CN115466324A - 一种单克隆抗体增量的制备方法 - Google Patents

一种单克隆抗体增量的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种单克隆抗体增量的制备方法，步骤如下：S1，分别制备无血清细胞培养基、无抗体血清、营养溶液；S2，将S1制备的产物混合制得杂交瘤细胞培养基，其中无抗体血清的体积比例为1‑10％；S3，将杂交瘤细胞培养基置于容器中，其体积为容器体积的1/10；S4，将新城疫单克隆抗体或莱克多巴胺单克隆抗体接种至杂交瘤细胞培养基进行培养，每隔48h，补充1/4容积量杂交瘤细胞培养基，直至容器内的杂交瘤细胞培养基完全满，进行单克隆抗体的生产；S5，将生产的单克隆抗体用饱和硫酸铵沉淀法或层析柱法进行纯化。该发明提高了单克隆抗体的产量和生物活性，降低了生产成本。

Description

一种单克隆抗体增量的制备方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是一种单克隆抗体增量的制备方法。
背景技术
单克隆抗体具有广泛的应用，可用于疾病的诊断和治疗等。目前的单克隆抗体主要来源于腹水法或细胞培养法。而腹水法获得的产品批次件差异较大，纯化困难、价格昂贵、不利于使用，细胞培养法的细胞来源广泛，易纯化成本低，但现有方法中难于进行无血清培养，而且融合效率低下、细胞活性较差、生长速度缓慢、无法高密度培养，产量低。
发明内容
针对现有的不足，本发明提供一种单克隆抗体增量的制备方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种单克隆抗体增量的制备方法：步骤如下：
S1，分别制备无血清细胞培养基、无抗体血清、营养溶液；
S2，将S1制备的无血清细胞培养基、无抗体血清、营养溶液混合制得杂交瘤细胞培养基，其中无抗体血清的体积比例为1-10％；
S3，将杂交瘤细胞培养基置于容器中，其体积为容器体积的1/10；
S4，将新城疫单克隆抗体或莱克多巴胺单克隆抗体接种至杂交瘤细胞培养基进行培养，每隔48h，补充1/4容积量杂交瘤细胞培养基，直至容器内的杂交瘤细胞培养基完全满，进行单克隆抗体的生产；
S5，将生产的单克隆抗体用饱和硫酸铵沉淀法或层析柱法进行纯化。
作为优选，所述无血清培养基包括完全培养基和不完全培养基中的一种或两种，所述不完全培养基包括RPMI1640、DEME培养基中的一种，所述完全培养基包括HybridomaSFM培养基、CD Hybridoma培养基、NCTC-190培养基中的任意一种，所述无抗体血清是去除血清中IgG抗体后的血清。
作为优选，所述营养溶液包括表皮细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、白蛋白、水解物，所述水解物包括酵母水解物和水解植物蛋白，两者的质量比为1:1，所述表皮细胞生长因子的添加量为10-30μg/L，所述成纤维细胞生长因子的添加量为10-30μg/L，所述白蛋白的添加量为1-3g/L，所述水解物的添加量为1-3g/L。
作为优选，所述新城疫单克隆抗体或莱克多巴胺单克隆抗体是以10-1000万/ml的接种密度接种至杂交瘤细胞培养基并进行培养的。
作为优选，所述步骤S5之前还需要将生产的单克隆抗体依次通过蛋白芯片和多肽芯片进行筛选。
作为优选，所述培养条件为，培养温度35-39℃，二氧化碳的浓度为4％-10％，转速为110-260rpm。
作为优选，所述纯化采用层析柱法进行，其中亲和层析柱为Protein A或ProteinG中的任意一种。
作为优选，所述步骤S1中还添加有如下浓度的添加剂：转铁蛋白10-30mg/L、谷氨酰胺60-70g/L、油酸20-30mg/L、亚油酸5-15mg/L、钙盐100-150mg/L、锌盐20-30mg/L。
作为优选，所述添加剂按1:100的体积比加入培养基中。
作为优选，所述步骤S1中，在细胞培养过程中每隔24h添加一次如下浓度的物质：丙酮酸钠10-20g/L、葡萄糖50-100mmol/ml。
