JPH0723780A - 有用物質生産用合成培地 - Google Patents
有用物質生産用合成培地Info
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- JPH0723780A JPH0723780A JP5171420A JP17142093A JPH0723780A JP H0723780 A JPH0723780 A JP H0723780A JP 5171420 A JP5171420 A JP 5171420A JP 17142093 A JP17142093 A JP 17142093A JP H0723780 A JPH0723780 A JP H0723780A
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- medium
- cells
- glycylglycine
- synthetic medium
- serum
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 有用物質生産のための動物細胞の高密度培養
用の完全無蛋白培地を提供する。 【構成】市販培地を基礎培地とし、これにグリシルグリ
シンを１乃至１００ｍＭ添加して有用物質生産動物細胞
を培養する。 【効果】 本発明の培地で培養することにより、インス
リン、アルブミン、トランスフェリン等の蛋白質成分を
含む無血清培地に比べて同等の有用物質生産が可能とな
る。
用の完全無蛋白培地を提供する。 【構成】市販培地を基礎培地とし、これにグリシルグリ
シンを１乃至１００ｍＭ添加して有用物質生産動物細胞
を培養する。 【効果】 本発明の培地で培養することにより、インス
リン、アルブミン、トランスフェリン等の蛋白質成分を
含む無血清培地に比べて同等の有用物質生産が可能とな
る。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は動物細胞の高密度培養用
の合成培地に関し、さらに詳しくは該細胞に高濃度に有
用物質を生産させるための有用物質生産用完全無蛋白合
成培地に関する。
の合成培地に関し、さらに詳しくは該細胞に高濃度に有
用物質を生産させるための有用物質生産用完全無蛋白合
成培地に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来、動物細胞の培養にはアミノ酸やビ
タミン、無機塩などを含んだ等張緩衝液例えばＲＰＭＩ
１６４０、イーグルＭＥＭ、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２などの
合成基礎培地に１０〜２０％程度のウシ胎児血清（ＦＣ
Ｓ）などの動物血清を添加した培養液が一般に用いられ
る。これらの血清含有培養液で動物細胞を培養し、有用
物質を生産させる研究が数多く行われてきた。
タミン、無機塩などを含んだ等張緩衝液例えばＲＰＭＩ
１６４０、イーグルＭＥＭ、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２などの
合成基礎培地に１０〜２０％程度のウシ胎児血清（ＦＣ
Ｓ）などの動物血清を添加した培養液が一般に用いられ
る。これらの血清含有培養液で動物細胞を培養し、有用
物質を生産させる研究が数多く行われてきた。
【０００３】しかし、動物細胞を用いて有用物質を生産
させるに際して、培地に血清を加えることは培地コスト
の上昇を招き、また血清由来の蛋白質を含む培養液から
目的とする有用物質を単離することが困難になるなどの
欠点がある。また多くの場合、血清にはロット間に品質
の不均一性が見られる。そこで血清の使用に先立ってロ
ットチェックを十分に行い、使用可能な血清を選択する
必要があるが、この血清の選択には多くの労力を要す
る。この様な理由のため、従来より血清を全く含まない
培地（無血清培地）の開発が行われてきた。しかし、従
来の無血清培地（イーグルＭＥＭ、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１
