CN115530374A - 一种沙棘叶白雀木醇提取物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种沙棘叶白雀木醇提取物的制备方法和沙棘叶白雀木醇提取物以及沙棘叶白雀木醇提取物制备抑制α‑淀粉酶活性制剂中的应用，沙棘叶白雀木醇提取物的制备方法具体为将沙棘叶干燥粉碎成粉末，加入蒸馏水室温放置，使沙棘叶粉得到充分得到浸泡，将沙棘叶粉溶液超声提取，过滤减压浓缩，得到沙棘叶白雀木醇提取物的浸膏。本发明的一种从沙棘叶中提取白雀木醇的方法具有工艺简单，操作简便，适于工业化提取等特点，促进了沙棘叶资源的深加工。所述制备方法制备得到的沙棘叶白雀木醇提取物对α‑淀粉酶活性具有一定的抑制效果。

Description

一种沙棘叶白雀木醇提取物及其应用
本申请是申请日为2019年10月22日、申请号为201911007177.3发明名称为《一种沙棘叶白雀木醇提取物的制备方法》的分案申请。
技术领域
本发明涉及植物提取物制备领域，具体而言，涉及一种沙棘叶白雀木醇提取物的制备方法。
背景技术
沙棘作为一种药食同源植物，其药用价值已被广泛重视并研究应用，并且利用较多的大多为沙棘果实。近来研究发现，长期被作为废弃料处理的沙棘叶也存在着较多的活性物质，白雀木醇作为一种特殊的活性物质首次被我们发现存在于沙棘叶中，且含量丰富，具有极高的研究开发价值。以往药理研究表明，白雀木醇可以应用于治疗胃损伤、各种神经退化性疾病、癌症、哮喘、败血型休克等病症。研究表明富含白雀木醇的沙棘提取物具有显著的降低血糖、改善胰岛素抵抗的功能，可以作为一种天然的降糖剂应用于药品、保健品等等方面。
目前针对白雀木醇的研究主要集中在橡胶树资源中，而对沙棘资源中的白雀木醇研究较少，仅仅曾有学者探讨过沙棘果汁中白雀木醇的存在对于降低小鼠血糖有积极的影响，然而针对沙棘叶中的白雀木醇的研究尚处于空白状态，我们前期研究数据表明，沙棘叶中白雀木醇含量显著高于沙棘果实，对沙棘叶中白雀木醇进行提取、纯化及活性开发等研究具有重要的意义和价值。
然而，如果从沙棘叶中将白雀木醇提取出来，这是目前的技术难点。白雀木醇是一种分子量为194.18的小分子物质，它极易溶于水，难溶于有机溶剂，因此从沙棘叶中提取分离这种水溶性的生物活性化合物时，必然要用含有一定比例水的有机溶剂，后续浓缩时间较长；而且对提取条件要求高，在整个分离过程中的温度、酸碱性等条件不能太剧烈，以免活性物质发生分解，异构等；其次，沙棘叶中存在多种糖类化合物，与白雀木醇具有类似的水溶性，因此将其完全分离、收集、纯化也是一个很大的难点和挑战。截止目前，对沙棘叶中白雀木醇的分离纯化等研究还尚未有报道，因此积极探索沙棘叶中白雀木醇的提取与纯化，可以有效促进沙棘叶的综合利用和深度开发。
发明内容
本发明的目的旨在以我国资源十分丰富、且尚未得到有效开发利用的沙棘叶为植物材料，提供一种高效的沙棘叶白雀木醇提取物的制备方法，并应用于食品、保健品中。
基于上述目的，本发明提供的一种沙棘叶白雀木醇粗提取物的制备方法，包括以下步骤：
(1)将沙棘叶粉碎成粉末，加入蒸馏水室温放置一段时间，使沙棘叶粉得到充分得到浸泡；
(2)将沙棘叶粉溶液超声提取，得到超声提取物，过滤，得到沙棘叶提取液；
(3)将沙棘叶提取液减压浓缩，得到沙棘叶白雀木醇提取物的浸膏。
