CN115466696A - 一种复合益生菌及其在预防肝损伤中的用途 - Google Patents

一种复合益生菌及其在预防肝损伤中的用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种复合益生菌及其在预防肝损伤中的用途，涉及生物技术领域。该复合益生菌包括动物双歧杆菌乳亚种和植物乳杆菌，所述动物双歧杆菌乳亚种的保藏编号为CGMCC No.20816；所述植物乳杆菌的保藏编号为CGMCC No.16648。本发明提供的复合益生菌具有以下作用：上调双调蛋白的表达，促进肝脏器官的损伤后修复；增强酶活性抗氧化防御体系；降低与急性肝损伤相关的炎症因子的产生，缓解炎症反应；平衡肠道内的菌群，维持正常的生理机能。综上，本发明提供的复合益生菌可以有效的预防和/或治疗急性肝损伤。

Description

一种复合益生菌及其在预防肝损伤中的用途
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种复合益生菌及其在预防肝损伤中的用途。
背景技术
肝脏是动物机体最重要的代谢与解毒器官，在机体的新陈代谢过程中扮演着重要的角色，它在糖、脂肪、蛋白质及维生素、激素等代谢过程中起极重要的作用，肝脏对来自体内和体外的许多非营养性物质如各种药物、毒物以及体内某些代谢产物，具有生物转化作用，通过新陈代谢将它们彻底分解排出体外。肝脏的组织解剖特点及其所含的丰富的酶决定了肝脏具有重要的代谢和其他诸多功能，所以肝脏被喻为是“机体最大的化工厂”。肝脏能够贮藏血液，根据机体的需要可将血液释出或贮藏，从而间接地调节全身的血液循环。肝脏还能调节水和电解质的代谢，所以当肝脏有病时，常见有腹水或全身浮肿等。肝脏也是非常重要旳屏障机构，因此发生疾病时，肝脏易受各种致病因素的侵害而很容易遭受细菌、病毒或外来毒物的侵害，表现出明显的病理变化。
急性肝损伤的发病机理已知涉及氧化应激、炎症反应以及细胞凋亡等相互作用。目前肝损伤的确切机制仍在研究中，而肝损伤的治疗仍是人类需要解决的一大难题。虽然许多药物可用于治疗肝损伤，但药物治疗存在副作用，对机体也会造成损伤。因此，迫切需要寻找新的预防和治疗肝损伤的方法。
双调蛋白(Amphiregulin，Areg)是表皮生长因子受体(Epidermal growth factorreceptor，EGFR)的配体，正常肝脏中的Areg表达量甚微，但在肝组织受损后，Areg的表达量大幅度上调，激活肝脏的有丝分裂；同时，Areg还能抑制肝细胞凋亡，最终的共同作用减轻了肝损伤，促进了肝脏损伤后修复。有研究表明，Areg能通过激活EGFR通路，下调TNF-α介导的“死亡信号”通路，从而减轻肝损伤。
发明内容
本发明的目的是提供一种复合益生菌及其在预防肝损伤中的用途，以解决上述现有技术存在的问题，本发明提供的复合益生菌可以预防和/或治疗急性肝损伤。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种复合益生菌，包括动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacteriumanimalis subsp.lactis)和植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)，所述动物双歧杆菌乳亚种在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.20816；所述植物乳杆菌在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCCNo.16648。
本发明还提供一种复合微生物菌剂，包括上述的复合益生菌。
进一步地，所述复合微生物菌剂的制备方法包括：
(1)将所述动物双歧杆菌乳亚种和所述植物乳杆菌分别发酵培养后，得到动物双歧杆菌乳亚种发酵液和植物乳杆菌发酵液，之后分别用无菌水稀释至105CFU/mL，得到动物双歧杆菌乳亚种发酵剂和植物乳杆菌发酵剂；
(2)将所述动物双歧杆菌乳亚种发酵剂和所述植物乳杆菌发酵剂混合均匀，即得所述复合微生物菌剂。
进一步地，在步骤(1)中，所述动物双歧杆菌乳亚种和所述植物乳杆菌的发酵培养基均为MRS培养基。
进一步地，在步骤(1)中，所述动物双歧杆菌乳亚种和所述植物乳杆菌的发酵培养条件均为：37℃，24h。
进一步地，在步骤(2)中，所述动物双歧杆菌乳亚种发酵剂和所述植物乳杆菌发酵剂按照活菌量比1：1混合均匀。
本发明还提供上述的复合益生菌或复合微生物菌剂在制备预防和/或治疗急性肝损伤的药物中的应用。