２、ＲＰＭＩ１６４０などを単独であるいはその混合物
を基本培地とするもの）の多くは、有用物質生産細胞を
培養する場合にも、該細胞が比較的低密度の状態から産
生物質の蓄積濃度の高い高密度の状態へ増殖する能力を
指標として開発されてきたため、血清中に含まれる増殖
因子であるインスリンや各種のｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔ
ｏｒ類、鉄の供給因子であるトランスフェリン、さらに
はアルブミンなどの蛋白質類もしくは脂質の添加を必要
としていた（特開昭61-25480号公報、特開昭64-34282号
公報、特開平3-201980号公報）。しかし、これら蛋白質
類や脂質添加物のコストが培地全体のコストに占める割
合は依然高い。また、培養液から有用物質を回収する場
合は、細胞の増殖のために培地に添加された蛋白質を有
用物質の精製工程において除去する必要がある。そこ
で、以上のような問題点を解決するために完全無蛋白培
地の開発が望まれてきた。
させるに際して、培地に血清を加えることは培地コスト
の上昇を招き、また血清由来の蛋白質を含む培養液から
目的とする有用物質を単離することが困難になるなどの
欠点がある。また多くの場合、血清にはロット間に品質
の不均一性が見られる。そこで血清の使用に先立ってロ
ットチェックを十分に行い、使用可能な血清を選択する
必要があるが、この血清の選択には多くの労力を要す
る。この様な理由のため、従来より血清を全く含まない
培地（無血清培地）の開発が行われてきた。しかし、従
来の無血清培地（イーグルＭＥＭ、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１
２、ＲＰＭＩ１６４０などを単独であるいはその混合物
を基本培地とするもの）の多くは、有用物質生産細胞を
培養する場合にも、該細胞が比較的低密度の状態から産
生物質の蓄積濃度の高い高密度の状態へ増殖する能力を
指標として開発されてきたため、血清中に含まれる増殖
因子であるインスリンや各種のｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔ
ｏｒ類、鉄の供給因子であるトランスフェリン、さらに
はアルブミンなどの蛋白質類もしくは脂質の添加を必要
としていた（特開昭61-25480号公報、特開昭64-34282号
公報、特開平3-201980号公報）。しかし、これら蛋白質
類や脂質添加物のコストが培地全体のコストに占める割
合は依然高い。また、培養液から有用物質を回収する場
合は、細胞の増殖のために培地に添加された蛋白質を有
用物質の精製工程において除去する必要がある。そこ
で、以上のような問題点を解決するために完全無蛋白培
地の開発が望まれてきた。
【０００４】
【発明が解決しようとする問題点】本発明の目的は有用
物質生産のための動物細胞培養用の蛋白成分を全く含有
せず、グリシルグリシンを含有する完全無蛋白培地を提
供することにある。
物質生産のための動物細胞培養用の蛋白成分を全く含有
せず、グリシルグリシンを含有する完全無蛋白培地を提
供することにある。
【０００５】
【問題点を解決する手段】かかる状況のもと、本発明者
らは従来の動物細胞培養用無血清培地がインスリン、ト
ランスフェリン、もしくはアルブミンといった蛋白質成
分を含有していることに着目し、従来の無血清培地にお
いて検討されてきたような細胞の増殖性に代わって、長
期間にわたる生産条件下（高細胞密度条件：１×１０6
／ｍｌ以上）での細胞の有用物質生産能力と細胞数維持
能力及び細胞の生存率を指標とし、蛋白質成分を全く含
まない培地の検討を行った。その結果、高細胞密度条件
下では鉄キレート剤としてグリシルグリシンがトランス
フェリンの代用となること、そしてその際に細胞の増殖
効果を示すインスリンの添加は基本的に必要でないこと
を新たに見いだし、これをもとに高密度培養における有
用物質生産用の完全無蛋白合成培地を完成するに至っ
た。
らは従来の動物細胞培養用無血清培地がインスリン、ト
ランスフェリン、もしくはアルブミンといった蛋白質成
分を含有していることに着目し、従来の無血清培地にお
