CN115461118A - 用于治疗家族性高胆固醇血症和低密度脂蛋白胆固醇升高的组合物和方法 - Google Patents

用于治疗家族性高胆固醇血症和低密度脂蛋白胆固醇升高的组合物和方法 Download PDF

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Abstract

提供了基因治疗组合物和方法，所述基因治疗组合物和方法用于靶向极低密度脂蛋白受体基因(VLDLR)和低密度脂蛋白受体基因(LDLR)，以降低患者中的总胆固醇和/或低密度脂蛋白胆固醇(LDL‑C)，从而治疗或减轻家族性高胆固醇血症。

Description

用于治疗家族性高胆固醇血症和低密度脂蛋白胆固醇升高的 组合物和方法
技术领域
本发明部分涉及用于治疗和/或减轻与低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)升高相关的疾病和疾患的方法、组合物和产品。
优先权
本申请要求2020年4月29日提交的美国临时专利申请号63/017,424的优先权和权益，所述申请的全部内容以引用的方式并入本文。
以电子方式提交的文本文件的描述
本申请含有通过EFS-Web随此以电子方式提交的ASCI I格式的序列表。2021年4月28日创建的ASCI I拷贝名为SAL-001PC_Sequence Listing_ST25.txt且大小为75,515字节。序列表以引用的方式整体并入本文。
背景技术
家族性高胆固醇血症(FH)是一种常染色体显性遗传病，其是最常见的血脂异常之一且特征在于自出生以来高浓度的总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)。它是发病率介于1:200-1:250人之间的危及生命的疾患，其导致动脉粥样硬化加速和早发冠心病。参见Hopkins等人,J Clin Lipidol 2011；5:S9-17；Talmud等人Curr Opin Lipidol 2014；25:274-81。
胆固醇是重要的细胞组分，并且维持胆固醇稳态对正常生理功能至关重要。血浆胆固醇的水平升高与各种病理疾患相关，最显著的是冠心病，其中高胆固醇水平导致动脉中泡沫细胞形成和斑块积聚，可能导致心脏病发作或中风。细胞胆固醇代谢和血浆胆固醇水平的调控取决于低密度脂蛋白(LDL)受体介导的LDL摄取到特定细胞中。LDL是血液中胆固醇的主要载体，占总血浆胆固醇的超过60％。LDL通过由apoB-100-LDL受体相互作用触发的受体介导的内吞作用被肝脏和肝外组织吸收。内化的LDL颗粒被转运至溶酶体，在溶酶体中它被降解为游离胆固醇和氨基酸。在人中，肝脏是LDL分解代谢和LDL受体活性的最重要器官。在肝脏中，LDL可通过药物干预进行调控。通过肝组织摄取LDL的潜在机制尚不清楚。因此，LDL摄取及其调控是动脉粥样硬化及相关疾病的重要治疗靶标。
FH构成最严重的常见遗传性代谢疾病之一。尽管其高流行率，但FH仍然严重诊断不足和治疗不足。估计70％至95％的FH由三种基因(APOB、LDLR、原蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶kexin 9(PCSK9))中的一者中的杂合致病性变体引起。低密度脂蛋白受体基因(LDLR)中的突变导致90％以上的病例。LDLR是参与低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的内吞作用的细胞表面蛋白受体。LDL-C在细胞膜处结合后，它被细胞吸收并转运至溶酶体，在溶酶体中蛋白质部分被降解，并且胆固醇分子通过负反馈抑制进一步胆固醇合成。LDLR基因中的致病性变体减少细胞内产生的LDL受体的数量，或者破坏受体结合LDL-c的能力。LDLR基因中的纯合FH(HoFH)和杂合FH(HeFH)致病性变体导致高水平的血浆LDL-C和动脉粥样硬化。
纯合FH由三种基因(APOB、LDLR、PCSK9)中的一者中的双等位基因(纯合或复合杂合)致病性变体引起。最初被描述为影响1:1,000,000的HoFH现在估计具有1:160,000至1:250,000的流行率。Cuchel等人Eur Heart J 2014；35:2146-57。大多数患有HoFH的个体到其25岁左右经历严重冠状动脉疾病(CAD)。到青少年时期的死亡率或冠状动脉搭桥手术率较高，并且严重主动脉狭窄也是常见的。
FH的常规治疗通常涉及多种药理剂。例如，他汀类药物可有助于HeFH患者，但是，特别是对于患有HoFH的个体，应答通常减弱并且可能不足。他汀类药物在HoFH的治疗中可能相对无效，因为其功效在很大程度上取决于肝脏中功能性LDL受体的上调。此外，一些患者具有他汀耐受不良。在患有HoFH的个体中，LDL受体的两个拷贝的活性不存在或大大降低，并且HoFH的疗法除了使用多种其它药物外，通常还需要LDL单采血液成分术(机械过滤)。LDL单采血液成分术通常从年轻时开始需要，并且其使用由于提供这种程序的设施数量有限而加剧。在一些严重病例中，FH患者进行肝脏移植。
存在用于治疗FH和LDL-C升高的患者的若干药物，包括洛美他派、米泊美生(KYNAMRO)和原蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/Kexin 9型(PCSK9)抑制剂(例如，英立西兰、依洛尤单抗(REPATHA)、阿利库单抗(PRALUENT))。然而，尽管目前的努力，在FH患者中LDL-C水平和相关心血管发病率和死亡率仍然较高。FH通常需要终生降脂药物治疗，这对患者和医疗系统都是负担。
因此，仍然需要用于降低患者中的LDL-C的改进地组合物和方法，从而改善患者的心血管健康。
发明内容
本发明提供了用于治疗和/或减轻患有家族性高胆固醇血症(FH)或LDL-C升高的患者中的心血管事件的组合物和方法。本发明的组合物和方法利用包含转座子表达载体的基因转移构建体，所述转座子表达载体使用序列或基因座特异性转座(SLST)来纠正具有LDLR基因突变或LDL-C升高的患者中的脂质代谢。以这种方式，本发明提供了用于恢复肝细胞中、纯合FH(HeFH)中、杂合FH(HoFH)患者中和LDL-C升高患者中的LDL代谢的方式。本发明可用于治疗家族性高胆固醇血症、常见高胆固醇血症、甘油三酯升高、胰岛素抵抗、代谢综合征和以总胆固醇水平升高为特征的其它疾病。
因此，在一些方面，提供了一种包含基因转移构建体的组合物，所述组合物包含(a)编码极低密度脂蛋白受体(VLDLR)蛋白或低密度脂蛋白受体(LDLR)蛋白或其功能片段的核酸；(b)肝脏特异性启动子；和(c)非病毒载体，所述非病毒载体包含一个或多个转座酶识别位点和一个或多个反向末端重复序列(ITR)或末端序列。在实施方案中，这些构建体可与PCSK9 miRNA组合，以减少PCSK9的肝脏合成并上调LDL和VLDL受体两者。基因转移允许功能性VLDLR或LDLR的稳定位点特异性基因组整合。本发明的基因转移构建体允许降低总胆固醇水平，以由此治疗和/或减轻FH及其症状，并改善患者的总体心血管健康。
根据本公开的基因疗法可使用基于转座子的载体系统，在转座酶辅助下进行，所述转座酶与待转移的基因提供在同一载体上(顺式)或不同的载体上(反式)。基于转座子的载体系统可在肝脏特异性启动子控制下操作。在一些实施方案中，所述肝脏特异性启动子是LP1启动子。LP1启动子可以是人LP1启动子，其可如，例如Nathwani等人Blood第107(7)卷(2006):2653-61中所述构建，所述文献以引用的方式整体并入本文。在实施方案中，所述LP1启动子描述于Nathwani等人Blood第107(7)卷(2006):2653-61中，所述文献以引用的方式整体并入本文，参见例如Nathwani等人的图S1。
在实施方案中，转座酶，例如来源于家蚕(Bombyx mori)、热带爪蟾(Xenopustropicalis)、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)、马铁菊头蝠(Rhinolophus ferrumequinum)、埃及果蝠(Rousettus aegyptiacus)、苍白矛吻蝠(Phyllostomus discolor)、大鼠耳蝠(Myotis myotis)、小棕蝠(Myotis lucifugus)、大狐蝠(Pteropus vampyrus)、库氏伏翼(Pipistrellus kuhlii)、黑猩猩(Pan troglodytes)、獒蝠(Molossus molossus)或智人(Homo sapiens)的转座酶和/或其工程化型式被用于将基因转移构建体的VLDLR或LDLR基因(有或没有PCSK9沉默miRNA)插入患者的基因组中(因此，有或没有PCSK9沉默miRNA的VLDLR或LDLR基因构建体在本文偶尔称为转座子)。
在实施方案中，转座酶是小棕蝠转座酶(MLT，或MLT转座酶)，其包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少约90％、或至少约93％、或至少约95％、或至少约97％、或至少约98％或至少约99％同一性的变体，以及选自L573X、E574X和S2X的一个或多个突变，其中X是任何氨基酸或没有氨基酸，任选地X是A、G或缺失。在实施方案中，所述突变是L573del、E574del和S2A。
在实施方案中，MLT转座酶具有选自L573X、E574X和S2X的一个或多个突变。在一些实施方案中，X是任何氨基酸或没有氨基酸。
在实施方案中，所述MLT转座酶包含具有突变L573del、E574del和S2A的氨基酸序列，并且另外具有赋予过度活性的一种或多种突变(或过度活跃突变)。在实施方案中，所述过度活跃突变是S8X、C13X和N125X突变中的一者或多者，其中X任选地是任何氨基酸或没有氨基酸，任选地X是P、R或k。在实施方案中，所述突变是S8P、C13R和N125K。在一些实施方案中，所述MLT转座酶具有S8P和C13R突变。在一些实施方案中，所述MLT转座酶具有N125K突变。在一些实施方案中，MLT转座酶具有所有三个S8P、C13R和N125K突变。
所描述的组合物可使用脂质纳米颗粒(LNP)递送至宿主细胞。在一些实施方案中，所述LNP包含选自中性或结构脂质(例如DSPC)、阳离子脂质(例如MC3)、胆固醇、PEG缀合脂质(CDM-PEG)和靶向配体[(例如N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)]的一种或多种分子。在一些实施方案中，所述LNP包含GalNAc或另一种配体以用于去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)介导的摄取到LDL、VLDL或其它脂质受体减少或缺失的肝细胞中。
在一些实施方案中，提供了一种用于降低患者中的总胆固醇和/或LDL-C的方法，所述方法可以是体内或离体方法。因此，在一些实施方案中，提供了一种方法，所述方法包括向有需要的患者施用根据本公开的实施方案的组合物。在一些实施方案中，一种用于降低患者中的总胆固醇和/或LDL-C的离体方法包括(a)使从患者获得的细胞与所描述的组合物接触，以及(b)将所述细胞施用于有需要的患者。
在一些实施方案中，提供了一种用于治疗和/或减轻LDL-C升高的方法，所述方法也可在体内或离体进行。用于治疗和/或减轻LDL-C升高的方法可包括治疗和/或减轻FH。在一些实施方案中，所述方法包括向有需要的患者施用根据本公开的实施方案的组合物。在一些实施方案中，用于治疗和/或减轻FH的方法包括(a)使从患者获得的细胞与本公开的组合物接触，(b)将所述细胞施用于有需要的患者。
根据本公开的实施方案的组合物和方法是基本上非免疫原性的，不会引起任何难处理的副作用，并且在一些情况下，可通过单次施用有效地递送。FH的治疗和/或减轻或总胆固醇和/或LDL-C的降低可以是稳健的和持久的。所描述的组合物和方法允许治疗和/或减轻冠状动脉疾病(CAD)或动脉粥样硬化。
在本公开的一些方面，提供了一种分离的细胞，所述分离的细胞包含根据本公开的实施方案的组合物。
在以下所附描述中阐述了本发明的细节。虽然在本发明的实践或测试中可以使用与本文所描述的那些方法和材料类似或等效的方法和材料，但如今描述了说明性的方法和材料。本发明的其它特征、目的和优点将是从说明书和权利要求书清楚的。在说明书和所附权利要求书中，单数形式还包括复数，除非上下文另外清楚地指出。除非另外定义，否则本文使用的所有技术性和科学性术语具有与本发明所属领域的技术人员通常所理解的相同的含义。
附图说明
图1描绘人LDRL基因的示意性图示。
图2描绘人LDRL基因mRNA的示意性图示。
图3描绘人LDRL蛋白的示意性图示。
图4A、4B、4C、4D、4E、4F、4G和4H是本公开的一些实施方案中使用的基因转移构建体的示意性图示。
图5示出在本公开的一些实施方案中使用的脂质纳米颗粒结构。
图6示出Huh7细胞在核转染后24小时的GFP表达；四个图(从左至右)示出使用NucleofectorTM溶液试剂盒(Lonza,Basel,Switzerland)、程序CA-137、CM-150、CM-138和EO-100获得的数据。每个图的顶行示出GFP荧光，并且底行示出明场显微镜数据。
图7示出Huh7细胞在核转染后4天的GFP表达结果；四个图(从左至右)示出使用NucleofectorTM溶液试剂盒、程序CA-137、CM-150、CM-138和EO-100获得的数据。每个图的顶行示出GFP荧光，并且底行示出亮场显微镜数据。
图8A、8B、8C和8D示出核转染后24小时的核转染效率的定量结果：使用NucleofectorTM溶液试剂盒、程序CA-137(图8A)、CM-150(图8B)、CM-138(图8C)和EO-100(图8D)获得的数据。每个图的顶行示出GFP荧光，并且底行示出荧光激活细胞分选(FACS)图。
图9A、9B、9C、9D、9E、9F、和9G示出转染后7天，在不同条件下经转染的Huh7细胞的FACS图，如下：(图9A)无程序–阴性测定对照；(图9B)pmaxGFP–阳性测定对照；(图9C)LP1-VLDLR/PGK-GFP质粒(即包含LP1启动子、极低密度脂蛋白受体(VLDLR)基因和PGK启动子驱动的增强表达(eGFP)的质粒)；(图9D)LP1-VLDLR/PGK-GFP+MLT 1；(图9E)LP1-VLDLR/PGK-GFP+MLT 2；(图9F)MLT 1；以及(图9G)MLT 2。
图10描绘未处理的Huh7细胞相比用VLDLR质粒和MLT转座酶2处理的Huh7细胞的LDL-C摄取。
图11描绘在不同条件下VLDLR表达的RT qPCR结果：未处理的Huh7细胞；用LP1-hVLDRL供体和MLT转座酶处理的Huh7细胞；用LP1-hVLDRL+PGK-GFP供体和MLT转座酶处理的Huh7细胞；Huh7细胞未用供体处理(“无供体”)；仅用供体(LP1-hVLDRL)处理的Huh7细胞“仅供体”；仅用供体(LP1-hVLDRL+PGK-GFP)处理的Huh7细胞“仅供体”；HEK293细胞。
图12是本公开的一些实施方案中使用的基因转移构建体(DNA供体质粒)的示意性图示。
图13A、13B和13C是对于使用图12中的基因转移构建体的有(“转座酶+”)和无(“转座酶-”)转座酶(MLT 1和MLT 2)的测定，Huh7细胞中GFP表达的图像和FACS图。图13A、13B和13C分别示出24小时(图13A)、72小时(图13B)和7天(图13C)的转座酶-测定(上)和转座酶+测定(下)的数据。
图14A、14B、14C和14D示出非核转染的(未处理的)HEK293和Huh7细胞中的基线LDL摄取：图14A示出未处理的HEK293细胞，仅LDL摄取；图14B示出未处理的Huh7细胞，仅LDL摄取；图14C示出未处理的HEK293细胞，未染色；并且图14D示出未处理的Huh7细胞，未染色。
图15A、15B、15C、15D和15E示出经转座的Huh7细胞对比非转座的Huh7细胞针对LDL摄取：图15A示出未转座的(转座酶-)HEK293细胞用于比较；图15B示出未转座的(转座酶-)Huh7细胞；图15C示出用人LP1-VLDLR质粒(pVLDLR)核转染的未转座的(转座酶-)Huh7细胞；图15D示出用人LP1-VLDLR质粒(pVLDLR)核转染的、用MLT 1转座的Huh7细胞；并且图15E示出用人LP1-VLDLR质粒(pVLDLR)核转染的、用MLT转座酶2转座的Huh7细胞。
图16A和16B示出动物群组1(在表7中描述)在第3天(图16A)和第5天(图16B)的全身生物发光成像(BLI)。
图17A和17B示出动物群组2(在表8中描述)在第3天(图17A)和第5天(图17B)的BLI。
图18A和18B示出动物群组3(在表9中描述)在第3天(图18A)和第5天(图18B)的BLI。
图19示出在长期维持(分别26和33天)后来自属于动物组6和动物组8的动物的BLI。
图20示出：左图–来自在第26天施用LNP中等剂量(250uL)(ldlr-/-)的动物序列号6001(表8)的BLI；右图–来自在第26天施用LNP低剂量(125uL)(ldlr-/-)的动物序列号8002(表9)的BLI。
图21A示出本公开的肝脏特异性LNP制剂在ldlr-/-小鼠中的功效评估的结果。示出未处理的和处理的(vldlr)小鼠在参考范围以及在第7天(D7)和第15天(D15)的甘油三酯(mg/dL)。
图21B示出作为测试动物的血液中丙氨酸转氨酶(ALT)的测量(u/L)的安全评估的结果。示出未处理组、处理组(vLdlr)和PBS组的数据，每个组包括参考(“1”)范围以及在D7(“2”)和D15(“3”)的数据。
具体实施方式
本发明部分基于以下发现，即非病毒、无衣壳的基因治疗方法和组合物可用于降低总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)，并且由此治疗和减轻家族性高胆固醇血症(FH)和LDL-C升高的心血管影响。根据本公开的非病毒基因治疗方法可用于肝脏导向性基因疗法，以纠正低密度脂蛋白受体基因(LDLR)、极低密度脂蛋白受体基因(VLDLR)中的突变，或减轻LDL-C的血清升高。所描述的方法和组合物采用LDLR或VLDLR的转座。所描述的方法和组合物改善患者的心血管健康，并且由此改善患者的总体预后和健康。
在一些实施方案中，所描述的方法和组合物可作为一次性剂量或重复剂量施用。在一些实施方案中，施用途径可以是静脉内施用或施用至门静脉内或直接施用至肝实质。
FH由三种主要基因(LDLR、APOB和PCSK9)中的突变引起，但LDLR中的突变是最常见的–超过90％的报告的引起FH的突变是在LDLR中，其中5％至10％在APOB中，并且不到1％在PCSK9中。参见Iacocca等人Expert Rev Mol Diagn 2017；17:641-51。
LDLR位于染色体19上，并且其基因组结构跨45kb，包括18个外显子和17个内含子。LDLR基因、mRNA和蛋白质分别在图1、2和3中示意性地示出。人LDLR转录变体1mRNA(NCBI参考：NM_000527.5)是：
Figure BDA0003911510150000091
Figure BDA0003911510150000101
已经报告了LDLR的启动子、内含子和外显子中的致病性变体，并且大多数致病性变体位于配体结合结构域(40％)或表皮生长因子前体样结构域(47％)内，其中最高频率的致病性变体在外显子4(20％)中报告。LDLR编码839个氨基酸的成熟蛋白质产物。LDLR具有可彼此独立地发挥作用的四个不同的功能结构域：LDL受体结构域A类(LDLa)；表皮生长因子样结构域(EGF)；钙结合EGF样结构域(EGF-CA)；和LDL受体重复B类(LDLb)。LDLR包括参与LDL胆固醇(LDL-C)的内吞作用的细胞表面蛋白。LDL-C在细胞膜处结合后，它被带至细胞中并带至溶酶体，在溶酶体中蛋白质部分被降解，并且胆固醇分子通过负反馈抑制胆固醇合成。
LDLR中的致病性变体通常减少细胞内产生的LDL受体的数量，或者破坏受体结合LDL-c的能力。无论具体机制如何，LDLR中的杂合致病性变体都导致高水平的血浆LDL-C。
肝脏LDLR表达受PCSK9调控，PCSK9是干扰PCSK9介导的LDLR降解的第二代降脂药物的重点。另一种机制涉及基于泛素-蛋白酶体途径对受体的降解的LDLR表达的转录后调控，已成为增加受体表达的额外靶标。用于增加LDLR表达的此类策略由PCSK9中天然存在的功能丧失突变和LDLR的诱导型降解剂(IDOL；MYLIP)支持，所述诱导型降解剂降低LDL-C水平，但没有与这些变体相关的疾病。人LDLR变体K830R和C839A先前已报告可阻止IDOL介导的LDLR降解。Somanathan等人,Circ Res 2014；115:591-9。此外，L339D对人PCSK9介导的降解具有抗性。同上。与使用野生型LDLR的载体相比，在递送含有所有三种变体(L339D、K830R和C839A)的LDLR的AAV载体中，LDRL对PCSK9和IDOL途径的调控具有抗性。同上。
在一些实施方案中，编码人LDLR蛋白或其功能片段的核酸包含NM_000527.5(SEQID NO:1)的核苷酸序列，或与所述核苷酸序列具有至少约90％、或至少约93％、或至少约95％、或至少约97％或至少约98％同一性的变体。
在实施方案中，所述LDLR蛋白是人LDLR蛋白或其功能片段。
在实施方案中，编码人LDLR蛋白或其功能片段的核酸包含编码蛋白质的核苷酸序列，所述蛋白质具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少约90％、或至少约93％、或至少约95％、或至少约97％或至少约98％同一性的变体。
