CN115477693B - 海洋真菌来源的两种环肽化合物及其制备方法和在制备抗炎药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于抗炎药物领域，提供海洋真菌来源的两种环肽化合物及其制备方法和在制备抗炎药物中的应用，两种环肽类化合物的结构式如式(Ⅰ)和(II)所示；其制备方法包括如下步骤：挑取Aspergillus sp.GXNU‑BG1菌株，接入培养瓶中，摇床培养，得到种子培养液；将种子培养液中的菌株转接入固体大米发酵培养基中，静置培养，获得真菌菌丝；将上述培养好的真菌菌丝用乙酸乙酯提取三次，浓缩提取液得浓缩浸膏，将获得的浓缩浸膏利用硅胶正相色谱层析进行分离，收集5％～40％氯仿/甲醇洗脱液，再采用柱层析分离技术进行分离。本发明所得两种化合物具有显著抗炎活性，可用于制备抗炎药物。
Description
技术领域
本发明涉及抗炎药物技术领域，具体涉及海洋真菌来源的两种环肽化合物及其制备方法和在制备抗炎药物中的应用。
背景技术
炎症反应是机体抵御组织损伤或病原体不可或缺的防御机制，是机体对各种物理、化学、生物等有害刺激所产生的一种以防御为主的病理反应，主要表现为红斑、水肿、灼烧感、痛感、瘙痒感及功能障碍等。一般说来，炎症反应对机体是有利的，有利于机体对环境的适应；但在更多情况下，过于激烈的炎症反应不仅阻碍了病情的缓解、增加了患者的痛苦，还可能使病情复杂化，甚至对机体造成难以修复的损伤。因此，维持正常的炎症水平对我们的健康是非常重要的。
据估计，全世界有约20亿人被各种类型的炎症所困扰。目前临床常用的抗炎药物主要为非甾体抗炎药，但这些药物长期大量使用会产生一系列不良反应和耐受性，如严重的胃肠道损伤、肝肾功能损伤、过敏反应和造成二次感染等。因此，寻找一种新的具有抗炎活性的药物，对炎症的治疗具有相当的必要性。
环肽类化合物作为药物分子，具有抗癌、抗病毒、抗菌、免疫抑制等广泛的生物活性。迄今为止，总共有超过40种环肽类药物正在临床应用中，平均每年约有一种环肽类药物进入治疗市场。值得注意的是，越来越多来自植物、动物和微生物的环肽被发掘并鉴定。比较有名的天然来源的环肽药物主要包括从真菌中分离的免疫抑制药物环孢菌素；来源于海洋芋螺的镇痛药齐考诺肽；细菌来源的组蛋白脱乙酰基酶抑制剂罗米地辛以及从海鞘中分离得到抗肿瘤药物普利肽新。海洋来源，特别是微生物代谢产物来源的化合物具有可持续性、代谢产物丰富多样性等特点，一直是药物筛选的天然宝库。本发明提供一种海洋真菌来源的两种环肽化合物，具有显著抑制抗炎活性，具有抗炎治疗的临床应用潜力。
发明内容
本发明的发明目的在于：针对上述存在的问题，提供海洋真菌来源的两种环肽化合物及其制备方法和在制备抗炎药物中的应用。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
海洋真菌来源的两种环肽类化合物，两种环肽类化合物的结构式如式(I)和(II)所示：
本发明所述的两种环肽类化合物(I)和(II)是从海洋真菌Aspergillus sp.GXNU-BG1的发酵液中分离获得的，海洋真菌Aspergillus sp.GXNU-BG1于2021年01月04日保藏在广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：60940。
具体地，上述两种海洋真菌来源的两种环肽类化合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)种子培养：挑取Aspergillus sp.GXNU-BG1菌株，接入培养瓶中，摇床培养，得到种子培养液；
(2)发酵培养：将种子培养液中的菌株转接入固体大米发酵培养基中，静置培养，获得真菌菌丝；
(3)分离：将上述培养好的真菌菌丝用乙酸乙酯提取三次，浓缩提取液得浓缩浸膏，将获得的浓缩浸膏利用硅胶正相色谱层析进行分离，用氯仿/甲醇进行洗脱，收集5％～40％氯仿/甲醇洗脱液，再采用柱层析分离技术进行分离，得到结构式如式(I)和(II)的两种环肽类化合物。
上述制备方法中，优选地，步骤(1)中所述种子培养所用的培养基组成按比例为：琼脂2-5克，氯化钠2-5克，蛋白胨1-3克，牛肉浸膏2-5克，琼脂1-3克，葡萄糖30克，酵母提取物1克，水1升。