いて検討されてきたような細胞の増殖性に代わって、長
期間にわたる生産条件下（高細胞密度条件：１×１０6
／ｍｌ以上）での細胞の有用物質生産能力と細胞数維持
能力及び細胞の生存率を指標とし、蛋白質成分を全く含
まない培地の検討を行った。その結果、高細胞密度条件
下では鉄キレート剤としてグリシルグリシンがトランス
フェリンの代用となること、そしてその際に細胞の増殖
効果を示すインスリンの添加は基本的に必要でないこと
を新たに見いだし、これをもとに高密度培養における有
用物質生産用の完全無蛋白合成培地を完成するに至っ
た。
【０００６】すなわち、本発明は有用物質生産を目的と
した動物細胞の高密度培養に用いる、増殖因子である蛋
白質を全く含有せず、グリシルグリシンを含有している
ことを特徴とする有用物質生産用合成培地に関する。
した動物細胞の高密度培養に用いる、増殖因子である蛋
白質を全く含有せず、グリシルグリシンを含有している
ことを特徴とする有用物質生産用合成培地に関する。
【０００７】本発明の培地に使用される基礎培地として
は一般に市販されているもの、例えば、イーグルＭＥＭ
培地、Ｈａｍ’ｓ Ｆ−１２培地、ダルベッコ変法イー
グル培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地等を用いることもで
き、これら市販培地を単独または２種以上の組合せを任
意の割合で調合しても使用できる。本発明においては上
記基礎培地にグリシルグリシンを添加する。グリシルグ
リシンの添加量は１〜１００ｍＭ、好ましくは２〜３０
ｍＭ、より好ましくは５〜１５ｍＭ程度が適当である
が、過剰のグリシルグリシンの添加は培地全体の浸透圧
の上昇を招くため好ましくない。グリシルグリシン以外
の培地構成成分としては通常の細胞培養に必要と考えら
れる有効成分の添加が必要である。すなわち、基本的な
栄養源として必須アミノ酸成分、無機塩、糖などを含む
基礎培地に必要があればピルビン酸ナトリウム及び、塩
酸プトレッシン、ヒポキサンチン、チミジン、エタノー
ルアミン等のビタミン類や亜セレン酸、酢酸亜鉛、硫酸
銅等の金属成分を添加してもよい。本発明の培地を用い
た有用物質生産細胞の培養は、通常の動物細胞培養条件
下で行うことによって良好な結果が得られる。細胞の生
存率は従来のトランスフェリン、インスリン等の蛋白質
成分を含む無血清培地を用いて細胞培養した場合と比較
して同等であり、また目的の有用物質生産においてを何
等問題はない。本発明の培地はヒト由来の細胞、例え
ば、ヒト末梢血リンパ球をＥＢウイルス等でトランスフ
ォームされた形質転換細胞（ＲＡＪＩ細胞）やミエロー
マ細胞との融合細胞（ハイブリドーマ）の培養に対して
有用であり、特にモノクローナル抗体を産生する細胞の
培養に有用であるが、ヒト以外の動物細胞でも使用でき
る。また、本発明の培地は上記記載のような浮遊性細胞
に有用であるが、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞等の接着依存
性細胞でも使用できる。培養液からの有用物質の精製法
としてはイオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロ
マトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、逆相クロ
マトグラフィー等の各種液体クロマトグラフィー、硫安
分画、限外ろ過膜及び各種電気泳動を単独或いは適宜組
み合わせて使用できる。以下、本発明を実施例に基づい
て説明する。
は一般に市販されているもの、例えば、イーグルＭＥＭ
培地、Ｈａｍ’ｓ Ｆ−１２培地、ダルベッコ変法イー
グル培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地等を用いることもで
き、これら市販培地を単独または２種以上の組合せを任
意の割合で調合しても使用できる。本発明においては上
記基礎培地にグリシルグリシンを添加する。グリシルグ
リシンの添加量は１〜１００ｍＭ、好ましくは２〜３０
ｍＭ、より好ましくは５〜１５ｍＭ程度が適当である