在本发明中的一个具体实施方案，优选的，步骤(1)中将沙棘叶粉碎至10～40目粉末；所述沙棘叶粉质量与蒸馏水体积的比值范围为1：10至1：15，所述沙棘叶粉质量单位为克，所述蒸馏水体积单位为毫升，所述室温放置一段时间为12～24小时。
在本发明中的一个具体实施方案，优选的，步骤(1)中将沙棘叶粉碎至20目粉末；所述沙棘叶粉质量与蒸馏水体积比为1：10，所述室温放置时间为12小时。
在本发明中的一个具体实施方案，优选的，步骤(1)中将沙棘叶粉碎至20目粉末；所述沙棘叶粉质量与蒸馏水体积比为1：15，所述室温放置时间为12小时。
在本发明中的一个具体实施方案，优选的，步骤(2)中超声提取次数为两次，第一次超声提取的步骤为：将浸泡后的沙棘叶粉溶液在40℃～60℃下超声提取30～60min后，将沙棘叶粉溶液冷却至35～40℃，过滤得到溶液，此溶液为第一次超声提取液；第二次超声提取得步骤为：将过滤后的剩余沙棘叶粉残渣再加入蒸馏水，所述沙棘叶粉质量与所述蒸馏水体积的比值范围为1:5至1:8，其中所述沙棘叶粉质量的单位为克，所述蒸馏水体积的单位为毫升，40℃～60℃下超声提取30～60min后，将将沙棘叶粉溶液冷却至35～40℃，过滤得到溶液，此溶液为第二次超声提取液。
在本发明中的一个具体实施方案，优选的，步骤(2)中超声提取次数为两次，第一次超声提取的步骤为：将浸泡后的沙棘叶粉溶液在55℃下超声提取30min后，将沙棘叶粉溶液冷却至35℃，过滤得到溶液；第二次超声提取步骤为：将过滤后的剩余沙棘叶粉残渣再加入蒸馏水，所述沙棘叶粉质量与所述蒸馏水体积比为1:5，55℃下超声提取30min后，将将沙棘叶粉溶液冷却至35℃，过滤得到溶液。
在本发明中的一个具体实施方案，优选的，步骤(2)中超声提取次数为两次，第一次超声提取的步骤为：将浸泡后的沙棘叶粉溶液在55℃下超声提取40min后，将沙棘叶粉溶液冷却至35℃，过滤得到溶液；第二次超声提取步骤为：将过滤后的剩余沙棘叶粉残渣再加入蒸馏水，所述沙棘叶粉质量与所述蒸馏水体积比为1:5，55℃下超声提取30min后，将将沙棘叶粉溶液冷却至35℃，过滤得到溶液。
在本发明中的一个具体实施方案，优选的，根据权利要求1所述的沙棘叶白雀木醇提取物的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述沙棘叶提取液为将两次超声提取液混合得到的沙棘叶提取液，在50～65℃，0.05MPa～0.1MPa下减压浓缩，去除所有溶剂得到沙棘叶白雀木醇提取物浸膏。
本发明还提供了一种上述技术方案制备得到的沙棘叶白雀木醇提取物，所述沙棘叶白雀木醇提取物中沙棘叶白雀木醇产品得率13～20％，可溶性总糖17.9～33.9％，蛋白质5.99～15.79％，粗脂肪8.9～19.9％，水分6.84～9.97％，灰分11.67～15.46％。
本发明还提供了一种上述技术方案所述沙棘叶白雀木醇提取物在制备抑制α-淀粉酶活性制剂中的应用。
在本发明中的一个具体实施方案，优选的，所述沙棘白雀木醇提取物对α-淀粉酶抑制率具有浓度依赖性；随着沙棘叶白雀木醇提取物浓度的增大，其对α-淀粉酶的抑制能力也逐渐增大。
附图说明
图1.沙棘叶白雀木醇提取物对α-淀粉酶的抑制动力学曲线。
图2.沙棘叶白雀木醇提取物对α-淀粉酶的抑制动力学曲线。
图3.采用实施例1制备方法制备的沙棘叶白雀木醇提取物的成分含量检测结果。
图4.表5所示数据对应的文件最后一次编辑时间展示截取图。
