KR20230002594A - 가족성 고콜레스테롤혈증 및 상승된 저밀도 지단백질 콜레스테롤의 치료를 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

가족성 고콜레스테롤혈증 및 상승된 저밀도 지단백질 콜레스테롤의 치료를 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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조셉 제이. 히긴스
스콧 맥밀란
레이 타비비아자르
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살리오젠 테라퓨틱스 인코포레이티드
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Abstract

초저밀도 지단백질 수용체 유전자(VLDLR) 및 저밀도 지단백질 수용체 유전자(LDLR)를 표적으로 하여 환자에서 총 콜레스테롤 및/또는 저밀도 지단백질 콜레스테롤(LDL-C)을 저하시켜서, 가족성 고콜레스테롤혈증을 치료 또는 완화하기 위한 유전자 치료 조성물 및 방법이 제공된다.

Description

가족성 고콜레스테롤혈증 및 상승된 저밀도 지단백질 콜레스테롤의 치료를 위한 조성물 및 방법
본 발명의 분야
본 발명은, 부분적으로는, 상승된 저밀도 지단백질 콜레스테롤(LDL-C)과 관련된 질환 및 병태를 치료 및/또는 완화하기 위한 방법, 조성물, 및 제품에 관한 것이다.
우선권
본 출원은 2020년 4월 29일자로 출원된 미국 특허 가출원 제63/017,424호에 대한 우선권 및 이로부터의 이익을 주장하며, 이의 전체 내용은 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
전자적으로 제출된 텍스트 파일에 대한 설명
본 출원은 EFS-웹(Web)을 통해 본 명세서와 함께 전자적으로 제출된 ASCII 형식의 서열목록을 포함한다. 2021년 4월 28일자로 생성된 ASCII 사본은 명칭이 SAL-001PC_Sequence Listing_ST25.txt이고, 크기가 75,515 바이트이다. 서열목록은 본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용된다.
가족성 고콜레스테롤혈증( familial hypercholesterolemia: FH)은 가장 흔한 이상지질혈증 중 하나이며 태어날 때부터 총 콜레스테롤 및 저밀도 지단백질 콜레스테롤(LDL-C)의 높은 농도를 특징으로 하는 상염색체 우성 질환이다. 이는 1:200 내지 1:250명 사이의 빈도로 생명을 위협하는 병태로서, 이는 죽상동맥경화증의 가속화 및 조기 관상동맥 심장 질환을 야기한다. 문헌[Hopkins et al., J Clin Lipidol 2011;5:S9-17; Talmud et al. Curr Opin Lipidol 2014;25:274-81]을 참조한다.
콜레스테롤은 필수 세포 성분이며 콜레스테롤 항상성의 유지는 정상적인 생리 기능에 중요하다. 혈장 콜레스테롤 수준의 상승은 다양한 병리학적 상태, 가장 특히 높은 콜레스테롤 수준이 동맥에서 거품 세포 형성 및 플라크 축적을 야기하여 잠재적으로 심장마비 또는 뇌졸중을 초래하는 관상동맥 심장 질환과 연관이 있다. 세포 콜레스테롤 대사 및 혈장 콜레스테롤 수준의 조절은 특정 세포로의 저밀도 지단백질(LDL) 수용체-매개 LDL 흡수에 따라 다르다. LDL은 혈중 콜레스테롤의 주요 운반체로서, 총 혈장 콜레스테롤의 60% 초과를 차지한다. LDL은 apoB-100-LDL 수용체 상호작용에 의해 촉발된 수용체 매개 엔도사이토시스를 통해 간 및 간외 조직에 의해 흡수된다. 내재화된 LDL 입자는 리소좀으로 운반되며, 리소좀에서 유리 콜레스테롤과 아미노산으로 분해된다. 인간에서, 간은 LDL 이화작용과 LDL 수용체 활성에 가장 중요한 기관이다. 간에서, LDL은 약리학적 개입에 의해 조절될 수 있다. 간 조직에 의한 LDL 흡수의 기본 메커니즘은 명확하게 이해되지 않는다. 따라서, LDL 섭취와 이의 조절은 죽상동맥경화증 및 관련 질환에 대한 중요한 치료 표적이다.
FH는 가장 심각한 일반적으로 유전되는 대사 질환 중 하나를 구성한다. 높은 유병률에도 불구하고, FH는 여전히 심각하게 과소진단되고 불충분하게 치료된다. FH의 추정되는 70% 내지 95%는 3개의 유전자(APOB, LDLR, 전단백질 전환효소 서브틸리신 켁신 9(proprotein convertase subtilisin kexin 9: PCSK9)) 중 하나의 이형접합 병원성 변이체에 기인한다. 저밀도 지단백질 수용체 유전자(LDLR)의 돌연변이가 90% 초과의 사례를 유발한다. LDLR은 저밀도 지단백질-콜레스테롤(LDL-C)의 엔도사이토시스에 관여하는 세포 표면 단백질 수용체이다. LDL-C가 세포막에 결합된 후, 세포에 의해 흡수되어 단백질 모이어티가 분해되고 콜레스테롤 분자가 음성 피드백을 통해 추가 콜레스테롤 합성을 억제하는 리소좀으로 운반된다. LDLR 유전자의 병원성 변이체는 세포 내에서 생성되는 LDL 수용체의 수를 감소시키거나 LDL-C에 결합하는 수용체의 능력을 방해한다. LDLR 유전자의 동형접합 FH(HoFH) 및 이형접합 FH(HeFH) 병원성 변이체는 높은 수준의 혈장 LDL-C 및 죽상동맥경화증을 유발한다.
동형접합 FH는 3개의 유전자(APOB, LDLR, PCSK9) 중 하나의 이중대립(동형접합 또는 복합 이형접합) 병원성 변이체에 기인한다. 처음에 1:1,000,000에 영향을 미치는 것으로 설명된 HoFH는 현재 유병률이 1:160,000 내지 1:250,000인 것으로 추정된다. Cuchel et al. Eur Heart J 2014;35:2146-57. HoFH가 있는 대부분의 개체는 20대 중반까지 심각한 관상동맥 질환(CAD)을 경험한다. 십대까지의 사망률이나 관상동맥 우회술의 비율이 높고, 심각한 대동맥판막 협착증도 또한 흔하다.
FH의 종래 치료는 전형적으로 여러 약리학적 작용제를 포함한다. 예를 들어, 스타틴 약물은 HeFH 환자에게 도움이 될 수 있지만, 특히 HoFH가 있는 개체의 경우 반응이 종종 약화되고 부적절할 수 있다. 스타틴의 효능은 간에서 기능적 LDL 수용체의 상향 조절에 크게 좌우되기 때문에 HoFH 치료에서 스타틴은 상대적으로 비효과적일 수 있다. 또한, 일부 환자는 스타틴 불내성을 갖는다. HoFH가 있는 개체의 경우, LDL 수용체 복제물 둘 다의 활성이 없거나 크게 감소하며, HoFH에 대한 치료는 종종 여러 다른 약물의 사용에 추가적으로 LDL 성분채집술(기계적 여과)을 필요로 한다. LDL 성분채집술은 종종 어린 나이부터 시작하는 것이 요구되며, 이 절차를 제공하는 시설의 수가 제한되어 이의 사용이 악화된다. 일부 심각한 경우, FH 환자는 간 이식을 받는다.
로미타피드(lomitapide), 미포머센(mipomersen; KYNAMRO), 전단백질 전환효소 서브틸리신/켁신 유형 9(PCSK9) 저해제(예를 들어, 인클리시란(inclisiran), 에볼로쿠맙(evolocumab; REPATHA), 알리로쿠맙(alirocumab, PRALUENT))를 포함하여 FH 및 LDL-C가 상승된 환자의 치료를 위한 여러 약물이 존재한다. 그러나, 현재의 노력에도 불구하고, LDL-C 수준과 연관 심혈관 이환율 및 사망률은 FH 환자에서 여전히 높다. FH는 종종 평생 지질-저하 약물 요법을 필요로 하며, 이는 환자와 의료 시스템에 부담이 된다.