が、過剰のグリシルグリシンの添加は培地全体の浸透圧
の上昇を招くため好ましくない。グリシルグリシン以外
の培地構成成分としては通常の細胞培養に必要と考えら
れる有効成分の添加が必要である。すなわち、基本的な
栄養源として必須アミノ酸成分、無機塩、糖などを含む
基礎培地に必要があればピルビン酸ナトリウム及び、塩
酸プトレッシン、ヒポキサンチン、チミジン、エタノー
ルアミン等のビタミン類や亜セレン酸、酢酸亜鉛、硫酸
銅等の金属成分を添加してもよい。本発明の培地を用い
た有用物質生産細胞の培養は、通常の動物細胞培養条件
下で行うことによって良好な結果が得られる。細胞の生
存率は従来のトランスフェリン、インスリン等の蛋白質
成分を含む無血清培地を用いて細胞培養した場合と比較
して同等であり、また目的の有用物質生産においてを何
等問題はない。本発明の培地はヒト由来の細胞、例え
ば、ヒト末梢血リンパ球をＥＢウイルス等でトランスフ
ォームされた形質転換細胞（ＲＡＪＩ細胞）やミエロー
マ細胞との融合細胞（ハイブリドーマ）の培養に対して
有用であり、特にモノクローナル抗体を産生する細胞の
培養に有用であるが、ヒト以外の動物細胞でも使用でき
る。また、本発明の培地は上記記載のような浮遊性細胞
に有用であるが、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞等の接着依存
性細胞でも使用できる。培養液からの有用物質の精製法
としてはイオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロ
マトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、逆相クロ
マトグラフィー等の各種液体クロマトグラフィー、硫安
分画、限外ろ過膜及び各種電気泳動を単独或いは適宜組
み合わせて使用できる。以下、本発明を実施例に基づい
て説明する。
【０００８】
実施例１ イーグルＭＥＭ培地とＲＰＭＩ１６４０培地とを混合
し、これに添加物としてピルビン酸ナトリウム、塩酸プ
トレッシン、ヒポキサンチン、チミジン、エタノールア
ミン、シアノコバラミン、亜セレン酸、酢酸亜鉛、硫酸
銅などと共に１３．５ｍＭになるようにグリシルグリシ
ンを加えて無蛋白培地を調製した。抗緑膿菌（Ｅ、Ｆ
型）ヒト型ＩｇＭ抗体産生ＥＢＶ形質転換細胞・ＭＰ５
０３８（微工研寄託番号ＢＰ−１５９６）及び抗緑膿菌
（Ｉ、Ｄ型）ＩｇＭ抗体産生ヒト×ヒトハイブリドーマ
・ＭＰ５１５６（微工研寄託番号ＢＰ−２３３９）を上
記無蛋白培地と上記培地にグリシルグリシンの代わりに
インスリンを１０ｍｇ／ｌとトランスフェリンを１０ｍ
ｇ／ｌ添加した培地（無血清培地）及び無蛋白培地から
グリシルグリシンを除いた培地（グリシルグリシン非添
加無蛋白培地）とにそれぞれ１×１０6／ｍｌになるよ
うに播種した。そして、５％炭酸ガス、３７℃下で２４
時間培養し、それぞれの細胞の２４時間後の抗体産生量
を比較した。培養後、培養液を１０００ＲＰＭで１０分
間遠心して細胞を除去し、培養上清を分離した。上清中
の抗体（ＩｇＭ）量の測定は９６ウェルプレートを用い
た酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）で行った。ＥＬＩＳ
Ａ法は次のようにして行った。予め、９６ウェルプレー
トに０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）で１００倍に希
釈した抗ヒトＩｇＭヤギ抗体（Ｔａｇｏ．４１０２）を
４℃で１晩吸着させ、コーティング操作を行った。翌
日、非特異的吸着を防ぐ目的で０．５％（Ｗ／Ｖ）ウシ
血清アルブミンを含むリン酸緩衝生理食塩水 ｐＨ７．
４（以下ＰＢＳと略記する）でブロッキング操作を行っ
たのち、培養上清を上記ブロッキング液で希釈したもの
を添加して室温で２時間反応させた。更に、ブロッキン
グ液で５００倍に希釈したアルカリフォスファターゼ標
識抗ヒトＩｇＭヤギ抗体（Ｔａｇｏ．２４９２）を添加
して２時間反応させた。０．６ｍｇ／ｍＬのｐ−ニトロ
フェニルリン酸（ＳＩＧＭＡ社製）溶液を添加して発色