上述制备方法中，优选地，步骤(1)中所述摇床培养的条件为摇床转速80～220rpm，25～35℃培养2～10天。
上述制备方法中，优选地，步骤(2)中所述发酵培养所用的培养基为大米与海水按照1g：1.2ml的质量体积比混合得到。
上述制备方法中，优选地，步骤(2)所述静置培养的条件为，控制温度为25～35℃，培养时间20～120天。
上述制备方法中，优选地，步骤(3)所述层析分离技术为硅胶柱层析技术、凝胶柱层析技术和C-18反相柱层析技术；其中硅胶层析使用二氯甲烷与甲醇为洗脱剂，比例按0:100、5:95、10:90、20:80、30:70、50:50依次洗脱；凝胶柱层析技术和C-18反相柱层析均使用甲醇与水为洗脱剂，比例按50:50、60:40、80:20、100:00依次洗脱。
上述海洋真菌来源的两种环肽类化合物(I)和(II)具有抗炎活性，可以应用于的在制备抗炎药物。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
1、本发明首次利用海洋真菌Aspergillus sp.GXNU-BG1获得式(I)和(II)的两种环肽类化合物，该类化合物具有显著抑制抗炎活性。NO(一氧化氮)抑制活性筛选试验表明，化合物(I)和(II)对NO的生成表现出明显的抑制活性，化合物(I)的半数抑制浓度(IC50值)为11.42±0.16，化合物(I)的半数抑制浓度(IC50值)为18.66±0.13，而阳性对照地塞米松的半数抑制浓度(IC50值)为26.06±0.11。因此，本发明提供的两种环肽类化合物具有抗炎治疗的临床应用潜力。
2、本发明利用海洋真菌Aspergillus sp.GXNU-BG1制备环肽类化合物的制备工艺简单，便于该两种环肽化合物的工业化大生产。
具体实施方式
为了更清楚地表达本发明，以下通过具体实施例对本发明作进一步说明。所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
一、制备实施例
实施例1海洋真菌Aspergillus sp.GXNU-BG1的分离与鉴定
1、材料：从广西防城港市北仑河口采集的红树林老鼠簕叶子的内生真菌样品。
2、经过菌株的培养、分离、鉴定，获得纯的内生真菌菌株，经过鉴定为曲霉真菌Aspergillus sp.GXNU-BG1。海洋真菌Aspergillus sp.GXNU-BG1于2021年01月04日保藏在广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：60940，保藏单位的地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
实施例2
两种环肽类化合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)种子培养：种子培养所用的培养基组成按比例为：琼脂2克，氯化钠2克，蛋白胨1克，牛肉浸膏2克，琼脂1克，葡萄糖30克，酵母提取物1克，水1升；培养基倒入培养瓶，挑取Aspergillus sp.GXNU-BG1菌株，接入培养瓶中，摇床培养，摇床培养的条件为摇床转速80rpm，25℃培养10天，得到种子培养液；
(2)发酵培养：将种子培养液中的菌株转接入固体大米发酵培养基中，所用的培养基为大米与海水按照1g：1.2ml的质量体积比混合得到，静置培养，控制温度为25～35℃，培养时间20天，获得真菌菌丝；
(3)分离：将上述培养好的真菌菌丝用乙酸乙酯提取三次，浓缩提取液得浓缩浸膏，将获得的浓缩浸膏利用硅胶正相色谱层析进行分离，用氯仿/甲醇进行洗脱，收集5％～40％氯仿/甲醇洗脱液，再采用硅胶柱层析技术、凝胶柱层析技术和C-18反相柱层析技术进行分离，；其中硅胶层析使用二氯甲烷与甲醇为洗脱剂，比例按0:100、5:95、10:90、20:80、30:70、50:50的体积比依次洗脱；凝胶柱层析技术和C-18反相柱层析均使用甲醇与水为洗脱剂，比例按50:50、60:40、80:20、100:00的体积比依次洗脱，得到结构式如式(I)和(II)的两种环肽类化合物。
实施例3