图5.图1制作最后一次编辑时间展示截取图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1.沙棘叶白雀木醇提取物的制备方法及其应用
沙棘叶白雀木醇提取物的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)称取粉碎至20目的沙棘叶粉于锥形瓶中，按照沙棘叶粉质量与蒸馏水体积比为1:10的比例加入蒸馏水得到沙棘叶粉溶液，其中所述沙棘叶粉质量的单位为克，所述蒸馏水体积的单位为毫升室温放置12小时，使沙棘叶粉得到充分的浸泡；
(2)将浸泡完全的沙棘叶粉溶液，在55℃下超声提取30min后，将沙棘叶粉溶液冷却至35℃，过滤得到溶液，此溶液为第一次超声提取液；将过滤后的剩余沙棘叶粉残渣再加入蒸馏水，所述沙棘叶粉质量与所述蒸馏水体积的比为1:5，其中所述沙棘叶粉质量的单位为克，所述蒸馏水体积的单位为毫升，55℃下超声提取30min后，将将沙棘叶粉溶液冷却至35℃，过滤得到溶液，此溶液为第二次超声提取液。
(3)将两次超声提取液混合得到沙棘叶提取液，在62℃，0.1MPa下减压浓缩，去除所有溶剂得到沙棘叶白雀木醇提取物浸膏。
参考相应国标方法进行测定和计算，得到的沙棘叶白雀木醇提取物的特征如图3所示，具体为：沙棘叶白雀木醇产品得率14-18％，可溶性总糖17.9-33.9％，蛋白质5.99-15.79％，粗脂肪8.9-19.9％，水分6.84-9.97％，灰分11.67-15.46％。
将制备得到的沙棘叶白雀木醇提取物的α-淀粉酶活性抑制实验，具体包括以下步骤：
(1)对α-淀粉酶活性抑制能力的检测(DNS法)：取制备得到的沙棘叶白雀木醇提取物溶于蒸馏水中，分别配置浓度为20mg/ml、10mg/ml、1mg/ml、0.5mg/ml、0.1mg/ml共5个浓度，进行以下α-淀粉酶活性抑制能力的测定实验，取0.25mLα-淀粉酶溶液于试管中37℃水浴，加入0.25mL的样品溶液，37℃水浴条件下反应5min，接着加入0.5mL1％的淀粉底物溶液，继续反应5min后，加入1mL DNS显色溶液，混匀，置于沸水浴中8min。冷却后加蒸馏水稀释至10mL，540nm分光光度测吸光值。为了计算样品溶液对α-淀粉酶的抑制活性，本实验中还需设置调零组、空白组以及背景组，结合实验组数据，按照以下公式进行计算。
不同组别的反应体系及反应剂量详见表1，数据结果见表1。
Figure BDA0003900287350000051
(2)对α-淀粉酶的抑制类型：取本实施例制备得到的沙棘叶白雀木醇提取物溶于蒸馏水中，设置两个不同浓度1mg/ml和0.1mg/ml，分别加入不同浓度(0.5％、1.0％、1.5％、2.0％、2.5％)淀粉溶液，按照步骤(2)操作方法测定吸光值，利用双倒数法作图，实验结果见图1，其中1mg/ml沙棘叶粗提物的底物浓度的倒数1/S与酶促反应速率的倒数1/V的关系实则为y＝0.0947x+4.8678，R2＝0.9939，0.1mg/ml沙棘叶粗提物的底物浓度的倒数1/S与酶促反应速率的倒数1/V的关系实则为y＝0.0765x+4.8132，R2＝0.9888。
表1.α-淀粉酶活性抑制实验组别
Figure BDA0003900287350000052
表2.不同浓度沙棘叶白雀木醇提取物对α-淀粉酶活性的抑制作用
Figure BDA0003900287350000053