따라서, 환자에서 LDL-C를 저하시켜 환자의 심혈관 건강을 개선하기 위한 개선된 조성물 및 방법에 대한 요구가 남아 있다.
본 발명은 가족성 고콜레스테롤혈증(FH) 또는 상승된 LDL-C가 있는 환자에서 심혈관 사건을 치료 및/또는 완화하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 본 발명의 조성물 및 방법은 LDLR 유전자 돌연변이 또는 상승된 LDL-C가 있는 환자에서 지질 대사를 교정하기 위해 서열-특이적 또는 유전자좌-특이적 전위(SLST)를 사용하는 트랜스포존 발현 벡터를 포함하는 유전자 전달 작제물을 사용한다. 이러한 방식으로, 본 발명은 간세포, 동형접합 FH(HeFH), 이형접합 FH(HoFH) 환자, 및 상승된 LDL-C가 있는 환자에서 LDL 대사를 회복시키는 방법을 제공한다. 본 발명은 가족성 고콜레스테롤혈증, 일반적인 고콜레스테롤혈증, 트라이글리세라이드 증가, 인슐린 저항성, 대사 증후군 및 총 콜레스테롤 수준 상승을 특징으로 하는 기타 질환을 치료하는 데 사용될 수 있다.
따라서, 일부 양태에서, (a) 초저밀도 지단백질 수용체(VLDLR) 단백질 또는 저밀도 지단백질 수용체(LDLR) 단백질 또는 이의 기능적 단편을 인코딩하는 핵산; (b) 간-특이적 프로모터; 및 (c) 하나 이상의 트랜스포사제 인식 부위 및 하나 이상의 역 말단 반복부(inverted terminal repeat: ITR) 또는 말단 서열을 포함하는 비-바이러스 벡터를 포함하는, 유전자 전달 작제물을 포함하는 조성물이 제공된다. 실시형태에서, 이들 작제물은 PCSK9 miRNA와 조합되어 PCSK9의 간 합성을 감소시키고 LDL 및 VLDL 수용체 둘 다를 상향조절할 수 있다. 유전자 전달은 기능적 VLDLR 또는 LDLR의 안정적인 부위-특이적 게놈 통합을 가능하게 한다. 본 발명의 유전자 전달 작제물은 총 콜레스테롤 수준을 저하시켜 FH 및 이의 증상을 치료 및/또는 완화하고 환자의 전반적인 심혈관 건강을 개선시킬 수 있다.
본 개시내용에 따른 유전자 치료는, 전달될 유전자와 동일한 벡터(시스) 또는 상이한 벡터(트랜스) 상에 제공되는 트랜스포사제의 도움으로, 트랜스포존-기반 벡터 시스템을 사용하여 수행될 수 있다. 트랜스포존-기반 벡터 시스템은 간-특이적 프로모터의 제어 하에 작동할 수 있다. 일부 실시형태에서, 간-특이적 프로모터는 LP1 프로모터이다. LP1 프로모터는 인간 LP1 프로모터일 수 있으며, 이는 예를 들어 문헌[Nathwani et al. Blood vol. 107(7) (2006):2653-61]에 기재된 바와 같이 구축될 수 있고, 이는 본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용된다. 실시형태에서, LP1 프로모터는 문헌[Nathwani et al. Blood vol. 107(7) (2006):2653-61]에 기재되어 있으며, 이는 본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용되고, 예를 들어 Nathwani외 다수의 도 S1을 참조한다.
실시형태에서, 트랜스포사제, 예를 들어 봄빅스 모리(Bombyx mori), 제노푸스 트로피칼리스(Xenopus tropicalis), 트리코플루시아 니(Trichoplusia ni), 리놀로푸스 페룸에퀴눔(Rhinolophus ferrumequinum), 로우세투스 아에집티아쿠스(Rousettus aegyptiacus), 필로스토무스 디스콜로르(Phyllostomus discolor), 마이오티스 마이오티스(Myotis myotis), 마이오티스 루시푸구스(Myotis lucifugus), 프테로푸스 밤피루스(Pteropus vampyrus), 피피스트렐루스 쿠흘리(Pipistrellus kuhlii), 판 트로글로다이테스(Pan troglodytes), 몰로수스 몰로수스(Molossus molossus), 또는 호모 사피엔스(Homo sapiens)로부터 유래된 것, 및/또는 이의 조작된 형태가 PCSK9 침묵 miRNA의 유무에 관계없이 환자의 게놈으로 유전자 전달 작제물의 VLDLR 또는 LDLR 유전자를 삽입하는 데 사용된다(따라서, PCSK9 침묵 miRNA의 유무에 관계없이 VLDLR 또는 LDLR 유전자 작제물은 때때로 본 명세서에서 트랜스포존으로 지칭됨).
실시형태에서, 트랜스포사제는 서열번호 9, 또는 이와 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 93%, 또는 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 97%, 또는 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 동일성을 갖는 변이체의 아미노산 서열, 및 L573X, E574X 및 S2X로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 마이오티스 루시푸구스 트랜스포사제(MLT, 또는 MLT 트랜스포사제)이며, 여기서 X는 임의의 아미노산이거나 아미노산이 없는 것이고, 선택적으로 X는 A, G 또는 결실이다. 실시형태에서, 돌연변이는 L573del, E574del 및 S2A이다.
실시형태에서, MLT 트랜스포사제는 L573X, E574X 및 S2X로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 갖는다. 일부 실시형태에서, X는 임의의 아미노산이거나 아미노산이 없다.
실시형태에서, MLT 트랜스포사제는 돌연변이 L573del, E574del 및 S2A, 그리고 추가적으로 과잉활성(또는 과잉활성 돌연변이)을 부여하는 하나 이상의 돌연변이가 있는 아미노산 서열을 포함한다. 실시형태예에서, 과잉활성 돌연변이는 S8X, C13X 및 N125X 돌연변이 중 하나 이상이며, 여기서 X는 선택적으로 임의의 아미노산이거나 아미노산이 없는 것이고, 선택적으로 X는 P, R 또는 K이다. 실시형태에서, 돌연변이는 S8P, C13R 및 N125K이다. 일부 실시형태에서, MLT 트랜스포사제는 S8P 및 C13R 돌연변이를 갖는다. 일부 실시형태에서, MLT 트랜스포사제는 N125K 돌연변이를 갖는다. 일부 실시형태에서, MLT 트랜스포사제는 3개의 S8P, C13R 및 N125K 돌연변이 모두를 갖는다.
기재된 조성물은 지질 나노입자(LNP)를 사용하여 숙주 세포에 전달될 수 있다. 일부 실시형태에서, LNP는 중성 또는 구조적 지질(예를 들어, DSPC), 양이온성 지질(예를 들어, MC3), 콜레스테롤, PEG-접합 지질(CDM-PEG), 및 표적화 리간드[(예를 들어, N-아세틸갈락토사민(GalNAc)]로부터 선택되는 하나 이상의 분자를 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는 GalNAc 또는 LDL, VLDL 또는 다른 지질 수용체가 감소되거나 부재하는 간세포로의 아시알로당단백질 수용체(ASGPR)-매개 흡수를 위한 GalNAc 또는 또 다른 리간드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 환자의 총 콜레스테롤 및/또는 LDL-C를 저하시키는 방법이 제공되며, 이는 생체내 또는 생체외 방법일 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 이를 필요로 하는 환자에게 본 개시내용의 실시형태에 따른 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 환자에서 총 콜레스테롤 및/또는 LDL-C를 저하시키기 위한 생체외 방법은 (a) 환자로부터 수득한 세포를 기재된 조성물과 접촉시키는 단계, 및 (b) 세포를 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 상승된 LDL-C를 치료 및/또는 완화하는 방법이 제공되며, 이는 또한 생체내 또는 생체외에서 수행될 수 있다. 상승된 LDL-C를 치료 및/또는 완화하는 방법은 FH를 치료 및/또는 완화하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 방법은 본 개시내용의 실시형태에 따른 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, FH를 치료 및/또는 완화하는 방법은 (a) 환자로부터 수득된 세포를 본 개시내용의 조성물과 접촉시키는 단계, (b) 세포를 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 개시내용의 실시형태에 따른 조성물 및 방법은 실질적으로 비-면역원성이고, 임의의 관리 불가능한 부작용을 유발하지 않으며, 일부 경우에 단일 투여를 통해 효과적으로 전달될 수 있다. FH의 치료 및/또는 완화, 또는 총 콜레스테롤 및/또는 LDL-C의 저하는 강력하고 영속성이 있을 수 있다. 기재된 조성물 및 방법은 관상 동맥 질환(CAD) 또는 죽상동맥경화증의 치료 및/또는 완화를 가능하게 한다.
