CN115501259B

CN115501259B - 一种用于缓解溃疡性结肠炎的组合物和应用

Info

Publication number: CN115501259B
Application number: CN202211159410.1A
Authority: CN
Inventors: 姜毓君; 满朝新; 崔政盈; 张宇; 苏悦
Original assignee: Northeast Agricultural University
Current assignee: Northeast Agricultural University
Priority date: 2022-09-22
Filing date: 2022-09-22
Publication date: 2023-04-21
Anticipated expiration: 2042-09-22
Also published as: CN115501259A

Abstract

本发明公开了一种用于缓解溃疡性结肠炎的组合物和应用，本发明提供的用于缓解溃疡性结肠炎的组合物，在缓解葡聚糖硫酸钠诱导小鼠炎症性肠病方面的应用，其方法安全有效，可以降低炎症因子TNF‑α、IFN‑γ、IL‑1β、IL‑17和IL‑6含量，增加抗炎因子TGF‑β和IL‑10含量，降低脾脏指数和提升胸腺指数，降低血清和结肠组织中MPO活力，提升小鼠每日摄食量，缓解小鼠由于DSS诱导的体重降低、不思进食和精神萎靡的情况，提升DAI评分，达到缓解肠道炎症的作用。

Description

一种用于缓解溃疡性结肠炎的组合物和应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种用于缓解溃疡性结肠炎的组合物和应用。

背景技术

炎症性肠病全球患病率逐年递增，其中溃疡性结肠炎的发病率高于克罗恩病，对人们健康有极大风险，溃疡性结肠炎临床治疗目的主要是缓解炎症反应，减缓疾病的进展和降低并发症的发生，改善患者生活质量；正常结肠中存在多种微生物群落，可以抑制非共生微生物的定植和感染，保持抗感染和抗炎状态，被称为“肠道稳态”，而使用抗生素、免疫抑制、化疗、住院、长期护理、手术等风险因素，都会导致肠道微生物被破坏，打破“肠道稳态”，破坏免疫系统，造成病原微生物定植在肠道。尽管多种生物制剂均属于有效治疗的药物，但患者可能会因多种原因失去疗效如形成抗药物抗体，增加其他并发症如严重感染或恶性肿瘤的风险，糖皮质激素可以用于IBD诱导治疗，但在维持缓解方面既没有效果也不安全；激素常见的不良反应包括但不限于感染、骨质疏松症、高血糖症、高血压、精神障碍和伤口愈合困难等，并且其价格昂贵，严重影响患者的生活质量。

基于目前的治疗现状，通过微生态制剂来改变宿主肠道微生物是一种有潜力的治疗策略，具有重要的研究价值。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种用于缓解溃疡性结肠炎的组合物和应用，解决目前缓解肠道炎症类药物具有较严重的副作用的技术问题。

为了实现上述目的，本发明采取如下技术方案：

一种用于缓解溃疡性结肠炎的组合物，所述组合物由副干酪乳杆菌JY062和益生元所组成；

其中，所述益生元的制备方法如下：将壳聚糖溶解在醋酸溶液中，再加入半胱氨酸，搅拌混合均匀，然后加入京尼平溶液，搅拌反应，待反应完成后，经透析、冷冻干燥，得到益生元。