从表2可以看出，随着沙棘叶白雀木醇提取物浓度的增大，其对α-淀粉酶的抑制能力也逐渐增大，当沙棘叶纯化物浓度为20mg/mL时，抑制率为65.10％。以上结果说明沙棘叶白雀木醇提取物对α-淀粉酶具有一定的抑制作用。
酶促反应的抑制类型一般通过抑制作用的双倒数图判定，非竞争抑制Km不变，但Vmax减小；竞争性抑制Vmax不变，但Km减小；反竞争抑制Km减小，Vmax也减小。由图1分析可知，本实施例中制备得到的沙棘叶白雀木醇提取物不同浓度抑制剂条件下的抑制动力学曲线相交汇于Y轴，即当抑制剂浓度增大时，Vmax基本保持不变，而Km值则呈现减小的趋势，Km值从0.0157减小为0.0123，初步推断沙棘叶提取物对α-淀粉酶的抑制类型为竞争性抑制。这表明抑制剂与酶底物结构类似，可与底物竞争酶活性中心，从而降低酶和底物的亲和力，从而表现为酶的活性降低。
实施例2、沙棘叶白雀木醇提取物的制备方法及其应用
所述沙棘叶白雀木醇提取物的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)称取粉碎至20目的沙棘叶粉于锥形瓶中，按照沙棘叶粉质量与蒸馏水体积比为1:15的比例加入蒸馏水得到沙棘叶粉溶液，其中所述沙棘叶粉质量的单位为克，所述蒸馏水体积的单位为毫升室温放置12小时，使沙棘叶粉得到充分的浸泡；
(2)将浸泡完全的沙棘叶粉溶液，在55℃下超声提取40min后，将沙棘叶粉溶液冷却至35℃，过滤得到溶液，此溶液为第一次超声提取液；将过滤后的剩余沙棘叶粉残渣再加入蒸馏水，所述沙棘叶粉质量与所述蒸馏水体积的比为1:5，其中所述沙棘叶粉质量的单位为克，所述蒸馏水体积的单位为毫升，55℃下超声提取30min后，将将沙棘叶粉溶液冷却至35℃，过滤得到溶液，此溶液为第二次超声提取液。
(3)将两次超声提取液混合得到沙棘叶提取液，在62℃，0.1MPa下减压浓缩，去除所有溶剂得到沙棘叶白雀木醇提取物浸膏。
参考相应国标方法进行测定和计算，得到的沙棘叶白雀木醇提取物的特征是：沙棘叶白雀木醇产品得率13-20％，可溶性总糖17.9-33.9％，蛋白质5.99-15.79％，粗脂肪8.9-19.9％，水分6.84-9.97％，灰分11.67-15.46％。
将制备得到的沙棘叶白雀木醇提取物的α-淀粉酶活性抑制实验，具体包括以下步骤：
(1)对α-淀粉酶活性抑制能力的检测(DNS法)：取制备得到的沙棘叶白雀木醇提取物溶于蒸馏水中，分别配置浓度为20mg/ml、10mg/ml、1mg/ml、0.5mg/ml、0.1mg/ml共5个浓度，进行以下α-淀粉酶活性抑制能力的测定实验，取0.25mLα-淀粉酶溶液于试管中37℃水浴，加入0.25mL的样品溶液，37℃水浴条件下反应5min，接着加入0.5mL1％的淀粉底物溶液，继续反应5min后，加入1mL DNS显色溶液，混匀，置于沸水浴中8min。冷却后加蒸馏水稀释至10mL，540nm分光光度测吸光值。为了计算样品溶液对α-淀粉酶的抑制活性，本实验中还需设置调零组、空白组以及背景组，结合实验组数据，按照以下公式进行计算。不同组别的反应体系及反应剂量详见表3，数据结果见表4。
Figure BDA0003900287350000071