본 개시내용의 일부 양태에서, 본 개시내용의 실시형태에 따른 조성물을 포함하는 단리된 세포가 제공된다.
본 발명의 세부사항은 하기 첨부된 설명에 제시되어 있다. 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 테스트에 사용될 수 있지만, 예시적인 방법 및 물질이 이제 설명된다. 본 발명의 다른 특징, 목적, 및 이점은 상세한 설명 및 청구범위로부터 명백할 것이다. 명세서 및 첨부된 청구범위에서, 문맥이 명확하게 달리 지시하지 않는 한, 단수 형태는 또한 복수를 포함한다. 달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 당업자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다.
도 1은 인간 LDRL 유전자의 개략도를 도시한다.
도 2는 인간 LDRL 유전자 mRNA의 개략도를 도시한다.
도 3은 인간 LDRL 단백질의 개략도를 도시한다.
도 4A, 도 4B, 도 4C, 도 4D, 도 4E, 도 4F, 도 4G 및 도 4H는 본 개시내용의 일부 실시형태에서 사용된 유전자 전달 작제물의 개략도이다.
도 5는 본 개시내용의 일부 실시형태에서 사용된 지질 나노입자 구조를 예시한다.
도 6은 뉴클레오펙션(nucleofection) 24시간 후 Huh7 세포의 GFP 발현을 예시하며: 4개의 패널(좌측에서 우측으로)은 Nucleofector™ 용액 키트(Lonza, 스위스 바젤 소재), 프로그램 CA-137, CM-150, CM-138, 및 EO-100으로 얻은 데이터를 예시한다. 각각의 패널의 상단 행은 GFP 형광을 나타내고, 하단 행은 명시야 현미경 데이터를 나타낸다.
도 7은 뉴클레오펙션 4일 후 Huh7 세포의 GFP 발현 결과를 예시하고; 4개의 패널(좌측에서 우측으로)은 Nucleofector™ 용액 키트, 프로그램 CA-137, CM-150, CM-138 및 EO-100으로 얻은 데이터를 예시한다. 각각의 패널의 상단 행은 GFP 형광을 나타내고, 하단 행은 명시야 현미경 데이터를 나타낸다.
도 8A, 도 8B, 도 8D 및 도 8D는 뉴클레오펙션 24시간 후 뉴클레오펙션 효율의 정량화 결과를 예시한다: 데이터는 Nucleofector™ 용액 키트, 프로그램 CA-137(도 8A), CM-150(도 8B), CM-138(도 8C) 및 EO-100(도 8D)으로 얻은 것이다. 각각의 도면의 상단 행은 GFP 형광을 나타내고, 하단 행은 형광-활성화 세포 분류(FACS) 플롯을 나타낸다.
도 9A, 도 9B, 도 9C, 도 9D, 도 9E, 도 9F 및 도 9G는 다음과 같이 형질감염 7일 후 상이한 조건 하에서 형질감염된 Huh7 세포의 FACS 플롯을 예시한다: (도 9A) 프로그램 없음 - 음성 분석 대조군; (도 9B) pmaxGFP - 양성 분석 대조군; (도 9C) LP1-VLDLR/PGK-GFP 플라스미드(즉, LP1 프로모터, 초저밀도 지단백질 수용체(VLDLR) 유전자, 및 향상된 GFP(eGFP)의 PGK 프로모터-유도 발현을 포함하는 플라스미드); (도 9D) LP1-VLDLR/PGK-GFP + MLT 1; (도 9E) LP1-VLDLR/PGK-GFP + MLT 2; (도 9F) MLT 1; 및 (도 9G) MLT 2.
도 10은 미처리 Huh7 세포 대 VLDLR 플라스미드 및 MLT 트랜스포사제 2로 처리된 Huh7 세포의 LDL-C 흡수를 도시한다.
도 11은 다양한 조건 하에 VLDLR 발현의 RT qPCR 결과를 도시한다: 미처리 Huh7 세포; LP1-hVLDRL 공여체 및 MLT 트랜스포사제로 처리된 Huh7 세포; LP1-hVLDRL + PGK-GFP 공여체 및 MLT 트랜스포사제로 처리된 Huh7 세포; 공여체로 처리되지 않은 Huh7 세포("공여체 없음(NO DONOR)"); 공여체(LP1-hVLDRL)만으로 처리된 Huh7 세포("공여체 단독(DONOR ONLY)"); 공여체(LP1-hVLDRL + PGK-GFP)만으로 처리된 Huh7 세포("공여체 단독(DONOR ONLY)"); HEK293 세포.
도 12는 본 개시내용의 일부 실시형태에서 사용된 유전자 전달 작제물(DNA 공여체 플라스미드)의 개략도이다.
도 13A, 도 13B 및 도 13C는 도 12의 유전자 전달 작제물을 사용한 트랜스포사제(MLT 1 및 MLT 2)를 이용한 분석("트랜스포사제+") 및 이용하지 않은 분석("트랜스포사제-")에 대한 Huh7 세포에서의 GFP 발현의 이미지 및 FACS 플롯이다. 도 13A, 도 13B 및 도 13C는 각각 24시간(도 13A), 72시간(도 13B) 및 7일(도 13C)에서의 트랜스포사제- 분석(상단) 및 트랜스포사제+ 분석(하단)에 대한 데이터를 나타낸다.
도 14A, 도 14B, 도 14C 및 도 14D는 뉴클레오펙션되지 않은(미처리) HEK293 및 Huh7 세포에서 기준선 LDL 흡수를 예시한다: 도 14A는 미처리 HEK293 세포, LDL 흡수 단독을 나타내고; 도 14B는 미처리 Huh7 세포, LDL 흡수 단독을 나타내며; 도 14C는 염색되지 않은 미처리 HEK293 세포를 나타내고; 도 14D는 염색되지 않은 미처리 Huh7 세포를 나타낸다.
도 15A, 도 15B, 도 15C, 도 15D 및 도 15E는 전위된 대 전위되지 않은 Huh7 세포에서 LDL 흡수를 예시한다: 도 15A는 비교를 위해 전위되지 않은(트랜스포사제 -) HEK293 세포를 나타내고; 도 15B는 전위되지 않은(트랜스포사제 -) Huh7 세포를 나타내며; 도 15C는 인간 LP1-VLDLR 플라스미드(pVLDLR)로 뉴클레오펙션된 전위되지 않은(트랜스포사제 -) Huh7 세포를 나타내고; 도 15D는 인간 LP1-VLDLR 플라스미드(pVLDLR)로 뉴클레오펙션된 MLT 1로 전위된 Huh7 세포를 나타내며; 도 15E는 인간 LP1-VLDLR 플라스미드(pVLDLR)로 뉴클레오펙션된 MLT 트랜스포사제 2로 전위된 Huh7 세포를 나타낸다.
도 16A 및 도 16B는 제3일(도 16A) 및 제5일(도 16B)의 동물 코호트 1(표 7에 기재함)에 대한 전신 생물발광 영상화(BLI)를 나타낸다.