两种环肽类化合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)种子培养：种子培养所用的培养基组成按比例为：琼脂5克，氯化钠5克，蛋白胨3克，牛肉浸膏5克，琼脂3克，葡萄糖30克，酵母提取物1克，水1升；培养基倒入培养瓶，挑取Aspergillus sp.GXNU-BG1菌株，接入培养瓶中，摇床培养，摇床培养的条件为摇床转速220rpm，25～35℃培养2天，得到种子培养液；
(2)发酵培养：将种子培养液中的菌株转接入固体大米发酵培养基中，所用的培养基为大米与海水按照1g：1.2ml的质量体积比混合得到，静置培养，控制温度为25～35℃，培养时间120天，获得真菌菌丝；
(3)分离：将上述培养好的真菌菌丝用乙酸乙酯提取三次，浓缩提取液得浓缩浸膏，将获得的浓缩浸膏利用硅胶正相色谱层析进行分离，用氯仿/甲醇进行洗脱，收集5％～40％氯仿/甲醇洗脱液，再采用硅胶柱层析技术、凝胶柱层析技术和C-18反相柱层析技术进行分离，；其中硅胶层析使用二氯甲烷与甲醇为洗脱剂，比例按0:100、5:95、10:90、20:80、30:70、50:50的体积比依次洗脱；凝胶柱层析技术和C-18反相柱层析均使用甲醇与水为洗脱剂，比例按50:50、60:40、80:20、100:00的体积比依次洗脱，得到结构式如式(I)和(II)的两种环肽类化合物。
二、化合物的确认
对上述得到的新型两种环肽类化合物进行结构测试解析，得到以下试验数据：
新型环肽类化合物I：C32H46N6O5；HRESIMS：595.3605[M+H]+(理论计算值595.3608)；一维核磁共振数据:13CNMR 124.7，121.8，123.7，128.6，136.5，117.1，135.8，99.6，28.5，71.4，171.6，68.2，32.1，19.1，19.1，170.5，54.8，18.9，171.3，55.8，176.5，41.9，26.4，24.5，24.5，44.7，26.1，22.9，24.3，59.6，173.2，31.4。
新型环肽类化合物II：C34H50N6O5；HRESIMS：377.1139[M-H]-(理论计算值377.1137)；一维核磁共振数据:13CNMR124.6，121.9，123.8，128.7，136.6，117.2，135.9，99.7，28.7，71.6，171.8，68.4，32.3，19.5，19.5，170.6，54.9，17.9，34.2，17.9，171.1，55.6，176.7，41.9，26.6，24.6，24.6，44.8，26.2，22.9，24.4，59.8，173.4，31.6。
经过鉴定，两种新型环肽类化合物的结构式如式(I)和(II)所示：
三、两种环肽类化合物的抗炎活性实验(对细胞生成NO的抑制作用)
实施例2和3中获得的两种环肽类化合物对RAW264.7细胞生成NO的抑制作用实验：
1.材料：
1.1DMEM高糖培养基、胎牛血清、胰蛋白酶(美国Gibco)；磷酸缓冲盐溶液(PBS)(美国Gibco)；二甲基亚砜(美国Mpbio)；CCK8细胞计数试剂盒(美国APExBIO)；地塞米松、脂多糖(LPS)(美国Sigma)；Griess试剂盒(上海碧云天)。
1.2化合物细胞毒性试验：
用二甲基亚砜(100％)溶解化合物至浓度为20mmol·L-1于冰箱冻存备用，实验时用DMEM高糖培养液稀释至200μmol·L-1。RAW264.7细胞经0.25％胰蛋白酶消化后，重悬于含10％FBS的DMEM高糖培养液中，以每毫升1.25×104个细胞(每孔100μL)接种于96孔板，置于含5％CO2的37℃恒温培养箱内培养24h后，将各组的培养液均换成新鲜含10％FBS的DMEM高糖培养液。化合物测试组分别加入相应化合物(每孔10μL)，正常对照组加入含10％胎牛血清DMEM高糖培养液(每孔10μL)继续培养24h后，加入5mg·mL-1MTT(每孔10μL)，进行活细胞染色，采用白藜芦醇作为对照。孵育3h后，弃去培养液，加入DMSO(每孔100μL)溶解，并在摇板机上振摇使之充分溶解，随后在490nm的波长下测定OD值。空白组每孔加入100μL DMSO，用以下公式计算各组的细胞存活率：
细胞存活率(％)＝(OD值化合物测试组－OD值空白组)/(OD值正常对照组－OD值空白组)×100％。
1.3化合物抗炎活性测试