在实施方案中，编码人LDLR蛋白或其功能片段的核酸包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列，或与所述核苷酸序列具有至少约90％、或至少约93％、或至少约95％、或至少约97％或至少约98％同一性的变体。
在一些实施方案中，人LDLR蛋白包含选自L339D、K830R和C839A的一个或多个突变。在一些实施方案中，人LDLR包含编码蛋白质的SEQ ID NO:2的核苷酸序列，所述蛋白质具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少约90％、或至少约93％、或至少约95％、或至少约97％或至少约98％同一性的变体。在一些实施方案中，人LDLR包含SEQID NO:2的核苷酸序列，所述核苷酸序列编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少约90％、或至少约93％、或至少约95％、或至少约97％或至少约98％同一性的变体。
在实施方案中，相对于SEQ ID NO:3的氨基酸序列，人LDLR蛋白或其功能片段包含选自L18F、K830R和C839A的一个或多个突变。
SEQ ID NO:2的核苷酸序列(2583bp)包含变体L339D、K830L、C839A，所述变体在下文加粗且加下划线。SEQ ID NO:3的氨基酸序列(860个氨基酸)包含变体L339D、K830L、C839A，所述变体在下文加粗且加下划线。
SEQ ID NO:2是
Figure BDA0003911510150000131
SEQ ID NO:3是
Figure BDA0003911510150000132
在一些实施方案中，编码人LDLR的核酸可包含编码蛋白质的核苷酸序列，所述蛋白质具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少约90％、或至少约93％、或至少约95％、或至少约97％或至少约98％同一性的变体。
VLDLR位于染色体9上，并且含有跨基因组的大约40kb的19个外显子。所述基因的外显子-内含子组构几乎与LDLR基因相同，除了编码VLDL受体的配体结合结构域中的额外重复的额外外显子。智人VLDLR转录物(mRNA)变体1是9,213bp(NCBI参考：NM_003383.5)或大约9.2kb：
Figure BDA0003911510150000141
Figure BDA0003911510150000151
Figure BDA0003911510150000161
Figure BDA0003911510150000171
VLDLR与LDLR一样，由5个结构域组成：与LDLR的配体结合结构域同源的由8个富含半胱氨酸的重复序列组成的N末端328个氨基酸；与表皮生长因子前体同源的介导LDLR中配体的酸依赖性解离的396个氨基酸的区域；与LDLR的簇集O-连接的糖同源的46个氨基酸的结构域；22个氨基酸的跨膜结构域；以及54个氨基酸的细胞质结构域，所述结构域包含受体簇集到被膜凹窝中所需的NPXY序列。VLDL受体的基因在心脏、肌肉和脂肪组织中高度表达，所述组织在脂肪酸代谢中具有活性；基本上没有在肝脏中发现表达。
本公开的组合物和方法提供了靶向LDLR和VLDLR的基因转移构建体，以纠正患者基因组中的致病性变体，并且由此降低总胆固醇和/或低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)。因此，在本公开的一些方面，提供了一种包含基因转移构建体的组合物，所述组合物包含(a)VLDLR或LDLR或其功能片段，(b)肝脏特异性启动子，和(c)非病毒载体，所述非病毒载体包含一个或多个转座酶识别位点和一个或多个反向末端重复序列(ITR)或末端序列。
在一些实施方案中，基因转移构建体包含VLDLR或其功能片段，而不是LDLR。VLDLR在结构和功能上与LDLR密切相关，并且其主要通过富含apoE的脂蛋白直接摄取到内皮细胞并通过上调脂蛋白脂肪酶介导的这些脂蛋白的代谢来调节所述的脂蛋白的肝外代谢。与LDLR相比，VLDLR的表达不受细胞内游离胆固醇调控。在LDLR丰富的肝细胞中，VLDLR通常仅少量表达，但可补偿LDLR的缺失。参见Takahashi等人J Atheroscler Thromb 2004；11:200-8；Turunen等人(2016).Mol Ther 2016；24:620-35；Go和Mani.Yale J Biol Med2012；85:19-28。
在一些实施方案中，VLDLR蛋白是人VLDLR蛋白或其功能片段。在实施方案中，编码人VLDLR蛋白或其功能片段的核酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列编码SEQ ID NO:6的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少约90％、或至少约93％、或至少约95％、或至少约97％或至少约98％同一性的变体。
在一些实施方案中，编码人VLDLR或其功能片段的核酸包含SEQ ID NO:5的核苷酸序列，或与所述核苷酸序列具有至少约90％、或至少约93％、或至少约95％、或至少约97％或至少约98％同一性的变体：
Figure BDA0003911510150000191
在一些实施方案中，编码人VLDLR或其功能片段的核酸包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列，或与所述氨基酸序列具有至少约90％、或至少约93％、或至少约95％、或至少约97％或至少约98％同一性的变体：
Figure BDA0003911510150000201
在一些实施方案中，VLDLR基因或其功能片段是小鼠(小家鼠)VLDLR。小鼠VLDLR可包含编码蛋白质的SEQ ID NO:7的核苷酸序列，所述蛋白质具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少约90％、或至少约93％、或至少约95％、或至少约97％或至少约98％同一性的变体。
在实施方案中，编码人VLDLR蛋白或其功能片段的核酸包含SEQ ID NO:4的核苷酸序列或SEQ ID NO:5的核苷酸序列，或与所述核苷酸序列具有至少约90％、或至少约93％、或至少约95％、或至少约97％或至少约98％同一性的变体。
在一些实施方案中，编码小鼠VLDLR或其功能片段的核酸包含SEQ ID NO:7的核苷酸序列，或与所述核苷酸序列具有至少约90％、或至少约93％、或至少约95％、或至少约97％或至少约98％同一性的变体：
Figure BDA0003911510150000211
在一些实施方案中，小鼠VLDLR或其功能片段包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列，或与所述氨基酸序列具有至少约90％、或至少约93％、或至少约95％、或至少约97％或至少约98％同一性的变体：
Figure BDA0003911510150000221
在一些实施方案中，本发明涉及通过双重转座子和转座酶系统进行基因转移的组合物和方法。可转座元件是自然界中普遍存在的非病毒基因递送媒介物。基于转座子的载体具有在细胞中稳定基因组整合和持久表达转基因构建体的能力。一般来说，双重转座子和转座酶系统通过剪切和粘贴机制(cut-and-paste mechanism)起作用，由此含有目标转基因的转座子DNA通过转座酶整合到染色体DNA中。
如本领域中所了解，转座子通常包含在转座子的中间编码转基因的开放阅读框以及在转座子的5'和3'端的末端重复序列。经翻译的转座酶与转座子的5'和3'序列结合，并执行转座功能。
在实施方案中，转座子可与可转座元件互换使用，可转座元件用于指能够将自身的拷贝插入到其它多核苷酸中的多核苷酸。术语转座子是本领域技术人员众所周知的，并且包括可根据序列组构，例如在每个末端的短反向重复序列(ITR)和/或在末端的直接重复长末端重复序列(LTR)来区分的转座子类别。在实施方案中，如本文所述的转座子可被描述为piggyBac样元件，例如特征在于其无踪迹切除的转座子元件，所述元件识别TTAA序列并在除去转座子后使插入位点处的序列恢复回至原始TTAA序列。
在一些实施方案中，非病毒载体是由转座酶所识别的ITR侧接的转座子介导的基因转移系统(例如，DNA质粒转座子系统)。在一些实施方案中，ITR位于VLDLR或LDLR构建体侧翼。非病毒载体以基于转座子的载体系统操作，所述载体系统包含由转座酶所识别的两个末端侧接的异源多核苷酸(也称为转基因)。转座子末端包含ITR，所述ITR可以是精确或不精确重复序列并且在取向上相对于彼此反向。转座酶作用于转座子末端，以由此从载体“剪切”转座子(连同转座子末端)并将所述转座子“粘贴”或整合到宿主基因组中。
在实施方案中，基因转移系统是编码转座子的核酸(DNA)，并且被称为“供体DNA”。在实施方案中，编码转座酶的核酸是辅助RNA(即编码转座酶的mRNA)，并且编码转座子的核酸是供体DNA(或DNA供体转座子)。在实施方案中，供体DNA被并入到质粒中。在实施方案中，供体DNA是质粒。
DNA供体转座子(其是使用“剪切和粘贴”机制的移动元件)包括在哺乳动物(例如小棕蝠、大鼠耳蝠、大狐蝠、库氏伏翼和黑猩猩)、包括人(智人)的情况下由两个末端序列侧接的供体DNA，或其它活生物体如昆虫(例如粉纹夜蛾)或两栖动物(爪蟾属物种)中的反向末端重复序列(ITR)。基因组DNA在宿主的供体位点通过双链裂解切割，并且供体DNA在此位点整合。使用生物工程化转座子和转座酶的双重系统包含(1)活性转座酶的来源，所述活性转座酶在特定核苷酸序列如TTAA处“切割”；和(2)DNA序列，所述DNA序列由通过转座酶动员的识别末端序列或ITR侧接。DNA序列的动员允许插入核酸或转基因插入在特定核苷酸序列(即TTAA)处而无DNA足迹。
在实施方案中，转座酶可作为DNA表达载体或可表达RNA或蛋白质提供，使得在转基因细胞中不发生转座酶的长期表达。
在实施方案中，转座酶是小棕蝠转座酶(MLT，或MLT转座酶)，其包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列，或与所述氨基酸序列具有至少约90％、或至少约93％、或至少约95％、或至少约97％、或至少约98％或至少约99％同一性的变体。在实施方案中，转座酶是小棕蝠转座酶(MLT，或MLT转座酶)，其包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列，或与所述氨基酸序列具有至少约90％、或至少约93％、或至少约95％、或至少约97％、或至少约98％或至少约99％同一性的变体和S2X，其中X是任何氨基酸或没有氨基酸，任选地X是A或G。在实施方案中，转座酶是小棕蝠转座酶(MLT，或MLT转座酶)，其包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列，或与所述氨基酸序列具有至少约90％、或至少约93％、或至少约95％、或至少约97％、或至少约98％或至少约99％同一性的变体和S2X(其中X是任何氨基酸或没有氨基酸，任选地X是A或G)以及选自L573X和E574X的C末端缺失(其中X是没有氨基酸)。在实施方案中，所述突变是L573del、E574del和S2A。
在实施方案中，MLT转座酶包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列，具有突变L573del、E574del和S2A：
Figure BDA0003911510150000241
或与所述氨基酸序列具有至少约90％、或至少约93％、或至少约95％、或至少约97％、或至少约98％或至少约99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，MLT转座酶由以下核苷酸序列编码：
Figure BDA0003911510150000242
或与所述核苷酸序列具有至少约90％、或至少约93％、或至少约95％、或至少约97％、或至少约98％或至少约99％同一性的核苷酸序列编码。
在一些实施方案中，MLT转座酶(例如，具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列或与其具有至少约90％、或至少约93％、或至少约95％、或至少约97％、或至少约98％或至少约99％同一性的氨基酸序列的MLT转座酶)包含赋予MLT转座酶过度活性的一个或多个过度活跃突变。在实施方案中，相对于SEQ ID NO:9的氨基酸序列或其功能等效物的过度活跃突变是S8X、C13X和N125X突变中的一者或多者，其中X任选地是任何氨基酸或没有氨基酸，任选地X是P、R或k。在实施方案中，突变是S8P、C13R和N125K。在一些实施方案中，MLT转座酶具有S8P和C13R突变。在一些实施方案中，所述MLT转座酶具有N125K突变。在一些实施方案中，MLT转座酶具有所有三个S8P、C13R和N125K突变。
在一些实施方案中，MLT转座酶由核苷酸序列(SEQ ID NO:11)编码，所述核苷酸序列对应于相对于SEQ ID NO:9的氨基酸序列或其功能等效物具有N125K突变的氨基酸序列(SEQ ID NO:12)，其中SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12是如下：
Figure BDA0003911510150000251
或与其具有至少约90％、或至少约93％、或至少约95％、或至少约97％、或至少约98％或至少约99％同一性的核苷酸序列(对应于N125K突变的密码子加下划线且加粗)。
Figure BDA0003911510150000261
或与其具有至少约90％、或至少约93％、或至少约95％、或至少约97％、或至少约98％或至少约99％同一性的氨基酸序列(对应于N125K突变的氨基酸加下划线且加粗)。
在一些实施方案中，由SEQ ID NO:11的核苷酸序列编码并且具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的MLT转座酶被称为MLT转座酶1(或MLT 1)。
在一些实施方案中，MLT转座酶由核苷酸序列(SEQ ID NO:13)编码，所述核苷酸序列对应于相对于SEQ ID NO:9的氨基酸序列或其功能等效物具有S8P和C13R突变的氨基酸序列(SEQ ID NO:14)，其中SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14是如下：
Figure BDA0003911510150000262
Figure BDA0003911510150000271
或与其具有至少约90％、或至少约93％、或至少约95％、或至少约97％、或至少约98％或至少约99％同一性的核苷酸序列(对应于S8P和C13R突变的密码子加下划线且加粗)。
Figure BDA0003911510150000272
或与其具有至少约90％、或至少约93％、或至少约95％、或至少约97％、或至少约98％或至少约99％同一性的氨基酸序列(对应于S8P和C13R突变的氨基酸加下划线且加粗)。
在一些实施方案中，由SEQ ID NO:13的核苷酸序列编码并具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的MLT转座酶被称为MLT转座酶2(或MLT 2)。
在一些实施方案中，转座酶来自Tc1/水手转座子系统。
在一些实施方案中，转座酶来自睡美人转座子系统(参见，例如Cell.1997；91:501–510)或piggyBac转座子系统(参见，例如Trends Biotechnol.2015年9月；33(9):525-33.doi:10.1016/j.tibtech.2015.06.009.Epub 2015年7月23日)。
在一些实施方案中，转座酶来自LEAP-IN 1型或LEAP-IN转座子系统(BiotechnolJ.2018Oct；13(10):e1700748.doi:10.1002/biot.201700748.Epub 2018年6月11日)。
在一些实施方案中，非病毒载体包含LEAP-IN 1型LEAP IN转座酶(ATUM,Newark,CA)。LEAP IN转座酶系统包含转座酶(例如，转座酶mRNA)和载体，所述载体含有由转座子同源反向末端重复序列(ITR)和转座识别基序(TTAT)侧接的一种或多种目标基因(转座子)、选择标记物、调控元件等。在共转染载体DNA和转座酶mRNA后，瞬时表达的酶催化转座子盒的单个拷贝(ITR之间的所有序列)在跨宿主细胞基因组的一个或多个位点处的高效和精确地整合。Hottentot等人In Genotyping:Methods and Protocols.White SJ,CantsilierisS,编:185–196.(New York,NY:Springer):2017.第185–196页。LEAPIN转座酶产生具有各种有利特征的稳定转基因整合体，包括在多个基因组基因座处、主要在开放染色质区段中的单拷贝整合；没有有效负荷限制，所以多个独立的转录单元可从单一构建体表达；整合的转基因保持其结构和功能完整性；并且转基因完整性的维持确保每个重组细胞中所需的链比率。
在一些实施方案中，编码VLDLR或LDLR蛋白的核酸可操作地偶联至可影响转基因(例如VLDLR或LDLR或其功能片段)的总体表达水平和细胞特异性的启动子。在一些实施方案中，启动子是组织特异性，即肝脏特异性启动子。在转座酶是编码转座酶的DNA序列的实施方案中，这种DNA序列还可操作地连接至启动子。可使用多种启动子，包括组织特异性启动子、诱导型启动子、组成型启动子等。
在一些实施方案中，基因转移构建体的肝脏特异性启动子可以是LP1启动子，在一些实施方案中，所述LP1启动子是人LP1启动子。LP1启动子描述于例如Nathwani等人Blood第2006卷；107(7):2653-61中。
在一些实施方案中，LP1启动子包含SEQ ID NO:15的核酸序列，或与所述核酸序列具有至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、至少约90％、或至少约93％、或至少约95％、或至少约97％或至少约98％同一性的变体的功能片段。在一些实施方案中，LP1启动子的核苷酸序列包含人载脂蛋白E/C-I基因基因座、肝脏控制区HCR-1(碱基对134至325，Genbank记录U32510.1)、人α-1-抗胰蛋白酶基因(S变体)(碱基对1747至2001，Genbank记录K02212.1)和小t-内含子SV40(碱基对241至333，Genbank记录FN824656.1)(545bp)：
Figure BDA0003911510150000291
在一些实施方案中，LP1启动子包含SEQ ID NO:15的核酸序列，或与所述核酸序列具有至少约80％、或至少约85％、至少约90％、或至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％或至少约98％同一性的变体。
在一些实施方案中，LP1启动子的核苷酸序列包含以下中的一者或多者：人载脂蛋白E/C-I基因基因座、肝脏控制区HCR-1(碱基对134至325，Genbank记录U32510.1)、人α-1-抗胰蛋白酶基因(S变体)(碱基对1747至2001，Genbank记录K02212.1)和小t-内含子SV40(碱基对241至333，Genbank记录FN824656.1)(545bp)：
在一些实施方案中，肝脏特异性启动子选自以下表1中包括的启动子。
在一些实施方案中，肝脏特异性启动子选自以下表1中包括的启动子，并且任选地具有如表1中所列的一个或多个增强子和/或如表1中所列的一个或多个内含子。
表1.肝脏特异性启动子。
Figure BDA0003911510150000292
Figure BDA0003911510150000301
在以上表1中，“E”表示增强子，“P”表示启动子，“Mm”表示小家鼠，“Hs”表示智人，并且“HBV”表示乙型肝炎病毒。
在一些实施方案中，肝脏特异性启动子是以上表1中的启动子的任何启动子。在一些实施方案中，肝脏特异性启动子是Kramer等人Mol Ther2003；7:375-85中所描述的启动子中的任一者，所述文献以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，启动子可如Kramer等人Mol Ther2003；7:375-85中所描述的启动子中的任一者，所述文献以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，肝脏特异性启动子是E-ALB(Mm)v2_P-AAT(Hs)或E-HBV_P-AAT(Hs)，两者均列于以上表1中。
在实施方案中，本发明的非病毒载体可包含在转座子的5'端和3'端的至少一对反向末端重复序列(ITR)。在实施方案中，ITR是位于载体的一端的序列，所述序列当与位于所述载体的相对端的互补序列组合使用时可形成发夹结构。所述对反向末端重复序列参与本公开的非病毒载体的转座子的转座活性，特别是参与目标DNA的DNA添加或去除和切除。在一个实施方案中，至少一对反向末端重复序列似乎是质粒中转座活性所需的最小序列。在另一个实施方案中，本公开的载体可包含至少两对、三对或四对反向末端重复序列。如本领域技术人员所了解，为了便于克隆，必要的末端序列可以尽可能短，并且因此含有尽可能少的反向重复序列。因此，在一个实施方案中，本公开的载体可包含不超过1对、不超过2对、不超过3对或不超过4对反向末端重复序列。在一个实施方案中，本公开的载体可仅包含一个反向末端重复序列。