させ、３０分後、３規定ＮａＯＨを加えることにより酵
素反応を停止させた。上清中の抗体濃度の測定は４０５
ｎｍにおける吸収をＥＬＩＳＡ ＲＥＡＤＥＲ（ＩＮＴ
ＥＲ ＭＥＤ：ＩｍｍｕｎｏＲｅａｄｅｒ ＮＪ−２０
０１）を用いて読み取った。結果を表１（表１）に示し
た。無蛋白培地で培養した場合のＭＰ５０３８及びＭＰ
５１５６細胞の抗体生産性は無血清培地における培養に
比べて同等であった。また、グリシルグリシン非添加無
蛋白培地で培養した細胞は生存率を維持することが出来
ず、死滅した。
し、これに添加物としてピルビン酸ナトリウム、塩酸プ
トレッシン、ヒポキサンチン、チミジン、エタノールア
ミン、シアノコバラミン、亜セレン酸、酢酸亜鉛、硫酸
銅などと共に１３．５ｍＭになるようにグリシルグリシ
ンを加えて無蛋白培地を調製した。抗緑膿菌（Ｅ、Ｆ
型）ヒト型ＩｇＭ抗体産生ＥＢＶ形質転換細胞・ＭＰ５
０３８（微工研寄託番号ＢＰ−１５９６）及び抗緑膿菌
（Ｉ、Ｄ型）ＩｇＭ抗体産生ヒト×ヒトハイブリドーマ
・ＭＰ５１５６（微工研寄託番号ＢＰ−２３３９）を上
記無蛋白培地と上記培地にグリシルグリシンの代わりに
インスリンを１０ｍｇ／ｌとトランスフェリンを１０ｍ
ｇ／ｌ添加した培地（無血清培地）及び無蛋白培地から
グリシルグリシンを除いた培地（グリシルグリシン非添
加無蛋白培地）とにそれぞれ１×１０6／ｍｌになるよ
うに播種した。そして、５％炭酸ガス、３７℃下で２４
時間培養し、それぞれの細胞の２４時間後の抗体産生量
を比較した。培養後、培養液を１０００ＲＰＭで１０分
間遠心して細胞を除去し、培養上清を分離した。上清中
の抗体（ＩｇＭ）量の測定は９６ウェルプレートを用い
た酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）で行った。ＥＬＩＳ
Ａ法は次のようにして行った。予め、９６ウェルプレー
トに０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）で１００倍に希
釈した抗ヒトＩｇＭヤギ抗体（Ｔａｇｏ．４１０２）を
４℃で１晩吸着させ、コーティング操作を行った。翌
日、非特異的吸着を防ぐ目的で０．５％（Ｗ／Ｖ）ウシ
血清アルブミンを含むリン酸緩衝生理食塩水 ｐＨ７．
４（以下ＰＢＳと略記する）でブロッキング操作を行っ
たのち、培養上清を上記ブロッキング液で希釈したもの
を添加して室温で２時間反応させた。更に、ブロッキン
グ液で５００倍に希釈したアルカリフォスファターゼ標
識抗ヒトＩｇＭヤギ抗体（Ｔａｇｏ．２４９２）を添加
して２時間反応させた。０．６ｍｇ／ｍＬのｐ−ニトロ
フェニルリン酸（ＳＩＧＭＡ社製）溶液を添加して発色
させ、３０分後、３規定ＮａＯＨを加えることにより酵
素反応を停止させた。上清中の抗体濃度の測定は４０５
ｎｍにおける吸収をＥＬＩＳＡ ＲＥＡＤＥＲ（ＩＮＴ
ＥＲ ＭＥＤ：ＩｍｍｕｎｏＲｅａｄｅｒ ＮＪ−２０
０１）を用いて読み取った。結果を表１（表１）に示し
た。無蛋白培地で培養した場合のＭＰ５０３８及びＭＰ
５１５６細胞の抗体生産性は無血清培地における培養に
比べて同等であった。また、グリシルグリシン非添加無
蛋白培地で培養した細胞は生存率を維持することが出来
ず、死滅した。
【０００９】
【表１】
【００１０】実施例２ 抗緑膿菌（共通抗原）ＩｇＧ２ａ抗体を産生するマウス
ハイブリドーマ・ＭＰ５００５（ＩＦＯ寄託番号５００
９７）を実施例１に記載の無蛋白培地と無血清培地とで
培養し、２４時間後の抗体産生量を測定した。ＥＬＩＳ
Ａ法は抗ヒトＩｇＭヤギ抗体の代わりに抗マウスＩｇＧ
ヤギ抗体（Ｔａｇｏ．４１４０）を、アルカリフォスフ
ァターゼ標識抗ヒトＩｇＭヤギ抗体の代わりにはアルカ
リフォスファターゼ標識抗マウスＩｇＧヤギ抗体（Ｔａ
ｇｏ．６５４０）を使用した以外は実施例１と同様の方
法で行った。結果を表２（表２）に示した。本発明の無
蛋白培地で培養したＭＰ５００５細胞は無血清培地に比
べて、同等の生産性を示した。
ハイブリドーマ・ＭＰ５００５（ＩＦＯ寄託番号５００
９７）を実施例１に記載の無蛋白培地と無血清培地とで
培養し、２４時間後の抗体産生量を測定した。ＥＬＩＳ