本发明还提供上述的复合益生菌或复合微生物菌剂在制备促进双调蛋白表达的产品中的应用。
本发明公开了以下技术效果：
本发明公开了一种由动物双歧杆菌乳亚种和植物乳杆菌组成的复合益生菌，该复合益生菌具有如下作用：
1.上调双调蛋白(Areg)的表达，进而激活EGFR通路，调节细胞的增殖与分化，促进肝脏器官的损伤后修复。
2.增强酶活性抗氧化防御体系，改善CAT、GSH、SOD的活性，MDA含量，以及ROS的水平，能明显改善小鼠肝组织的氧化损伤。
3.降低与急性肝损伤相关的炎症因子的产生，缓解炎症反应。
4.能够在体内定植，有利于抑制致病菌，扩大有益菌的优势地位，平衡肠道内的菌群，进而利于机体各种代谢通路的进行，维持正常的生理机能。
总之，本发明提供的复合益生菌可以有效的预防和/或治疗急性肝损伤。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为qPCR测定小鼠Areg mRNA的表达结果；NS表示相对于CCl4诱导组差异不显著；**表示相对于CCl4诱导组差异极其显著；
图2为小鼠血清内Areg含量的检测结果；NS表示相对于CCl4诱导组差异不显著；*表示相对于CCl4诱导组差异显著；**表示相对于CCl4诱导组差异极其显著；
图3为小鼠血清中ALT含量的检测结果；**表示相对于CCl4诱导组差异极其显著；
图4为小鼠血清中AST含量的检测结果；**表示相对于CCl4诱导组差异极其显著；
图5为小鼠血清中TG含量的检测结果；**表示相对于CCl4诱导组差异极其显著；
图6为小鼠血清中MDA含量的检测结果；**表示相对于CCl4诱导组差异极其显著；
图7为小鼠血清中T-SOD含量的检测结果；**表示相对于CCl4诱导组差异极其显著；
图8为小鼠血清中ROS含量的检测结果；**表示相对于CCl4诱导组差异极其显著；
图9为小鼠血清中GSH含量的检测结果；**表示相对于CCl4诱导组差异极其显著；
图10为小鼠血清中CAT含量的检测结果；**表示相对于CCl4诱导组差异极其显著；
图11为小鼠血清中IL-6水平的检测结果；**表示相对于CCl4诱导组差异极其显著；
图12为小鼠血清中TNF-α水平的检测结果；**表示相对于CCl4诱导组差异极其显著；
图13为小鼠血清中IFN-γ水平的检测结果；**表示相对于CCl4诱导组差异极其显著。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1
本实施例旨在筛选得到一种可以上调Areg表达的益生菌组合，从而可以应用于急性肝损伤的防治。
一、材料和方法
1.1材料
动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animalis subsp.lactis)NJ241：于2020年9月24日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.20816。
格氏乳杆菌(Lactobacillusgasseri)GS18，于2021年8月24日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.23187。
植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)HFY15，于2018年10月29日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.16648。
凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)BC01，于2017年12月21日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2017813。
表1益生菌组合
组别 益生菌组合
A 动物双歧杆菌乳亚种NJ241+植物乳杆菌HFY15
B 动物双歧杆菌乳亚种NJ241+格氏乳杆菌GS18
C 格氏乳杆菌GS18+植物乳杆菌HFY15
D 凝结芽孢杆菌BC01+动物双歧杆菌乳亚种NJ241
E 凝结芽孢杆菌BC01+格氏乳杆菌GS18
F 凝结芽孢杆菌BC01+植物乳杆菌HFY15
G 动物双歧杆菌乳亚种NJ241
H 植物乳杆菌HFY15
I 格氏乳杆菌GS18
J 凝结芽孢杆菌BC01
1.2方法
1.2.1菌种发酵培养
1.2.1.1将保存的动物双歧杆菌乳亚种NJ241、格氏乳杆菌GS18、植物乳杆菌HFY15和凝结芽孢杆菌BC01分别进行如下操作：
(1)在MRS平板上划线活化两次，再接种于MRS液体培养基，在37℃条件下活化18h，之后按照5％的接种量接种于MRS液体培养基，37℃，发酵培养24h，得到发酵液；