在实施方案中，本发明的反向末端重复序列可形成完全反向末端重复序列(或可互换地称为“完全反向重复序列”)或不完全反向末端重复序列(或可互换地称为“不完全反向重复序列”)。如本文所用，术语“完全反向重复序列”是指以相反方向放置的两个相同DNA序列。相比之下，术语“不完全反向重复序列”是指除了含有一些不匹配之外彼此相似的两个DNA序列。这些重复序列(即完全反向重复序列和不完全反向重复序列两者)是转座酶的结合位点。
在一些实施方案中，非病毒载体的ITR(或末端序列)是通过“剪切和粘贴”机制进行转座的piggyBac样转座子的那些。在一些实施方案中，piggyBac样转座子包含TTAA重复序列。piggyBac转座子是用于基因修饰的常用转座子系统，并且在实际转座事件过程中不需要DNA合成。piggyBac元件可通过转座酶从供体染色体中切割，并且分裂的供体DNA可与DNA连接酶重新连接。Zhao等人Translational lung cancer research,2006；5(1):120–125。piggyBac转座子显示精确切除，即使序列恢复至其整合前状态。参见Yusa.piggyBacTransposon.Microbiol Spectr.2015年4月；3(2)。在一些实施方案中，基因转移构建体包含Super piggyBacTM(SPB)转座酶。参见Barnett等人Blood 2016；128(22):2167。
在一些实施方案中，可使用其它非病毒基因转移工具，如例如，睡美人转座子系统。参见，例如Aronovich等人Human Molecular Genetics,2011；20(R1),R14–R20。
在一些实施方案中，可对转座子系统的序列进行密码子优化，以在哺乳动物系统中提供改善的mRNA稳定性和蛋白质表达。
在各种实施方案中，基因转移构建体可以是任何合适的遗传构建体，如核酸构建体、质粒或载体。在各种实施方案中，基因转移构建体是DNA。在一些实施方案中，基因转移构建体是RNA。在一些实施方案中，基因转移构建体可具有DNA序列和RNA序列，如例如miRNA(例如PCSK9)。
在实施方案中，本发明的核酸包括聚合形式的任何长度的核苷酸，核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或它们的类似物或衍生物。在实施方案中，提供了双链和单链DNA，以及双链和单链RNA，以及RNA-DNA杂合体。在实施方案中，提供了转录激活的多核苷酸，如甲基化或加帽多核苷酸。在实施方案中，本发明的组合物是mRNA或DNA。
在实施方案中，本发明的非病毒载体是包含编码多肽的多核苷酸并可操作地连接至控制序列的线性或环状DNA分子，其中所述控制序列提供编码所述多肽的多核苷酸的表达。在实施方案中，所述非病毒载体包含启动子序列以及转录和翻译终止信号序列。此类载体可尤其包括染色体和附加型载体，例如，源自细菌质粒、转座子、酵母附加体、插入元件、酵母染色体元件的载体，以及源自它们的组合的载体。本发明的构建体可含有调控以及引起表达的控制区。
在一些实施方案中，基因转移构建体可以是密码子优化的。在所描述的实施方案中，编码VLDLR蛋白和LDLR蛋白或其功能片段的核酸充当整合到宿主基因组(例如，人基因组)中的转基因，以提供所需的临床结果。转基因密码子优化可用于优化转基因的治疗潜力及其在宿主生物体中的表达。进行密码子优化以使转基因中的密码子使用与宿主生物体或细胞中每个密码子的转移RNA(tRNA)的丰度相匹配。密码子优化方法是本领域中已知的，并在且描述于，例如，WO2007/142954中，所述专利以引用的方式整体并入本文。优化策略可包括，例如，翻译起始区的修改、mRNA结构元件的改变以及使用不同的密码子偏倚。
基因转移构建体包含被选择以确保构建体的稳定表达的若干其它调控元件。因此，在一些实施方案中，非病毒载体是DNA质粒，所述DNA质粒可包含防止或减轻邻近基因的激活或失活的一个或多个绝缘子序列。
在实施方案中，ITR或末端序列是piggyBac样转座子的那些，任选地包含TTAA重复序列，和/或ITR或末端序列位于编码VLDLR蛋白或LDLR蛋白或其功能片段的核酸侧翼。
在一些实施方案中，一个或多个绝缘子序列包含HS4绝缘子(1.2-kb 5'-HS4鸡β-珠蛋白(cHS4)绝缘子元件)和D4Z4绝缘子[与面肩肱型营养不良(FSHD)相关的串联大卫星重复序列)]。在一些实施方案中，HS4绝缘子和D4Z4绝缘子的序列如Rival-Gervier等人MolTher.2013年8月；21(8):1536-50中所述，所述文献以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，基因转移构建体的基因能够在转座酶存在下转座。在一些实施方案中，根据本公开的实施方案的非病毒载体包含编码转座酶的核酸构建体。转座酶可以是转座酶DNA质粒。在一些实施方案中，转座酶是体外转录的mRNA。转座酶能够从基因转移构建体中切除基因和/或使基因从基因转移构建体转座至位点或基因座特异性基因组区域。
包含根据本公开的基因转移构建体的组合物可包含一个或多个非病毒载体。此外，转座酶可与具有转基因的转座子设置在同一或不同载体上。因此，在一些实施方案中，转座酶和包含转基因的转座子呈顺式构型，使得它们包含在同一载体中。在一些实施方案中，转座酶和包含转基因的转座子呈反式构型，使得它们包含在不同的载体中。载体是根据本公开的任何非病毒载体。
在一些实施方案中，转座酶来源于家蚕、热带爪蟾、粉纹夜蛾、马铁菊头蝠、埃及果蝠、苍白矛吻蝠、大鼠耳蝠、小棕蝠、大狐蝠、库氏伏翼、黑猩猩、獒蝠或智人，和/或是其工程化型式。在一些实施方案中，转座酶特异性地识别ITR。转座酶可包含编码家蚕、热带爪蟾或粉纹夜蛾蛋白的DNA或RNA序列。参见例如，美国专利号10,041,077，所述专利以引用的方式整体并入本文。
然而，在一些实施方案中，转座酶可作为蛋白质直接引入细胞中，例如使用细胞穿透肽(例如，如Ramsey and Flynn(2015).Cell-penetrating peptides transporttherapeutics into cells.Pharmacol.Ther.154:78-86中所描述)；使用包括盐加丙烷甜菜碱的小分子(例如，如Astolfo等人Cell 2015；161:674-690中所述)；或电穿孔(例如，如Morgan和Day.Methods in Molecular Biology 1995；48:63-71中所述)。
在一些实施方案中，转座子系统可如，例如美国专利号10,435,696中所描述来实施，所述专利以引用的方式整体并入本文。
在一些实施方案中，所描述的组合物包含特定比例的转基因(例如，编码VLDLR蛋白或LDLR蛋白或其功能片段的核酸)和转座酶。在一些实施方案中，选择转基因与转座酶比例，以提高转座活性的效率。转基因与转座酶比例取决于经转染的基因转移构建体的浓度。在一些实施方案中，编码极低密度脂蛋白受体蛋白(VLDLR)或低密度脂蛋白受体蛋白(LDLR)或其功能片段的核酸与编码转座酶的核酸构建体的比例是约5:1、或约4:1、或约3:1、或约2:1、或约1:1、或约1:2、或约1:3、或约1:4或约1:5。
在一些实施方案中，编码极低密度脂蛋白受体蛋白(VLDLR)或低密度脂蛋白受体蛋白(LDLR)或其功能片段的核酸与编码转座酶的核酸构建体的比例是约2:1。
在一些实施方案中，非病毒载体是通过各种转染方法(如，例如采用脂质颗粒的方法)引入细胞中的缀合多核苷酸序列。在一些实施方案中，包含基因转移构建体的组合物包含递送颗粒。在一些实施方案中，所述递送颗粒包含基于脂质的颗粒(例如，脂质纳米颗粒(LNP))、阳离子脂质或生物可降解聚合物)。基因转移构建体的脂质纳米颗粒(LNP)递送提供某些优点，包括瞬时、非整合表达以限制潜在脱靶事件和免疫应答，以及具有转运大货物能力的有效递送。LNP已被用于小干扰RNA(siRNA)和mRNA的递送，以及用于在体外和体内将CRISPR/Cas9组组分递送至肝细胞和肝脏。例如，美国专利号10,195,291描述了使用LNP递送RNA干扰(RNAi)治疗剂。
在一些实施方案中，根据本公开的实施方案的组合物呈LNP形式。在一些实施方案中，所述LNP包含选自以下的一种或多种脂质：1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)、N,N-二油烯基-N,N-二甲基氯化铵(DODAC)、N-(2,3-二油烯基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)、N,N-二硬脂酰基-N,N-二甲基溴化铵(DDAB)、与二甲基氨基乙烷-氨甲酰基混合的阳离子胆固醇衍生物(DC-Chol)、磷脂酰胆碱(PC)、三油精(三油酸甘油酯)和1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[羧基(聚乙二醇)-2000](DSPE-PEG)、1,2-二肉豆酰-外消旋-甘油基-3-甲氧基聚乙二醇–2000(DMG-PEG 2K)以及1,2二硬脂酰基-sn-甘油-3磷酸胆碱(DSPC)。
在一些实施方案中，LNP可如图5中所示，其改编自Patel等人,J Control Release2019；303:91-100。如图5所示，LNP可包含结构脂质(例如DSPC)、PEG缀合脂质(CDM-PEG)、阳离子脂质(MC3)、胆固醇和靶向配体(例如GalNAc)中的一者或多者。
在一些实施方案中，所述组合物可具有不同比例的脂质和聚合物，其中所述脂质可选自例如，DOTAP、DC-Chol、PC、三油精、DSPE-PEG，并且其中所述聚合物可以是例如PEI或聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)。可以另外或可替代地使用任何其它脂质和聚合物。在一些实施方案中，脂质和聚合物的比例是约0.5:1、或约1:1、或约1:1.5、或约1:2、或约1:2.5、或约1:3、或约3:1、或约2.5:1、或约2:1、或约1.5:1、或约1:1或约1:0.5。
在一些实施方案中，LNP包含阳离子脂质，所述阳离子脂质的非限制性实例包括N,N-二油烯基-N,N-二甲基氯化铵(DODAC)、N,N-二硬脂酰基-N,N-二甲基溴化铵(DDAB)、N-(I-(2,3-二油酰基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTAP)、N-(I-(2,3-二油烯基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)、N,N-二甲基-2,3-二油烯基氧基)丙胺(DODMA)、1,2-二亚油烯基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)、1,2-二亚麻基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLenDMA)、1,2-二亚油烯基氨基甲酰基氧基-3-二甲基氨基丙烷(DLin-C-DAP)、1,2-二亚油烯基氧基-3-(二甲基氨基)乙酰氧基丙烷(DLin-DAC)、1,2-二亚油烯基氧基-3-吗啉代丙烷(DLin-MA)、1,2-二亚油酰基-3-二甲基氨基丙烷(DLinDAP)、1,2-二亚油烯基硫代-3-二甲基氨基丙烷(DLin-S-DMA)、1-亚油酰基-2-亚油烯基氧基-3-二甲基氨基丙烷(DLin-2-DMAP)、1,2-二亚油烯基氧基-3-三甲基氨基丙烷氯化物盐(DLin-TMA.Cl)、1,2-二亚油酰基-3-三甲基氨基丙烷氯化物盐(DLin-TAP.Cl)、1,2-二亚油烯基氧基-3-(N-甲基哌嗪并)丙烷(DLin-MPZ)或3-(N,N-二亚油烯基氨基)-1,2-丙二醇(DLinAP)、3-(N,N-二油烯基氨基)-1,2-丙二醇(DOAP)、1,2-二亚麻基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)、2,2-二亚油烯基-4-二甲基氨基甲基-[1,3]-二氧戊环(DLin-K-DMA)或其类似物、(3aR,5s,6aS)-N,N-二甲基-2,2-二((9Z,12Z)-十八-9,12-二烯基)四氢-3aH-环戊[d][1,3]间二氧杂环戊烯-5-胺(ALN100)、(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基4-(二甲基氨基)丁酸酯(MC3)、1,1'-(2-(4-(2-((2-(双(2-‘)氨基)乙基)(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)哌嗪-1-基)乙基氮烷二基)二十二烷-2-醇(TechG1)、1,2-二亚油烯基氧代-3-(2-N,N-二甲基氨基)乙氧基丙烷(DLin-EG-DMA)或它们的混合物。
在一些实施方案中，LNP包含选自以下的一种或多种分子：聚乙烯亚胺(PEI)和聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)和N-乙酰半乳糖胺(Gal-Nac)，所述分子适用于肝脏递送。在一些实施方案中，LNP包含如例如美国专利号5,985,826中所描述的脏脏导向性化合物，所述专利以引用的方式整体并入本文。已知GalNAc靶向在哺乳动物肝细胞上表达的去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)。参见Hu等人Protein Pept Lett.2014；21(10):1025-30。
在一些实例中，本公开的基因转移构建体可与PEI或其衍生物，如聚乙烯亚胺-聚乙二醇-N-乙酰半乳糖胺(PEI-PEG-GAL)或聚乙烯亚胺-聚乙二醇-三-N-乙酰半乳糖胺(PEI-PEG-triGAL)衍生物一起配制或复合。
在一些实施方案中，LNP是缀合脂质，所述缀合脂质的非限制性实例包括聚乙二醇(PEG)脂质，包括但不限于PEG-二酰基甘油(DAG)、PEG-二烷基氧基丙基(DAA)、PEG-磷脂、PEG-神经酰胺(Cer)或它们的混合物。PEG-DAA缀合物可以是例如，PEG-二月桂基氧基丙基(C12)、PEG-二肉豆蔻基氧基丙基(C14)、PEG-二棕榈基氧基丙基(C16)或PEG-二硬脂基氧基丙基(C18)。
在实施方案中，纳米颗粒是直径小于约1000nm的颗粒。在一些实施方案中，本公开的纳米颗粒具有约500nm或更小、或400nm或更小、或300nm或更小、或200nm或更小、或100nm或更小的最大尺寸(例如，直径)。在一些实施方案中，本发明的纳米颗粒具有介于约50nm与约150nm之间、或介于约70nm与约130nm之间、或介于约80nm与约120nm之间或介于约90nm与约110nm之间的最大尺寸。在一些实施方案中，本发明的纳米颗粒具有约100nm的最大尺寸(例如，直径)。
在一些方面，根据本公开的组合物可通过体内遗传修饰方法递送。在一些实施方案中，根据本公开的基因修饰可通过离体方法进行。
因此，在一些实施方案中，提供了一种用于降低患者中的总胆固醇和/或低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的方法，所述方法包括向有需要的患者施用根据本公开的任何实施方案或实施方案的组合的组合物。所述方法包括通过合适的途径递送所述组合物，包括静脉内或腹膜内施用，或施用至肝脏，任选地施用至门静脉或肝实质。
在一些方面，本发明提供了一种离体基因治疗方法。因此，在一些方面，提供了一种用于降低患者中的总胆固醇和/或LDL-C的方法，所述方法包括(a)使从患者获得的细胞与根据本公开的实施方案的组合物接触；以及(b)将所述细胞施用于有需要的患者。
在实施方案中，所述方法还包括使所述细胞与：编码任选地来源于家蚕、热带爪蟾、粉纹夜蛾、马铁菊头蝠、埃及果蝠、苍白矛吻蝠、大鼠耳蝠、小棕蝠、大狐蝠、库氏伏翼、黑猩猩、獒蝠或智人的转座酶和/或其工程化型式的核酸构建体和/或与编码靶向PCSK9的微小RNA的核酸构建体接触。
在一些实施方案中，本文所述的体内和离体方法可治疗家族性高胆固醇血症、常见高胆固醇血症、甘油三酯升高、胰岛素抵抗、代谢综合征和以胆固醇水平升高为特征的其它疾病。
在一些方面，提供了一种用于治疗和/或减轻FH的离体方法，所述方法包括(a)使从患者获得的细胞与根据本公开的实施方案的组合物接触，以及(b)将所述细胞施用于有需要的患者。在一些实施方案中，FH是纯合FH(HoFH)。在一些实施方案中，FH是杂合FH(HeFH)。在一些实施方案中，FH的特征在于APOB、LDLR和PCSK9中的一者或多者中的一个或多个突变。这些致病性突变可使用所描述的用于治疗和/或减轻血清中的高LDL-C水平的方法进行纠正。
在一些方面，提供了用于治疗和/或减轻FH的方法，所述方法包括向有需要的患者施用根据本公开的实施方案的组合物。在这种体内方法中，使用本文所述的任何技术施用所述组合物。
在实施方案中，用于治疗和/或减轻FH的方法还包括施用靶向PCSK9的miRNA。
离体基因疗法的优点之一是能够在患者施用前对转导的细胞进行“取样”。这有助于功效，并且允许在将细胞引入患者中之前进行安全性检查。例如，在输注产品之前可评估转导效率和/或整合的克隆性。肝脏具有独特的再生能力，其中实质细胞和非实质细胞两者都有助于这一过程。肝脏损伤后，肝细胞可转变为部分去分化的祖细胞，其产生可恢复器官的原始大小和正常功能的肝细胞和胆管上皮细胞。然而，原代人肝细胞(PHH)在体外不能自发分裂。这是离体疾病建模和针对肝脏的基于细胞的疗法的重要限制。尽管经遗传修饰的细胞的离体移植是肝脏移植的有吸引力的替代方案，但迄今为止，使用这项技术的尝试都没有成功。外科肝脏移植对于一些遗传性和获得性肝脏疾病仍然是治愈性/姑息性的，但由于缺少供体而受到阻碍。参见例如，McDiarmid,Liver Transpl 2001；7:48-50。
在一些实施方案中，分离的细胞是肝细胞，所述肝细胞可以是经修饰的肝细胞。在一些实施方案中，分离的细胞是原代人肝细胞(PHH)。在一些实施方案中，分离的细胞是诱导型多能干细胞。
诱导型多能干细胞(iPSC)具有充当干细胞移植的替代物的潜力。成体细胞重编程成iPSC引导成纤维细胞至肝细胞的转分化，从而绕过多能状态。参见例如，Yu等人(2013).Cell Stem Cell 13:328-40；Takahashi和Yamanaka(2006).Cell 126:663-76；Zhu等人(2014)Nature 508:93-7。iPSC具有固有自我更新能力和分化为三个胚层中的任一个的潜力，从而允许它们产生用于治疗先天性肝病的大量基因纠正的可移植肝细胞。然而，用于移植的iPSC的产生受到表观遗传异常和染色体重排的发生以及畸胎瘤的形成的限制。参见例如，Lian和Zhang(2013).Cell Stem Cell13:149-59；Si-Tayeb等人(2010)Hepatology 51:297-305；Ma等人(2014)Nature 511:177-83。
肝细胞通常不被认为是离体型遗传操作的良好候选物，因为它们在没有肝损伤的情况下处于静止状态，但最近的研究已经证明，它们的增殖可在体外诱导，尽管还没有达到人基因疗法所需的程度。Levy等人Nat Biotechnol 2015；33:1264-71。然而最近，Unzu等人开发了一种通过将人原代肝细胞离体暴露于生长因子和模拟Wnt、EGF和FGF信号传导的小分子的混合物而产生增殖性人肝祖细胞(HPC)的方法，所述方法导致PHH有效重编程为前体细胞。Unzu等人Hepatology 2019；69:2214-31。本公开提供了可有效用于离体基因修饰的组合物和方法。
在一些实施方案中，本文所述的体内方法和离体方法中的任一者改善患者的心血管健康。在一些实施方案中，所述方法是基本上非免疫原性的。
在一些实施方案中，所述方法需要单一施用。因此，本发明可提供仅一次性治疗剂，其可显著改善目前的治疗方案，目前的治疗方案通常是终生的并且涉及多种药物和/或程序(例如，LDL单采血液成分术)。
在一些实施方案中，所述方法刺激和/或增加肝细胞中的LDL代谢。在一些实施方案中，总胆固醇和/或LDL-C的降低是持久的。
在一些实施方案中，所述方法允许治疗和/或减轻冠状动脉疾病(CAD)。在一些实施方案中，所述方法允许治疗和/或减轻动脉粥样硬化。
在一些实施方案中，相对于在没有所述施用的情况下总胆固醇和/或LDL-C的水平，所述方法提供总胆固醇和/或LDL-C的大于约40％、或大于约50％、或大于约60％、或大于约70％、或大于约80％或大于约90％降低。
在一些实施方案中，所述方法将血清中的LDL-C水平降低至小于500mg/dL(小于约13mmol/L)。在一些实施方案中，所述方法将血清LDL-C水平降低至小于约450mg/dL、或小于约400mg/dL、或小于约350mg/dL、或小于约300mg/dL、或小于约250mg/dL、或小于约200mg/dL或小于约150mg/dL。在一些实施方案中，所述方法将血清LDL-C水平降低至小于约130mg/dL。
在一些实施方案中，本发明的组合物和方法允许降低PCSK9，这可通过使用靶向PCSK9的微小RNA(miRNA)来实现。
在实施方案中，本发明的基因靶向组合物可敲低PCSK9。在实施方案中，本发明的基因靶向组合物可防止LDLR和VLDLR降解和转换。
在实施方案中，本发明的基因靶向组合物包含靶向PCSK9的微小RNA。在实施方案中，靶向PCSK9的微小RNA序列在与LDLR或VLDLR基因不同的启动子控制下。在实施方案中，靶向PCSK9的微小RNA序列在CAG启动子控制下(参见，例如Gene.79(2):269-77)。在实施方案中，靶向PCSK9的微小RNA序列是在miR-451支架的环境中，不希望受理论束缚，所述miR-451支架可通过非规范Dicer独立途径强制miRNA加工，并避免由于过客链活性而产生脱靶效应。Herrera-Carrillo等人,Nucleic Acids Res 2017；45:10369-79。
