CN115466682B - 一种微生物保存液及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物保存技术领域，涉及一种微生物保存液及其使用方法。本发明提供的微生物保存液，以质量份计，由以下有效成分构成：聚乙烯醇42‑75份、低密度脂蛋白2‑3份、四氢嘧啶6‑40份、硫乙醇酸钠0.5‑1.2份和甘油100份。本发明提供的微生物保存液为微生物保存提供载体，能有效保护微生物活性，提高菌体存活率和菌体活性。

Description

一种微生物保存液及其使用方法

技术领域

本发明属于微生物保存技术领域，涉及一种微生物保存液及其使用方法。

背景技术

病原微生物也是一种重要的生物资源，它的保存不仅有利于重现已经做过的实验，证实发现新的菌种，而且也是研究、推广、开发和实际应用科研成果的基础。保存的菌种有的是开发利用的对象，有的是悉心研究的成果，有从自然界分离得到的，有经生物技术修饰改造获得的，都有着极大的研究价值和开发利用的潜力。

为得到一种能长期保存菌种的理想方法，以便更好地为科研、教学提供标准菌株。不同菌种或不同要求，适用不同的保藏方法，一般微生物培养物的保藏方法为：斜面保藏、液体石蜡保藏、冷冻干燥保藏、液氮超低温保藏法、低温冷冻保藏法。斜面保藏法，保藏期短；液体石蜡保藏法，必须直立存放，占空间大，不便携带；冻干保藏、液氮超低温保藏法，技术复杂，技术含量高，设备投入高，运行成本高，适合专业保藏机构，不适合生产企业。

低温保藏法是将菌种放置在低温冰箱中以减缓生理活动而进行的一种保藏方法。目前采用的保藏方法有两种：一是4℃冰箱直接保存（短期）；二是，菌液中加入一定比例的甘油混合后-80℃保存（中长期）。低温保存，无论是4℃还是-20℃、-80℃，加入一定比例的保护剂，可有效保护微生物活性，提高菌体存活率。对于各种微生物种类及结构不同，其在低温保存中的最佳保护剂配方也不同。目前，现有的微生物低温保存保护剂常见的为甘油、甘露醇、脱脂奶粉或培养液中的一种。但是，实验结果证明，现有的微生物采用甘油作为低温保存保护剂，微生物经过低温保存后的存活率和菌体活性仍然不高。

发明内容

本发明的目的在于开发出一种微生物保存液，针对肠道内病原菌种，提高微生物经过低温保存后的存活率和菌体活性。

基于上述目的，本发明提供了一种含纳米颗粒的微生物核酸检测试剂盒及检测方法来满足本领域的这种需要。

一方面，本发明涉及一种微生物保存液，其以质量份计，由以下有效成分构成：聚乙烯醇42-75份、低密度脂蛋白2-3份、四氢嘧啶6-40份、硫乙醇酸钠0.5-1.2份和甘油100份；优选地，以质量份计，由以下有效成分构成：聚乙烯醇53份、低密度脂蛋白2.6份、四氢嘧啶27份、硫乙醇酸钠0.8份和甘油100份。

进一步地，本发明提供的微生物保存液中，其制备方法为：将聚乙烯醇水浴加热到60℃后，加入四氢嘧啶和硫乙醇酸钠，混合均匀后降温至35-40℃，加入低密度脂蛋白和甘油，搅拌均匀调整pH至7.2-7.4，115℃灭菌15min。

进一步地，本发明提供的微生物保存液中，使用方法为：将所述微生物保存液水浴加热至35-40℃，检测pH维持为7.2-7.4，加入待保存菌种，采用惰性气体加压冷冻保存。

进一步地，本发明提供的微生物保存液中，所述惰性气体为氦气、氩气、氙气中的一种，所述惰性气体的气体浓度不低于85%；优选地，所述惰性气体为氦气。

进一步地，本发明提供的微生物保存液中，所述加压的压强为0.3-0.5MPa，所述冷冻保存为：先置于0-5℃保存12h，然后置于零下20℃至零下15℃保存12h，最后置于零下260℃至零下80℃保存。根据本发明提供的微生物保存液，所述保存温度可以为本领域常规的微生物低温保存的保存温度，典型地，所述保存温度可以为零下260℃至5℃之间的任意温度。典型地，用于微生物低温保存方法的设备可以为常规的各种设备，例如温度设置为4℃左右的冰箱、温度设置为零下20℃左右的冰箱、温度设置为零下80℃左右的冰箱、温度设置为零下160℃左右的冰箱或液氮保存罐（零下196℃以下）等。一般地，保存温度越低，保存的效果越好。为了降低安装运行所述保存设备的成本，优选情况下，所述保存温度为0℃至5℃之间的任意温度，或者，所述保存温度为零下20℃至零下15℃之间的任意温度。

进一步地，本发明提供的微生物保存液中，所述待保存菌种选为沙门氏菌、大肠杆菌中的一种。

进一步地，本发明提供的微生物保存液中，每10⁹个微生物，所述微生物保存液的使用量为1mL。

另一方面，本发明涉及一种微生物保存液在保存微生物中的应用。

本发明与现有技术相比具有以下有益效果或者优点：

本发明提供了一种微生物保存液，以甘油为基础，添加了聚乙烯醇为微生物保存提供低温保护载体，添加了低密度脂蛋白维持保存环境为菌种复苏提供环境，添加了四氢嘧啶维持环境渗透压，添加了硫乙醇酸钠维持保护环境。本发明提供的一种微生物保存液相较甘油能极为有效的提高菌种冷冻保存的存活率和菌体活性。