优选的，副干酪乳杆菌JY062和益生元的质量比为40-50:50-60。

优选的，副干酪乳杆菌JY062的活菌数≥2.0×10⁹CFU/g。

优选的，壳聚糖、醋酸溶液、半胱氨酸和京尼平溶液的质量比为3-6:100:2-4:30-50。

优选的，醋酸溶液的质量分数为5-8%，京尼平溶液的质量分数为0.6-0.8%。

优选的，搅拌反应温度为30-40℃，搅拌反应时间为1-2h。

优选的，透析的具体操作为：使用截留分子量8000的透析袋透析24h，每隔6h更换一次去离子水。

本发明还提供上述组合物在制备缓解溃疡性结肠炎药物中的应用。

优选的，所述药物为药学上可接受的剂型。

优选的，所述剂型为粉剂、注射液、胶囊或片剂。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明提供的副干酪乳杆菌JY062是一株高产胞外多糖的菌株，黏附性能好，容易在肠道中定值，具有治疗肠炎的潜力，为了进一步提高副干酪乳杆菌JY062的治疗效果，本发明利用可食用的壳聚糖接枝半胱氨酸，肠炎受损的病灶有结构被破坏的蛋白，裸露出巯基残基，且聚集有很多带正电的蛋白，壳聚糖接枝半胱氨酸中的壳聚糖带正电，半胱氨酸含有巯基带负电，壳聚糖接枝半胱氨酸通过正负电吸附作用以及巯基交联作用在肠炎处聚集，使得副干酪乳杆菌JY062更好的在病灶处增殖，降低肠道内氧气含量，抑制肠杆菌的增殖，同时壳聚糖还能显著降低肠道内大肠杆菌、沙门氏菌等有害菌群的数量，促进乳酸杆菌、双歧杆菌等有益菌群增殖，从而调节肠道微生态平衡。

本发明提供的用于缓解溃疡性结肠炎的组合物，在缓解葡聚糖硫酸钠诱导小鼠炎症性肠病方面的应用，其方法安全有效，可以降低炎症因子 TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-17和IL-6含量，增加抗炎因子TGF-β和IL-10含量，降低脾脏指数，降低血清和结肠组织中MPO活力，提升小鼠每日摄食量，缓解小鼠由于DSS诱导的体重降低、不思进食和精神萎靡的情况，提升DAI评分，达到缓解肠道炎症的作用。

附图说明

图1为小鼠进食量的变化图，其中，横坐标是天数，纵坐标是进食量；

图2为小鼠体重的变化图，其中，横坐标是天数，纵坐标是体重；

图3为小鼠疾病活动指数评分图，其中，横坐标是组别，纵坐标是疾病活动指数；

图4为小鼠结肠长度图，其中，横坐标是组别，纵坐标是结肠长度；

图5为小鼠结肠重量图，其中，横坐标是组别，纵坐标是结肠重量；

图6为小鼠结肠组织中炎症细胞因子表达量，其中，a：TNF-α；b：IFN-γ；c：IL-1β；d：IL-6；e：IL-17；f：TGF-β；g：IL-10；

图7为小鼠不同组织中MPO活力，其中，a：结肠组织；b：血清组织；

图8为小鼠免疫器官指数变化图，其中，横坐标是组别，纵坐标是脾脏指数。

具体实施方式

以下通过具体较佳实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明并不仅限于以下的实施例。

需要说明的是，无特殊说明外，本发明中涉及到的化学试剂均通过商业渠道购买。

副干酪乳杆菌JY062，分离自西藏传统发酵乳制品，记载在张宇, 姜毓君, 党芳芳,等. 副干酪乳杆菌TD062对Ⅱ型糖尿病小鼠的降糖作用[J]. 中国食品学报, 2020,v.20(05):112-118中。

副干酪乳杆菌JY062菌粉的制备：

（1）液体深层发酵培养

将副干酪乳杆菌JY062菌种以2%接种量接种至用250mL三角瓶装着的150mL种子培养基中，于37℃，5%的CO₂培养箱中静置培养，24h后，以3%的接种量接种至用1L三角瓶装着的800mL种子培养基中，于37℃，5%的CO₂培养箱中静置培养，培养约7h后，以3%的接种量接种至200mL发酵罐中，内装160mL发酵培养基；

发酵培养条件为：温度37℃，转速50rpm，压力0.05MPa，通风量1.5L/h，发酵过程中pH值用30%的氢氧化钾溶液控制在6.4，待发酵液OD600值和pH值趋于稳定后开始放罐，培养时间为8 h，放罐时罐温降至20℃，副干酪乳杆菌JY062发酵液放罐活菌数为1.0×10¹¹cfu/mL；

副干酪乳杆菌JY062的种子培养基为：葡萄糖8 g/L、蔗糖60 g/L、酵母提取物15g/L、乙酸钠8g/L、柠檬酸氢二铵4 g/L、七水硫酸镁0.6 g/L、一水硫酸锰0.3g/L，pH =6.4；

副干酪乳杆菌JY062的发酵培养基为：葡萄糖10 g/L、蔗糖80 g/L、酵母提取物40g/L、乙酸钠5g/L、柠檬酸氢二铵2 g/L、七水硫酸镁0.58 g/L、一水硫酸锰0.25 g/L，pH=6.4；