本发明的有益效果在于：该发明利用无血清培养基制成杂交瘤细胞培养基，然后利用杂交瘤细胞培养技术实现了单克隆抗体细胞的连续培养，提高了产量，有利于各种基于单克隆抗体诊断试剂或试剂盒的开发和治疗药物产量的提高，极大地节约了生产成本，降低实验动物地使用量，提高动物福利，产生巨大的社会效益和经济效益，同时产生的单克隆抗体也具有较高的生物活性，更利于使用。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明实施例的目的、技术方案和优点，下面将结合实施例对本发明作进一步说明，进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的部分实施例，而不是全部实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。此外，本发明中所提到的方向用语，例如，“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“内”、“外”等，仅是使用的方向用语是为了更好、更清楚地说明及理解本发明，而不是指示或暗指本发明必须具有的方位，因此不能理解为对本发明的限制。
本发明实施例，一种单克隆抗体增量的制备方法：一种单克隆抗体增量的制备方法：步骤如下：
S1，分别制备无血清细胞培养基、无抗体血清、营养溶液，其中无血清培养基包括完全培养基和不完全培养基中的一种或两种，所述不完全培养基包括RPMI1640、DEME培养基中的一种，所述完全培养基包括Hybridoma SFM培养基、CD Hybridoma培养基、NCTC-190培养基中的任意一种，所述无抗体血清是去除血清中IgG抗体后的血清，选择常用的牛血清来制备；所述营养溶液包括表皮细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、白蛋白、水解物，所述水解物包括酵母水解物和水解植物蛋白，两者的质量比为1:1，所述表皮细胞生长因子的添加量为10-30μg/L，所述成纤维细胞生长因子的添加量为10-30μg/L，所述白蛋白的添加量为1-3g/L，所述水解物的添加量为1-3g/L，这样的范围就更利益提高杂交瘤细胞的细胞量以及单克隆抗体的表达量，在实施例中选择表皮细胞生长因子的添加量为10μg/L、成纤维细胞生长因子的添加量为10μg/L、白蛋白的添加量为2g/L、水解物的添加量为1g/L；
S2，将S1制备的无血清细胞培养基、无抗体血清、营养溶液混合制得杂交瘤细胞培养基，其中无抗体血清的体积比例为1-10％，就实现了杂交瘤细胞培养基在培养杂交瘤细胞时免训话流程，提高了细胞的培养效率，减少由于添加高比例血清对于工艺稳定性的影响，避免了外源抗体的干扰，培养方法简单，有效，细胞培养效果好，抗体表达量高；
S3，将杂交瘤细胞培养基置于容器中，其体积为容器体积的1/10，就便于后续的补液；
S4，将新城疫单克隆抗体或莱克多巴胺单克隆抗体接种至杂交瘤细胞培养基进行培养，每隔48h，补充1/4容积量杂交瘤细胞培养基，直至容器内的杂交瘤细胞培养基完全满，进行单克隆抗体的生产；所述新城疫单克隆抗体或莱克多巴胺单克隆抗体是以10-1000万/ml的接种密度接种至杂交瘤细胞培养基并进行培养的；所述培养条件为，培养温度35-39℃，二氧化碳的浓度为4％-10％，转速为110-260rpm；
S5，将生产的单克隆抗体用饱和硫酸铵沉淀法或层析柱法进行纯化，所述纯化采用层析柱法进行，其中亲和层析柱为Protein A或Protein G中的任意一种,通过纯化就提高单克隆抗体的抗体量，比常规方法抗体量高25倍。
进一步的改进，所述步骤S5之前还需要将生产的单克隆抗体依次通过蛋白芯片和多肽芯片进行筛选，蛋白芯片和多肽芯片就通过抗体抗原特异性结合的原理对相应的样品进行检测、筛选和鉴定，进而制备出针对不同抗原和/或不同抗原表位的抗体。