(2)将发酵液加无菌水稀释至105CFU/mL，得到发酵剂。
1.2.1.2如表1所示，取上述制备好的四种发酵剂两两组合，按照活菌量比1：1混合均匀，分别得到A-F六组混合发酵剂和G-J四组单一发酵剂。
1.2.2筛选实验
120只6周龄雄性昆明小鼠，体重为(20±5g)，购于重庆医科大学实验动物中心(No.SYXK 2018-0003)，所有小鼠均在温度25±2℃、12h的光照/黑暗循环中恒定条件下喂养标准饲料和水。在实验开始前不限水和饲料喂养一周，然后将小鼠随机分组，每组10只，之后按照表2所示，进行小鼠实验，其中CK为空白对照组，CCl4诱导组为模型组，A-J为实验组。结束后所有小鼠禁食16h后，用CO2安乐处死小鼠，取组织和血样，全血离心分离血清，-80℃冷冻保存。分离肝脏并称重，然后将肝脏在-80℃冷冻保存。
表2
Figure BDA0003853612970000061
1.2.3小鼠肝组织中Areg表达测定(qPCR测定)
将100mg的肝脏组织置于一个装有小钢珠的匀浆管中，再加入1mL Trizol试剂，匀浆，从中分离和提取出总RNA，用微量光度法测定其含量和纯度，然后用总RNA作为模板，反转录合成cDNA。扩增反应体系：1μL模板(cDNA)、2μL引物(10μmol)、预混液10μL以及无菌超纯水7μL。扩增反应程序：40次95℃变性3min，60℃退火20s，95℃延伸1min。所涉及的引物如表3所示。用GAPDH作为内参基因，用2-△△Ct法计算出目标基因mRNA的相对表达量。
表3qPCR引物序列
Figure BDA0003853612970000062
1.2.4采用Areg检测试剂盒(上海初态生物)检测小鼠血清内Areg的含量。
二、结果
2.1小鼠体重和肝脏指数结果见表4。从表4可以看出，益生菌的摄入有助于提高小鼠体重，并降低肝重和肝脏指数，其中A组降低肝重和肝脏指数的效果最优。
表4小鼠体重和肝脏指数
组别 体重 肝重 肝脏指数
CK 30.50 1.51 4.95
CCl<sub>4</sub>诱导组 28.41 1.91 6.72
A 32.60 1.61 4.94
B 31.28 1.72 5.50
C 31.15 1.84 5.91
D 30.57 1.77 5.79
E 31.29 1.69 5.40
F 31.37 1.64 5.23
G 32.09 1.68 5.24
H 31.67 1.81 5.72
I 32.06 1.73 5.40
J 31.84 1.81 5.68
2.2qPCR测定结果
qPCR测定结果见图1，结果显示，A组，即动物双歧杆菌乳亚种NJ241+格氏乳杆菌GS18组，表现出对Areg mRNA的高表达。在J-G组，显示出动物双歧杆菌乳亚种NJ241在单一菌株的实验组中具有Areg mRNA的较高表达，并且在A-F组中，有动物双歧杆菌乳亚种NJ241参与的组别显示出Areg mRNA的较高表达，由此可见，动物双歧杆菌乳亚种NJ241是促使Areg mRNA高表达的优势菌株。然而动物双歧杆菌乳亚种NJ241与格氏乳杆菌GS18或凝结芽孢杆BC01菌联用时，促使Areg mRNA表达的效果远达不到动物双歧杆菌乳亚种NJ241+植物乳杆菌HFY15组，可见，只有特定的动物双歧杆菌乳亚种NJ241和植物乳杆菌HFY15的组合才具有协同增效作用。
2.3小鼠血清内Areg的含量
小鼠血清内Areg的含量检测结果见图2，结果显示，A组，即动物双歧杆菌乳亚种NJ241+植物乳杆菌HFY15组，小鼠血清内Areg的含量最高，其结果与qPCR测定结果一致。
综上所述，选定动物双歧杆菌乳亚种NJ241+植物乳杆菌HFY15作为防治急性肝损伤的益生菌组合。
实施例2
一、方法
1.1小鼠血清中ALT、AST、TG、MDA、ROS、GSH、T-SOD和CAT水平测定
利用试剂盒分别检测实施例1中CK组、CCl4诱导组、A组、G组和H组小鼠血清中谷丙转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、甘油三酯(TG)、丙二醛(MDA)、活性氧(ROS)、谷胱甘肽(GSH)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)和过氧化氢酶(CAT)水平，试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。
1.2小鼠血清中IL-6、TNF-α和IFN-γ水平测定