（2）菌粉的制备：待副干酪乳杆菌JY062发酵液温度降至20℃左右时，离心收集菌泥，离心菌体管道降温冷却，离心结束后收得菌泥，然后加入脱脂奶粉1.92kg，乳糖1.12kg，海藻糖0.8 kg，抗结块剂0.16 kg作为冻干保护剂，用10L无菌水溶解混匀，然后，混合物均匀铺于托盘上，每个托盘装1L，将托盘置于隔板上，在物料中放置温度探头，再进行冻干，收集菌粉，置于-20℃冰箱保存。

益生元的制备步骤如下：

将3g壳聚糖溶解在100g，5wt%的醋酸溶液中，再加入4g半胱氨酸，搅拌混合均匀，然后加入30g，0.8wt%的京尼平溶液，在40℃下搅拌反应2h，待反应完成后，使用截留分子量8000的透析袋透析24h，每隔6h更换一次去离子水，冷冻干燥，得到益生元。

试验设计

动物分组：试验动物选用60只8周龄，体重20g的雄性C57BL/6J，基础饲料适应性喂养1周后适应环境，随机分为5 组（n=12），分别为空白对照组、模型组、益生菌组、益生元组、益生菌和益生元复合组，采用苦味酸编号；空白对照组的小鼠在整个实验过程中（8-21d）正常饮食、自由饮水；干预组益生菌和益生元复合的小鼠在整个实验周期（8-21d）除正常饮食、自由饮水外，每天9点定时灌胃，益生菌组灌胃1g副干酪乳杆菌JY062菌粉、益生元组灌胃1g益生元、益生菌和益生元复合组灌胃0.5g副干酪乳杆菌JY062菌粉和0.5g益生元，灌胃一周后，即在建模期（15-21d），干预组益生菌和益生元复合均加入3% DSS水溶液诱导；模型组的小鼠在整个实验过程中（8-21d）正常饮食、自由饮水，在建模期（15-21d），加入3% DSS水溶液诱导。

一、小鼠状态

建模后每天观察各组小鼠皮毛色泽、精神状态、活动量、毛被以及进食情况，如眼部是否有白色分泌物，肛周是否有排泄物，毛色光滑或毛色干枯暗沉以及是否立毛，活动量增加或减少，精神状态活跃或萎靡，正常饮食或不思进食。

二、体重及进食量的变化

在整个实验过程中（8-21d），每天定时测定小鼠的食物消耗量并记录，结果如图1所示，并且在造模期间（14-21d），每天定时测定小鼠的体重记录，结果如图2所示，然后计算小鼠体重变化百分比，公式如下：

体重下降率（%）=(W₁-W₂)/W₁×100

其中，W₁为建模前一天（第14天）的小鼠体重（g），W₂为建模后每天的小鼠体重（g）。

从图1可以看出，与对照组小鼠相比，其他组别进食量整体呈下降趋势；与模型组相比，饮食干预组小鼠每日摄食量升高。

从图2可以看出，对照组小鼠体重与建模前相比呈现轻微上升趋势；其他组小鼠的体重在灌胃DSS的第3天开始均呈现下降趋势，尤其在第7天时体重显著下降，其中益生菌和益生元复合组缓解小鼠体重下降的能力最强。

三、疾病活动指数评分的测定

为了评估复合物对小鼠结肠炎的保护作用，每天观测小鼠体重、便血情况及粪便性状，进行疾病活动指数（disease activity index, DAI）评分，具体评分标准如下：

其中：小鼠粪便隐血情况采用邻联甲苯胺法测定，用取样牙签挑取少量小鼠粪便，涂在平皿中；滴加O-tolidine Solution 2滴（约0.1 mL）于粪便不同位置；滴加氧化剂2滴（约0.1 mL），立即计时并观察颜色变化；于2 min内判读完毕，如2 min内有蓝色出现，提示粪便含有血红蛋白或粪便隐血实验阳性。

试验结果如图3所示，从图中可以看出，对照组DAI指数基本为0，对比对照组，模型组DAI指数显著上升（P＜0.05），疾病活动指数评分为6.63；益生菌和益生元复合干预后，发现可在缓解小鼠DAI指数的升高（P＜0.05），且益生菌和益生元复合组DAI评分较低，DAI评分为3.1。