도 17A 및 도 17B는 제3일(도 17A) 및 제5일(도 17B)의 동물 코호트 2(표 8에 기재함)에 대한 BLI를 나타낸다.
도 18A 및 도 18B는 제3일(도 18A) 및 제5일(도 18B)의 동물 코호트 3(표 9에 기재함)에 대한 BLI를 나타낸다.
도 19는 장기간 유지(각각 26일 및 33일) 후 동물군 6 및 동물군 8에 속하는 동물의 BLI를 나타낸다.
도 20은, 좌측 패널의 제26일에 LNP 중간 용량(250uL)(ldlr-/-)을 투여한 동물 일련 번호 6001의 BLI(표 8); 우측 패널의 제26일에 LNP 낮은 용량(125uL)(ldlr-/-)을 투여한 동물 일련 번호 8002의 BLI(표 9)를 나타낸다.
도 21A는 ldlr -/- 마우스에서 본 개시내용의 간-특이적 LNP 제형의 효능 평가 결과를 나타낸다. 트라이글리세라이드(㎎/dL)는 미처리 및 처리(vldlr) 마우스의 경우 기준 범위와, 제7일(D7) 및 제15일(D15)에 나타나 있다.
도 21B는 테스트 동물의 혈액 내 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT)의 측정값으로서, 안전성 평가 결과(단위: u/L)를 나타낸다. 데이터는 미처리, 처리(vLdlr), 및 PBS 그룹에 대해 나타나 있으며, 각각은 참조("1") 범위, 및 D7("2")과 D15("3")에 대한 데이터를 포함한다.
본 발명은 부분적으로 비-바이러스의, 무-캡시드 유전자 치료 방법 및 조성물이 총 콜레스테롤 및 저밀도 지단백질 콜레스테롤(LDL-C)을 저하시키고 이에 의해 가족성 고콜레스테롤혈증(FH) 및 LDL-C 상승의 심혈관 영향을 치료 및 완화하는 데 사용될 수 있다는 발견을 기반으로 한다. 본 개시내용에 따른 비-바이러스 유전자 치료 방법은 간-지향(liver-directed) 유전자 치료에 사용되어 저밀도 지단백질 수용체 유전자(LDLR), 초저밀도 지단백질 수용체 유전자(VLDLR)의 돌연변이를 교정하거나, LDL-C의 혈청 상승을 완화한다. 기재된 방법 및 조성물은 LDLR 또는 VLDLR의 전위를 이용한다. 기재된 방법 및 조성물은 환자의 심혈관 건강을 개선시키고 이에 의해 환자의 전반적인 예후 및 건강을 개선시킨다.
일부 실시형태에서, 기재된 방법 및 조성물은 1회 용량 또는 반복 용량으로 투여될 수 있다. 투여 경로는 일부 실시형태에서 정맥내로 또는 문맥내 정맥으로 또는 간 실질로 직접일 수 있다.
FH는 3가지 주요 유전자인 LDLR, APOB 및 PCSK9의 돌연변이에 의해 유발되지만, LDLR의 돌연변이가 가장 흔하며, 보고된 FH-유발 변이체의 90% 초과가 LDLR에 있고, 5% 내지 10%가 APOB에 있으며 1% 미만이 PCSK9에 있다. 문헌[Iacocca et al. Expert Rev Mol Diagn 2017; 17:641-51]을 참조한다.
LDLR은 19번 염색체에 위치하며 게놈 구조는 18개의 엑손과 17개의 인트론을 포함하여 45 kb에 걸쳐 있다. LDLR 유전자, mRNA, 및 단백질은 각각 도 1, 도 2 및 도 3에 개략적으로 나타나 있다. 인간 LDLR 전사체 변이체 1 mRNA(NCBI 참조: NM_000527.5)는 다음과 같다:
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
병원성 변이체는 LDLR의 프로모터, 인트론, 및 엑손에서 보고되었으며, 병원성 변이체의 대부분은 리간드-결합(40%) 또는 표피 성장 인자 전구체-유사(47%) 도메인에 속하며, 가장 높은 빈도의 병원성 변이체는 엑손 4(20%)에서 보고된다. LDLR은 839개 아미노산의 성숙한 단백질 생성물을 인코딩한다. LDLR은 서로 독립적으로 기능할 수 있는 4개의 별개의 기능적 도메인, 즉, LDL 수용체 도메인 부류 A(LDLa); 표피 성장 인자-유사 도메인(EGF); 칼슘-결합 EGF-유사 도메인(EGF-CA); 및 LDL 수용체 반복 부류 B(LDLb)를 갖는다. LDLR은 LDL 콜레스테롤(LDL-C)의 엔도사이토시스에 관여하는 세포 표면 단백질을 포함한다. LDL-C가 세포막에 결합된 후, LDL-C는 세포 내 및 리소좀으로 흡수되며, 여기서 단백질 모이어티가 분해되고 콜레스테롤 분자가 음성 피드백을 통해 콜레스테롤 합성을 억제한다.
LDLR의 병원성 변이체는 보통 세포 내에서 생성되는 LDL 수용체의 수를 감소시키거나 LDL-C에 결합하는 수용체의 능력을 방해한다. 특정 메커니즘과 관계없이, LDLR의 이형접합 병원성 변이체는 높은 수준의 혈장 LDL-C를 유발한다.
간 LDLR 발현은 LDLR의 PCSK9-매개 분해를 방해하는 2세대 지질-저하 약물의 중심인 PCSK9에 의해 조절된다. 또 다른 메커니즘은 유비퀴틴-프로테아좀 경로에 의한 수용체의 분해를 기반으로 하는 LDLR 발현의 전사 후 조절을 포함하며, 이는 수용체 발현을 증가시키는 추가적인 표적으로 등장하였다. LDLR 발현을 증가시키는 이와 같은 전략은 PCSK9에서 자연적으로 발생하는 기능 상실 돌연변이와 LDL-C 수준을 저하시키지만 이러한 변이체와 연관된 질환이 없는 LDLR의 유도성 분해제(IDOL; MYLIP)에 의해 뒷받침된다. 인간 LDLR 변이체인 K830R 및 C839A는 LDLR의 IDOL-매개 분해를 방지하는 것으로 이전에 보고된 바 있다. Somanathan et al., Circ Res 2014; 115:591-9. 추가적으로, L339D는 인간 PCSK9-매개 분해에 대한 저항성을 부여한다. 상기 문헌과 동일. 3가지 변이체(L339D, K830R, 및 C839A)를 모두 포함하는 LDLR을 전달하는 AAV 벡터에서, LDLR은 야생형 LDLR을 사용하는 벡터와 비교하여 PCSK9 및 IDOL 경로 둘 다에 의한 조절에 대해 저항성이 있었다. 상기 문헌과 동일.
일부 실시형태에서, 인간 LDLR 단백질 또는 이의 기능적 단편을 인코딩하는 핵산은 NM_000527.5(서열번호 1)의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 93%, 또는 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 97%, 또는 적어도 약 98% 동일성을 갖는 변이체를 포함한다.
실시형태에서, LDLR 단백질은 인간 LDLR 단백질 또는 이의 기능적 단편이다.
실시형태에서, 인간 LDLR 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 기능적 단편을 인코딩하는 핵산은 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 단백질, 또는 이와 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 93%, 또는 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 97%, 또는 적어도 약 98% 동일성을 갖는 변이체를 포함한다.
실시형태에서, 인간 LDLR 단백질 또는 이의 기능적 단편을 인코딩하는 핵산은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 93%, 또는 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 97%, 또는 적어도 약 98% 동일성을 갖는 변이체를 포함한다.
일부 실시형태에서, 인간 LDLR 단백질은 L339D, K830R 및 C839A로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 인간 LDLR은 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 인코딩하는 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 93%, 또는 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 97%, 또는 적어도 약 98% 동일성을 갖는 변이체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 인간 LDLR은 서열번호 3의 아미노산 서열을 인코딩하는 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 93%, 또는 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 97%, 또는 적어도 약 98% 동일성을 갖는 변이체를 포함한다.