Ａ法は抗ヒトＩｇＭヤギ抗体の代わりに抗マウスＩｇＧ
ヤギ抗体（Ｔａｇｏ．４１４０）を、アルカリフォスフ
ァターゼ標識抗ヒトＩｇＭヤギ抗体の代わりにはアルカ
リフォスファターゼ標識抗マウスＩｇＧヤギ抗体（Ｔａ
ｇｏ．６５４０）を使用した以外は実施例１と同様の方
法で行った。結果を表２（表２）に示した。本発明の無
蛋白培地で培養したＭＰ５００５細胞は無血清培地に比
べて、同等の生産性を示した。
【００１１】
【表２】
【００１２】実施例３ 実施例２と同様の培地を用い、これに形質転換細胞・Ｍ
Ｐ５０３８及びハイブリドーマ細胞・ＭＰ５１４６をそ
れぞれ１×１０6／ｍｌになるように播種し、実施例１
と同様の条件で培養を行った。２４時間培養毎に細胞と
培養液を遠心により分離し、回収された細胞は始めと等
量の新鮮培地に再び播種しなおしてから培養を続け、回
収培養液はＥＬＩＳＡ法による測定まで−２０℃で凍結
保存した。この操作を１８日間繰り返した。ＥＬＩＳＡ
法による抗体の測定は実施例１と同様に行った。結果を
図１（図１）及び図２（図２）に示した。無蛋白培地で
培養したＭＰ５０３８及びＭＰ５１５６細胞は１８日間
の培養期間中に亘り無血清培地に比べて、同等の抗体生
産性を示した。
Ｐ５０３８及びハイブリドーマ細胞・ＭＰ５１４６をそ
れぞれ１×１０6／ｍｌになるように播種し、実施例１
と同様の条件で培養を行った。２４時間培養毎に細胞と
培養液を遠心により分離し、回収された細胞は始めと等
量の新鮮培地に再び播種しなおしてから培養を続け、回
収培養液はＥＬＩＳＡ法による測定まで−２０℃で凍結
保存した。この操作を１８日間繰り返した。ＥＬＩＳＡ
法による抗体の測定は実施例１と同様に行った。結果を
図１（図１）及び図２（図２）に示した。無蛋白培地で
培養したＭＰ５０３８及びＭＰ５１５６細胞は１８日間
の培養期間中に亘り無血清培地に比べて、同等の抗体生
産性を示した。
【００１３】実施例４ イーグルＭＥＭ培地とＲＰＭＩ１６４０培地とを混合
し、これに添加物としてピルビン酸ナトリウム、塩酸プ
トレッシン、ヒポキサンチン、チミジン、エタノールア
ミン、シアノコバラミン、亜セレン酸、酢酸亜鉛、硫酸
銅等とともに８．５ｍＭになるようにグリシルグリシン
を加えて培地を調製した。この培地に更に５％ＦＣＳを
加えた培地を１ｌスピナーフラスコ（Ｂｅｌｌｃｏ Ｂ
ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ＵＳＡ）に加え、更に３ｇ
／ｌの濃度でマイクロキャリアＣｙｔｏｄｅｘ−１（Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ：Ｓｗｅｄｅｎ）を懸濁した。付着性
細胞であり、組織プラスミノーゲン活性化因子（以降ｔ
−ＰＡと略す）を生産する組換えＣＨＯ細胞・ＳＶ−２
１−Ｍ２．５Ｋ７株細胞（特開平２−１２６９７８号公
報、第５表参照）を１×１０5／ｍｌの密度になるよう
に播種し以下に示す通りに培養した。即ち、８×１０5
〜１×１０6／ｍｌの細胞密度になるまで数日間、３７
℃でマイクロキャリア上に細胞を増殖させた。細胞が増
殖したところでマイクロキャリアを沈降させ、培養上清
を除いた後、１０ｍＭのｐ−アミノメチル安息香酸を含
む本培地を加え４８時間培養した。その後、マイクロキ
ャリアを沈降させて培養上清を回収した。細胞が付着し
たマイクロキャリアを等量の新鮮培地に懸濁して、再度
４８時間培養した。このような回収操作を更に４回繰り
返した。回収した培養液中の１本鎖ｔ−ＰＡはＥＬＩＳ
Ａ法で測定した。ＥＬＩＳＡ法の方法は概ね実施例１と
同様に行ったが、コーティングには１本鎖ｔ−ＰＡに対
するモノクローナル抗体ＰＡＭ１（ＢｉｏｐｏｏｌＡ
Ｂ：Ｓｗｅｄｅｎ）を使用した。ｔ−ＰＡスタンダード
と培養上清サンプルを反応させた後、抗ｔ−ＰＡウサギ
ＩｇＧ抗体を２次抗体とし、更に標識抗体としてアルカ
リフォスファターゼ標識抗ウサギＩｇＧヤギ抗体を反応
させた。スタンダードのｔ−ＰＡを用いた検量線をもと
にして培養上清中のＰＡＭ１に反応した１本鎖ｔ−ＰＡ
量を求めた。結果を表３（表３）に示す。
し、これに添加物としてピルビン酸ナトリウム、塩酸プ