四、结肠长度和重量的测定

在最后一天（21d）处死小鼠后，在超净工作上提取已被处死小鼠的全段结肠，滤纸吸干后测定其长度和重量并拍照记录，以及肉眼观察结肠状态，结束后立即使用生理盐水洗净肠道内容物，速冻于液氮中备用。

试验结果如图4所示，由图中可以看出，对照组小鼠的结肠长度最长（6.53cm），模型组小鼠的结肠最短（3.73cm），对比模型组，对照组小鼠结肠长度增加，且具有显著差异性（P＜0.05），益生菌和益生元复合干预后，可显著增加小鼠结肠长度（P＜0.05），为4.7cm。

由图5可以看出，对照组小鼠的重量最低（0.12g），结肠颜色为正常健康的肉粉色，粪便呈颗粒状；模型组小鼠的重量最高重量为0.20g，且小鼠结肠水肿现象严重，结肠充血，粪便不成形，说明 DSS 成功诱导小鼠出现结肠炎症状，模型建立成功，对比对照组，模型组由于结肠肿胀导致其重量显著增加（P＜0.05），益生菌和益生元复合干预后可减轻结肠水肿、改善粪便不成形的现象，益生菌和益生元复合效果最好，重量为0.15g，最接近于对照组。

五、RT-PCR法对结肠组织中炎症因子的mRNA 相对表达量进行测定

①小鼠结肠组织总RNA的提取

取制作好的小鼠结肠组织匀浆，按照Simply P总RNA提取试剂的方法提取小鼠结肠组织总 RNA，提取完毕后用1.5 mL Rnase-free离心管收集RNA，由于RNA易受环境等因素干扰，提取后应尽快进行后续实验，如不能立即使用需放置在冰盒上用封口膜封口，标注好姓名、时间后放置在-80℃冰箱暂存；实验超净台提前用氯仿擦拭消毒，所用器具用 DEPC水处理，提取RNA时全程避光在冰盒上操作。具体的操作步骤同上，用 NanoDrop 测定OD260、OD280 以及OD260/OD280 值，测定 RNA 的纯度和浓度。

②反转录cDNA合成

利用TaKaRa公司PrimeScriptTM RT Master Mix（Perfect Real Time）试剂盒，将提取质量合格的总RNA反转录为cDNA，按照试剂盒中的试剂盒规定的用量配置反转录体系，具体反应体系见表：

利用7000 PCR扩增仪进行反转录，使用前需预热机器，反转录所得cDNA置于-20℃保存，用于后续试验，具体反转录反应条件见表：

表反转录反应条件

③RT-PCR反应

选取TNF-α、INF-γ、IL-1β、IL-6、IL-10、IL-17、TGF-β多个细胞因子基因，作为目标基因用于RT-PCR研究，β-actin作为内参基因；在对照BI上查找所需基因的信息，利用Primer 5.0软件来设计各个基因特异性引物，PCR 引物均由上海生工技术有限公司合成，具体基因和引物序列见表。

表小鼠引物信息

调整 cDNA 的浓度，利用TaKaRa公司的SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ (PerfectReal-time)试剂盒将反转录的获得cDNA进行Real-time RT-PCR反应，每组别设置3次平行试验，具体反应体系及反应条件见表：

表Real-time RT-PCR反应体系（冰上操作）

表Real-time RT-PCR反应条件

利用ABI QuantStudio 3实时荧光定量PCR仪进行RT-PCR反应，对每个基因的扩增产物进行Melting curve分析，判断PCR产物是否为特异性扩增，确定其特异性和纯度；分析每个基因的Ct值，计算出每个基因的△Ct值、△△Ct值，采用 2-△△Ct 相对定量法对目的基因的相对表达量进行评估，

ΔCt=Ct样品-Ct内参

ΔΔCt=ΔCt实验组-ΔCt对照组

图6为小鼠结肠组织中炎症细胞因子表达量，由图中可以看出，与对照组相比，DSS刺激小鼠后可以显著提高TNF-α、INF-γ、IL-1β、IL-6、IL-17 mRNA 的表达水平（p＜0.05），降低IL-10和TGF-β mRNA 的表达水平（p＜0.05），灌胃复合物后，抗炎因子表达量明显增加，促炎因子表达量显著降低，说明益生菌和益生元复合可以减轻小鼠肠道炎症，增强小鼠肠内的抵抗力。