실시형태에서, 인간 LDLR 단백질 또는 이의 기능적 단편은 서열번호 3의 아미노산 서열을 참조하여 L18F, K830R 및 C839A로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다.
서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열(2583 bp)은 변이체 L339D, K830L, C839A를 포함하며, 이는 하기에 볼드체로 밑줄쳐 있다. 서열번호 3의 아미노산 서열(860개 아미노산)은 변이체 L339D, K830L, C839A를 포함하며, 이는 하기에 볼드체로 밑줄쳐 있다.
서열번호 2는 다음과 같다:
Figure pct00004
서열번호 3은 다음과 같다:
Figure pct00005
일부 실시형태에서, 인간 LDLR을 인코딩하는 핵산은 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 93%, 또는 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 97%, 또는 적어도 약 98% 동일성을 갖는 변이체를 포함한다.
VLDLR은 9번 염색체에 위치하며 게놈의 대략 40 kb에 걸쳐 있는 19개의 엑손을 포함한다. 유전자의 엑손-인트론 구조는 VLDL 수용체의 리간드 결합 도메인에서 추가적인 반복을 인코딩하는 추가 엑손을 제외하고는, LDLR 유전자의 구조와 거의 동일하다. 호모 사피엔스 VLDLR 전사체(mRNA) 변이체 1은 9,213 bp(NCBI 참조: NM_003383.5) 또는 대략 9.2 kb이다:
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
LDLR과 마찬가지로 VLDLR은 5개의 도메인, 즉, LDLR의 리간드-결합 도메인과 상동성인 8개의 시스테인이 풍부한 반복부로 구성된 N-말단의 328개 아미노산; LDLR에서 리간드의 산-의존성 해리를 매개하는 표피 성장 인자 전구체와 상동성인 396개 아미노산 영역; LDLR의 클러스터링된 O-연결 당과 상동성인 46개 아미노산 도메인; 22개 아미노산 막횡단 도메인; 및 피막소와(coated pit) 내로 수용체의 클러스터링에 필요한 NPXY 서열을 포함하는 54개 아미노산 세포질 도메인으로 이루어진다. VLDL 수용체에 대한 유전자는 지방산 대사에 활성인 심장, 근육, 및 지방 조직에서 고도로 발현되며; 본질적으로 간에서는 발현이 발견되지 않는다.
본 개시내용의 조성물 및 방법은 LDLR 및 VLDLR을 표적으로 하여 환자의 게놈에서 병원성 변이체를 교정하고 따라서 총 콜레스테롤 및/또는 저밀도 지단백질 콜레스테롤(LDL-C)을 저하시키는 유전자 전달 작제물을 제공한다. 따라서, 본 개시내용의 일부 양태에서, (a) VLDLR 또는 LDLR, 또는 이의 기능적 단편, (b) 간-특이적 프로모터, 및 (c) 하나 이상의 트랜스포사제 인식 부위 및 하나 이상의 역 말단 반복부(ITR) 또는 말단 서열을 포함하는 비-바이러스 벡터를 포함하는, 유전자 전달 작제물을 포함하는 조성물이 제공된다.
일부 실시형태에서, 유전자 전달 작제물은 LDLR 대신 VLDLR, 또는 이의 기능적 단편을 포함한다. VLDLR은 구조적 및 기능적으로 LDLR과 밀접하게 관련되어 있으며, 내피 세포로의 직접적인 흡수 및 이러한 지단백질의 지단백질 리파제-매개 대사를 상향 조절함으로써 apoE가 풍부한 지단백질의 간외 대사를 주로 조절한다. LDLR과 달리, VLDLR의 발현은 세포 내 유리 콜레스테롤에 의해 조절되지 않는다. LDLR이 풍부한 간세포에서, VLDLR은 일반적으로 소량으로만 발현되지만 LDLR의 부재를 보완할 수 있다. 문헌[Takahashi et al. J Atheroscler Thromb 2004; 11:200-8; Turunen et al. (2016). Mol Ther 2016; 24:620-35; Go & Mani. Yale J Biol Med 2012; 85:19-28]을 참조한다.
일부 실시형태에서, VLDLR 단백질은 인간 VLDLR 단백질 또는 이의 기능적 단편이다. 실시형태에서, 인간 VLDLR 단백질 또는 이의 기능적 단편을 인코딩하는 핵산은 서열번호 6의 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 93%, 또는 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 97%, 또는 적어도 약 98% 동일성을 갖는 변이체를 포함한다.
일부 실시형태에서, 인간 VLDLR, 또는 이의 기능적 단편을 인코딩하는 핵산은 서열번호 5의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 93%, 또는 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 97%, 또는 적어도 약 98% 동일성을 갖는 변이체를 포함한다:
Figure pct00010
일부 실시형태에서, 인간 VLDLR, 또는 이의 기능적 단편을 인코딩하는 핵산은 서열번호 6의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 93%, 또는 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 97%, 또는 적어도 약 98% 동일성을 갖는 변이체를 포함한다:
Figure pct00011
일부 실시형태에서, VLDLR 유전자, 또는 이의 기능적 단편은 마우스(무스 무스쿨루스(Mus musculus) VLDLR이다. 마우스 VLDLR은 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 인코딩하는 서열번호 7의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 93%, 또는 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 97%, 또는 적어도 약 98% 동일성을 갖는 변이체를 포함할 수 있다.
실시형태에서, 인간 VLDLR 단백질 또는 이의 기능적 단편을 인코딩하는 핵산은 서열번호 4의 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 5의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 93%, 또는 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 97%, 또는 적어도 약 98% 동일성을 갖는 변이체를 포함한다.
일부 실시형태에서, 마우스 VLDLR, 또는 이의 기능적 단편을 인코딩하는 핵산은 서열번호 7의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 93%, 또는 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 97%, 또는 적어도 약 98% 동일성을 갖는 변이체를 포함한다:
Figure pct00012
일부 실시형태에서, 마우스 VLDLR, 또는 이의 기능적 단편은 서열번호 8의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 93%, 또는 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 97%, 또는 적어도 약 98% 동일성을 갖는 변이체를 포함한다:
Figure pct00013
일부 실시형태에서, 본 발명은 이중 트랜스포존 및 트랜스포사제 시스템을 통한 유전자 전달을 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 전위 요소는 자연에서 편재적으로 발견되는 비-바이러스 유전자 전달 비히클이다. 트랜스포존-기반 벡터는 세포에서 안정적인 게놈 통합 및 이식유전자 작제물의 오래 지속되는 발현 능력을 갖는다. 일반적으로 말하면, 이중 트랜스포존 및 트랜스포사제 시스템은 관심이 있는 이식유전자(들)를 포함하는 트랜스포존 DNA가 트랜스포사제 효소에 의해 염색체 DNA에 통합되는 오려붙이기(cut-and-paste) 메커니즘을 통해 작동한다.
당업계에서 이해되는 바와 같이, 트랜스포존은 종종 트랜스포존의 중간에 있는 이식유전자 및 트랜스포존의 5' 및 3' 말단에 있는 말단 반복 서열을 인코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함한다. 번역된 트랜스포사제는 트랜스포존의 5' 및 3' 서열에 결합하여 전위 기능을 수행한다.
실시형태에서, 트랜스포존은, 다른 폴리뉴클레오타이드에 자신의 복제물을 삽입할 수 있는 폴리뉴클레오타이드를 지칭하는 데 사용되는 전위 요소와 호환 가능하게 사용된다. 용어 트랜스포존은 당업자에게 잘 알려져 있으며 서열 구조에 기초하여 구별될 수 있는 트랜스포존의 부류, 예를 들어 각각의 말단의 짧은 역 반복부(ITR), 및/또는 말단에서 직접 반복되는 긴 말단 반복부(LTR)를 포함한다. 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 트랜스포존은 피기백(piggyBac) 유사 요소, 예를 들어 TTAA 서열을 인식하고 트랜스포존을 제거한 후 삽입 부위의 서열을 원래의 TTAA 서열로 복원시키는, 흔적이 없는 절단을 특징으로 하는 트랜스포존 요소로서 기재될 수 있다.