トレッシン、ヒポキサンチン、チミジン、エタノールア
ミン、シアノコバラミン、亜セレン酸、酢酸亜鉛、硫酸
銅等とともに８．５ｍＭになるようにグリシルグリシン
を加えて培地を調製した。この培地に更に５％ＦＣＳを
加えた培地を１ｌスピナーフラスコ（Ｂｅｌｌｃｏ Ｂ
ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ＵＳＡ）に加え、更に３ｇ
／ｌの濃度でマイクロキャリアＣｙｔｏｄｅｘ−１（Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ：Ｓｗｅｄｅｎ）を懸濁した。付着性
細胞であり、組織プラスミノーゲン活性化因子（以降ｔ
−ＰＡと略す）を生産する組換えＣＨＯ細胞・ＳＶ−２
１−Ｍ２．５Ｋ７株細胞（特開平２−１２６９７８号公
報、第５表参照）を１×１０5／ｍｌの密度になるよう
に播種し以下に示す通りに培養した。即ち、８×１０5
〜１×１０6／ｍｌの細胞密度になるまで数日間、３７
℃でマイクロキャリア上に細胞を増殖させた。細胞が増
殖したところでマイクロキャリアを沈降させ、培養上清
を除いた後、１０ｍＭのｐ−アミノメチル安息香酸を含
む本培地を加え４８時間培養した。その後、マイクロキ
ャリアを沈降させて培養上清を回収した。細胞が付着し
たマイクロキャリアを等量の新鮮培地に懸濁して、再度
４８時間培養した。このような回収操作を更に４回繰り
返した。回収した培養液中の１本鎖ｔ−ＰＡはＥＬＩＳ
Ａ法で測定した。ＥＬＩＳＡ法の方法は概ね実施例１と
同様に行ったが、コーティングには１本鎖ｔ−ＰＡに対
するモノクローナル抗体ＰＡＭ１（ＢｉｏｐｏｏｌＡ
Ｂ：Ｓｗｅｄｅｎ）を使用した。ｔ−ＰＡスタンダード
と培養上清サンプルを反応させた後、抗ｔ−ＰＡウサギ
ＩｇＧ抗体を２次抗体とし、更に標識抗体としてアルカ
リフォスファターゼ標識抗ウサギＩｇＧヤギ抗体を反応
させた。スタンダードのｔ−ＰＡを用いた検量線をもと
にして培養上清中のＰＡＭ１に反応した１本鎖ｔ−ＰＡ
量を求めた。結果を表３（表３）に示す。
【００１４】
【表３】 本培地で培養したＳＶ−２１−Ｍ２．５Ｋ７株は、高濃
度のｔ−ＰＡの生産性を維持した。
度のｔ−ＰＡの生産性を維持した。
【００１５】
【発明の効果】本発明によれば、ジペプチドといった低
分子化合物であるグリシルグリシンを添加することによ
って、従来の無血清培地で用いられていたトランスフェ
リン、インスリン、アルブミンなどの蛋白質成分を添加
することなしに動物細胞に有用物質を生産させることが
できる。
分子化合物であるグリシルグリシンを添加することによ
って、従来の無血清培地で用いられていたトランスフェ
リン、インスリン、アルブミンなどの蛋白質成分を添加
することなしに動物細胞に有用物質を生産させることが
できる。
【図１】ＭＰ５１５６の血清無添加培地及び１０％血清
添加培地における抗体生産量の経時的変化を示す。
添加培地における抗体生産量の経時的変化を示す。
【図２】ＭＰ５０３８の血清無添加培地及び１０％血清
添加培地における抗体生産量の経時的変化を示す。
添加培地における抗体生産量の経時的変化を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 池田 一郎 千葉県茂原市東郷1144番地 三井東圧化学 株式会社内 (72)発明者 林 智子 千葉県茂原市東郷1144番地 三井東圧化学 株式会社内
Claims (6)
- 【請求項１】 動物細胞の高密度培養に用いる、増殖因
子である蛋白質を全く含有せず、グリシルグリシンを含
有していることを特徴とする有用物質生産用合成培地。 - 【請求項２】 グリシルグリシンの含有量が１〜１００
ｍＭである請求項１記載の有用物質生産用合成培地。 - 【請求項３】 蛋白質がインスリン、トランスフェリン
或いはアルブミンである請求項１記載の有用物質生産用
合成培地。 - 【請求項４】 動物細胞がヒト由来の細胞である請求項
１記載の有用物質生産用合成培地 - 【請求項５】 ヒト由来細胞がＥＢウィルスによる形質
転換細胞あるいはハイブリドーマ細胞である請求項４記