在实施方案中，本发明的基因靶向组合物可用于涉及包含基因靶向组合物的额外组合物的方法中，所述基因靶向组合物包含靶向PCSK9的微小RNA。在实施方案中，靶向PCSK9的微小RNA序列在与LDLR或VLDLR基因不同的启动子控制下。在实施方案中，靶向PCSK9的微小RNA序列在CAG启动子控制下(参见，例如Gene.79(2):269–77)。在实施方案中，靶向PCSK9的微小RNA序列在miR-451支架的环境中。
在实施方案中，靶向PCSK9的微小RNA是miR-24、miR-191、miR-195、miR-222和miR-224中的一者。
PCSK9通过主要在肝脏中与LDL受体形成复合物而促进所述受体的降解。LDL受体定位于细胞表面上，与LDL结合，并且之后复合物通过内吞作用转运至内体，并在酸性条件下释放LDL。LDL被降解为氨基酸和胆固醇，而LDL受体被转运至细胞表面，与LDL结合并带至细胞中。LDL受体至细胞表面的这种再循环发生大约150次。PCSK9由肝细胞中的内质网分泌，与细胞膜上的LDL受体结合，并且被带至细胞中。PCSK9所结合的LDL受体在溶酶体中降解而未再循环。PCSK9还调控LDLR横向同源物VLDLR，并且通过调控脂肪VLDLR水平来限制脂肪生成。
因为PCSK9促进LDL受体的降解，所以靶向PCSK9可影响血浆中的LDL胆固醇水平。人中的功能丧失突变与低LDL-C水平和较低的心血管疾病发病率相关。参见Cohen等人,NEngl J Med 2006；354:1264-72；Miyake等人Atherosclerosis 2008；196:29-36。PCSK9功能的完全丧失不被认为影响人或哺乳动物的存活力或健康。参见Zhao等人,Am J HumGenet 2006；79:514-23；Rashid等人,Proc Natl Acad Sci USA 2005；102:5374-9。PCSK9功能的丧失导致LDL-C的降低，并且在一项超过15年的回顾性结果研究中，PCSK9的一个拷贝的丧失显示转变LDL-C降低，并导致保护免受心血管疾病的风险:益处增加。Cohen等人,NEngl J Med 2006；354:1264-72。
RNA干扰和相关的RNA沉默途径利用高度特异性的内源性机制来调控基因表达。小干扰RNA(siRNA)通过形成效应RNA诱导的沉默复合物而以序列特异性方式选择性地且催化地沉默其互补的靶信使RNA(mRNA)的翻译。最近，英立西兰(一种siRNA)显示降低具有升高的LDL胆固醇水平的处于高心血管风险的患者中的PCSK9和LDL胆固醇水平。Ray等人,NEngl J Med 2017；376:1430-40。使用PCSK9序列特异性miRNA构建体的PCSK9沉默可被设计为具有高基因沉默活性。使用miRNA miR-451支架的方法可通过非规范的Dicer独立途径强制miRNA加工，并避免由于过客链活性而产生脱靶效应。Herrera-Carrillo等人,NucleicAcids Res 2017；45:10369-79。
在一些实施方案中，递送编码任选地来源于家蚕、热带爪蟾或粉纹夜蛾的转座酶和/或其工程化型式的核酸构建体。
在一些实施方案中，使细胞与编码任选地来源于家蚕、热带爪蟾或粉纹夜蛾的转座酶和/或其工程化型式的核酸构建体接触。
在一些实施方案中，转座酶来源于家蚕、热带爪蟾、粉纹夜蛾、马铁菊头蝠、埃及果蝠、苍白矛吻蝠、大鼠耳蝠、小棕蝠、大狐蝠、库氏伏翼、黑猩猩、獒蝠或智人，和/或其工程化型式。
在一些实施方案中，治疗和/或减轻跳FH的方法在没有类固醇治疗的情况下进行。类固醇，如糖皮质激素类固醇(例如，强的松)已被用于通过减少免疫应答来提高基于AAV的基因疗法的有效性。然而，类固醇治疗并非没有副作用。本公开的组合物和方法可以是基本上非免疫原性的，并且因此可消除对类固醇治疗的需要。
然而，在一些实施方案中，所述方法与类固醇治疗组合进行。
在一些实施方案中，所述方法可用于将所描述的组合物与一种或多种额外治疗剂组合施用。额外治疗剂的非限制性实例包括以下中的一者或多者：他汀、依折麦布、胆汁酸结合树脂、依洛尤单抗、英立西兰、洛美他派和米泊美生。因此，在一些实施方案中，所述方法还包括施用以下中的一者或多者：他汀、依折麦布、胆汁酸结合树脂、依洛尤单抗、英立西兰、洛美他派和米泊美生。在一些实施方案中，他汀是以下中的一者或多者：阿托伐他汀(LIPITOR)、氟伐他汀(LESCOL)、洛伐他汀(ALTOCOR；ALTOPREV；MEVACOR)、匹伐他汀(LIVALO)、普伐他汀(PRAVACHOL)、瑞舒伐他汀钙(CRESTOR)和辛伐他汀(ZOCOR)。
在多个方面，提供了包含基因转移构建体的组合物。在实施方案中，所述组合物包含(a)编码极低密度脂蛋白受体蛋白(VLDLR)或低密度脂蛋白受体蛋白(LDLR)或其功能片段的核酸，其中所述VLDLR是人VLDLR，所述人VLDLR包含SEQ ID NO:4的核苷酸序列或与所述核苷酸序列具有约90％同一性的变体，或SEQ ID NO:5的核苷酸序列或与所述核苷酸序列具有约90％同一性的变体；(b)肝脏特异性启动子，其中所述肝脏特异性启动子是人LP1启动子，所述人LP1启动子具有SEQ ID NO:15的核酸序列或与所述核酸序列具有至少约90％同一性的变体；和(c)非病毒载体，所述非病毒载体包含一个或多个转座酶识别位点和一个或多个反向末端重复序列(ITR)或末端序列。
在一些实施方案中，所述方法消除对用以下中的一者或多者治疗的需要：他汀、依折麦布、胆汁酸结合树脂、依洛尤单抗、英立西兰、洛美他派和米泊美生。本发明的方法和组合物可提供总胆固醇和/或LDL-C水平的持久降低，并且因此可减少或消除对额外治疗剂的需要。
此外，在一些实施方案中，所述方法消除对LDL单采血液成分术的需要。
在一些实施方案中，根据本公开的用于非病毒基因疗法的组合物通过各种递送途径施用，包括静脉内、门静脉内、流体动力递送和直接注射。在一些实施方案中，施用是静脉内施用。在一些实施方案中，施用是门静脉内或直接注射到肝实质中。例如，在一个实施方案中，施用是使用对流增强递送(CED)的肝实质内注射。CED是在微步输注套管的尖端产生压力梯度以通过中枢神经系统的间隙空间直接递送治疗剂的技术。Mehta等人(2017).Neurotherapeutics:the Journal of the American Society for ExperimentalNeuroTherapeutics,14(2),358–371。
在一些实施方案中，将细胞施用于患者是静脉内施用。静脉内施用是常用的方法，然而在一些情况下可能需要增加的总剂量并且可能导致非靶器官的转导。在一些情况下，静脉内施用也可增加转导卵巢和睾丸中的生殖细胞的机会。这在使用转座酶的整合基因疗法中是不合乎需要的。
在一些实施方案中，施用至细胞是动脉内、门静脉内和或逆行静脉内途径。
在一些实施方案中，将细胞施用于患者是静脉门静脉内施用。
在一些实施方案中，将细胞施用于患者是直接肝实质内施用。在人中，经皮肝活检是将长针通过皮肤、皮下组织、肋间肌和腹膜引入肝脏中以获得肝组织标本的程序。这种程序通常在门诊进行。在一些实施方案中，直接注射可遵循类似的程序，并且微套管可用于通过对流增强递送(CED)注射组合物。CED是依赖于压力驱动的整体流动的直接输注技术。目前它被用于向中枢神经系统(CNS)递送基因疗法。整体流动由来自泵的小压力梯度产生，所述压力梯度推动溶质通过定向在CNS内的导管，其提供比通过扩散可实现的更大体积的药物分布。与传统对流递送相比，CED产生更高的治疗剂浓度，输注时间更长，并且输注部位的分布体积更大，从而产生最小组织损伤。CNS中的输注速率在3至15微升/分钟的范围内。在一些实施方案中，输注速率可高于15微升/分钟。
在一些实施方案中，肝活检在成像引导下进行。在一些实施方案中，使用成像技术引导肝活检，所述成像技术包括超声引导、经颈静脉、计算机断层摄影术(CT)、磁共振成像(MRI)、腹腔镜和内窥镜超声。在一些实施方案中，可使用肝右叶的经皮CED输注(肝体积的5/6)。
在一些实施方案中，根据本公开的组合物包含药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
配制合适的药物组合物的方法是本领域中已知的，参见例如，Remington:TheScience and Practice of Pharmacy,第21版,2005；和the books in the series Drugsand the Pharmaceutical Sciences:a Series of Textbooks and Monographs(Dekker,N.Y.)。例如，适于可注射使用的药物组合物可包括无菌水溶液(在水溶性的情况下)或分散液以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。对于静脉内施用，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF,Parsippany,N.J.)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，组合物必须是无菌的并且必须具有达到容易注射的程度的流动性。在制造和储存条件下，所述组合物应该稳定并且必须在贮存中防止诸如细菌和真菌的微生物的污染作用。载体可以是溶剂或分散介质，所述溶剂或分散介质含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。可例如通过使用包衣(如卵磷脂)、通过在分散液的情况下维持所需粒度以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。防止微生物的作用可通过不同的抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等来实现。在许多情况下，将优选在组合物中包含等渗剂，例如糖、多元醇(如甘露醇、山梨糖醇)、氯化钠。可通过在组合物中包含延迟吸收的剂(例如单硬脂酸铝和明胶)而使可注射组合物的吸收延长。
无菌可注射溶液可通过将所需量的活性化合物(根据需要)与以上列举的成分中的一种或其组合一起并入适当溶剂中、随后过滤灭菌来制备。通常，通过将活性化合物并入无菌媒介物中来制备分散液，所述无菌媒介物含有基本分散介质以及来自以上列举的那些的所需其它成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，其产生活性成分加来自其先前无菌过滤溶液的任何其它所需成分的粉末。
治疗性化合物可与将保护治疗性化合物免于从身体快速消除的载体一起制备，诸如受控释放制剂，包括植入物和微囊化递送系统。可使用生物可降解的、生物相容的聚合物，如胶原蛋白、乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐(例如聚[1,3-双(羧基苯氧基)丙烷-共-癸二酸](PCPP-SA)基质、脂肪酸二聚体-癸二酸(FAD-SA)共聚物、聚(丙交酯-共-乙交酯))、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯、聚乙二醇包被的脂质体和聚乳酸。此类制剂可使用标准技术制备，或者例如从Alza Corporation和Nova Pharmaceuticals,Inc商业上获得。脂质体悬浮液也可用作药物上可接受的载体。这些可根据本领域技术人员已知的方法，例如，如美国专利号4,522,811中所述来制备。可使用半固体、胶凝、软凝胶或其它制剂(包括受控释放)，例如当需要施用至手术部位时。制备此类制剂的方法是本领域中已知的，并且可包括使用生物可降解的、生物相容的聚合物。参见，例如Sawyer等人,Yale J Biol Med.2006；79(3-4):141-152。
在实施方案中，提供了一种在转座酶存在下使用本文所述的基因转移构建体转化细胞以产生稳定转染的细胞的方法，所述稳定转染的细胞由目标基因稳定整合到细胞中而产生。在实施方案中，稳定整合包括将多核苷酸引入到细胞的染色体或微型染色体中并且因此成为细胞基因组的相对永久部分。
在实施方案中，本发明涉及确定目标基因，例如VLDLR或LDLR是否成功转移到宿主的基因组中。在一个实施方案中，所述方法可包括进行与位于目标基因侧翼的引物的聚合酶链反应；确定所获得的经扩增的聚合酶链反应产物的大小；以及将所获得的产物的大小与参考大小进行比较，其中如果所获得的产物的大小与预期大小相匹配，则所述目标基因成功地转移。
在实施方案中，提供了一种包含如本文所述的组合物(例如，但不限于包含基因转移构建体和/或转座酶的组合物)的宿主细胞。在各实施方案中，宿主细胞是原核或真核细胞，例如哺乳动物细胞。
在实施方案中，提供了一种转基因生物体，所述转基因生物体可包含已经通过本公开的方法转化的细胞。在一个实例中，生物体可以是哺乳动物或昆虫。当生物体是哺乳动物时，所述生物体可包括但不限于小鼠、大鼠、猴、狗、兔等。当生物体是昆虫时，所述生物体可包括但不限于果蝇、蚊子、螟蛉虫等。
所述组合物可与施用说明书一起包括在容器、药盒、包装或分配器中。
本文还提供了药盒，所述药盒包括：i)本发明的任何上述基因转移构建体，和/或本发明的任何上述细胞，以及ii)容器。在某些实施方案中，药盒还包括其使用说明书。在某些实施方案中，任何上述药盒还可包含重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含编码转座酶的核酸序列。
通过以下非限制性实施例进一步描述本发明。
实施例
实施例1：转座子表达载体的设计
使用LEAPIN转座酶技术(ATUM,Newark,CA)设计并克隆了非病毒转座子表达载体。转座子表达载体包含与LP1启动子连接并由LP1启动子驱动的人VLDLR。还产生了包含小鼠LP1-vldlr的转座子表达载体。使用人LDRL-/-个体多能干细胞(iPSC)疾病细胞系或转化的人或胚胎干细胞(ESC)。其它测试的细胞系包括人肝细胞系(HepG2、Huh7)和非肝细胞系(CHO、HT1080和HEK293)。使用B6.129S7-Ldlrtm1Her/J(JAX)小鼠模型(ldlr-/-)。
图4A、4B、4C、4D、4E、4F、4G和4H示出在体外转染和转座功效评估以及人干细胞中的表达研究中使用的构建体和ldlr-/-小鼠中的LP1-荧光素酶生物分布的示意性图示。图4A示出具有磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子的转座子构建体。图4B和4C示出用于确定所设计的表达载体的转座功效的LP1-GFP转座子构建体。图4D示出用于评估分化为肝细胞后用VLDLR转染干细胞的表型后果的LP1-VLDRL构建体。制备包含小鼠、猪、食蟹猴和人序列的LP1-VLDRL构建体。图4E示出通过静脉内、门静脉内和肝实质内途径施用至肝脏以评估使用不同途径的生物分布的LP1增强的人VLDLR(e-LDLR)构建体。
此外，构建体被设计为包含miRNA来敲低PCSK9，以防止LDLR和VLDLR降解和转换。图4F示出在不同于LP1的启动子控制下的具有PCSK9靶向miRNA的构建体，其中所述构建体可通过静脉内、门静脉内或肝实质内途径施用至肝脏，以评估使用不同途径的生物分布和剂量范围。图4G示出包含LP1-VLDRL转座子和含有在不同于LP1的启动子控制下的PCSK9靶向miRNA的转座子的构建体。图4H示出包含LP1-e-LDLR转座子和含有在不同于LP1的启动子控制下的PCSK9靶向miRNA的转座子的构建体。
实施例2：使用转基因小鼠的体内实验
此实施例中的实验包括LP1-vldlr和LP1-荧光素酶构建体静脉内、门静脉内和肝实质内注射到ldlr-/-小鼠中，以确定剂量、耐受性、生物分布、安全性和功效。设计YucatanLdlr-/-转基因小型猪中的类似实验，以显示适当构建体和施用程序的安全性、耐受性和功效。可在GLP环境中，在Yucatan猪或食蟹猴中进行生物分布、剂量反应、药代动力学、药效学、安全性和病理学研究。
实施例3：测定肝细胞系和非肝细胞系中的转座功效和转座酶(Ts):转座子(Tn)比率
通过在用PGK1-GFP Tn转染后，肝细胞系和非肝细胞系(即，Huh7、HepG2、HT1801)的荧光激活细胞分选(FACS)分析来测定在组成型磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子控制下表达GFP的转座子的转座功效。这些构建体包含LEAPIN转座酶。图4A示出可在此实施例中使用的载体的实例。使用各种肝脏特异性启动子，包括以上表1中列出的那些。
实施例4：选择肝脏特异性启动子(LSP)
基于如上以上实施例3中测定的转座功效和Ts:Tn比率选择肝细胞系和非肝细胞系。使用不同肝脏特异性启动子(表1)的绿色荧光蛋白(GFP)表达水平通过用转座子(图4A和4B)和转座酶共转染细胞系来测定。肝脏特异性启动子如Kramer等人Mol Ther 2003；7:375-85中所述进行评价。转染后1天、1周、2周和4周通过FACS分析测定GFP表达。
实施例5：评价包含人VLDLR、增强的LDLR(L339D、K830R、C839A)以及PCSK9的敲低的转座子构建体
转染实验在肝细胞系和非肝细胞系中进行，以评价旨在改善由LDLR突变引起的FH的构建体的表达。两种转座子(Tn)构建体设计包括具有人VLDLR的构建体，和具有增强的人VLDLR(e-LDLR)的构建体，所述构建体具有引入到人LDLR cDNA的编码序列中以减少与原蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/Kexin 9型(PCSK9)和LDLR的诱导降解剂(IDOL)的相互作用的氨基酸取代(L339D、K830R和C839A)。此外，构建体被设计为包含miRNA来敲低PCSK9，以防止LDLR和VLDLR降解和转换，参见图4F-4H。
选择具体的细胞系、Ts:Tn比率、强组成型LSP和最安全的Ts构建体(即定义的位点特异性整合)，如以上实施例3和4中所述。通过前面描述的方法，在未转染的和转染的细胞中进行FACS分析，以评价LDLR和VLDLR。参见Somanathan等人Circ Res 2014；115:591-9；Kozarsky等人(1996).Nat Genet 3:54-62；Turunen等人(2016).Mol Ther 2016；24:620-35。
实施例6：产生用于FH患者iPSC和转基因ldlr-/-小鼠和大型动物模型中的体内研究的转座子(Tn)和转座酶(Ts)构建体
转座子(Tn)和转座酶(Ts)构建体被鉴定用于患者的LDRL-/-干细胞(iPSC或ESC)中的体外测试和转基因ldlr-/-小鼠中的体内测试(包括荧光素酶生物分布)。所使用的构建体在图4B、4C、4D和4F中示意性地示出。一些研究在大型动物中进行，例如Yucatan小型猪LDRL-/-(野猪(Sus scrofa))和非人灵长类动物(食蟹猴(cynomolgus monkeys；macacafascicularis))。
实施例7：用LP1-VLDLR(Hs)/MLT转座酶转染的Huh-7细胞中的mRNA表达
此研究的目的是通过在HUH7细胞中产生两种转基因细胞系–LP1-VLDLR/PGK-GFP和LP1-VLDLR来证明MLT转座酶1和MLT转座酶2的整合效率。
细胞系产生
将HUH7细胞使用特定核转染条件(三种不同的4D-NucleofectorTM溶液与15种不同的NucleofectorTM程序组合，加1个对照(无核转染))，使用两种不同的质粒(LP1-VLDLR/PGK-GFP和单独LP1-VLDLR)与本公开的MLT转座酶(SEQ ID NO:9)的组合转染。72小时后，施加抗生素处理(Kan+)以选择阳性转染克隆。包含选择抗生素的细胞培养基每2-3天更换一次，并在14天内每天目测检查细胞的细胞毒性。在14天后使用GFP信号的免疫荧光检测定量MLT转座酶的基因组编辑能力。
细胞系验证
在细胞系的产生和扩增过程中，使用阳性(HEK293)和阴性对照(HUH7)细胞系。进行微滴数字TM PCT(ddPCR)来定量每个细胞LP1-VLDLR转基因拷贝的数量。两种阳性对照是(1)单独LP1-VLDLR质粒；和(2)人基因组DNA(长度125-3000bp的gBlocksTM基因片段双链DNA片段，其是双链DNA的行业标准)。阴性对照是：(1)HEK293细胞；(2)未处理的HUH7细胞；(3)HUH7细胞+MLT转座酶；和(4)H2O对照。
进行qPCR以定量所述转基因在所有细胞系中的表达水平。使用了三种阳性对照：(1)HEK293细胞；(2)质粒；和(3)gBlocksTM基因片段。使用了三种阴性对照：(1)HUH7细胞；(2)HUH7细胞+MLT转座酶；(3)H2O对照。单独LP1-VLDLR用作随机整合的对照。
LDL-C摄取方案
Abcam LDL摄取试剂盒(目录号ab133127)根据供应商说明书使用。经核转染的HUH7细胞在70％-80％的汇合度下使用。用LDL-DylightTM 549对HUH7细胞进行染色，以检测LDL摄取到经核转染的细胞中。使用赫斯特染色用于定量细胞核数量进行的高内涵成像进行读出。
所使用的试剂
表2示出在本试验中使用的试剂。
Figure BDA0003911510150000501
结果
