氧基苯基)丙烯腈(Lipi-DSBOMe)的合成
向对二乙氨基苯乙腈(1.60g,10.0mmol)和2,5-二甲氧基对苯二甲醛(0.97g,5.0mmol)的叔丁醇(40mL)和四氢呋喃(20mL)混合溶液中加入叔丁醇钾(1.12g,10.0mmol)和四丁基氢氧化铵(3.40g,10.0mmol)，反应体系在50℃下搅拌4小时，冷却至室温后将反应混合物倒入100mL甲醇中，过滤得到1.71g(3.20mmol,64％)深红色粉末状的Lipi-DSBOMe。
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.87(s,2H),7.79(s,2H),7.58(d,J＝8.7Hz,4H),6.70(d,J＝8.3Hz,4H),3.94(s,6H),3.41(m,8H),1.21(t,J＝6.9Hz,12H).13C NMR(101MHz,CDCl3):δ151.70,148.31,130.45,127.41,125.41,121.53,119.00,111.49,
图1为实施例1所合成荧光探针分子Lipi-DSBOMe的核磁氢谱，图2为实施例1所合成荧光探针分子Lipi-DSBOMe的核磁碳谱，表明制备得到了目标产物Lipi-DSBOMe。
实施例2：实施例1中制备的荧光探针分子Lipi-DSBOMe吸收-发射光谱的测定
用50mL甲苯(toluene)溶剂将实施例1中合成的荧光探针分子Lipi-DSBOMe配成10μM浓度的溶液。在350～700nm波长范围内通过紫外吸收光谱仪收集得到吸收光谱，用海洋光学光纤式荧光光谱仪在波长为470nm激发光的激发下收集得到发射光谱，使用Origin软件对该荧光探针分子的光谱数据进行处理得到如图3所示的该探针分子在甲苯溶液中的吸收-发射光谱(左侧虚线部分为吸收光谱，右侧实线部分为发射光谱)，说明该荧光探针分子Lipi-DSBOMe的吸收-发射峰位和它大的斯托克斯位移。
实施例3：细胞的培养
本实施例中所有百分数均为体积分数。
HeLa、HepG2和HT22这三种细胞株是在37℃、CO2浓度为5％的培养箱中进行培养，培养液为含有10％胎牛血清和1％双抗(青链霉素混合液)的高糖DMEM培养液。其中，胎牛血清、双抗和高糖DMEM是直接从生物试剂公司购买得到的。
待细胞生长到对数期，我们对细胞进行传代处理：将细胞培养瓶中原有的5mL培养液吸走后用2mL不含胎牛血清的高糖DMEM培养液(含1％双抗)清洗细胞表面，将该培养液吸走后再用0.5mL胰酶消化处理细胞2分钟，待大部分细胞脱壁后，加入2mL含10％胎牛血清和1％双抗的高糖DMEM培养液吹打均匀，取适量该细胞分散液分别转移至新的细胞培养瓶和培养皿中，放入CO2细胞培养箱中培养，培养皿中的细胞待浓度适宜后用于共聚焦或超分辨成像实验。
实施例4：实施例1中制备的荧光探针分子Lipi-DSBOMe细胞毒性的测试
我们使用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑(MTT)对荧光探针分子Lipi-DSBOMe进行细胞毒性测试(HeLa细胞)。在96孔板上接种HeLa细胞(每个孔1*104个细胞)，放入CO2细胞培养箱中培养24小时。之后将中间的60个孔的培养液换成含有不同浓度(0、0.5、1.0、2.0、5.0和10.0μM)荧光探针分子Lipi-DSBOMe和1％(体积分数)DMSO的培养液(每个浓度设置10组平行试验)，再培养24小时后，向这些孔中加入MTT试剂(每孔10μL)，放回细胞培养箱中继续培养4小时。将这些孔中原有培养液移除后加入DMSO(每孔100μL)溶解生成的甲瓒结晶，室温放置30分钟后用酶标仪在490nm处测量各个孔的吸光度值。因为只有活细胞才能与MTT试剂作用生成甲瓒结晶，所以我们可以用各组浓度不同孔的平均吸光度值与对照组(探针分子浓度为0的10个孔)的平均吸光度值作比较，计算细胞存活率，结果如图4所示，说明荧光探针分子Lipi-DSBOMe基本没有细胞毒性，10.0μM浓度的该探针分子在24小时内也不会影响HeLa细胞的正常生长。