(2)对α-淀粉酶的抑制类型：取本实施例制备得到的沙棘叶白雀木醇提取物溶于蒸馏水中，设置两个不同浓度1mg/ml和0.1mg/ml，分别加入不同浓度(0.5％、1.0％、1.5％、2.0％、2.5％)淀粉溶液，按照步骤(2)操作方法测定吸光值，利用双倒数法作图，实验结果见图2。其中1mg/ml沙棘叶粗提物的底物浓度的倒数1/S与酶促反应速率的倒数1/V的关系实则为y＝0.0903x+4.8835，R2＝0.9938，0.1mg/ml沙棘叶粗提物的底物浓度的倒数1/S与酶促反应速率的倒数1/V的关系实则为y＝0.0699x+4.8718，R2＝0.9949。
表3.α-淀粉酶活性抑制实验组别
Figure BDA0003900287350000072
表4.不同浓度沙棘叶白雀木醇提取物对α-淀粉酶活性的抑制作用
Figure BDA0003900287350000073
从表4可以看出，随着沙棘叶白雀木醇提取物浓度的增大，其对α-淀粉酶的抑制能力也逐渐增大，当沙棘叶纯化物浓度为20mg/mL时，抑制率为69.07％。并且同实施例1下所得提取物的α-淀粉酶活性抑制能力相比，实施例2条件下所得沙棘叶提取物的活性抑制能力更强。以上结果说明，不同提取条件也会对沙棘叶提取物的α-淀粉酶活性抑制效果有一定的影响。
前述实施例1中确定本发明制备所得沙棘叶提取物的抑制类型的方式详细如下：
(1)判断原理：根据酶促动力学的知识，在pH，温度及酶的浓度恒定的情况下，酶促反应的速率与底物的浓度之间的关系可以用米氏方程来表示：V＝Vmax*S/(C+S)，由Briggs和Haldane推导得到方程：V＝Vmax*S/(Km+S)，该方程的双倒数形式为1/V＝Km/Vmax*1/S+1/Vmax，其中Km为米氏常数；Vmax为最大酶促反应速率。这两个值为判断抑制类型的重要参数，当待测样品为竞争性抑制剂时，则表现为Km增大，Vmax不变；当待测样品为非竞争性抑制剂时，表现为Km不变，Vmax降低。
更直观的判断方法：当两条直线交点在纵轴为竞争性抑制，在横轴上为非竞争性抑制。
(2)操作步骤：选择两个不同样品浓度1mg/ml和0.1mg/ml，分别加入不同浓度(0.5％、1.0％、1.5％、2.0％、2.5％)淀粉溶液。
取0.25mLα-淀粉酶溶液于试管中37℃水浴，加入0.25mL的样品溶液，37℃水浴条件下反应5min，接着加入0.5mL 1％的淀粉底物溶液，继续反应5min后，加入1mL DNS显色溶液，混匀，置于沸水浴中8min。冷却后加蒸馏水稀释至10mL，540nm分光光度测吸光值。
利用双倒数作图法，以1/[S]为横坐标，1/V为纵坐标，作图判断抑制类型。
注意事项
(1)DNS溶液配置完成后需存放7天后使用，注意一定要配够，避免重复配置耽误时间。
(2)实验中反应时间要精确，涉及到后续算数。
(3)抑制类型的实验要在一天内完成，尽量连续，不同实验组别保障相同实验条件。
实验结果
(1)抑制类型判断实验检测结果见表5和表6，其中表5所示数据对应的文件最后一次编辑时间展示截取图如图4所示，沙棘叶提取物对α-淀粉酶抑制作用的双倒数图见图1和图2，其中图1制作最后一次编辑时间展示截取图如图5所示。由图1和图2可知，实施例1和实施例2的两组样品的双倒数图中的两条直线均相交汇于Y轴，交点为最大反应速度的倒数1/Vmax，即无论抑制剂的浓度如何变化，Vmax都是保持恒定的。由此可以推断沙棘叶提取物对α-淀粉酶的抑制类型为竞争性抑制。这表明抑制剂与酶底物结果类似，可与底物竞争酶活性中心，从而降低酶和底物的亲和力，从而表现为酶的活性降低。
表5.抑制类型判断实验检测结果
Figure BDA0003900287350000091