图6示出Huh7细胞在核转染后24小时的GFP表达；四个图(从左至右)示出使用NucleofectorTM溶液试剂盒(Lonza,Basel,Switzerland)、程序CA-137、CM-150、CM-138和EO-100获得的数据。每个图的顶行示出GFP荧光，并且底行示出亮场显微镜数据。图7示出Huh7细胞在核转染后4天的GFP表达结果；四个图(从左至右)示出使用NucleofectorTM溶液试剂盒、程序CA-137、CM-150、CM-138和EO-100获得的数据。每个图的顶行示出GFP荧光，并且底行示出亮场显微镜数据。图8A、8B、8C和8D示出核转染后24小时核转染效率的定量结果：用NucleofectorTM溶液试剂盒、程序CA-137(图8A)、CM-150(图8B)、CM-138(10,700活细胞，Q2％GFP:51％)(图8C)和EO-100(图8D)获得的数据。每个图的顶行示出GFP荧光，并且底行示出FACS图：(1)10,700活细胞，Q2％GFP:51％；(2)13,300活细胞，Q2％GFP:39％；(3)13,800活细胞，Q2％GFP:45％；以及(4)10,800活细胞，Q2％GFP:71％。
图9A、9B、9C、9D、9E、9F、和9G示出转染后7天，在不同条件下经转染的Huh7细胞的FACS图，如下：(图9A)无程序–阴性测定对照；(图9B)pmaxGFP–阳性测定对照；(图9C)LP1-VLDLR/PGK-GFP质粒(即包含LP1启动子、极低密度脂蛋白受体(VLDLR)基因和PGK启动子驱动的增强表达(eGFP)的质粒)；(图9D)LP1-VLDLR/PGK-GFP+MLT1；(图9E)LP1-VLDLR/PGK-GFP+MLT2；(图9F)MLT1；以及(图9G)MLT 2。以下表3提供关于图9A至9G的每种转染的信息。
表3.图9A至9G中的信息的描述
Figure BDA0003911510150000511
图9A、图9B、图9C、图9D、图9E、图9F和图9G中的FACS图显示，与此研究中的阴性对照(图1、6和7)相比时，LP1-VLDLR/PGK-GFP+MLT 1和LP1-VLDLR/PGK-GFP+MLT 2(图4和5)两者均能够有效转染Huh7细胞。观察到没有任何转座酶的LP1-VLDLR/PGK-GFP具有与LP1-VLDLR/PGK-GFP和转座酶(MLT 1或MLT 2)的组合相似的表达。这表明转座酶的存在不会不利地影响Huh7细胞的活力。
图10，示出未处理的Huh7细胞相比用VLDLR质粒和MLT转座酶2处理的Huh7细胞的LDL-C摄取，显示当用VLDLR质粒和MLT转座酶2处理Huh7细胞时，Huh7细胞的LDL-C摄取中存在约30％-50％增加。
图11，示出在不同条件下VLDLR表达的qPCR结果，显示样品1(LP1-hVLDLR)和样品2(LP1-hVLDLR+PGK-GFP)中MLT转座酶2的存在增加VLDLR表达。这证明与对照相比时，人肝细胞(Huh7细胞)中LP1-hVLDLR的表达增加大于10倍。
总之，此研究尤其证明了当用LP1-hVLDLR处理Huh7细胞时，VLDLR mRNA表达的表达增加。此研究还已经证明，与未处理的细胞系相比，用VLDLR质粒和MLT转座酶2处理时，LDL-C摄取从约30％增加至50％(图10)。
实施例8：用于测定转座活性的流式细胞术分析
此研究评估了使用流式细胞术以测定经转染细胞系的体外转座。在此研究中，使用流式细胞术以测量在不同肝细胞系和非肝细胞细胞系中GFP的存在。
将样品在配备有15mW风冷488氩离子激光器的流式细胞仪(Becton DickinsonImmunocytometry Systems,BDIS)上进行分析。绿色GFP荧光在530/30-nm带通(BP)滤波器后采集。在荧光通道之间采用电子补偿以去除残留光谱重叠。GFP荧光数据显示在四个十进制对数尺度上。低流速设置(12μL/min)用于样品采集，以提高直方图上的变异系数。在每个样品上，在单峰门中收集至少10,000个事件。多变量数据的分析采用CELL Questy软件(BDIS)进行，并且直方图的细胞周期分析采用ModFit LTy软件(Verity software House,Topsham,ME)进行。
表4示出在本试验中使用的试剂。
Figure BDA0003911510150000521
Figure BDA0003911510150000531
在此研究中，DNA供体(质粒)候选物(图12)在细胞系中通过流式细胞术通过其GFP表达进行测试和测量。
这些体外临床前发现研究的结果提供使用转座子构建体来治疗人类疾病的概念验证。此外，此研究中获得的数据支持使用流式细胞术来通过测量供体GFP定量经转座细胞的数量。
实施例9：Huh-7人肝细胞中PGK-GFP和LP1-VLDLR的共转染
此研究的目的是评估用PGK-GFP和LP1-VLDLR共转染的有或没有根据本公开的MLT转座酶1和MLT转座酶2的VLDLR/PGK-GFP和VLDLR转基因的整合。
HUH7细胞系制备
使用4D-NucleofectorTM溶液V与15种不同的NucleofectorTM程序和1个对照(无核转染)对HUH7细胞系进行测试。对于所有后续实验，在24小时后选择效率最高且死亡率最低的NucleofectionTM条件。
使用先前预定的核转染条件，使用两种不同的质粒(单独LP1-VLDLR/PGK-GFP和LP1-VLDLR)与两种不同的转座酶-MLT转座酶1和MLT转座酶2的组合转染HUH7细胞。72小时后，施加抗生素处理(Kan+)以选择阳性转染克隆。含有选择抗生素的细胞培养基每2-3天更换一次，并在14天内每天目测检查细胞的细胞毒性。在14天后使用GFP信号的免疫荧光检测定量和比较两种转座酶(MLT1和MLT 2)的基因组编辑能力。
测定优化
在细胞系的产生和扩增过程中，出于优化目的使用阳性(HEK293)和阴性对照(HUH7)细胞系。设计用于ddPCR测定的特异性Taqman探针以检测VLDLR转基因来定量LP1VLDLR转基因拷贝数。用于拷贝数确定测定的参考基因。用于稳定整合的Gblock(阳性对照)和质粒特异性探针(阴性对照)的VIDLR表达水平。
在蛋白质印迹和免疫细胞化学(ICC)实验中，在两种稀释度下对至多两种抗体进行测试。相同的两种抗体用于在两种细胞系中进行ICC。选择特定稀释度的单一抗体进行进一步实验。
使用LDL摄取测定试剂盒(Abcam；目录号ab133127)评估LDL摄取。遵循制造商提供的方案，没有修改。将细胞以至多四种不同的密度涂铺。实验以技术三次重复进行。进行高内涵成像和图像分析。计算细胞内荧光LDL的强度。
使用Amaxa NucleofectorTM程序CA-137(Lonza)对新产生的VLDLR/PGK-GFP和VLDLR细胞系中的VLDLR表达进行评估。HEK293细胞用于阳性对照用，并且HUH7细胞用于阴性对照。进行ddPCR以定量每个细胞的LP1-VLDLR转基因拷贝数，并定量所述转基因在所有细胞系中的表达水平。通过蛋白质印迹进行蛋白水平下的VLDLR定量。
采用赫斯特染色进行高内涵成像和图像分析以定量细胞核数量，并使用针对人VLDLR的选定抗体进行免疫细胞化学。
试剂
表5总结在本试验中使用的试剂。
Figure BDA0003911510150000541
结果
图13A、13B和13C是对于使用图12中的基因转移构建体的有(“转座酶+”)和无(“转座酶-”)转座酶(MLT 1和MLT 2)的测定，Huh7细胞中GFP表达的图像和FACS图。图13A、13B和13C分别示出24小时(图13A)、72小时(图13B)和7天(图13C)的转座酶-测定(上)和转座酶+测定(下)的数据。
图13A、13B和13C中所示的FACs分析的结果是使用图12的供体DNA构建体产生的。24小时后，在有(转座酶+)和没有(转座酶-)转座酶的两种测定中，对于两者存在定量在约2％下的很少至没有GFP表达(图13A)。在72小时在转座酶转染的细胞中存在0％ GFP表达，而在转座酶+细胞(转座酶+LP1-VLDLR和PGK-GFP)中，在72小时观察到23％ GFP表达(图13B)。在第7天，在转座酶-细胞中存在7％ GFP表达，而在72小时在转座酶+细胞中存在21％GFP表达(图13C)。此数据通过ddPCR和FACS两者进行定量。
因此，在这些实验中获得的数据说明，转座酶+PGK-GFP和LP1-VLDLR可转座Huh7细胞，如图13A、13B和13C中所示。这些经转染的细胞的比较展示在转座酶-细胞和转座酶+细胞中的显著差异。在72小时，用转座酶+LP1-VLDLR和PGK-GFP转染的Huh7细胞显示23％ GFP表达。这表明，在72小时，转座酶+LP1-VLDLR和PGK-GFP可转染Huh7细胞，而不引起有害细胞死亡。在第7天，转座酶+转染的细胞仍然显示21％ GFP表达，而转座酶-转染的细胞(即转染中未使用转座酶)在第7天显示7％ GFP表达。当比较此数据时，可观察到，当考虑来自实验结果的对照GFP阳性细胞％时，在7天后其仍然显示14％ GFP表达，其是显著的。
实施例10：用LP1-VLDLR转座的Huh-7细胞中的LD摄取
此研究的目的是评估使用本公开的MLT转座酶(辅助RNA)和由肝脏特异性启动子LP1驱动的具有人VLDLR(密码子优化)的供体DNA构建转染细胞转座的Huh7细胞中细胞水平下的LDL摄取和调控。目的是显示在生长两周后VLDLR转基因在Huh7细胞中的成功整合。试剂盒采用人LDL。Huh7细胞通常不表达人VLDLR，但表达LDLR。预期在除了LDLR还表达VLDLR的经转座Huh7细胞中观察到LDL摄取的增加。使用DyLightTM 550作为荧光探针，以检测LDL摄取到培养的Hu-7细胞中。
方法
此研究中使用的方案是针对96孔板设计的(对于其它尺寸的板，适用于每个孔的介质/溶液的体积相应地调整)：
1.将96孔板接种3x104细胞/，并生长细胞过夜。对于HepG2细胞，在除了前生长细胞2天；
2.第二天或第三天，用实验化合物或媒介物处理细胞24小时；
3.处理结束时，用75-100μl/孔LDL-DyLightTM 550工作溶液更换培养基；
4.将细胞在37℃孵育箱中再孵育3至4小时，或持续实验方案中使用的时间段；
5.在LDL摄取孵育结束时，抽吸培养基并用新鲜培养基或PBS更换；
6.在具有能够分别测量激发波长和发射波长540nm和570nm的滤波器的显微镜下检查LDL摄取的程度。
试剂
表6总结在本试验中使用的试剂。
Figure BDA0003911510150000561
结果
Abcam LDL摄取测定试剂盒(目录号ab133127)根据供应商说明书使用，以确定用本公开的转座酶(RNA辅助酶)和LPI-VLDLR供体转座并在培养中保持14天的Huh7细胞中的LDL摄取。将用LP1-VLDLR核转染的经核转染的HUH7细胞生长14天，达到70％至80％的汇合度。用LDL-DylightTM 549对经核转染的细胞进行染色以检测LDL摄取。用高内涵成像进行读出。
图14A、14B、14C和14D示出非核转染的(未处理的)HEK293和Huh7细胞中的基线LDL摄取：图14A示出未处理的HEK293细胞，仅LDL摄取；图14B示出未处理的Huh7细胞，仅LDL摄取；图14C示出未处理的HEK293细胞，未染色；并且图14D示出未处理的Huh7细胞，未染色。如图14A、14B、14C和14D中所示，与未处理的、未染色的细胞(0％)相比，LDL摄取信号在非核转染的(未处理)的HEK293和用LDL-DylightTM 549染色的Huh7细胞两者中检测到(30％至50％)。HEK293和Huh7细胞类型两者均具有低密度脂蛋白受体(LDLR)。在常氧条件下的Huh7细胞不表达极低密度脂蛋白受体(VLDLR)，而HEK293表达LDLR和VLDLR两者。
图15A、15B、15C、15D和15E示出经转座的Huh7细胞对比非转座的Huh7细胞针对LDL摄取：图15A示出未转座的(转座酶-)HEK293细胞用于比较；图15B示出未转座的(转座酶-)Huh7细胞；图15C示出用人LP1-VLDLR质粒(pVLDLR)核转染的未转座的(转座酶-)Huh7细胞；图15D示出用人LP1-VLDLR质粒(pVLDLR)核转染的、用MLT 1转座的Huh7细胞；并且图15E示出用人LP1-VLDLR质粒(pVLDLR)核转染的、用MLT转座酶2转座的Huh7细胞。如所示，与用MLT1或MLT转座酶2转座的Huh7细胞(70％至90％)相比，在非核转染的HEK293细胞和Huh7细胞以及用LDL-DylightTM 549染色的非转座的Huh7细胞中LDL摄取信号更小(30％至50％)。
结果表明，经转座的Huh7细胞的表面上VLDLR的增加导致LDL摄取的增加。
实施例11：ldlr-/-小鼠中LNP LP1-荧光素酶/转座酶BLI的药效学剂量范围
此研究的目的是比较荧光标记的脂质纳米颗粒在体内在相同背景品系的野生型(ldlr+/+和ldlr-/-)C57BL/6小鼠中的肝脏摄取。在肝内注射测试物品后的2个时间点(第3天和第5天)通过全身生物发光成像(BLI)记录荧光素酶的表达。
此研究使用了以下脂质纳米颗粒(LNP)制剂：可电离脂质、胆固醇、磷脂和PEG-脂质。
动物组
本研究使用了专门培育的初次接受试验的小鼠，品系：ldlr-/-和野生型(ldlr+/+)C57BL/6J(Jackson Laboratories,Bar Harbor,ME)。雄性的数量：16C57BL/6J野生型(ldlr+/+)(加2个替代)/16ldlr-/-敲除(加2个替代)。开始给药时的目标年龄：约10周；和到达时的目标体重：26.9+1.7g。
在表7、表8和表9中描述此研究中使用的三个小鼠群组。
表7.动物群组1.
Figure BDA0003911510150000581
表8.动物群组2.
Figure BDA0003911510150000582
Figure BDA0003911510150000591
表9.动物群组3.
Figure BDA0003911510150000592
试剂和测试物品
表10总结在本试验中使用的试剂。
试剂
LNP(可电离脂质、胆固醇、磷脂和PEG--脂质)
MLT转座酶2
LP1荧光素酶
本研究中使用的媒介物是磷酸盐缓冲盐水(PBS)(pH 7.4)、NO Ca2+或Mg2+(储存在约4℃)。
本研究中使用的测试物品是：
●PBS：不含钙或镁的1X PBS缓冲液，注射用无菌溶液(使用27G-31G注射针)。
●测试物品1：空LNP。
●测试物品2：LNP LP1-荧光素酶2/MLT转座酶2(750ug核酸/mL)(储备液)。
表11总结测试物品的剂量，其中所述剂量在本实验中使用。
表11.测试物品和PBS的剂量。
Figure BDA0003911510150000601
*基于注射至左外侧叶的约50uL。
结果
总计8组小鼠注射不同剂量的测试物品(LP1-vldlr+MLT转座酶)或空LNP(假手术)。图16A和16B示出群组1在第3天(图16A)和第5天(图16B)的BLI。图17A和17B示出群组2在第3天(图17A)和第5天(图17B)的BLI。图18A和18B示出群组3在第3天(图18A)和第5天(图18B)的BLI。图19示出在长期维持(分别26和33天)后来自属于组6和组8的动物的BLI。
令人感兴趣地，不仅野生型小鼠，而且ldlr-/-小鼠(组5、6、7、8)也显示供体DNA的显著摄取，如图16A、16B、17A、17B、18A、18B和19中所示。空LNP对wt或ldlr-/-小鼠均无任何致死作用(图16A、16B、17A、17B)。
高剂量LNP虽然在wt小鼠中在第3天和第5天均显示供体DNA的成功转座，但在ldlr-/-小鼠中未显示任何有希望的效应(图17A和17B)。然而，高剂量LNP在wt小鼠(组2)中在第5天显示发光递减模式(图17B)。然而，中等剂量在野生型(组3)小鼠中在两天仍然有效，但在ldlr-/-(组6)小鼠中在第5天未显示功效(图17B)。令人感兴趣地，低剂量对wt和ldlr-/-小鼠均显示显著影响(图18A和18B)。当接受中等和低剂量的测试物品的两组动物(组6和8)被允许停留更长持续时间–26天和33天时，使用低剂量(组8)的动物显示来自稳定整合的荧光素酶DNA的持续发光表达(图20)。来自组2的1只动物、来自组5的2只动物和来自组6的1只动物由于手术程序死亡。
总之，低剂量的测试物品(0.35mg/kg)显示最佳发光结果。低剂量在相对较长时间段内表现出最佳整合或转座效率。
实施例11：稳定局部肝脏整合
图20的左图示出施用了注射至肝左外侧叶的50uL含单独供体DNA的LNP的ldlr-/-动物，其中肝脏总剂量为6.25ug的DNA，并在注射后第26天成像。图20的右图示出施用了注射至肝左外侧液的50uL含供体DNA和辅助RNA两者的LNP的ldlr-/-动物，其中肝脏总剂量为9.375ug的核酸(DNA 6.25ug，3.125ugRNA)，并在注射后第26天成像。图20中的结果表明，当通过局部和靶向注射至ldlr-/-动物的肝脏左外侧叶施用含有LP1-荧光素酶2/MLT转座酶的肝脏特异性LNP制剂时，在单剂量测试物品后，发生供体DNA的稳定局部肝脏整合。此外，没有证据表明肝外整合，从而证明通过本发明方法递送的靶向疗法。
实施例12：肝脏特异性LNP制剂在ldlr-/-小鼠中的安全性和功效的评估
在本研究中，使用LP1-vldlr/MLT转座酶通过直接注射到肝左外侧叶中向ldlr-/-小鼠施用肝脏特异性LNP制剂。图21A示出功效评估的结果，表明与未处理的(单独供体)小鼠相比，在第7天(D7)和第15天(D15)在经处理的ldlr-/-小鼠中甘油三酯(mg/dL)与参考范围相比的降低。图21B示出安全性评估的结果，其测量测试动物血液中的肝酶丙氨酸转氨酶(ALT)(u/L)，其指示肝功能。在图21B中，示出未处理组、处理组和PBS组的数据，每个组包括参考(“1”)范围以及在D7(“2”)和D15(“3”)的数据。
这些结果证明，与正常参考范围相比，甘油三酯显示约40％降低。未观察到LDL-C的短期变化。此外，由于直接肝脏注射所致的ALT的初始升高(图21A，第7天)随后恢复至正常参考范围(图21A，第15天)。
定义
以下定义结合本文所公开的发明来使用。除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域技术人员通常理解的相同的含义。
术语“体内”是指在受试者身体内发生的事件。
术语“离体”是指包括对已经从受试者的身体去除的细胞、组织和/或器官进行处理或进行程序的事件。适当地，所述细胞、组织和/或器官可在处理或手术的方法中返回至受试者的身体。
如本文所用，术语“变体”包括但不限于包含核酸或氨基酸序列的核酸或蛋白质，所述核酸或氨基酸序列通过在某些位置处的一个或多个取代、缺失和/或添加而与参考的核酸或氨基酸序列不同。变体可包含一个或多个保守性取代。保守取代可包括，例如，类似地带电或不带电氨基酸的取代。
如本文所用的“载体”或“媒介物”是指适合用于药物施用的载体材料。本文有用的载体和媒介物包括本领域中已知的任何此类材料，例如无毒且不以有害方式与组合物的其它组分相互作用的任何液体、凝胶、溶剂、液体稀释剂、增溶剂、表面活性剂等。
短语“药学上可接受的”是指在合理医学判断范围内、适用于与人和动物组织接触而无过量毒性、刺激、过敏反应或其它问题或并发症、与合理的利益/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。
术语“药学上可接受的载体”或“药学上可接受的赋形剂”旨在包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣剂、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂以及惰性成分。用于活性药物成分的使用此类药学上可接受的载体或药学上可接受的赋形剂的使用是本领域中众所周知的。除非任何常规药学上可接受的载体或药学上可接受的赋形剂与活性药物成分不相容，否则考虑其在本发明的治疗性组合物中的使用。另外的活性药物成分(如其它药物)也可并入到所描述的组合物和方法中。
如本文所用，“一个/种(a/an)”或“所述(the)”可意指一个或多于一个/种。
另外，当与参考数字指示结合使用时，术语“约”意指参考数字指示加上或减去该参考数字指示的多至10％。例如，语言“约50”涵盖了45至55的范围。
如本文所用的，单词“包括”及其变型意图为非限制性的，以使得列表中的项目的详述不排除也可适用于此技术的组合物和方法的其它类似项目。类似地，术语“可以(can)”和“可(may)”以及其变型意图为非限制性的，以使得实施方案可以或可包括某些要素或特征的详述不排除不包含那些要素或特征的本技术的其它实施方案。
尽管作为诸如包括、含有或具有等术语的同义词的开放式术语“包含”在本文中用于描述并要求保护本发明，可替代地可使用诸如“由……组成”或“基本上由……组成”的替代性术语来描述本发明或其实施方案。
如本文所用，单词“优选的”和“优选地”是指本技术在某些情况下提供某些益处的实施方案。然而，在相同或其它情况下，其它实施方案也可以是优选的。此外，一个或多个优选实施方案的详述并不意味着其它实施方案不是有用的，并且并不意图从本技术的范围内排除其它实施方案。
等效方案
尽管已经结合本发明具体的实施方案描述了本发明，但应理解本发明能够具有另外的修改，并且本申请意图涵盖通常遵循本发明原理的、包括虽然不属于本发明所公开内容范围但属于本发明所属领域的公知技术或常用的技术手段并可以应用于本文中阐述和所附权利要求的范围所列出的必要特征的任何变型、用途或者变更。
本领域技术人员仅使用常规实验将会认识到或将能够确定本文中确切描述的具体实施方案的许多等效方案。此类等效方案意图涵盖在所附权利要求书的范围中。
以引用的方式并入
本文引用的所有专利和公布特此以引用的方式整体并入。
本文所论述的公开仅为其在本申请的申请日之前的公开内容而提供。本文中的任何内容都不应被解释为承认本发明无权凭借先前的发明先于这种公布。
如本文所用，所有标题仅用于组织并且不旨在以任何方式限制本公开。任何单独部分的内容可能同样适用于所有部分。
序列表
<110> 萨利欧基因治疗公司(Saliogen Therapeutics, Inc.)
J·J·希金斯(HIGGINS, Joseph J.)