实施例5：实施例1中制备的荧光探针分子Lipi-DSBOMe与脂滴荧光探针分子BODIPY在HeLa细胞中共染色实验
我们将HeLa细胞培养于20mm直径玻璃底的培养皿中，在CO2培养箱中繁殖2天。从培养箱中拿出后，移除培养皿中原有DMEM培养液，加入1mL含有Lipi-DSBOMe(2μM)、BODIPY(2μM)和1％(体积分数)DMSO的DMEM培养液，放入细胞培养箱继续培养2小时。取出之后，用HBSS溶液洗3遍，之后在HBSS溶液中进行荧光成像。如图5所示，我们可以清晰地观察到实施例1中制备的荧光探针分子Lipi-DSBOMe与脂滴荧光探针分子BODIPY在HeLa细胞中能很好地实现共定位，说明了实施例1中制备的荧光探针分子Lipi-DSBOMe具有优异的细胞脂滴特异性。
实施例6：实施例1中制备的荧光探针分子Lipi-DSBOMe的光稳定性测试
我们将实施例5中铺满HeLa细胞的2个培养皿从细胞培养箱中取出后，移除原有DMEM培养液，分别加入含有2μM Lipi-DSBOMe和2μM Nile Red的DMEM培养液(含1％DMSO)，放回培养箱中继续培养2小时后，取出2个培养皿，分别用HBSS溶液洗3遍，之后进行荧光成像。我们在2个培养皿中分别选定2个区域，之后分别连续成像50张，发现Nile Red会很快被光漂白，而实施例1中制备的荧光探针分子Lipi-DSBOMe在成像50张后相对荧光强度仍能保持在90％以上(图6)，说明了其优异的光稳定性。
实施例7：实施例1中制备的荧光探针分子Lipi-DSBOMe的三维共聚焦成像
我们将实施例5中铺满HeLa细胞的培养皿从培养箱取出后，移除原有DMEM培养液，加入含有2μM Lipi-DSBOMe和1％ DMSO的DMEM培养液，放回培养箱培养2小时后取出，用HBSS溶液洗去游离探针分子，之后用4％的多聚甲醛试剂对细胞进行固定(室温下避光放置20分钟)，之后用PBS溶液洗3遍后进行三维共聚焦成像。在选定的区域范围内不同的Z轴深度上记录多张扫描切片后通过LAS X软件进行三维重构得到了如图7所示的三维共聚焦图片，说明了该探针分子高的光稳定性、高的脂滴染色选择性以及高的荧光亮度。
实施例8：实施例1中制备的荧光探针分子Lipi-DSBOMe的波长扫描成像
我们将铺满HepG2和HT22细胞的培养皿从培养箱取出后，移除原有DMEM培养液，加入含有2μM Lipi-DSBOMe和1％ DMSO的DMEM培养液，放回培养箱培养2小时后取出，用HBSS溶液洗3遍后在HBSS溶液中进行波长扫描成像。在选定的区域内使用488nm激发光激发该荧光探针分子，之后固定检测区间宽度为10nm，并以5nm的步幅从500nm递增至770nm，之后通过LAS X软件处理得到如图8所示选定区域的原位发射光谱，通过Gaussian拟合确定发射峰位分别为550nm(HT22细胞)和555nm(HepG2细胞)，说明了该探针分子极性敏感的发射特性。
实施例9：实施例1中制备的荧光探针分子Lipi-DSBOMe的STED超分辨成像
我们将实施例5中铺满HeLa细胞的培养皿从培养箱取出后，移除原有DMEM培养液，加入含有2μM Lipi-DSBOMe和1％ DMSO的DMEM培养液，放回培养箱培养2小时后取出，用HBSS溶液洗3遍，然后进行STED超分辨成像。如图9所示，与共聚焦成像照片相比，STED超分辨成像照片中脂滴变的越来越尖锐，相应的成像分辨率从250nm以上提升到200nm以下，有的甚至可达到100nm以下。说明了荧光探针分子Lipi-DSBOMe高的光稳定性以及作为脂滴超分辨成像荧光探针分子的实用性。

Claims (2)

1.一种基于氰基二苯乙烯骨架的细胞脂滴荧光成像探针在制备细胞脂滴多模态荧光成像试剂中的应用，该荧光成像探针的结构式如下所示，
2.如权利要求1所述的一种基于氰基二苯乙烯骨架的细胞脂滴荧光成像探针在制备细胞脂滴多模态荧光成像试剂中的应用，其特征在于：所述多模态荧光成像为共聚焦成像、波长扫描成像或STED超分辨成像，所述细胞为HeLa细胞、HepG2细胞或HT22细胞。
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