进一步的改进，所述步骤S1中还添加有如下浓度的添加剂：转铁蛋白10-30mg/L、谷氨酰胺60-70g/L、油酸20-30mg/L、亚油酸5-15mg/L、钙盐100-150mg/L、锌盐20-30mg/L，其中谷氨酰胺为L-谷氨酰胺或其衍生物，钙盐为氯化钙、碳酸氢钙或葡糖糖酸钙，锌盐为氯化锌或硫酸锌，各组分所添加的浓度为转铁蛋白15mg/L、谷氨酰胺60g/L、油酸25mg/L、亚油酸5mg/L、钙盐110mg/L、锌盐20mg/L，将添加剂配合好后然后依据所选择的培养基的体积，按照添加剂对培养基1:100的体积比加入培养基中进行培养。其中的转铁蛋白能够通过与转铁蛋白受体相互作用，从而与三价铁离子可逆性结合，调节铁离子转运和代谢，维持细胞内的铁平衡，进而维持细胞的生长和增殖，起到一种生长因子的功能，同时其还是一种重要的胞外抗氧化剂，可避免细胞外环境中自由基的产生，防止细胞受到伤害；钙和锌则提供细胞分裂增殖所需的微量元素，从而调高细胞增殖效率，进而提高细胞克隆成功率。
进一步的改进，所述步骤S1中，在细胞培养过程中每隔24h添加一次如下浓度的物质：丙酮酸钠10-20g/L、葡萄糖50-100mmol/ml，丙酮酸钠和葡萄糖的浓度分别为10g/L、葡萄糖60mmol/ml，它们作为细胞代谢所需的能量物质，在细胞的三羧酸循环中，有助于提高细胞的代谢效率从而提高细胞的活性，同时由于谷氨酰胺在培养基保存过程中会逐步降解，添加的丙酮酸钠就有助于培养基营养环境的稳定，提高增殖能力。
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (10)

1.一种单克隆抗体增量的制备方法，其特征在于：步骤如下：
S1，分别制备无血清细胞培养基、无抗体血清、营养溶液；
S2，将S1制备的无血清细胞培养基、无抗体血清、营养溶液混合制得杂交瘤细胞培养基，其中无抗体血清的体积比例为1-10％；
S3，将杂交瘤细胞培养基置于容器中，其体积为容器体积的1/10；
S4，将新城疫单克隆抗体或莱克多巴胺单克隆抗体接种至杂交瘤细胞培养基进行培养，每隔48h，补充1/4容积量杂交瘤细胞培养基，直至容器内的杂交瘤细胞培养基完全满，进行单克隆抗体的生产；
S5，将生产的单克隆抗体用饱和硫酸铵沉淀法或层析柱法进行纯化。
2.根据权利要求1所述单克隆抗体增量的制备方法，其特征在于:所述无血清培养基包括完全培养基和不完全培养基中的一种或两种，所述不完全培养基包括RPMI1640、DEME培养基中的一种，所述完全培养基包括Hybridoma SFM培养基、CD Hybridoma培养基、NCTC-190培养基中的任意一种，所述无抗体血清是去除血清中IgG抗体后的血清。
3.根据权利要求1所述单克隆抗体增量的制备方法，其特征在于:所述营养溶液包括表皮细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、白蛋白、水解物，所述水解物包括酵母水解物和水解植物蛋白，两者的质量比为1:1，所述表皮细胞生长因子的添加量为10-30μg/L，所述成纤维细胞生长因子的添加量为10-30μg/L，所述白蛋白的添加量为1-3g/L，所述水解物的添加量为1-3g/L。
4.根据权利要求1所述单克隆抗体增量的制备方法，其特征在于:所述新城疫单克隆抗体或莱克多巴胺单克隆抗体是以10-1000万/ml的接种密度接种至杂交瘤细胞培养基并进行培养的。
5.根据权利要求1所述单克隆抗体增量的制备方法，其特征在于:所述步骤S5之前还需要将生产的单克隆抗体依次通过蛋白芯片和多肽芯片进行筛选。
6.根据权利要求1所述单克隆抗体增量的制备方法，其特征在于:所述培养条件为，培养温度35-39℃，二氧化碳的浓度为4％-10％，转速为110-260rpm。
7.根据权利要求1所述单克隆抗体增量的制备方法，其特征在于:所述纯化采用层析柱法进行，其中亲和层析柱为Protein A或Protein G中的任意一种。
8.根据权利要求1所述单克隆抗体增量的制备方法，其特征在于:所述步骤S1中还添加有如下浓度的添加剂：转铁蛋白10-30mg/L、谷氨酰胺60-70g/L、油酸20-30mg/L、亚油酸5-15mg/L、钙盐100-150mg/L、锌盐20-30mg/L。
9.根据权利要求8所述单克隆抗体增量的制备方法，其特征在于:所述添加剂按1:100的体积比加入培养基中。
10.根据权利要求8所述单克隆抗体增量的制备方法，其特征在于:所述步骤S1中，在细胞培养过程中每隔24h添加一次如下浓度的物质：丙酮酸钠10-20g/L、葡萄糖50-100mmol/ml。
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