六、ELISA法对小鼠不同组织MPO活力进行测定

称取结肠组织 20 mg，使用 PBS 溶液清洗干净后用手术剪剪碎，加入生理盐水，并使用全自动组织研磨仪制备5%组织匀浆，小鼠处死后，收集全血，离心收集血清，并在-20℃条件下保存备用，实验时小鼠血清在4℃下以3000 r/min离心20 min得到上清液，采用MPO生化试剂盒并按照操作说明书对结肠组织和血清中炎症标志物MPO的活性变化进行检测，按照如下组织计算公式：

MPO活力=（测定OD值-对照OD值）/11.3×取样量（g）。

结果如图7所示，模型组小鼠结肠组织中MPO活性(279.65EU/L) ，显著高于对照组(144.19EU/L)；血清中MPO活性(376.93EU/L) ，也显著高于对照组(190.38EU/L)，表明DSS诱导后，小鼠肠道内大量的中性粒细胞浸润，炎症程度显著升高，益生菌和益生元复合干预抑制了小鼠结肠组织和血清中MPO活性的表达，表明其可以降低结肠炎小鼠的炎症水平，且益生菌和益生元复合组效果较好。

七、脏器指数的测定

脾脏中存在着很多的淋巴细胞，脏器指数可以在一定程度体现出机体免疫能力的高低，故选择对小鼠的脾脏指数进行测定，处死小鼠后，取小鼠脾脏，滤纸吸干残血，称重，利用如下公式计算脏器指数：

试验结果如图8所示，从图中可以看出，与对照组比较，模型组小鼠的脾脏指数显著升高（P < 0.05），脾脏指数为4.82%，表明3%的DSS可以激活结肠炎小鼠脾脏中免疫细胞的增殖，进而激活非特异性免疫应答途径，与模型组对比，益生菌和益生元复合组的脾脏指数均明显降低（p<0.05），为10.31%，对其影响最为明显，益生菌和益生元复合干预后，结肠炎小鼠脾肿大的现象有所缓解，说明可以维持免疫器官的正常功能。

最后需要说明的是：以上实施例不以任何形式限制本发明。对本领域技术人员来说，在本发明基础上，可以对其作一些修改和改进。因此，凡在不偏离本发明精神的基础上所做的任何修改或改进，均属于本发明要求保护的范围之内。

Claims

1.一种组合物在制备缓解溃疡性结肠炎药物中的应用，其特征在于，所述组合物由副干酪乳杆菌JY062和益生元所组成；

其中，所述益生元的制备方法如下：将壳聚糖溶解在醋酸溶液中，再加入半胱氨酸，搅拌混合均匀，然后加入京尼平溶液，搅拌反应，待反应完成后，经透析、冷冻干燥，得到益生元；

其中，副干酪乳杆菌JY062和益生元的质量比为40-50:50-60；

壳聚糖、醋酸溶液、半胱氨酸和京尼平溶液的质量比为3-6:100:2-4:30-50。

2.根据权利要求1所述的组合物在制备缓解溃疡性结肠炎药物中的应用，其特征在于，副干酪乳杆菌JY062的活菌数≥2.0×10⁹CFU/g。

3.根据权利要求1所述的组合物在制备缓解溃疡性结肠炎药物中的应用，其特征在于，醋酸溶液的质量分数为5-8%，京尼平溶液的质量分数为0.6-0.8%。

4.根据权利要求1所述的组合物在制备缓解溃疡性结肠炎药物中的应用，其特征在于，搅拌反应温度为30-40℃，搅拌反应时间为1-2h。

5.根据权利要求1所述的组合物在制备缓解溃疡性结肠炎药物中的应用，其特征在于，透析的具体操作为：使用截留分子量8000的透析袋透析24h，每隔6h更换一次去离子水。

6.如权利要求1所述的组合物在制备缓解溃疡性结肠炎药物中的应用，其特征在于，所述药物为药学上可接受的剂型。

7.如权利要求6所述的组合物在制备缓解溃疡性结肠炎药物中的应用，其特征在于，所述剂型为粉剂、注射液、胶囊或片剂。