S·麦克米兰(MCMILLAN, Scott)
R·塔比比亚扎尔(TABIBIAZAR, Ray)
<120> 用于治疗家族性高胆固醇血症和低密度脂蛋白胆固醇升高的组合物和方法
<130> SAL-001PC/126933-5001
<150> US 63/017,424
<151> 2020-04-29
<160> 15
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<210> 1
<211> 5173
<212> DNA
<213> 人LDLR转录物变体1 mRNA (human LDLR transcript variant 1 mRNA)
<400> 1
gtgcaatcgc gggaagccag ggtttccagc taggacacag caggtcgtga tccgggtcgg 60
gacactgcct ggcagaggct gcgagcatgg ggccctgggg ctggaaattg cgctggaccg 120
tcgccttgct cctcgccgcg gcggggactg cagtgggcga cagatgcgaa agaaacgagt 180
tccagtgcca agacgggaaa tgcatctcct acaagtgggt ctgcgatggc agcgctgagt 240
gccaggatgg ctctgatgag tcccaggaga cgtgcttgtc tgtcacctgc aaatccgggg 300
acttcagctg tgggggccgt gtcaaccgct gcattcctca gttctggagg tgcgatggcc 360
aagtggactg cgacaacggc tcagacgagc aaggctgtcc ccccaagacg tgctcccagg 420
acgagtttcg ctgccacgat gggaagtgca tctctcggca gttcgtctgt gactcagacc 480
gggactgctt ggacggctca gacgaggcct cctgcccggt gctcacctgt ggtcccgcca 540
gcttccagtg caacagctcc acctgcatcc cccagctgtg ggcctgcgac aacgaccccg 600
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ttaagatcgg ctacgagtgc ctgtgccccg acggcttcca gctggtggcc cagcgaagat 1140
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tcagggagaa cggctccaag ccaagggcca tcgtggtgga tcctgttcat ggcttcatgt 1680
actggactga ctggggaact cccgccaaga tcaagaaagg gggcctgaat ggtgtggaca 1740
tctactcgct ggtgactgaa aacattcagt ggcccaatgg catcacccta gatctcctca 1800
gtggccgcct ctactgggtt gactccaaac ttcactccat ctcaagcatc gatgtcaacg 1860
ggggcaaccg gaagaccatc ttggaggatg aaaagaggct ggcccacccc ttctccttgg 1920
ccgtctttga ggacaaagta ttttggacag atatcatcaa cgaagccatt ttcagtgcca 1980
accgcctcac aggttccgat gtcaacttgt tggctgaaaa cctactgtcc ccagaggata 2040
tggttctctt ccacaacctc acccagccaa gaggagtgaa ctggtgtgag aggaccaccc 2100
tgagcaatgg cggctgccag tatctgtgcc tccctgcccc gcagatcaac ccccactcgc 2160
ccaagtttac ctgcgcctgc ccggacggca tgctgctggc cagggacatg aggagctgcc 2220
tcacagaggc tgaggctgca gtggccaccc aggagacatc caccgtcagg ctaaaggtca 2280
gctccacagc cgtaaggaca cagcacacaa ccacccgacc tgttcccgac acctcccggc 2340
tgcctggggc cacccctggg ctcaccacgg tggagatagt gacaatgtct caccaagctc 2400
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actggcggct taagaacatc aacagcatca actttgacaa ccccgtctat cagaagacca 2580
cagaggatga ggtccacatt tgccacaacc aggacggcta cagctacccc tcgagacaga 2640
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acccttcctg agacctcgcc ggccttgttt tattcaaaga cagagaagac caaagcattg 2760
cctgccagag ctttgtttta tatatttatt catctgggag gcagaacagg cttcggacag 2820
tgcccatgca atggcttggg ttgggatttt ggtttcttcc tttcctcgtg aaggataaga 2880
gaaacaggcc cggggggacc aggatgacac ctccatttct ctccaggaag ttttgagttt 2940
ctctccaccg tgacacaatc ctcaaacatg gaagatgaaa ggggagggga tgtcaggccc 3000
agagaagcaa gtggctttca acacacaaca gcagatggca ccaacgggac cccctggccc 3060
tgcctcatcc accaatctct aagccaaacc cctaaactca ggagtcaacg tgtttacctc 3120
ttctatgcaa gccttgctag acagccaggt tagcctttgc cctgtcaccc ccgaatcatg 3180
acccacccag tgtctttcga ggtgggtttg taccttcctt aagccaggaa agggattcat 3240
ggcgtcggaa atgatctggc tgaatccgtg gtggcaccga gaccaaactc attcaccaaa 3300
tgatgccact tcccagaggc agagcctgag tcactggtca cccttaatat ttattaagtg 3360
cctgagacac ccggttacct tggccgtgag gacacgtggc ctgcacccag gtgtggctgt 3420
caggacacca gcctggtgcc catcctcccg acccctaccc acttccattc ccgtggtctc 3480
cttgcacttt ctcagttcag agttgtacac tgtgtacatt tggcatttgt gttattattt 3540
tgcactgttt tctgtcgtgt gtgttgggat gggatcccag gccagggaaa gcccgtgtca 3600
atgaatgccg gggacagaga ggggcaggtt gaccgggact tcaaagccgt gatcgtgaat 3660
atcgagaact gccattgtcg tctttatgtc cgcccaccta gtgcttccac ttctatgcaa 3720
atgcctccaa gccattcact tccccaatct tgtcgttgat gggtatgtgt ttaaaacatg 3780
cacggtgagg ccgggcgcag tggctcacgc ctgtaatccc agcactttgg gaggccgagg 3840
cgggtggatc atgaggtcag gagatcgaga ccatcctggc taacacgtga aaccccgtct 3900
ctactaaaaa tacaaaaaat tagccgggcg tggtggcggg cacctgtagt cccagctact 3960
cgggaggctg aggcaggaga atggtgtgaa cccgggaagc ggagcttgca gtgagccgag 4020
attgcgccac tgcagtccgc agtctggcct gggcgacaga gcgagactcc gtctcaaaaa 4080
aaaaaaacaa aaaaaaacca tgcatggtgc atcagcagcc catggcctct ggccaggcat 4140
ggcgaggctg aggtgggagg atggtttgag ctcaggcatt tgaggctgtc gtgagctatg 4200
attatgccac tgctttccag cctgggcaac atagtaagac cccatctctt aaaaaatgaa 4260
tttggccaga cacaggtgcc tcacgcctgt aatcccagca ctttgggagg ctgagctgga 4320
tcacttgagt tcaggagttg gagaccaggc ctgagcaaca aagcgagatc ccatctctac 4380
aaaaaccaaa aagttaaaaa tcagctgggt acggtggcac gtgcctgtga tcccagctac 4440
ttgggaggct gaggcaggag gatcgcctga gcccaggagg tggaggttgc agtgagccat 4500
gatcgagcca ctgcactcca gcctgggcaa cagatgaaga ccctatttca gaaatacaac 4560
tataaaaaaa taaataaatc ctccagtctg gatcgtttga cgggacttca ggttctttct 4620
gaaatcgccg tgttactgtt gcactgatgt ccggagagac agtgacagcc tccgtcagac 4680
tcccgcgtga agatgtcaca agggattggc aattgtcccc agggacaaaa cactgtgtcc 4740
cccccagtgc agggaaccgt gataagcctt tctggtttcg gagcacgtaa atgcgtccct 4800
gtacagatag tggggatttt ttgttatgtt tgcactttgt atattggttg aaactgttat 4860
cacttatata tatatatata cacacatata tataaaatct atttattttt gcaaaccctg 4920
gttgctgtat ttgttcagtg actattctcg gggccctgtg tagggggtta ttgcctctga 4980
aatgcctctt ctttatgtac aaagattatt tgcacgaact ggactgtgtg caacgctttt 5040
tgggagaatg atgtccccgt tgtatgtatg agtggcttct gggagatggg tgtcactttt 5100
taaaccactg tatagaaggt ttttgtagcc tgaatgtctt actgtgatca attaaatttc 5160
ttaaatgaac caa 5173
<210> 2
<211> 2583
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 2
atggggccct ggggctggaa attgcgctgg accgtcgcct tgctcctcgc cgcggcgggg 60
actgcagtgg gcgacagatg cgaaagaaac gagttccagt gccaagacgg gaaatgcatc 120
tcctacaagt gggtctgcga tggcagcgct gagtgccagg atggctctga tgagtcccag 180
gagacgtgct tgtctgtcac ctgcaaatcc ggggacttca gctgtggggg ccgtgtcaac 240
cgctgcattc ctcagttctg gaggtgcgat ggccaagtgg actgcgacaa cggctcagac 300
gagcaaggct gtccccccaa gacgtgctcc caggacgagt ttcgctgcca cgatgggaag 360
tgcatctctc ggcagttcgt ctgtgactca gaccgggact gcttggacgg ctcagacgag 420
gcctcctgcc cggtgctcac ctgtggtccc gccagcttcc agtgcaacag ctccacctgc 480
atcccccagc tgtgggcctg cgacaacgac cccgactgcg aagatggctc ggatgagtgg 540
ccgcagcgct gtaggggtct ttacgtgttc caaggggaca gtagcccctg ctcggccttc 600
gagttccact gcctaagtgg cgagtgcatc cactccagct ggcgctgtga tggtggcccc 660
gactgcaagg acaaatctga cgaggaaaac tgcgctgtgg ccacctgtcg ccctgacgaa 720
ttccagtgct ctgatggaaa ctgcatccat ggcagccggc agtgtgaccg ggaatatgac 780
tgcaaggaca tgagcgatga agttggctgc gttaatgtga cactctgcga gggacccaac 840
aagttcaagt gtcacagcgg cgaatgcatc accctggaca aagtctgcaa catggctaga 900
gactgccggg actggtcaga tgaacccatc aaagagtgcg ggaccaacga atgcttggac 960
aacaacggcg gctgttccca cgtctgcaat gaccttaaga tcggctacga gtgcctgtgc 1020
cccgacggct tccagctggt ggcccagcga agatgcgaag atatcgatga gtgtcaggat 1080
cccgacacct gcagccagct ctgcgtgaac ctggagggtg gctacaagtg ccagtgtgag 1140
gaaggcttcc agctggaccc ccacacgaag gcctgcaagg ctgtgggctc catcgcctac 1200
ctcttcttca ccaaccggca cgaggtcagg aagatgacgc tggaccggag cgagtacacc 1260
agcctcatcc ccaacctgag gaacgtggtc gctctggaca cggaggtggc cagcaataga 1320
atctactggt ctgacctgtc ccagagaatg atctgcagca cccagcttga cagagcccac 1380
ggcgtctctt cctatgacac cgtcatcagc agagacatcc aggcccccga cgggctggct 1440
gtggactgga tccacagcaa catctactgg accgactctg tcctgggcac tgtctctgtt 1500
gcggatacca agggcgtgaa gaggaaaacg ttattcaggg agaacggctc caagccaagg 1560
gccatcgtgg tggatcctgt tcatggcttc atgtactgga ctgactgggg aactcccgcc 1620
aagatcaaga aagggggcct gaatggtgtg gacatctact cgctggtgac tgaaaacatt 1680
cagtggccca atggcatcac cctagatctc ctcagtggcc gcctctactg ggttgactcc 1740
aaacttcact ccatctcaag catcgatgtc aacgggggca accggaagac catcttggag 1800
gatgaaaaga ggctggccca ccccttctcc ttggccgtct ttgaggacaa agtattttgg 1860
acagatatca tcaacgaagc cattttcagt gccaaccgcc tcacaggttc cgatgtcaac 1920
ttgttggctg aaaacctact gtccccagag gatatggttc tcttccacaa cctcacccag 1980
ccaagaggag tgaactggtg tgagaggacc accctgagca atggcggctg ccagtatctg 2040
tgcctccctg ccccgcagat caacccccac tcgcccaagt ttacctgcgc ctgcccggac 2100
ggcatgctgc tggccaggga catgaggagc tgcctcacag aggctgaggc tgcagtggcc 2160
acccaggaga catccaccgt caggctaaag gtcagctcca cagccgtaag gacacagcac 2220
acaaccaccc gacctgttcc cgacacctcc cggctgcctg gggccacccc tgggctcacc 2280
acggtggaga tagtgacaat gtctcaccaa gctctgggcg acgttgctgg cagaggaaat 2340
gagaagaagc ccagtagcgt gagggctctg tccattgtcc tccccatcgt gctcctcgtc 2400
ttcctttgcc tgggggtctt ccttctatgg aagaactggc ggcttaagaa catcaacagc 2460
atcaactttg acaaccccgt ctatcagaag accacagagg atgaggtcca catttgccac 2520
aaccaggacg gctacagcta cccctcgaga cagatggtca gtctggagga tgacgtggcg 2580
tga 2583
<210> 3
<211> 860
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 3
Met Gly Pro Trp Gly Trp Lys Leu Arg Trp Thr Val Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ala Ala Ala Gly Thr Ala Val Gly Asp Arg Cys Glu Arg Asn Glu Phe
20 25 30
Gln Cys Gln Asp Gly Lys Cys Ile Ser Tyr Lys Trp Val Cys Asp Gly
35 40 45
Ser Ala Glu Cys Gln Asp Gly Ser Asp Glu Ser Gln Glu Thr Cys Leu
50 55 60
Ser Val Thr Cys Lys Ser Gly Asp Phe Ser Cys Gly Gly Arg Val Asn
65 70 75 80
Arg Cys Ile Pro Gln Phe Trp Arg Cys Asp Gly Gln Val Asp Cys Asp
85 90 95
Asn Gly Ser Asp Glu Gln Gly Cys Pro Pro Lys Thr Cys Ser Gln Asp
100 105 110
Glu Phe Arg Cys His Asp Gly Lys Cys Ile Ser Arg Gln Phe Val Cys
115 120 125
Asp Ser Asp Arg Asp Cys Leu Asp Gly Ser Asp Glu Ala Ser Cys Pro
130 135 140
Val Leu Thr Cys Gly Pro Ala Ser Phe Gln Cys Asn Ser Ser Thr Cys
145 150 155 160
Ile Pro Gln Leu Trp Ala Cys Asp Asn Asp Pro Asp Cys Glu Asp Gly
165 170 175
Ser Asp Glu Trp Pro Gln Arg Cys Arg Gly Leu Tyr Val Phe Gln Gly
180 185 190
Asp Ser Ser Pro Cys Ser Ala Phe Glu Phe His Cys Leu Ser Gly Glu
195 200 205
Cys Ile His Ser Ser Trp Arg Cys Asp Gly Gly Pro Asp Cys Lys Asp
210 215 220
Lys Ser Asp Glu Glu Asn Cys Ala Val Ala Thr Cys Arg Pro Asp Glu
225 230 235 240
Phe Gln Cys Ser Asp Gly Asn Cys Ile His Gly Ser Arg Gln Cys Asp
245 250 255
Arg Glu Tyr Asp Cys Lys Asp Met Ser Asp Glu Val Gly Cys Val Asn
260 265 270
Val Thr Leu Cys Glu Gly Pro Asn Lys Phe Lys Cys His Ser Gly Glu
275 280 285
Cys Ile Thr Leu Asp Lys Val Cys Asn Met Ala Arg Asp Cys Arg Asp
290 295 300
Trp Ser Asp Glu Pro Ile Lys Glu Cys Gly Thr Asn Glu Cys Leu Asp
305 310 315 320
Asn Asn Gly Gly Cys Ser His Val Cys Asn Asp Leu Lys Ile Gly Tyr
325 330 335
Glu Cys Leu Cys Pro Asp Gly Phe Gln Leu Val Ala Gln Arg Arg Cys
340 345 350
Glu Asp Ile Asp Glu Cys Gln Asp Pro Asp Thr Cys Ser Gln Leu Cys
355 360 365
Val Asn Leu Glu Gly Gly Tyr Lys Cys Gln Cys Glu Glu Gly Phe Gln
370 375 380
Leu Asp Pro His Thr Lys Ala Cys Lys Ala Val Gly Ser Ile Ala Tyr
385 390 395 400
Leu Phe Phe Thr Asn Arg His Glu Val Arg Lys Met Thr Leu Asp Arg
405 410 415
Ser Glu Tyr Thr Ser Leu Ile Pro Asn Leu Arg Asn Val Val Ala Leu
420 425 430
Asp Thr Glu Val Ala Ser Asn Arg Ile Tyr Trp Ser Asp Leu Ser Gln
435 440 445
Arg Met Ile Cys Ser Thr Gln Leu Asp Arg Ala His Gly Val Ser Ser
450 455 460
Tyr Asp Thr Val Ile Ser Arg Asp Ile Gln Ala Pro Asp Gly Leu Ala
465 470 475 480
Val Asp Trp Ile His Ser Asn Ile Tyr Trp Thr Asp Ser Val Leu Gly
485 490 495
Thr Val Ser Val Ala Asp Thr Lys Gly Val Lys Arg Lys Thr Leu Phe
500 505 510
Arg Glu Asn Gly Ser Lys Pro Arg Ala Ile Val Val Asp Pro Val His
515 520 525
Gly Phe Met Tyr Trp Thr Asp Trp Gly Thr Pro Ala Lys Ile Lys Lys
530 535 540
Gly Gly Leu Asn Gly Val Asp Ile Tyr Ser Leu Val Thr Glu Asn Ile
545 550 555 560
Gln Trp Pro Asn Gly Ile Thr Leu Asp Leu Leu Ser Gly Arg Leu Tyr
565 570 575
Trp Val Asp Ser Lys Leu His Ser Ile Ser Ser Ile Asp Val Asn Gly
580 585 590
Gly Asn Arg Lys Thr Ile Leu Glu Asp Glu Lys Arg Leu Ala His Pro
595 600 605
Phe Ser Leu Ala Val Phe Glu Asp Lys Val Phe Trp Thr Asp Ile Ile
610 615 620
Asn Glu Ala Ile Phe Ser Ala Asn Arg Leu Thr Gly Ser Asp Val Asn
625 630 635 640
Leu Leu Ala Glu Asn Leu Leu Ser Pro Glu Asp Met Val Leu Phe His
645 650 655
Asn Leu Thr Gln Pro Arg Gly Val Asn Trp Cys Glu Arg Thr Thr Leu
660 665 670
Ser Asn Gly Gly Cys Gln Tyr Leu Cys Leu Pro Ala Pro Gln Ile Asn
675 680 685
Pro His Ser Pro Lys Phe Thr Cys Ala Cys Pro Asp Gly Met Leu Leu
690 695 700
Ala Arg Asp Met Arg Ser Cys Leu Thr Glu Ala Glu Ala Ala Val Ala
705 710 715 720
Thr Gln Glu Thr Ser Thr Val Arg Leu Lys Val Ser Ser Thr Ala Val
725 730 735
Arg Thr Gln His Thr Thr Thr Arg Pro Val Pro Asp Thr Ser Arg Leu
740 745 750
Pro Gly Ala Thr Pro Gly Leu Thr Thr Val Glu Ile Val Thr Met Ser
755 760 765
His Gln Ala Leu Gly Asp Val Ala Gly Arg Gly Asn Glu Lys Lys Pro
770 775 780
Ser Ser Val Arg Ala Leu Ser Ile Val Leu Pro Ile Val Leu Leu Val
785 790 795 800
Phe Leu Cys Leu Gly Val Phe Leu Leu Trp Lys Asn Trp Arg Leu Lys
805 810 815
Asn Ile Asn Ser Ile Asn Phe Asp Asn Pro Val Tyr Gln Lys Thr Thr
820 825 830
Glu Asp Glu Val His Ile Cys His Asn Gln Asp Gly Tyr Ser Tyr Pro
835 840 845
Ser Arg Gln Met Val Ser Leu Glu Asp Asp Val Ala
850 855 860
<210> 4
<211> 9213
<212> DNA
<213> 智人VLDLR转录物(mRNA)变体1 (Homo sapiens VLDLR transcript (mRNA)variant 1)
<400> 4
accccgctct ccggccgccg ccggtgcggg tgctccgcta ccggctcctc tccgttctgt 60
gctctcttct gctctcggct ccccaccccc tctcccttcc ctcctctccc cttgcctccc 120
ctcctctgca gcgcctgcat tattttctgc ccgcaggctc ggcttgcact gctgctgcag 180
cccggggagg tggctgggtg ggtggggagg agactgtgca agttgtaggg gagggggtgc 240
cctcttcttc cccgctccct tcccccgcca actccttccc ctccttctcc ccctttcccc 300
tccccgcccc caccttcttc ctcctttcgg aaggactggt aacttgtcgt gcggagcgaa 360
cggcggcggc ggcggcggcg gcggcaccat ccaggcgggc accatgggca cgtccgcgct 420
ctgggcgctc tggctgctgc tcgcgctgtg ctgggcgccc cgggagagcg gcgccaccgg 480
aaccgggaga aaagccaaat gtgaaccctc ccaattccag tgcacaaatg gtcgctgtat 540
tacgctgttg tggaaatgtg atggggatga agactgtgtt gacggcagtg atgaaaagaa 600
ctgtgtaaag aagacgtgtg ctgaatctga cttcgtgtgc aacaatggcc agtgtgttcc 660
cagccgatgg aagtgtgatg gagatcctga ctgcgaagat ggttcagatg aaagcccaga 720
acagtgccat atgagaacat gccgcataca tgaaatcagc tgtggcgccc attctactca 780
gtgtatccca gtgtcctgga gatgtgatgg tgaaaatgat tgtgacagtg gagaagatga 840
agaaaactgt ggcaatataa catgtagtcc cgacgagttc acctgctcca gtggccgctg 900
catctccagg aactttgtat gcaatggcca ggatgactgc agcgatggca gtgatgagct 960
ggactgtgcc ccgccaacct gtggcgccca tgagttccag tgcagcacct cctcctgcat 1020
ccccatcagc tgggtatgcg acgatgatgc agactgctcc gaccaatctg atgagtccct 1080
ggagcagtgt ggccgtcagc cagtcataca caccaagtgt ccagccagcg aaatccagtg 1140
cggctctggc gagtgcatcc ataagaagtg gcgatgtgat ggggaccctg actgcaagga 1200
tggcagtgat gaggtcaact gtccctctcg aacttgccga cctgaccaat ttgaatgtga 1260
ggatggcagc tgcatccatg gcagcaggca gtgtaatggt atccgagact gtgtcgatgg 1320
ttccgatgaa gtcaactgca aaaatgtcaa tcagtgcttg ggccctggaa aattcaagtg 1380
cagaagtgga gaatgcatag atatcagcaa agtatgtaac caggagcagg actgcaggga 1440