利用试剂盒分别检测实施例1中CK组、CCl4诱导组、A组、G组和H组小鼠血清中白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和干扰素-γ(IFN-γ)的含量，试剂盒均购自上海酶联生物科技有限公司。
二、结果
2.1 ALT、AST和TG检测结果
ALT和AST是肝脏正常运转过程中不可或缺的催化剂。肝脏受损时，ALT和AST进入血液，增加小鼠血清转氨酶的数量。因此，ALT和AST可以作为评估肝功能损害的指标，其数值与肝脏细胞损伤程度呈正相关。另外，肝损伤可导致外周脂肪组织中的脂肪被运输到肝脏并聚集，使肝内TG含量升高。
实施例1中CK组、CCl4诱导组、A组、G组和H组小鼠血清中ALT、AST和TG的检测结果，分别见图3-5，结果显示，植物乳杆菌HFY15虽然降低血清中ALT、AST和TG的含量，但作用有限。本发明将动物双歧杆菌乳亚种NJ241和植物乳杆菌HFY15复合使用，利用两种菌株的协同促进作用，进一步降低了血清中ALT、AST和TG的含量。
2.2 MDA、T-SOD、ROS、GSH和CAT检测结果
氧化应激是导致急性肝损伤的重要因素之一，而酶活性抗氧化防御体系能有效地减少氧化应激所致的损害。因此，本发明采用SOD、CAT、ROS、GSH、MDA等方法对肝细胞的氧化能力进行了评价。
实施例1中CK组、CCl4诱导组、A组、G组和H组小鼠血清中MDA、T-SOD、ROS、GSH和CAT的检测结果，分别见图6-10，结果显示植物乳杆菌HFY15能明显改善小鼠CAT、GSH、T-SOD的活性、MDA含量和ROS的水平，本发明利用动物双歧杆菌乳亚种NJ241和植物乳杆菌HFY15的协同促进作用，进一步提高了改善小鼠CAT、GSH、T-SOD的活性、MDA含量和ROS水平的作用，尤其使CAT和T-SOD更加趋向于正常水平。
2.3 IL-6、TNF-α和IFN-γ水平检测结果
炎症因子在肝脏损害中扮演重要角色。CCl4对肝组织的氧化应激及炎症介质的释放有促进作用，使小鼠血清炎症因子IL-6、TNF-α和IFN-γ水平显著增加。
实施例1中CK组、CCl4诱导组、A组、G组和H组小鼠血清中IL-6、TNF-α和IFN-γ的检测结果，分别见图11-13，结果显示，本发明将动物双歧杆菌乳亚种NJ241和植物乳杆菌HFY15复合使用，利用两种菌株的协同促进作用，有效降低了IL-6、TNF-α和IFN-γ水平。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (8)

1.一种复合益生菌，其特征在于，包括动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacteriumanimalis subsp.lactis)和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，所述动物双歧杆菌乳亚种在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.20816；所述植物乳杆菌在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCCNo.16648。
2.一种复合微生物菌剂，其特征在于，包括权利要求1所述的复合益生菌。
3.根据权利要求2所述的复合微生物菌剂，其特征在于，所述复合微生物菌剂的制备方法包括：
(1)将所述动物双歧杆菌乳亚种和所述植物乳杆菌分别发酵培养后，得到动物双歧杆菌乳亚种发酵液和植物乳杆菌发酵液，之后用无菌水分别稀释至105CFU/mL，得到动物双歧杆菌乳亚种发酵剂和植物乳杆菌发酵剂；
(2)将所述动物双歧杆菌乳亚种发酵剂和所述植物乳杆菌发酵剂混合均匀，即得所述复合微生物菌剂。
4.根据权利要求3所述的复合微生物菌剂，其特征在于，在步骤(1)中，所述动物双歧杆菌乳亚种和所述植物乳杆菌的发酵培养基均为MRS培养基。
5.根据权利要求3所述的复合微生物菌剂，其特征在于，在步骤(1)中，所述动物双歧杆菌乳亚种和所述植物乳杆菌的发酵培养条件均为：37℃，24h。
6.根据权利要求3所述的复合微生物菌剂，其特征在于，在步骤(2)中，所述动物双歧杆菌乳亚种发酵剂和所述植物乳杆菌发酵剂按照活菌量比1：1混合均匀。
7.一种如权利要求1所述的复合益生菌或权利要求2-6任一项所述的复合微生物菌剂在制备预防和/或治疗急性肝损伤的药物中的应用。
8.一种如权利要求1所述的复合益生菌或权利要求2-6任一项所述的复合微生物菌剂在制备促进双调蛋白表达的产品中的应用。
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