具体实施方式

为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案能予以实施，下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但所举实施例不作为对本发明的限定。

下述各实施例中所述实验方法和检测方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可在市场上购买得到。

实施例1

本实施例提供了一种微生物保存液的制备。

各组分构成如表1所示。

表1，微生物保存液

制备过程：将聚乙烯醇水浴加热到60℃后，加入四氢嘧啶和硫乙醇酸钠，混合均匀后降温至35-40℃，加入低密度脂蛋白和甘油，搅拌均匀调整pH至7.2-7.4，115℃灭菌15min。

实施例2

本实施例提供了一种微生物保存液的保存沙门氏菌的试验。

本实施例使用沙门氏菌菌株编号为ATCC 14028，购自广东环凯微生物科技。将沙门氏菌在缓冲蛋白胨水（蛋白胨10g/L、氯化钠5.0 g/L、磷酸氢二钠9.0 g/L、磷酸二氢钾1.5 g/L）中培育，得到菌体浓度为10⁹个/mL的含沙门氏菌的待保存液。将1mL含沙门氏菌的待保存液分别与1mL实施例1提供的微生物保存液1#、微生物保存液2#、微生物保存液3#复配保存，对比组采用甘油复配保存，每组试验重复5次。

复配保存方法为：将所述微生物保存液水浴加热至35-40℃，检测pH维持为7.2-7.4，加入含沙门氏菌的待保存液，采用氦气0.3-0.5MPa加压0-5℃保存12h，然后置于零下20℃保存6个月。

在室温下用稀释涂平板计数法，参照文献（叶磊、杨学敏，微生物检测技术，化学工业出版社，2009年第1版）中的方法进行，测得沙门氏菌的存活率，试验结果如表2所示。

表2，沙门氏菌保存效果

由表2可知，本发明提供的微生物保存液20℃保存沙门氏菌6个月后，其存活率最高为96.71%±1.44%，相较甘油84.16%±3.85%的存活率，本发明提供的微生物保存液表现出更加的优异的保存效果。

实施例3

本实施例提供了一种微生物保存液的保存大肠杆菌的试验。

本实施例使用大肠杆菌菌株编号为CICC 10662，购自上海沪峥生物科技有限公司。将大肠杆菌在LB培养基（胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L和氯化钠10g/L）中培育，得到菌体浓度为10⁹个/mL的含大肠杆菌的待保存液。将1mL含大肠杆菌的待保存液分别与1mL实施例1提供的微生物保存液1#、微生物保存液2#、微生物保存液3#复配保存，对比组采用甘油、未加入聚乙烯醇的微生物保存液1#、未加入聚乙烯醇的微生物保存液2#、未加入聚乙烯醇的微生物保存液3#复配保存，每组试验重复5次。

复配保存方法为：将所述微生物保存液水浴加热至35-40℃，检测pH维持为7.2-7.4，加入含大肠杆菌的待保存液，采用氦气0.3-0.5MPa加压0-5℃保存7天。

保存结束后全部分别接种到200mL LB培养基中，统计培育至10¹²个活菌所需要的培育时间，具体如表3所示。

表3，大肠杆菌培育至10¹²个活菌所需要的培育时间

由表3可知，本发明添加聚乙烯醇后，能显著缩短大肠杆菌冷冻保藏后培育至10¹²个活菌所需要的培育时间，即极大得提高了大肠杆菌冷冻保存的菌体活性。相较甘油，本发明提供的微生物保存液，能显著缩短大肠杆菌冷冻保藏后培育至10¹²个活菌所需要的培育时间，即极大得提高了大肠杆菌冷冻保存的菌体活性。

如上所述，即可较好地实现本发明，上述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种改变和改进，均应落入本发明确定的保护范围内。

Claims (6)

1.一种肠道内病原菌种保存液，其特征在于，以质量份计，由以下有效成分构成：聚乙烯醇53份、低密度脂蛋白2.6份、四氢嘧啶27份、硫乙醇酸钠0.8份和甘油100份；制备方法为：将聚乙烯醇水浴加热到60℃后，加入四氢嘧啶和硫乙醇酸钠，混合均匀后降温至35-40℃，加入低密度脂蛋白和甘油，搅拌均匀调整pH至7.2-7.4，121℃灭菌15min。

2.根据权利要求1的肠道内病原菌种保存液的使用方法，其特征在于，将所述肠道内病原菌种保存液水浴加热至35-40℃，检测pH维持为7.2-7.4，加入待保存菌种，采用惰性气体加压冷冻保存；所述惰性气体为氦气、氩气、氙气中的一种，所述惰性气体的气体浓度不低于85％。

3.根据权利要求2所述的肠道内病原菌种保存液的使用方法，其特征在于，所述惰性气体为氦气。

4.根据权利要求2所述的肠道内病原菌种保存液的使用方法，其特征在于，所述加压的压强为0.3-0.5MPa，所述冷冻保存为：先置于0-5℃保存12h，然后置于零下20℃至零下15℃保存12h，最后置于零下260℃至零下80℃保存。

5.根据权利要求1所述的肠道内病原菌种保存液在沙门氏菌或者大肠杆菌中的应用。

6.根据权利要求5所述的肠道内病原菌种保存液的应用，其特征在于，每10⁹个肠道内病原菌种，所述肠道内病原菌种保存液的使用量为1mL。