載の有用物質生産用合成培地 - 【請求項６】 有用物質が抗体である請求項１記載の物
質生産用合成培地。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5171420A JPH0723780A (ja) | 1993-07-12 | 1993-07-12 | 有用物質生産用合成培地 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5171420A JPH0723780A (ja) | 1993-07-12 | 1993-07-12 | 有用物質生産用合成培地 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0723780A true JPH0723780A (ja) | 1995-01-27 |
Family
ID=15922808
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5171420A Pending JPH0723780A (ja) | 1993-07-12 | 1993-07-12 | 有用物質生産用合成培地 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0723780A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002529072A (ja) * | 1998-11-06 | 2002-09-10 | スターンベルド バイオテクノロジー ノース アメリカ， インコーポレイテッド | 組換えヒトエリスロポイエチンを産生する細胞の大量培養のための方法 |
| US6528286B1 (en) | 1998-05-29 | 2003-03-04 | Genentech, Inc. | Mammalian cell culture process for producing glycoproteins |
| US20100256234A1 (en) * | 2007-10-10 | 2010-10-07 | Maco Pharma | Method for Stimulating the Proliferation of Differentiated Cells Belonging to the Chondrogenic Lineage |
| JP2016036342A (ja) * | 2014-08-07 | 2016-03-22 | 株式会社大阪ソーダ | 有用物質産生促進用添加剤 |
| WO2018084228A1 (ja) * | 2016-11-04 | 2018-05-11 | 国立大学法人東京大学 | 動物細胞又は動物組織の凍結保存用溶液、凍結物、及び凍結保存方法 |
-
1993
- 1993-07-12 JP JP5171420A patent/JPH0723780A/ja active Pending
Cited By (8)
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| WO2018084228A1 (ja) * | 2016-11-04 | 2018-05-11 | 国立大学法人東京大学 | 動物細胞又は動物組織の凍結保存用溶液、凍結物、及び凍結保存方法 |
| JPWO2018084228A1 (ja) * | 2016-11-04 | 2019-09-26 | 国立大学法人 東京大学 | 動物細胞又は動物組織の凍結保存用溶液、凍結物、及び凍結保存方法 |
| US11540507B2 (en) | 2016-11-04 | 2023-01-03 | The University Of Tokyo | Solution for cryopreservation of animal cells or animal tissues, cryopreserved product, and cryopreservation method |
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