ctggagtgat gagcccctga aagagtgtca tataaacgaa tgcttggtaa ataatggtgg 1500
atgttctcat atctgcaaag acctagttat aggctacgag tgtgactgtg cagctgggtt 1560
tgaactgata gataggaaaa cctgtggaga tattgatgaa tgccaaaatc caggaatctg 1620
cagtcaaatt tgtatcaact taaaaggcgg ttacaagtgt gaatgtagtc gtggctatca 1680
aatggatctt gctactggcg tgtgcaaggc agtaggcaaa gagccaagtc tgatcttcac 1740
taatcgaaga gacatcagga agattggctt agagaggaaa gaatatatcc aactagttga 1800
acagctaaga aacactgtgg ctctcgatgc tgacattgct gcccagaaac tattctgggc 1860
cgatctaagc caaaaggcta tcttcagtgc ctcaattgat gacaaggttg gtagacatgt 1920
taaaatgatc gacaatgtct ataatcctgc agccattgct gttgattggg tgtacaagac 1980
catctactgg actgatgcgg cttctaagac tatttcagta gctaccctag atggaaccaa 2040
gaggaagttc ctgtttaact ctgacttgcg agagcctgcc tccatagctg tggacccact 2100
gtctggcttt gtttactggt cagactgggg tgaaccagct aaaatagaaa aagcaggaat 2160
gaatggattc gatagacgtc cactggtgac agcggatatc cagtggccta acggaattac 2220
acttgacctt ataaaaagtc gcctctattg gcttgattct aagttgcaca tgttatccag 2280
cgtggacttg aatggccaag atcgtaggat agtactaaag tctctggagt tcctagctca 2340
tcctcttgca ctaacaatat ttgaggatcg tgtctactgg atagatgggg aaaatgaagc 2400
agtctatggt gccaataaat tcactggatc agagctagcc actctagtca acaacctgaa 2460
tgatgcccaa gacatcattg tctatcatga acttgtacag ccatcaggta aaaattggtg 2520
tgaagaagac atggagaatg gaggatgtga atacctatgc ctgccagcac cacagattaa 2580
tgatcactct ccaaaatata cctgttcctg tcccagtggg tacaatgtag aggaaaatgg 2640
ccgagactgt caaagtactg caactactgt gacttacagt gagacaaaag atacgaacac 2700
aacagaaatt tcagcaacta gtggactagt tcctggaggg atcaatgtga ccacagcagt 2760
atcagaggtc agtgttcccc caaaagggac ttctgccgca tgggccattc ttcctctctt 2820
gctcttagtg atggcagcag taggtggcta cttgatgtgg cggaattggc aacacaagaa 2880
catgaaaagc atgaactttg acaatcctgt gtacttgaaa accactgaag aggacctctc 2940
catagacatt ggtagacaca gtgcttctgt tggacacacg tacccagcaa tatcagttgt 3000
aagcacagat gatgatctag cttgacttct gtgacaaatg ttgacctttg aggtctaaac 3060
aaataatacc cccgtcggaa tggtaaccga gccagcagct gaagtctctt tttcttcctc 3120
tcggctggaa gaacatcaag atacctttgc gtggatcaag cttgtgtact tgaccgtttt 3180
tatattactt ttgtaaatat tcttgtccac attctacttc agctttggat gtggttaccg 3240
agtatctgta acccttgaat ttctagacag tattgccacc tctggccaaa tatgcacttt 3300
ccctagaaag ccatattcca gcagtgaaac ttgtgctata gtgtatacca cctgtacata 3360
cattgtatag gccatctgta aatatcccag agaacaatca ctattcttaa gcactttgaa 3420
aatatttcta tgtaaattat tgtaaacttt ttcaatggtt gggacaatgg caataggaca 3480
aaacgggtta ctaagatgaa attgccaaaa aaatttataa actaattttg tacgtatgaa 3540
tgatatcttt gacctcaatg gaggtttgca aagactgagt gttcaaacta ctgtacattt 3600
tttttcaagt gctaaaaaat taaaccaagc agcttaacca tggtttgtgc ctgttcctct 3660
aggatgaact cctatcctga gtagtaccaa gtgttctaac taaatgtgtg agctgtagtt 3720
cttgatgttg tataactaag cctgtaattg ggctggtttc tcttacaccc tagcacagtt 3780
aaaaaatgaa gtactgttta acatttgctc ccgaaatatt tcttactgtg taaaagaagc 3840
tagcttagtc tgtacctaga attcctcttg gttagaggag tgagtttctt ttttttccat 3900
taacttgttt cctgatcgag aaacacgtgc taagatttct atgaattctg cttctttata 3960
gttaagtctc tgttttccat gttctgtcat ttatataggt caaggacaag tgccttctaa 4020
ggcatggata agggctttct tcttatgaaa gtctagactg tcttactgtg aagatggcca 4080
gggaggatag caagcaatgg cattcttgaa cagtctaagg caggtttctc agtgtggtcc 4140
tgagaacaga agcatctgca tcacctggga atgtattaga aatgcaagtt cccagcccca 4200
tcccagacct actgaatcag aaactctggg ggcgagggct gaaacctgct ttcataagcc 4260
cttcaggcga tactgatgta aactaaagct taaaaaccac cgttttactg tgacttcatg 4320
aagaatataa ttgcaatatc acctaaattt ttatcctggc tgggatgggg cagattctta 4380
ctatggacaa tttctggaac ttacagtatg aagagcagat gaggagtttg agacaaagaa 4440
aaaattgtac agggagttta gtgaattttc catcaggttg gccattactt tctttctcta 4500
aagtctcagg atgtctggaa gcaaggaaag acaaaagact tgaagcaccg ggtgcatgct 4560
gtgtgtcaca agtgaggtgg agagttggct gtggaaggta cagcaattcc tctggaatta 4620
aatgaccgac caacacagta ccaagaggat gaagagaaga tgttttgcgt tgctacgtga 4680
atcagtggat gactcatatt tcacttgcat atgaaatata aggcagttaa catcttgttt 4740
gtggcttaag caaggacatt aatcctacta gatgaagggg aagttggttc tgttgtctta 4800
agggatgccc ccttgtgatt ttggtcaact gaatgaaaaa gaaaagatag ccttggactt 4860
ttttttcatg ggaggtttgg aggtcaagca tgtagaagga aaaggctgta gtcatgaata 4920
tagaactgtc tgctctccac cttttcctca ctctacattt agtcatcaca ctgaacagga 4980
tgtggcctgc tgacagtgag tagctgaagt gcctgtttgg taagtaggtt agcattcatc 5040
atgaactctg aaagccattt cagagtttgg ctgctgctct gaccctgctg tggtacaaaa 5100
aacatggatt tttttttttt taactggagt aataccaaat tccctttaga agcttgaagt 5160
ttgatactat tgctttcccc attataagga ttatacagta ttaattaatt ataaggccca 5220
aagtttgttt tggcaaataa agtattattc tctatcatca tcttttgaat tcctgtccct 5280
agtatgttct ttcatgttct gggtaaaatt tccaaccctc aaagagtcta aaacgtctca 5340
ttttttttta ccacgtcctc cccagtaaga agccaaggta caactcattg tacctacgag 5400
gtacaaactc atttgtagaa acaaagtaac tagatattcc tattgaaata agaatagata 5460
tattggtggg ccaggcatgg tggctcacgc ctataatccc agcactttgg aaggccaagg 5520
caggaggatc acttgaggcc aggagttcga gaccagcctg agcaacatgg tgagaccctg 5580
tctctacaaa aaaaaaattt ataaaaataa aagaaaaaaa tagttatatg actaaactac 5640
tagtcaatac agcttgcaat aatagtgcat gaatgataac aggcctcggc tttatcaccc 5700
aaaaaataac ttgaattcta tgtgaaatgt gttaggataa gtttgctctg tctctagagt 5760
tcaatgtaga agataattaa gaggtaaaat atgaagctta tcatacacta aaggagaata 5820
tttggagtta gatgagcctg tcacacaaag tgaaagtgga ccctccagaa attttaggaa 5880
ttgccacaaa gattgatgat agatgaataa acagatttgt ggcctctggt aaagaaatcc 5940
agccaagttc ctctgtccaa atttttaagt gccctttgca agctaatcta tttggcaaaa 6000
aaatagtccc agttgttcaa ctagctccct taaaacattc tagtaggtgt tttaaagcct 6060
aggtatcgct gcctctttag ttcttgatga atacaaggca aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 6120
aaaaaaattg aggctttcac tttggcattt gcttctgttc cttgtatctg tggaagtcaa 6180
gtagcccttc tcaaaaatga gaagccaagc tttaaatagc aaactacagg gtattaaaag 6240
actaactctt cagttaagaa cactgtagaa atggtagacc aacttaaagt ctacctttta 6300
acaatcttta ccccaaacct aaagattcta ggggtcactt atctctatta cgtaatctaa 6360
ctggaataat ttcctagaat tcttactagt gaaatcttac ccaagtaaaa caatttatta 6420
ttttgaatcc aaatgaaagc tatactgttt gctttcaatg gtggcaaaaa cttgcaaaaa 6480
gcagatatac ttttgctaat ttaagttgaa gtactatgaa tacaacctgc taatcttgat 6540
ccccaaatct gagcccttca gtttcataat tgttttatcc tgaacgtagt tgtgacatag 6600
acatttctca aaagggtctg atacatcaaa ctcctaacaa gtaggagcag caactagcta 6660
aagagtagaa agaagcttcc cttattgtgg gtgatgaggc ggtgcctaaa aaccacatat 6720
atataatccc ctgggtatta catattctgc aagccctgtt agtggggaga tggtagtggc 6780
aatagcagcg atagttgcgt cagtgctaac tgctgctgct gcccgttctg ttggcggctg 6840
ctggccaagt gtgcacactt agccctggtt gaggtgcatt gtctgctgtc gtctgttaag 6900
catctaaccg gagtgggagg gcacatcaag cgatttcact ctcttaaaga aaaggttttt 6960
aggtattttt ggtattatat agtctctaag gccagaaggg gcttataatg acttctcttc 7020
tagaattgta atactaaaaa actactcgag taaatatcct aacaagtatg atttttcttg 7080
ggaaaactaa aaattgtaca tccatgcttc agccatatca tgggcctaaa ctatgagagt 7140
tcagaaatat ataaaagtac aaaaatcttc aaaggtactt atttccaaat atggagggaa 7200
tgaatctgaa gagggaacaa tggcgttttt cgaacttatt tctctctaat ccagcctgga 7260
ggatttttag ccgaaacagt tgcatgtgaa ggattatcag ccatctttgc atatcccttt 7320
cacatctacc ttcacacagg aaagctgaat gcattttacc agtgaggctc tagatatgaa 7380
acttagggat ccatagataa ataagctact aacaaactga taacagtggt gttccatctc 7440
tctatcatgt ctcctgagtc cgtttcacgt ttttgagcct ggctaatgag aaaaagaaca 7500
aagtaggacc atgacccagt gttctcctgt aaatctcact gtaaaaatct caatgcaaaa 7560
acactgagac aggagtgaga ccagctgcgg gtggggagtt tgtgctccgc aggttacctc 7620
atggcatatc aaaaatggct tttttcttca ctgcgctcaa ggaaaaagtc agatgggtga 7680
caaggtggtt ctgtttagaa gcagcaggca atgtagttaa cagcatagac ttccgtgtct 7740
tgtgtgtggt accttgggca agttactaac tccctctgta aagtagagac gatggggact 7800
gtctcactgt gacaaggtaa gatttaagtg agatgcacac aaaaagctca gcacagtgtc 7860
tggcatctaa tatgtgcagg gcagatgtca ctactgaata tcacatcaat gctagggctg 7920
tatttactgt cacacacagg caccggtaag tgactttacc ggtgaaagtc acaggtacct 7980
ttatctatga tgaatgtaat gtgttagatg gtgaccgaag tgttctccac tacacctgtc 8040
tgaagagatc taagtctgat atttaaggag tgatagcatc ttgcatactt aagaaggctt 8100
aaaagactgc atggtttaaa ccctagaaac ataaatggaa tgtttctgcc tcagttcttt 8160
tgactacctc ctaggacatg gaaacaaata tttgggagcc tgcatagtct ttagatggct 8220
gccaaagcac ttaaaatctc ctttaaattc ttaccatatg cttacttttg tactaagtaa 8280
gtgctcccaa gtcttttact tgctcttcac agcaacccta ataggtatct ccattttaca 8340
taggtaaaaa ctgaggctac aaacaatcta tggttccaaa tcctatgtgc ttactgccgt 8400
cttctcttag aaggggatgc agtactgtac aaagattgag ctggatgtcg cattgcatgt 8460
ttgctgagtc ctcctcattg ctgatgttag gatccttcaa cagtttctca gatgccagct 8520
atggctggca tccagtatgg tggtgtaatg gaagtgtact actagcacta ctacatcagg 8580
tcagcacaga ttaactcagt tacgtgttat accttcaaga cgctagacat tccagaatta 8640
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gccaaaaaga caggaagaac tgtggcttgt aactcaatga tgctataact ccagcactgg 8880
atcttaagta ttctggaata taccagattg gtagaactac cagacttggg tatttctcag 8940
ttaacacaca tgcaaggagg aagagagttt ttttgaacaa aatgactggc tttgacaaaa 9000
ctatcttgct ctttttaaat gtcacttgat actagaatgc gatttaaaag catgtaatgc 9060
ctcaggagtc cggcatatac aaccaaatta tcatgctcag gatcttcaga attctaaagg 9120
cacatgttag aatgcagagt cctgatgacc tgtcaataaa ctttttttta ctaatgaact 9180
gtacatttaa ataaaagttt atttttggga taa 9213
<210> 5
<211> 2622
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 5
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<211> 2622
<212> DNA
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Glu Met Lys Lys Phe Leu Gly Leu Ile Val Leu Met Gly Gln Val Arg
145 150 155 160
Lys Asp Arg Arg Asp Asp Tyr Trp Thr Thr Glu Pro Trp Thr Glu Thr
165 170 175
Pro Tyr Phe Gly Lys Thr Met Thr Arg Asp Arg Phe Arg Gln Ile Trp
180 185 190
Lys Ala Trp His Phe Asn Asn Asn Ala Asp Ile Val Asn Glu Ser Asp
195 200 205
Arg Leu Cys Lys Val Arg Pro Val Leu Asp Tyr Phe Val Pro Lys Phe
210 215 220
Ile Asn Ile Tyr Lys Pro His Gln Gln Leu Ser Leu Asp Glu Gly Ile
225 230 235 240
Val Pro Trp Arg Gly Arg Leu Phe Phe Arg Val Tyr Asn Ala Gly Lys
245 250 255
Ile Val Lys Tyr Gly Ile Leu Val Arg Leu Leu Cys Glu Ser Asp Thr
260 265 270
Gly Tyr Ile Cys Asn Met Glu Ile Tyr Cys Gly Glu Gly Lys Arg Leu
275 280 285
Leu Glu Thr Ile Gln Thr Val Val Ser Pro Tyr Thr Asp Ser Trp Tyr
290 295 300
His Ile Tyr Met Asp Asn Tyr Tyr Asn Ser Val Ala Asn Cys Glu Ala
305 310 315 320
Leu Met Lys Asn Lys Phe Arg Ile Cys Gly Thr Ile Arg Lys Asn Arg
325 330 335
Gly Ile Pro Lys Asp Phe Gln Thr Ile Ser Leu Lys Lys Gly Glu Thr
340 345 350
Lys Phe Ile Arg Lys Asn Asp Ile Leu Leu Gln Val Trp Gln Ser Lys
355 360 365
Lys Pro Val Tyr Leu Ile Ser Ser Ile His Ser Ala Glu Met Glu Glu
370 375 380
Ser Gln Asn Ile Asp Arg Thr Ser Lys Lys Lys Ile Val Lys Pro Asn
385 390 395 400
Ala Leu Ile Asp Tyr Asn Lys His Met Lys Gly Val Asp Arg Ala Asp
405 410 415
Gln Tyr Leu Ser Tyr Tyr Ser Ile Leu Arg Arg Thr Val Lys Trp Thr
420 425 430
Lys Arg Leu Ala Met Tyr Met Ile Asn Cys Ala Leu Phe Asn Ser Tyr
435 440 445
Ala Val Tyr Lys Ser Val Arg Gln Arg Lys Met Gly Phe Lys Met Phe
450 455 460
Leu Lys Gln Thr Ala Ile His Trp Leu Thr Asp Asp Ile Pro Glu Asp
465 470 475 480
Met Asp Ile Val Pro Asp Leu Gln Pro Val Pro Ser Thr Ser Gly Met
485 490 495
Arg Ala Lys Pro Pro Thr Ser Asp Pro Pro Cys Arg Leu Ser Met Asp
500 505 510
Met Arg Lys His Thr Leu Gln Ala Ile Val Gly Ser Gly Lys Lys Lys
515 520 525
Asn Ile Leu Arg Arg Cys Arg Val Cys Ser Val His Lys Leu Arg Ser
530 535 540
Glu Thr Arg Tyr Met Cys Lys Phe Cys Asn Ile Pro Leu His Lys Gly
545 550 555 560
Ala Cys Phe Glu Lys Tyr His Thr Leu Lys Asn Tyr
565 570
<210> 10
<211> 1719
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 10
atggcccagc acagcgacta cagcgacgac gagttctgtg ccgataagct gagtaactac 60
agctgcgaca gcgacctgga aaacgccagc acatccgacg aggacagctc tgacgacgag 120
gtgatggtgc ggcccagaac cctgagacgg agaagaatca gcagctctag cagcgactct 180
gaatccgaca tcgagggcgg ccgggaagag tggagccacg tggacaaccc tcctgttctg 240
gaagattttc tgggccatca gggcctgaac accgacgccg tgatcaacaa catcgaggat 300
gccgtgaagc tgttcatagg agatgatttc tttgagttcc tggtcgagga atccaaccgc 360
tattacaacc agaatagaaa caacttcaag ctgagcaaga aaagcctgaa gtggaaggac 420
atcacccctc aggagatgaa aaagttcctg ggactgatcg ttctgatggg acaggtgcgg 480
aaggacagaa gggatgatta ctggacaacc gaaccttgga ccgagacccc ttactttggc 540
aagaccatga ccagagacag attcagacag atctggaaag cctggcactt caacaacaat 600
gctgatatcg tgaacgagtc tgatagactg tgtaaagtgc ggccagtgtt ggattacttc 660
gtgcctaagt tcatcaacat ctataagcct caccagcagc tgagcctgga tgaaggcatc 720
gtgccctggc ggggcagact gttcttcaga gtgtacaatg ctggcaagat cgtcaaatac 780
ggcatcctgg tgcgccttct gtgcgagagc gatacaggct acatctgtaa tatggaaatc 840
tactgcggcg agggcaaaag actgctggaa accatccaga ccgtcgtttc cccttatacc 900
gacagctggt accacatcta catggacaac tactacaatt ctgtggccaa ctgcgaggcc 960
ctgatgaaga acaagtttag aatctgcggc acaatcagaa aaaacagagg catccctaag 1020
gacttccaga ccatctctct gaagaagggc gaaaccaagt tcatcagaaa gaacgacatc 1080
ctgctccaag tgtggcagtc caagaaaccc gtgtacctga tcagcagcat ccatagcgcc 1140
gagatggaag aaagccagaa catcgacaga acaagcaaga agaagatcgt gaagcccaat 1200
gctctgatcg actacaacaa gcacatgaaa ggcgtggacc gggccgacca gtacctgtct 1260
tattactcta tcctgagaag aacagtgaaa tggaccaaga gactggccat gtacatgatc 1320
aattgcgccc tgttcaacag ctacgccgtg tacaagtccg tgcgacaaag aaaaatggga 1380
ttcaagatgt tcctgaagca gacagccatc cactggctga cagacgacat tcctgaggac 1440
atggacattg tgccagatct gcaacctgtg cccagcacct ctggtatgag agctaagcct 1500
cccaccagcg atcctccatg tagactgagc atggacatgc ggaagcacac cctgcaggcc 1560
atcgtcggca gcggcaagaa gaagaacatc cttagacggt gcagggtgtg cagcgtgcac 1620
aagctgcgga gcgagactcg gtacatgtgc aagttttgca acattcccct gcacaaggga 1680
gcctgcttcg agaagtacca caccctgaag aattactag 1719
<210> 11
<211> 1719
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 11
atggcccagc acagcgacta cagcgacgac gagttctgtg ccgataagct gagtaactac 60
agctgcgaca gcgacctgga aaacgccagc acatccgacg aggacagctc tgacgacgag 120
gtgatggtgc ggcccagaac cctgagacgg agaagaatca gcagctctag cagcgactct 180
gaatccgaca tcgagggcgg ccgggaagag tggagccacg tggacaaccc tcctgttctg 240
gaagattttc tgggccatca gggcctgaac accgacgccg tgatcaacaa catcgaggat 300
gccgtgaagc tgttcatagg agatgatttc tttgagttcc tggtcgagga atccaaccgc 360
tattacaacc agaagagaaa caacttcaag ctgagcaaga aaagcctgaa gtggaaggac 420
atcacccctc aggagatgaa aaagttcctg ggactgatcg ttctgatggg acaggtgcgg 480
aaggacagaa gggatgatta ctggacaacc gaaccttgga ccgagacccc ttactttggc 540
aagaccatga ccagagacag attcagacag atctggaaag cctggcactt caacaacaat 600
gctgatatcg tgaacgagtc tgatagactg tgtaaagtgc ggccagtgtt ggattacttc 660
gtgcctaagt tcatcaacat ctataagcct caccagcagc tgagcctgga tgaaggcatc 720
gtgccctggc ggggcagact gttcttcaga gtgtacaatg ctggcaagat cgtcaaatac 780