일부 실시형태에서, 비-바이러스 벡터는 트랜스포사제에 의해 인식되는 ITR이 측접한 트랜스포존-매개 유전자 전달 시스템(예를 들어, DNA 플라스미드 트랜스포존 시스템)이다. 일부 실시형태에서, ITR은 VLDLR 또는 LDLR 작제물에 측접한다. 비-바이러스 벡터는 트랜스포사제에 의해 인식되는 2개의 말단이 측접한 이종성 폴리뉴클레오타이드(또한 이식유전자로도 지칭됨)를 포함하는 트랜스포존-기반 벡터 시스템으로서 작동한다. 트랜스포존 말단은 정확하거나 부정확한 반복부일 수 있고 서로에 대해 방향이 반전된 ITR을 포함한다. 트랜스포사제는 트랜스포존 말단에 작용하여 벡터로부터 (트랜스포존 말단과 함께) 트랜스포존을 "절단"하고 트랜스포존을 숙주 게놈에 "붙이기"를 하거나, 통합한다.
실시형태에서, 유전자 전달 시스템은 트랜스포존을 인코딩하는 핵산(DNA)이며, "공여체 DNA"로 지칭된다. 실시형태에서, 트랜스포사제를 인코딩하는 핵산은 헬퍼 RNA(즉, 트랜스포사제를 인코딩하는 mRNA)이고, 트랜스포존을 인코딩하는 핵산은 공여체 DNA(또는 DNA 공여체 트랜스포존)이다. 실시형태에서, 공여체 DNA는 플라스미드에 혼입된다. 실시형태에서, 공여체 DNA는 플라스미드이다.
"오려붙이기" 메커니즘을 사용하는 이동 요소인 DNA 공여체 트랜스포존은 인간(호모 사피엔스)을 포함하여 포유동물(예를 들어, 마이오티스 루시푸구스, 마이오티스 마이오티스, 프테로푸스 밤피루스, 피피스트렐루스 쿠흘리 및 판 트로글로다이테스)의 경우 2개의 말단 서열이 측접한 공여체 DNA, 또는 곤충(예를 들어, 트리크노플루시아 니(Trichnoplusia ni)) 또는 양서류(제노푸스(Xenopus) 종)와 같은 다른 살아있는 유기체의 역 말단 반복부(ITR)를 포함한다. 게놈 DNA는 숙주의 공여체 부위에서 이중 가닥 절단에 의해 절단되고 공여체 DNA는 이 부위에서 통합된다. 생체공학적 트랜스포존 및 트랜스포사제를 사용하는 이중 시스템은 (1) TTAA와 같은 특정 뉴클레오타이드 서열에서 "절단"하는 활성 트랜스포사제의 공급원 및 (2) 트랜스포사제에 의해 동원되는 ITR 또는 인식 말단 서열이 측접한 DNA 서열(들)을 포함한다. DNA 서열의 동원은 개재 핵산, 또는 이식유전자가 DNA 발자국 없이 특정 뉴클레오타이드 서열(즉, TTAA)에 삽입될 수 있게 한다.
실시형태에서, 트랜스포사제는 트랜스포사제의 장기간 발현이 유전자이식 세포에서 발생하지 않도록 DNA 발현 벡터 또는 발현 가능한 RNA 또는 단백질로서 제공될 수 있다.
실시형태에서, 트랜스포사제는 서열번호 9의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 93%, 또는 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 97%, 또는 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 동일성을 갖는 변이체를 포함하는 마이오티스 루시푸구스 트랜스포사제(MLT, 또는 MLT 트랜스포사제)이다. 실시형태에서, 트랜스포사제는 서열번호 9의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 93%, 또는 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 97%, 또는 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 동일성을 갖는 변이체 및 S2X를 포함하는 마이오티스 루시푸구스 트랜스포사제(MLT, 또는 MLT 트랜스포사제)이며, 여기서 X는 임의의 아미노산이거나 아미노산이 없는 것이고, 선택적으로 X는 A 또는 G이다. 실시형태에서, 트랜스포사제는 서열번호 9의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 93%, 또는 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 97%, 또는 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 동일성을 갖는 변이체 및 S2X를 포함하는 마이오티스 루시푸구스 트랜스포사제(MLT, 또는 MLT 트랜스포사제)이며, 여기서 X는 임의의 아미노산이거나 아미노산이 없는 것이고, 선택적으로 X는 A 또는 G 및 L573X 및 E574X로부터 선택되는 C 말단 결실이며, 여기서 X는 아미노산이 없는 것이다. 실시형태에서, 돌연변이는 L573del, E574del 및 S2A이다.
실시형태에서, MLT 트랜스포사제는 돌연변이 L573del, E574del 및 S2A가 있는 서열번호 9의 아미노산 서열:
Figure pct00014
또는 이와 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 93%, 또는 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 97%, 또는 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, MLT 트랜스포사제는 하기 뉴클레오타이드 서열:
Figure pct00015
또는 이와 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 93%, 또는 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 97%, 또는 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩된다.
일부 실시형태에서, MLT 트랜스포사제(예를 들어, 서열번호 9의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 93%, 또는 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 97%, 또는 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 MLT 트랜스포사제)는 MLT 트랜스포사제에 과잉활성을 부여하는 하나 이상의 과잉활성 돌연변이를 포함한다. 실시형태에서, 서열번호 9의 아미노산 서열 또는 이의 기능적 등가물에 대해 과잉활성 돌연변이는 S8X, C13X 및 N125X 돌연변이 중 하나 이상이며, 여기서 X는 선택적으로 임의의 아미노산이거나 아미노산이 없는 것이고, 선택적으로 X는 P, R 또는 K이다. 실시형태에서, 돌연변이는 S8P, C13R 및 N125K이다. 일부 실시형태에서, MLT 트랜스포사제는 S8P 및 C13R 돌연변이를 갖는다. 일부 실시형태에서, MLT 트랜스포사제는 N125K 돌연변이를 갖는다. 일부 실시형태에서, MLT 트랜스포사제는 3개의 S8P, C13R 및 N125K 돌연변이를 모두 갖는다.
일부 실시형태에서, MLT 트랜스포사제는 서열번호 9의 아미노산 서열 또는 이의 기능적 등가물에 대해 N125K 돌연변이를 갖는 아미노산(서열번호 12)에 해당하는 뉴클레오타이드 서열(서열번호 11), 여기서 서열번호 11 및 서열번호 12는 다음과 같다:
Figure pct00016
또는 이와 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 93%, 또는 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 97%, 또는 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열(N125K 돌연변이에 해당하는 코돈은 밑줄쳐 있고 볼드체임).
Figure pct00017
또는 이와 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 93%, 또는 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 97%, 또는 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열(S8P 및 C13R 돌연변이에 해당하는 아미노산은 밑줄쳐 있고 볼드체임)에 의해 인코딩된다.
일부 실시형태에서, 서열 11의 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩되고 서열 12의 아미노산 서열을 갖는 MLT 트랜스포사제는 MLT 트랜스포사제 1(또는 MLT 1)로 지칭된다.
일부 실시형태에서, MLT 트랜스포사제는 서열번호 9의 아미노산 서열 또는 이의 기능적 등가물에 대해 S8P 및 C13R 돌연변이를 갖는 아미노산(서열번호 14)에 해당하는 뉴클레오타이드 서열(서열번호 13), 여기서 서열번호 13 및 서열번호 14는 다음과 같다:
Figure pct00018
또는 이와 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 93%, 또는 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 97%, 또는 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열(S8P 및 C13R 돌연변이에 해당하는 코돈은 밑줄쳐 있고 볼드체임).