RAW264.7细胞以每毫升2×105个的密度接种于96孔培养板上(每孔100μL)，置于含5％CO2的37℃恒温培养箱内培养24h后将各组的培养液均换成新鲜含10％胎牛血清的DMEM高糖培养液。在给药组中加入相应浓度的待测化合物(每孔10μL)，正常对照组和脂多糖模型组加入含10％胎牛血清DMEM高糖培养液(每孔10μL)。随后在化合物测试组与脂多糖模型组中分别加入0.001mg·mL-1的脂多糖(每孔10μL)，正常对照组加入10μL含10％FBS的DMEM高糖培养液。继续培养24h后，每孔取50μL上清与50μL Greiss试剂，室温反应15min。在540nm的波长下测定OD值，运用一氧化氮的标准曲线计算出各组一氧化氮(NO)摩尔质量分数，并进一步计算各加药组的抑制率。计算公式如下：
NO生成抑制率(％)＝1-w1÷w2×100％
w1代表化合物测试组的NO摩尔质量分数，w2代表脂多糖组的NO摩尔质量分数。
2.试验结果
试验结果显示两种环肽类化合物能显著有效抑制细胞生成的NO，两种环肽类化合物对RAW264.7细胞生成NO的抑制作用IC50值(μM)见表1。
表1两种环肽类化合物对RAW264.7细胞生成NO的抑制作用(IC50μM)
上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。
Claims (9)
1.海洋真菌来源的两种环肽类化合物，其特征在于：所述两种环肽类化合物的结构式如式(I)和(II)所示：
2.根据权利要求1所述的两种海洋真菌来源的两种环肽类化合物，其特征在于：所述两种环肽类化合物(I)和(II)是从海洋真菌Aspergillus sp.GXNU-BG1的发酵液中分离获得的，海洋真菌Aspergillus sp.GXNU-BG1于2021年01月04日保藏在广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：60940。
3.根据权利要求1所述的两种海洋真菌来源的两种环肽类化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)种子培养：挑取Aspergillus sp.GXNU-BG1菌株，接入培养瓶中，摇床培养，得到种子培养液；
(2)发酵培养：将种子培养液中的菌株转接入固体大米发酵培养基中，静置培养，获得真菌菌丝；
(3)分离：将上述培养好的真菌菌丝用乙酸乙酯提取三次，浓缩提取液得浓缩浸膏，将获得的浓缩浸膏利用硅胶正相色谱层析进行分离，用氯仿/甲醇进行洗脱，收集5％～40％氯仿/甲醇洗脱液，再采用柱层析分离技术进行分离，得到结构式如式(I)和(II)的两种环肽类化合物。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述种子培养所用的培养基组成按比例为：琼脂2-5克，氯化钠2-5克，蛋白胨1-3克，牛肉浸膏2-5克，琼脂1-3克，葡萄糖30克，酵母提取物1克，水1升。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述摇床培养的条件为摇床转速80～220rpm，25～35℃培养2～10天。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述发酵培养所用的培养基为大米与海水按照1g：1.2ml的质量体积比混合得到。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)所述静置培养的条件为，控制温度为25～35℃，培养时间20～120天。
8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)所述层析分离技术为硅胶柱层析技术、凝胶柱层析技术和C-18反相柱层析技术；其中硅胶层析使用二氯甲烷与甲醇为洗脱剂，比例按0:100、5:95、10:90、20:80、30:70、50:50依次洗脱；凝胶柱层析技术和C-18反相柱层析均使用甲醇与水为洗脱剂，比例按50:50、60:40、80:20、100:00依次洗脱。
9.权利要求1或2所述的海洋真菌来源的两种环肽类化合物(I)和(II)的在制备抗炎药物中的应用。
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