ggcatcctgg tgcgccttct gtgcgagagc gatacaggct acatctgtaa tatggaaatc 840
tactgcggcg agggcaaaag actgctggaa accatccaga ccgtcgtttc cccttatacc 900
gacagctggt accacatcta catggacaac tactacaatt ctgtggccaa ctgcgaggcc 960
ctgatgaaga acaagtttag aatctgcggc acaatcagaa aaaacagagg catccctaag 1020
gacttccaga ccatctctct gaagaagggc gaaaccaagt tcatcagaaa gaacgacatc 1080
ctgctccaag tgtggcagtc caagaaaccc gtgtacctga tcagcagcat ccatagcgcc 1140
gagatggaag aaagccagaa catcgacaga acaagcaaga agaagatcgt gaagcccaat 1200
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ttcaagatgt tcctgaagca gacagccatc cactggctga cagacgacat tcctgaggac 1440
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<210> 12
<211> 572
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 12
Met Ala Gln His Ser Asp Tyr Ser Asp Asp Glu Phe Cys Ala Asp Lys
1 5 10 15
Leu Ser Asn Tyr Ser Cys Asp Ser Asp Leu Glu Asn Ala Ser Thr Ser
20 25 30
Asp Glu Asp Ser Ser Asp Asp Glu Val Met Val Arg Pro Arg Thr Leu
35 40 45
Arg Arg Arg Arg Ile Ser Ser Ser Ser Ser Asp Ser Glu Ser Asp Ile
50 55 60
Glu Gly Gly Arg Glu Glu Trp Ser His Val Asp Asn Pro Pro Val Leu
65 70 75 80
Glu Asp Phe Leu Gly His Gln Gly Leu Asn Thr Asp Ala Val Ile Asn
85 90 95
Asn Ile Glu Asp Ala Val Lys Leu Phe Ile Gly Asp Asp Phe Phe Glu
100 105 110
Phe Leu Val Glu Glu Ser Asn Arg Tyr Tyr Asn Gln Lys Arg Asn Asn
115 120 125
Phe Lys Leu Ser Lys Lys Ser Leu Lys Trp Lys Asp Ile Thr Pro Gln
130 135 140
Glu Met Lys Lys Phe Leu Gly Leu Ile Val Leu Met Gly Gln Val Arg
145 150 155 160
Lys Asp Arg Arg Asp Asp Tyr Trp Thr Thr Glu Pro Trp Thr Glu Thr
165 170 175
Pro Tyr Phe Gly Lys Thr Met Thr Arg Asp Arg Phe Arg Gln Ile Trp
180 185 190
Lys Ala Trp His Phe Asn Asn Asn Ala Asp Ile Val Asn Glu Ser Asp
195 200 205
Arg Leu Cys Lys Val Arg Pro Val Leu Asp Tyr Phe Val Pro Lys Phe
210 215 220
Ile Asn Ile Tyr Lys Pro His Gln Gln Leu Ser Leu Asp Glu Gly Ile
225 230 235 240
Val Pro Trp Arg Gly Arg Leu Phe Phe Arg Val Tyr Asn Ala Gly Lys
245 250 255
Ile Val Lys Tyr Gly Ile Leu Val Arg Leu Leu Cys Glu Ser Asp Thr
260 265 270
Gly Tyr Ile Cys Asn Met Glu Ile Tyr Cys Gly Glu Gly Lys Arg Leu
275 280 285
Leu Glu Thr Ile Gln Thr Val Val Ser Pro Tyr Thr Asp Ser Trp Tyr
290 295 300
His Ile Tyr Met Asp Asn Tyr Tyr Asn Ser Val Ala Asn Cys Glu Ala
305 310 315 320
Leu Met Lys Asn Lys Phe Arg Ile Cys Gly Thr Ile Arg Lys Asn Arg
325 330 335
Gly Ile Pro Lys Asp Phe Gln Thr Ile Ser Leu Lys Lys Gly Glu Thr
340 345 350
Lys Phe Ile Arg Lys Asn Asp Ile Leu Leu Gln Val Trp Gln Ser Lys
355 360 365
Lys Pro Val Tyr Leu Ile Ser Ser Ile His Ser Ala Glu Met Glu Glu
370 375 380
Ser Gln Asn Ile Asp Arg Thr Ser Lys Lys Lys Ile Val Lys Pro Asn
385 390 395 400
Ala Leu Ile Asp Tyr Asn Lys His Met Lys Gly Val Asp Arg Ala Asp
405 410 415
Gln Tyr Leu Ser Tyr Tyr Ser Ile Leu Arg Arg Thr Val Lys Trp Thr
420 425 430
Lys Arg Leu Ala Met Tyr Met Ile Asn Cys Ala Leu Phe Asn Ser Tyr
435 440 445
Ala Val Tyr Lys Ser Val Arg Gln Arg Lys Met Gly Phe Lys Met Phe
450 455 460
Leu Lys Gln Thr Ala Ile His Trp Leu Thr Asp Asp Ile Pro Glu Asp
465 470 475 480
Met Asp Ile Val Pro Asp Leu Gln Pro Val Pro Ser Thr Ser Gly Met
485 490 495
Arg Ala Lys Pro Pro Thr Ser Asp Pro Pro Cys Arg Leu Ser Met Asp
500 505 510
Met Arg Lys His Thr Leu Gln Ala Ile Val Gly Ser Gly Lys Lys Lys
515 520 525
Asn Ile Leu Arg Arg Cys Arg Val Cys Ser Val His Lys Leu Arg Ser
530 535 540
Glu Thr Arg Tyr Met Cys Lys Phe Cys Asn Ile Pro Leu His Lys Gly
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Ala Cys Phe Glu Lys Tyr His Thr Leu Lys Asn Tyr
565 570
<210> 13
<211> 1719
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 13
atggcccagc acagcgacta ccccgacgac gagttcagag ccgataagct gagtaactac 60
agctgcgaca gcgacctgga aaacgccagc acatccgacg aggacagctc tgacgacgag 120
gtgatggtgc ggcccagaac cctgagacgg agaagaatca gcagctctag cagcgactct 180
gaatccgaca tcgagggcgg ccgggaagag tggagccacg tggacaaccc tcctgttctg 240
gaagattttc tgggccatca gggcctgaac accgacgccg tgatcaacaa catcgaggat 300
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tattacaacc agaatagaaa caacttcaag ctgagcaaga aaagcctgaa gtggaaggac 420
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aaggacagaa gggatgatta ctggacaacc gaaccttgga ccgagacccc ttactttggc 540
aagaccatga ccagagacag attcagacag atctggaaag cctggcactt caacaacaat 600
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<210> 14
<211> 572
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 14
Met Ala Gln His Ser Asp Tyr Pro Asp Asp Glu Phe Arg Ala Asp Lys
1 5 10 15
Leu Ser Asn Tyr Ser Cys Asp Ser Asp Leu Glu Asn Ala Ser Thr Ser
20 25 30
Asp Glu Asp Ser Ser Asp Asp Glu Val Met Val Arg Pro Arg Thr Leu
35 40 45
Arg Arg Arg Arg Ile Ser Ser Ser Ser Ser Asp Ser Glu Ser Asp Ile
50 55 60
Glu Gly Gly Arg Glu Glu Trp Ser His Val Asp Asn Pro Pro Val Leu
65 70 75 80
Glu Asp Phe Leu Gly His Gln Gly Leu Asn Thr Asp Ala Val Ile Asn
85 90 95
Asn Ile Glu Asp Ala Val Lys Leu Phe Ile Gly Asp Asp Phe Phe Glu
100 105 110
Phe Leu Val Glu Glu Ser Asn Arg Tyr Tyr Asn Gln Asn Arg Asn Asn
115 120 125
Phe Lys Leu Ser Lys Lys Ser Leu Lys Trp Lys Asp Ile Thr Pro Gln
130 135 140
Glu Met Lys Lys Phe Leu Gly Leu Ile Val Leu Met Gly Gln Val Arg
145 150 155 160
Lys Asp Arg Arg Asp Asp Tyr Trp Thr Thr Glu Pro Trp Thr Glu Thr
165 170 175
Pro Tyr Phe Gly Lys Thr Met Thr Arg Asp Arg Phe Arg Gln Ile Trp
180 185 190
Lys Ala Trp His Phe Asn Asn Asn Ala Asp Ile Val Asn Glu Ser Asp
195 200 205
Arg Leu Cys Lys Val Arg Pro Val Leu Asp Tyr Phe Val Pro Lys Phe
210 215 220
Ile Asn Ile Tyr Lys Pro His Gln Gln Leu Ser Leu Asp Glu Gly Ile
225 230 235 240
Val Pro Trp Arg Gly Arg Leu Phe Phe Arg Val Tyr Asn Ala Gly Lys
245 250 255
Ile Val Lys Tyr Gly Ile Leu Val Arg Leu Leu Cys Glu Ser Asp Thr
260 265 270
Gly Tyr Ile Cys Asn Met Glu Ile Tyr Cys Gly Glu Gly Lys Arg Leu
275 280 285
Leu Glu Thr Ile Gln Thr Val Val Ser Pro Tyr Thr Asp Ser Trp Tyr
290 295 300
His Ile Tyr Met Asp Asn Tyr Tyr Asn Ser Val Ala Asn Cys Glu Ala
305 310 315 320
Leu Met Lys Asn Lys Phe Arg Ile Cys Gly Thr Ile Arg Lys Asn Arg
325 330 335
Gly Ile Pro Lys Asp Phe Gln Thr Ile Ser Leu Lys Lys Gly Glu Thr
340 345 350
Lys Phe Ile Arg Lys Asn Asp Ile Leu Leu Gln Val Trp Gln Ser Lys
355 360 365
Lys Pro Val Tyr Leu Ile Ser Ser Ile His Ser Ala Glu Met Glu Glu
370 375 380
Ser Gln Asn Ile Asp Arg Thr Ser Lys Lys Lys Ile Val Lys Pro Asn
385 390 395 400
Ala Leu Ile Asp Tyr Asn Lys His Met Lys Gly Val Asp Arg Ala Asp
405 410 415
Gln Tyr Leu Ser Tyr Tyr Ser Ile Leu Arg Arg Thr Val Lys Trp Thr
420 425 430
Lys Arg Leu Ala Met Tyr Met Ile Asn Cys Ala Leu Phe Asn Ser Tyr
435 440 445
Ala Val Tyr Lys Ser Val Arg Gln Arg Lys Met Gly Phe Lys Met Phe
450 455 460
Leu Lys Gln Thr Ala Ile His Trp Leu Thr Asp Asp Ile Pro Glu Asp
465 470 475 480
Met Asp Ile Val Pro Asp Leu Gln Pro Val Pro Ser Thr Ser Gly Met
485 490 495
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500 505 510
Met Arg Lys His Thr Leu Gln Ala Ile Val Gly Ser Gly Lys Lys Lys
515 520 525
Asn Ile Leu Arg Arg Cys Arg Val Cys Ser Val His Lys Leu Arg Ser
530 535 540
Glu Thr Arg Tyr Met Cys Lys Phe Cys Asn Ile Pro Leu His Lys Gly
545 550 555 560
Ala Cys Phe Glu Lys Tyr His Thr Leu Lys Asn Tyr
565 570
<210> 15
<211> 545
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
<400> 15
ccctaaaatg ggcaaacatt gcaagcagca aacagcaaac acacagccct ccctgcctgc 60
tgaccttgga gctggggcag aggtcagaga cctctctggg cccatgccac ctccaacatc 120
cactcgaccc cttggaattt cggtggagag gagcagaggt tgtcctggcg tggtttaggt 180
agtgtgagag gggaatgact cctttcggta agtgcagtgg aagctgtaca ctgcccaggc 240
aaagcgtccg ggcagcgtag gcgggcgact cagatcccag ccagtggact tagcccctgt 300
ttgctcctcc gataactggg gtgaccttgg ttaatattca ccagcagcct cccccgttgc 360
ccctctggat ccactgctta aatacggacg aggacagggc cctgtctcct cagcttcagg 420
caccaccact gacctgggac agtgaatccg gactctaagg taaatataaa atttttaagt 480
gtataatgtg ttaaactact gattctaatt gtttgtgtat tttagattcc aacctatgga 540
actga 545

Claims (67)

1.一种包含基因转移构建体的组合物，所述组合物包含：
(a)编码极低密度脂蛋白受体(VLDLR)蛋白或低密度脂蛋白受体(LDLR)蛋白或其功能片段的核酸；
(b)肝脏特异性启动子；和
(c)非病毒载体，所述非病毒载体包含一个或多个转座酶识别位点和一个或多个反向末端重复序列(ITR)或末端序列。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述基因转移构建体包含DNA。
3.如权利要求1或2所述的组合物，其中所述基因转移构建体是密码子优化的。
4.如权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中所述VLDLR蛋白是人VLDLR蛋白或其功能片段。
5.如权利要求4所述的组合物，其中编码所述人VLDLR蛋白或其功能片段的所述核酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列编码SEQ IDNO:6的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少约90％、或至少约93％、或至少约95％、或至少约97％或至少约98％同一性的变体。
6.如权利要求4所述的组合物，其中编码所述人VLDLR蛋白或其功能片段的所述核酸包含SEQ ID NO:4的核苷酸序列或SEQ ID NO:5的核苷酸序列，或与所述核苷酸序列具有至少约90％、或至少约93％、或至少约95％、或至少约97％或至少约98％同一性的变体。
7.如权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中所述LDLR蛋白是人LDLR蛋白或其功能片段。
8.如权利要求7所述的组合物，其中编码所述人LDLR蛋白或其所述功能片段的所述核酸包含编码蛋白质的核苷酸序列，所述蛋白质具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少约90％、或至少约93％、或至少约95％、或至少约97％或至少约98％同一性的变体。
9.如权利要求8所述的组合物，其中编码所述人LDLR蛋白或其所述功能片段的所述核酸包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列或与所述核苷酸序列具有至少约90％、或至少约93％、或至少约95％、或至少约97％或至少约98％同一性的变体。
10.如权利要求7或8所述的组合物，其中相对于SEQ ID NO:3的氨基酸序列，所述人LDLR蛋白或其功能片段包含选自L18F、K830R和C839A的一个或多个突变。
11.如权利要求1至10中任一项所述的组合物，其中所述肝脏特异性启动子是LP1启动子，任选是人LP1启动子，或者其中所述肝脏特异性启动子是表1的启动子。
12.如权利要求11所述的组合物，其中所述LP1启动子包含：
(a)人抗胰蛋白酶启动子、人ApoE/HCR1增强子和/或SV40内含子；和/或
(b)SEQ ID NO:15的核酸序列或与所述核苷酸序列具有至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％、或至少约93％、或至少约95％、或至少约97％或至少约98％同一性的变体。
13.如权利要求1至12中任一项所述的组合物，其中所述非病毒载体是DNA质粒，并且任选地其中：
所述DNA质粒包含防止或减轻邻近基因的激活或失活的一个或多个绝缘子序列。
14.如权利要求1至13中任一项所述的组合物，其中：
所述ITR或所述末端序列是piggyBac样转座子的那些，任选地包含TTAA重复序列；并且/或者
所述I TR或所述末端序列位于编码所述VLDLR蛋白或所述LDLR蛋白或其功能片段的所述核酸侧翼。
15.如权利要求1至14中任一项所述的组合物，所述组合物还包含编码靶向原蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶kexi n 9(PCSK9)的微小RNA的核酸构建体。
16.如权利要求1至15中任一项所述的组合物，所述组合物还包含编码转座酶的核酸构建体，任选是编码所述转座酶的mRNA。
17.如权利要求16所述的组合物，其中所述转座酶来源于小棕蝠。
18.如权利要求1至15中任一项所述的组合物，所述组合物还包含编码转座酶的核酸构建体，任选是编码所述转座酶的DNA。
19.如权利要求16至18中任一项所述的组合物，其中所述转座酶来源于家蚕、热带爪蟾、粉纹夜蛾、马铁菊头蝠、埃及果蝠、苍白矛吻蝠、大鼠耳蝠、小棕蝠、大狐蝠、库氏伏翼、黑猩猩、獒蝠或智人，并且/或者是其工程化型式，并且/或者其中所述转座酶特异性地识别所述ITR或所述末端序列。
20.如权利要求1至19中任一项所述的组合物，其中所述组合物呈脂质纳米颗粒(LNP)的形式。
21.如权利要求20所述的组合物，所述组合物包含选自以下的一种或多种脂质：1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)、与二甲基氨基乙烷-氨甲酰基混合的阳离子胆固醇衍生物(DC-Chol)、磷脂酰胆碱(PC)、三油精(三油酸甘油酯)和1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[羧基(聚乙二醇)-2000](DSPE-PEG)、1,2-二肉豆酰-外消旋-甘油基-3-甲氧基聚乙二醇–2000(DMG-PEG 2K)和1,2二硬脂酰基-sn-甘油-3磷酸胆碱(DSPC)，并且/或者包含选自以下的一种或多种分子：聚乙烯亚胺(PEI)和聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)和N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)。
22.如权利要求1至21中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含额外治疗剂，其中所述额外治疗剂任选地选自以下中的一者或多者：他汀、依折麦布、胆汁酸结合树脂、依洛尤单抗、英立西兰、洛美他派和米泊美生，其中所述他汀任选地是以下中的一者或多者：阿托伐他汀(LIPITOR)、氟伐他汀(LESCOL)、洛伐他汀(ALTOCOR；ALTOPREV；MEVACOR)、匹伐他汀(LIVALO)、普伐他汀(PRAVACHOL)、瑞舒伐他汀钙(CRESTOR)和辛伐他汀(ZOCOR)。
23.一种分离的细胞，所述分离的细胞包含权利要求1至21中任一项所述的组合物。
24.一种用于降低患者中的总胆固醇和/或低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的方法，所述方法包括向有需要的患者施用权利要求1至21中任一项所述的组合物。
25.一种用于降低患者中的总胆固醇和/或低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的方法，所述方法包括：
(a)使从患者获得的细胞与权利要求1至21中任一项所述的组合物接触；以及
(b)将所述细胞施用于有需要的患者。
26.如权利要求24或25所述的方法，其中所述方法改善所述患者的心血管健康。
27.如权利要求24或25所述的方法，其中相对于在没有所述施用的情况下总胆固醇和/或LDL-C的水平，所述方法提供总胆固醇和/或LDL-C的大于约40％、或大于约50％、或大于约60％、或大于约70％、或大于约80％或大于约90％降低。
28.如权利要求24或25所述的方法，其中所述方法将血清LDL-C水平降低至小于500mg/dL(小于约13mmol/L)。
29.如权利要求24至28中任一项所述的方法，其中所述方法在不存在类固醇治疗的情况下进行。
30.如权利要求24至29中任一项所述的方法，其中所述方法是基本上非免疫原性的。
31.如权利要求24至30中任一项所述的方法，其中总胆固醇和/或LDL-C的所述降低是持久的。
32.如权利要求24至31中任一项所述的方法，其中所述方法需要单次施用。
33.如权利要求24至32中任一项所述的方法，其中所述方法刺激和/或增加肝细胞中的LDL代谢。
34.如权利要求24至33中任一项所述的方法，所述方法还包括施用：
编码任选地来源于家蚕、热带爪蟾、粉纹夜蛾、马铁菊头蝠、埃及果蝠、苍白矛吻蝠、大鼠耳蝠、小棕蝠、大狐蝠、库氏伏翼、黑猩猩、獒蝠或智人的转座酶和/或其工程化型式的核酸构建体；和/或
编码靶向PCSK9的微小RNA的核酸构建体。
35.如权利要求24至33中任一项所述的方法，所述方法还包括使所述细胞与以下接触：
编码任选地来源于家蚕、热带爪蟾、粉纹夜蛾、马铁菊头蝠、埃及果蝠、苍白矛吻蝠、大鼠耳蝠、小棕蝠、大狐蝠、库氏伏翼、黑猩猩、獒蝠或智人的转座酶和/或其工程化型式的核酸构建体；和/或
编码靶向PCSK9的微小RNA的核酸构建体。
36.如权利要求24至34中任一项所述的方法，其中所述施用是静脉内施用。
37.如权利要求24至36中任一项所述的方法，其中所述方法治疗家族性高胆固醇血症、常见高胆固醇血症、甘油三酯增加、胰岛素抵抗或代谢综合征。
38.如权利要求24至34中任一项所述的方法，其中所述施用是施用至肝脏，任选地施用至门静脉内或肝实质。
39.如权利要求34至38中任一项所述的方法，其中编码所述极低密度脂蛋白受体蛋白(VLDLR)或所述低密度脂蛋白受体蛋白(LDLR)或其功能片段的所述核酸与编码转座酶的所述核酸构建体的比例是约5:1、或约4:1、或约3:1、或约2:1、或约1:1、或约1:2、或约1:3、或约1:4或约1:5。
40.如权利要求34至39中任一项所述的方法，其中编码所述极低密度脂蛋白受体蛋白(VLDLR)或低密度脂蛋白受体蛋白(LDLR)或其功能片段的所述核酸与编码转座酶的所述核酸构建体的比例是约2:1。
41.如权利要求24至40中任一项所述的方法，所述方法还包括向所述有需要的患者施用靶向PCSK9的miRNA。
42.如权利要求24至40中任一项所述的方法，所述方法包括向所述有需要的患者施用额外治疗剂，其中所述额外治疗剂任选地选自以下中的一者或多者：他汀、依折麦布、胆汁酸结合树脂、依洛尤单抗、英立西兰、洛美他派和米泊美生。
43.如权利要求42所述的方法，其中所述他汀是以下中的一者或多者：阿托伐他汀(LIPITOR)、氟伐他汀(LESCOL)、洛伐他汀(ALTOCOR；ALTOPREV；MEVACOR)、匹伐他汀(LIVALO)、普伐他汀(PRAVACHOL)、瑞舒伐他汀钙(CRESTOR)和辛伐他汀(ZOCOR)。
44.一种用于治疗和/或减轻家族性高胆固醇血症(FH)的方法，所述方法包括向有需要的患者施用权利要求1至22中任一项所述的组合物。
45.一种用于治疗和/或减轻家族性高胆固醇血症(FH)的方法，所述方法包括：
(a)使从患者获得的细胞与权利要求1至22中任一项所述的组合物接触；以及
(b)将所述细胞施用于有需要的患者。
46.如权利要求44或45所述的方法，其中所述FH是纯合FH(HoFH)或杂合FH(HeFH)。
47.如权利要求44至46中任一项所述的方法，其中所述FH的特征在于APOB、LDLR和PCSK9中的一者或多者中的一个或多个突变。
48.如权利要求44至47中任一项所述的方法，其中所述方法治疗和/或减轻冠状动脉疾病(CAD)。
49.如权利要求44至48中任一项所述的方法，所述方法还包括施用以下中的一者或多者：他汀、依折麦布、胆汁酸结合树脂、依洛尤单抗、英立西兰、洛美他派和米泊美生。
50.如权利要求44至48中任一项所述的方法，其中所述方法消除对用以下中的一者或多者治疗的需要：他汀、依折麦布、胆汁酸结合树脂、依洛尤单抗、英立西兰、洛美他派和米泊美生。
51.如权利要求44至50中任一项所述的方法，其中所述方法消除对LDL单采血液成分术的需要。
52.如权利要求44至51中任一项所述的方法，其中所述方法消除对类固醇治疗的需要。
53.如权利要求44至52中任一项所述的方法，其中所述方法改善所述患者的心血管健康。
54.如权利要求44至53中任一项所述的方法，其中所述方法是基本上非免疫原性的。
55.如权利要求44至54中任一项所述的方法，其中所述治疗和/或减轻是持久的。
56.如权利要求44至55中任一项所述的方法，其中所述方法需要单次施用。
57.如权利要求44至56中任一项所述的方法，其中所述方法刺激和/或增加肝细胞中的LDL代谢。
58.如权利要求44至57中任一项所述的方法，所述方法还包括施用：
编码任选地源自家蚕或热带爪蟾的转座酶和/或其工程化型式的核酸构建体，和/或
编码靶向PCSK9的微小RNA的核酸构建体。
59.如权利要求44至58中任一项所述的方法，其中所述施用是静脉内施用。
60.如权利要求44至59中任一项所述的方法，其中所述施用是施用至肝脏，任选地施用至门静脉内或肝实质。
61.如权利要求44至57中任一项所述的方法，所述方法还包括使所述细胞与编码任选地来源于家蚕、热带爪蟾、粉纹夜蛾、马铁菊头蝠、埃及果蝠、苍白矛吻蝠、大鼠耳蝠、小棕蝠、大狐蝠、库氏伏翼、黑猩猩、獒蝠或智人的转座酶和/或其工程化型式的核酸构建体接触。
62.如权利要求58或权利要求61所述的方法，其中编码所述极低密度脂蛋白受体蛋白(VLDLR)或所述低密度脂蛋白受体蛋白(LDLR)或其功能片段的所述核酸与编码转座酶的所述核酸构建体的比例是约5:1、或约4:1、或约3:1、或约2:1、或约1:1、或约1:2、或约1:3、或约1:4或约1:5。
63.如权利要求58或权利要求61所述的方法，其中编码所述极低密度脂蛋白受体蛋白(VLDLR)或低密度脂蛋白受体蛋白(LDLR)或其功能片段的所述核酸与编码所述转座酶的所述核酸构建体的比例是约2:1。
64.如权利要求44至63中任一项所述的方法，所述方法还包括施用靶向PCSK9的miRNA。
65.如权利要求44至64中任一项所述的方法，所述方法包括向所述有需要的患者施用额外治疗剂，其中所述额外治疗剂任选地选自以下中的一者或多者：他汀、依折麦布、胆汁酸结合树脂、依洛尤单抗、洛美他派和米泊美生。
66.如权利要求65所述的方法，其中所述他汀是以下中的一者或多者：阿托伐他汀(LIPITOR)、氟伐他汀(LESCOL)、洛伐他汀(ALTOCOR；ALTOPREV；MEVACOR)、匹伐他汀(LIVALO)、普伐他汀(PRAVACHOL)、瑞舒伐他汀钙(CRESTOR)和辛伐他汀(ZOCOR)。
67.一种包含基因转移构建体的组合物，所述组合物包含：
(a)编码极低密度脂蛋白受体蛋白(VLDLR)或低密度脂蛋白受体蛋白(LDLR)或其功能片段的核酸，其中所述VLDLR是人VLDLR，所述人VLDLR包含SEQ ID NO:4的核苷酸序列或与所述核苷酸序列具有约90％同一性的变体，或SEQ ID NO:5的核苷酸序列或与所述核苷酸序列具有约90％同一性的变体；
(b)肝脏特异性启动子，其中所述肝脏特异性启动子是人LP1启动子，所述人LP1启动子具有SEQ ID NO:15的核酸序列或与所述核酸序列具有至少约90％同一性的变体；和
(c)非病毒载体，所述非病毒载体包含一个或多个转座酶识别位点和一个或多个反向末端重复序列(ITR)或末端序列。
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