Figure pct00019
또는 이와 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 93%, 또는 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 97%, 또는 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열(S8P 및 C13R 돌연변이에 해당하는 아미노산은 밑줄쳐 있고 볼드체임)에 의해 인코딩된다.
일부 실시형태에서, 서열번호 13의 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩되고 서열번호 14의 아미노산 서열을 갖는 MLT 트랜스포사제는 MLT 트랜스포사제 2(또는 MLT 2)로 지칭된다.
일부 실시형태에서, 트랜스포사제는 Tc1/마리너(mariner) 트랜스포존 시스템 유래의 것이다.
일부 실시형태에서, 트랜스포사제는 슬리핑 뷰티(Sleeping Beauty) 트랜스포존 시스템(예를 들어, 문헌[Cell. 1997;91:501-510] 참조), 또는 피기백 트랜스포존 시스템(예를 들어, 문헌[Trends Biotechnol. 2015 Sep;33(9):525-33. doi: 10.1016/j.tibtech.2015.06.009. Epub 2015 Jul 23] 참조) 유래의 것이다.
일부 실시형태에서, 트랜스포사제는 LEAP-IN 1 유형 또는 LEAP-IN 트랜스포존 시스템 유래의 것이다(Biotechnol J. 2018 Oct;13(10):e1700748. doi: 10.1002/biot.201700748. Epub 2018 Jun 11).
일부 실시형태에서, 비-바이러스 벡터는 LEAP-IN 1 유형의 LEAPIN 트랜스포사제(ATUM, 미국 캘리포니아주 뉴어크 소재)를 포함한다. LEAPIN 트랜스포사제 시스템은 트랜스포사제(예를 들어, 트랜스포사제 mRNA), 및 하나 이상의 관심이 있는 유전자(트랜스포존), 선택 마커, 조절 요소 등을 포함하고 트랜스포존 동족 역 말단 반복부(ITR) 및 전위 인식 모티프(TTAT)가 측접한 벡터를 포함한다. 벡터 DNA와 트랜스포사제 mRNA의 동시 형질감염 시, 일시적으로 발현된 효소는 숙주 세포의 게놈에 걸쳐 하나 이상의 부위에서 트랜스포존 카세트(ITR 사이의 모든 서열)의 단일 복사체의 고효율 및 정확한 통합을 촉매한다. Hottentot et al. In Genotyping: Methods and Protocols. White SJ, Cantsilieris S, eds: 185-196. (New York, NY: Springer): 2017. pp. 185-196. LEAPIN 트랜스포사제는 주로 열린 염색질 분절에서 다중 게놈 유전자좌에서의 단일 복사체 통합을 포함하여 다양한 유리한 특징을 갖는 안정적인 이식유전자 구성요소를 생성하고; 페이로드 제한이 없으므로 다수의 독립적인 전사 단위가 단일 작제물에서 발현될 수 있으며; 통합된 이식유전자는 구조적 및 기능적 완전성을 유지하고; 이식유전자 완전성의 유지는 모든 재조합 세포에서 원하는 사슬 비율을 보장한다.
일부 실시양태에서, VLDLR 또는 LDLR 단백질을 인코딩하는 핵산은 이식유전자(예를 들어, VLDLR 또는 LDLR, 또는 이의 기능적 단편)의 전체 발현 수준 및 세포-특이성에 영향을 미칠 수 있는 프로모터에 작동 가능하게 커플링된다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 조직-특이적, 즉, 간-특이적 프로모터이다. 트랜스포사제가 트랜스포사제를 인코딩하는 DNA 서열인 실시형태에서, 이와 같은 DNA 서열은 또한 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 조직-특이적 프로모터, 유도성 프로모터, 구성적 프로모터 등을 포함한 다양한 프로모터가 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 유전자 전달 작제물의 간-특이적 프로모터는 일부 실시형태에서 인간 LP1 프로모터인 LP1 프로모터일 수 있다. LP1 프로모터는, 예를 들어 문헌[Nathwani et al. Blood vol. 2006;107(7):2653-61]에 기재되어 있다.
일부 실시형태에서, LP1 프로모터는 서열번호 15의 핵산 서열, 또는 이와 적어도 약 50%, 또는 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 93%, 또는 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 97%, 또는 적어도 약 98% 동일성을 갖는 변이체의 기능적 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, LP1 프로모터의 뉴클레오타이드 서열은 인간 아포지단백질 E/C-I 유전자 좌, 간 제어 영역 HCR-1(염기쌍 134 내지 325, 젠뱅크(Genbank) 기록 U32510.1), 인간 알파-1-항트립신 유전자(S 변이체)(염기쌍 1747 내지 2001, 젠뱅크 기록 K02212.1) 및 소형 t-인트론 SV40(염기쌍 241 내지 333, 젠뱅크 기록 FN824656.1)(545 bp)을 포함한다:
Figure pct00020
일부 실시형태에서, LP1 프로모터는 서열번호 15의 핵산 서열, 또는 이와 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 91%, 또는 적어도 약 92%, 또는 적어도 약 93%, 또는 적어도 약 94%, 또는 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 96%, 또는 적어도 약 97%, 또는 적어도 약 98% 동일성을 갖는 변이체를 포함한다.
일부 실시형태에서, LP1 프로모터의 뉴클레오타이드 서열은 인간 아포지단백질 E/C-I 유전자 좌, 간 제어 영역 HCR-1(염기쌍 134 내지 325, 젠뱅크 기록 U32510.1), 인간 알파-1-항트립신 유전자(S 변이체)(염기쌍 1747 내지 2001, 젠뱅크 기록 K02212.1) 및 소형 t-인트론 SV40(염기쌍 241 내지 333, 젠뱅크 기록 FN824656.1)(545 bp)을 포함한다:
일부 실시형태에서, 간-특이적 프로모터는 하기 표 1에 포함된 프로모터로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 간-특이적 프로모터는 하기 표 1에 포함된 프로모터로부터 선택되고 선택적으로 표 1에 열거된 바와 같은 하나 이상의 인핸서 및/또는 표 1에 열거된 바와 같은 하나 이상의 인트론을 갖는다.
Figure pct00021
상기 표 1에서 "E"는 인핸서를 나타내고, "P"는 프로모터를 나타내며, "Mm"은 무스 무스쿨루스를 나타내고, "Hs"는 호모 사피엔스를 나타내며, "HBV"는 B형 간염 바이러스를 나타낸다.
일부 실시형태에서, 간-특이적 프로모터는 상기 표 1의 프로모터 중 임의의 프로모터이다. 일부 실시형태에서, 간-특이적 프로모터는 문헌[Kramer et al. Mol Ther 2003; 7:375-85]에 기재된 프로모터 중 임의의 하나이며, 이는 본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용된다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 문헌[Kramer et al. Mol Ther 2003; 7:375-85]에 기재된 바와 같이 구축될 수 있으며, 이는 본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용된다. 일부 실시형태에서, 간-특이적 프로모터는 E-ALB (Mm)v2_P-AAT(Hs) 또는 E-HBV_P-AAT(Hs)이고, 이들 둘 다 상기 표 1에 열거되어 있다.
실시형태에서, 본 발명의 비-바이러스 벡터는 트랜스포존의 5' 및 3' 말단에서 역 말단 반복부(ITR)의 적어도 한 쌍을 포함할 수 있다. 실시형태에서, ITR은 벡터의 반대 말단에 위치한 상보적 서열과 조합하여 사용될 때 헤어핀 구조를 형성할 수 있는 벡터의 한 말단에 위치한 서열이다. 한 쌍의 역 말단 반복부는 본 개시내용의 비-바이러스 벡터의 트랜스포존의 전위 활성에 관여하고, 특히 관심이 있는 DNA의 DNA 추가 또는 제거 및 절제에 관여한다. 일 실시형태에서, 적어도 한 쌍의 역 말단 반복부는 플라스미드에서 전위 활성에 필요한 최소 서열인 것으로 보인다. 다른 실시형태에서, 본 개시내용의 벡터는 적어도 2, 3 또는 4쌍의 역 말단 반복부를 포함할 수 있다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 클로닝의 용이함을 촉진시키기 위해, 필요한 말단 서열은 가능한 한 짧을 수 있고 따라서 가능한 적은 역 반복부를 함유할 수 있다. 따라서, 일 실시형태에서, 본 개시내용의 벡터는 1개 이하, 2개 이하, 3개 이하 또는 4개 이하 쌍의 역 말단 반복부를 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 본 개시내용의 벡터는 단 하나의 역 말단 반복부를 포함할 수 있다.