表6.抑制类型判断实验检测结果
Figure BDA0003900287350000092
Figure BDA0003900287350000101
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (8)

1.一种沙棘叶白雀木醇提取物，其特征在于，所述沙棘叶白雀木醇提取物的制备方法包括以下步骤：
(1)将沙棘叶粉碎成粉末，加入蒸馏水室温放置，使沙棘叶粉得到充分得到浸泡；
(2)将沙棘叶粉溶液超声提取，得到超声提取物，过滤，得到沙棘叶提取液；
(3)将沙棘叶提取液减压浓缩，得到沙棘叶白雀木醇提取物的浸膏。
2.根据权利要求1所述的沙棘叶白雀木醇提取物，其特征在于，步骤(1)中将沙棘叶粉碎至10～40目粉末；所述沙棘叶粉质量与蒸馏水体积比为1：10至1：15，所述室温放置时间为12～24小时。
3.根据权利要求2所述的沙棘叶白雀木醇提取物，其特征在于，步骤(1)中将沙棘叶粉碎至20目粉末；所述沙棘叶粉质量与蒸馏水体积比为1：10，所述室温放置时间为12小时；
或者步骤(1)中将沙棘叶粉碎至20目粉末；所述沙棘叶粉质量与蒸馏水体积比为1：15，所述室温放置时间为12小时。
4.根据权利要求1所述的沙棘叶白雀木醇提取物，其特征在于，步骤(2)中超声提取次数为两次，第一次超声提取的步骤为：将浸泡后的沙棘叶粉溶液在40℃～60℃下超声提取30～60min后，将沙棘叶粉溶液冷却至35～40℃，过滤得到溶液；第二次超声提取步骤为：将过滤后的剩余沙棘叶粉残渣再加入蒸馏水，所述沙棘叶粉质量与所述蒸馏水体积比为1:5至1:8，40℃～60℃下超声提取30～60min后，将将沙棘叶粉溶液冷却至35～40℃，过滤得到溶液。
5.根据权利要求4所述的沙棘叶白雀木醇提取物，其特征在于，步骤(2)中超声提取次数为两次，第一次超声提取的步骤为：将浸泡后的沙棘叶粉溶液在55℃下超声提取30min后，将沙棘叶粉溶液冷却至35℃，过滤得到溶液；第二次超声提取步骤为：将过滤后的剩余沙棘叶粉残渣再加入蒸馏水，所述沙棘叶粉质量与所述蒸馏水体积比为1:5，55℃下超声提取30min后，将将沙棘叶粉溶液冷却至35℃，过滤得到溶液；
或者步骤(2)中超声提取次数为两次，第一次超声提取的步骤为：将浸泡后的沙棘叶粉溶液在55℃下超声提取40min后，将沙棘叶粉溶液冷却至35℃，过滤得到溶液；第二次超声提取步骤为：将过滤后的剩余沙棘叶粉残渣再加入蒸馏水，所述沙棘叶粉质量与所述蒸馏水体积比为1:5，55℃下超声提取30min后，将将沙棘叶粉溶液冷却至35℃，过滤得到溶液。
6.根据权利要求1所述的沙棘叶白雀木醇提取物，其特征在于，步骤(3)中所述沙棘叶提取液为将两次超声提取液混合得到的沙棘叶提取液，在50～65℃，0.05MPa～0.1MPa下减压浓缩，去除所有溶剂得到沙棘叶白雀木醇提取物浸膏。
7.根据权利要求1～6任一项所述的沙棘叶白雀木醇提取物，其特征在于，所述沙棘叶白雀木醇提取物中沙棘叶白雀木醇产品得率13～20％，可溶性总糖17.9～33.9％，蛋白质5.99～15.79％，粗脂肪8.9～19.9％，水分6.84～9.97％，灰分11.67～15.46％。
8.权利要求1～7任一项所述的沙棘叶白雀木醇提取物在制备抑制α-淀粉酶活性制剂中的应用。
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