실시형태에서, 본 발명의 역 말단 반복부는 완전한 역 말단 반복부(또는 "완전 역 반복부"로 호환 가능하게 지칭됨) 또는 불완전한 역 말단 반복부(또는 "불완전 역 반복부"로 호환 가능하게 지칭됨) 중 하나를 형성할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "완전 역 반복부"는 반대 방향으로 배치된 2개의 동일한 DNA 서열을 지칭한다. 대조적으로, 용어 "불완전 역 반복부"는 약간의 불일치를 포함한다는 점을 제외하고는 서로 유사한 2개의 DNA 서열을 지칭한다. 이러한 반복부(즉, 완전 역 반복부 및 불완전 역 반복부 둘 다)는 트랜스포사제의 결합 부위이다.
일부 실시형태에서, 비-바이러스 벡터의 ITR(또는 말단 서열)은 "오려붙이기" 메커니즘을 통해 전위하는 피기백-유사 트랜스포존의 것이다. 일부 실시형태에서, 피기백-유사 트랜스포존은 TTAA 반복 서열을 포함한다. 피기백 트랜스포존은 유전자 변형을 위해 자주 사용되는 트랜스포존 시스템이며 실제 전위 사건 동안 DNA 합성을 필요로 하지 않는다. 피기백 요소는 트랜스포사제에 의해 공여체 염색체로부터 절단될 수 있으며, 분할된 공여체 DNA는 DNA 리가제를 이용하여 다시 연결될 수 있다. Zhao et al. Translational lung cancer research, 2006; 5(1):120-125. 피기백 트랜스포존은 정확한 절제, 즉, 서열을 통합 전 상태로 복원하는 것을 보여준다. 문헌[Yusa. piggyBac Transposon. Microbiol Spectr. 2015 Apr;3(2)]을 참조한다. 일부 실시형태에서, 유전자 전달 작제물은 Super piggyBac™(SPB) 트랜스포사제를 포함한다. 문헌[Barnett et al. Blood 2016; 128(22):2167]을 참조한다.
일부 실시형태에서, 예를 들어 슬리핑 뷰티 트랜스포존 시스템과 같은 다른 비-바이러스 유전자 전달 도구가 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Aronovich et al. Human Molecular Genetics, 2011; 20(R1), R14-R20]을 참조한다.
일부 실시형태에서, 트랜스포존 시스템의 서열은 포유동물 시스템에서 개선된 mRNA 안정성 및 단백질 발현을 제공하도록 코돈 최적화될 수 있다.
다양한 실시형태에서, 유전자 전달 작제물은 임의의 적합한 유전 작제물, 예컨대, 핵산 작제물, 플라스미드, 또는 벡터일 수 있다. 다양한 실시형태에서, 유전자 전달 작제물은 DNA이다. 일부 실시형태에서, 유전자 전달 작제물은 RNA이다. 일부 실시형태에서, 유전자 전달 수행은 DNA 서열 및 RNA 서열, 예컨대, miRNA(예를 들어, PCSK9)를 가질 수 있다.
실시형태에서, 본 핵산은 리보뉴클레오타이드 또는 데옥시리보뉴클레오타이드, 또는 이들의 유사체 또는 유도체와 같은 임의의 길이의 뉴클레오타이드의 중합체 형태를 포함한다. 실시형태에서, 이중-가닥 및 단일-가닥 DNA뿐만 아니라, 이중-가닥 및 단일-가닥 RNA, 및 RNA-DNA 하이브리드가 제공된다. 실시형태에서, 메틸화 또는 캡핑된 폴리뉴클레오타이드와 같은 전사적으로 활성화된 폴리뉴클레오타이드가 제공된다. 실시형태에서, 본 조성물은 mRNA 또는 DNA이다.
실시형태에서, 본 비-바이러스 벡터는 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하고 제어 서열에 작동 가능하게 연결된 선형 또는 원형 DNA 분자이며, 여기서 제어 서열은 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 발현을 제공한다. 실시형태에서, 비-바이러스 벡터는 프로모터 서열, 및 전사 및 번역 정지 신호 서열을 포함한다. 이와 같은 벡터는 특히 염색체 및 에피솜 벡터, 예를 들어 박테리아 플라스미드, 트랜스포존, 효모 에피솜, 삽입 요소, 효모 염색체 요소로부터 유래된 벡터, 및 이들의 조합으로부터 유래된 벡터를 포함할 수 있다. 본 작제물은 발현을 조절할 뿐만 아니라 유발하는 제어 영역을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 유전자 전달 작제물은 코돈 최적화될 수 있다. 기재된 실시형태에서, VLDLR 단백질 및 LDLR 단백질 또는 이의 기능적 단편을 인코딩하는 핵산은 원하는 임상 결과를 제공하기 위해 숙주 게놈(예를 들어, 인간 게놈)에 통합되는 이식유전자로서 기능한다. 이식유전자 코돈 최적화는 이식유전자의 치료 잠재력과 숙주 유기체에서의 이식유전자의 발현을 최적화하는 데 사용될 수 있다. 숙주 유기체 또는 세포에서의 각각의 코돈에 대한 전달 RNA(tRNA)의 풍부함과 이식유전자의 코돈 사용을 일치시키기 위해 코돈 최적화가 수행된다. 코돈 최적화 방법은 당업계에 알려져 있고, 예를 들어 WO 2007/142954에 기재되어 있으며, 이는 본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용된다. 최적화 전략은, 예를 들어 번역 개시 영역의 변형, mRNA 구조 요소의 변경, 및 상이한 코돈 편향의 사용을 포함할 수 있다.
유전자 전달 작제물은 작제물의 안정적인 발현을 보장하기 위해 선택되는 여러 다른 조절 요소를 포함한다. 따라서, 일부 실시형태에서, 비-바이러스 벡터는 인접 유전자의 활성화 또는 불활성화를 방지하거나 완화하는 하나 이상의 절연체 서열을 포함할 수 있는 DNA 플라스미드이다.
실시형태에서, ITR 또는 말단 서열은 선택적으로 TTAA 반복 서열을 포함하는 피기백-유사 트랜스포존의 것이고/이거나, ITR 또는 말단 서열은 VLDLR 단백질 또는 LDLR 단백질 또는 이의 기능적 단편을 인코딩하는 핵산에 측접한다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 절연체 서열은 HS4 절연체(1.2 kb 5'-HS4 닭 β-글로빈(cHS4) 절연체 요소) 및 D4Z4 절연체[안면견갑상완 이영양증(Facio-Scapulo-Humeral Dystrophy; FSHD)에 연결된 탠덤 거대부수체 반복부]를 포함한다. 일부 실시형태에서, HS4 절연체 및 D4Z4 절연체의 서열은 문헌[Rival-Gervier et al. Mol Ther. 2013 Aug; 21(8):1536-50]에 기재된 바와 같으며, 이는 본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용된다. 일부 실시형태에서, 유전자 전달 작제물의 유전자는 트랜스포사제의 존재 하에 전위될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 실시형태에 따른 비-바이러스 벡터는 트랜스포사제를 인코딩하는 핵산 작제물을 포함한다. 트랜스포사제는 트랜스포사제 DNA 플라스미드일 수 있다. 일부 실시형태에서, 트랜스포사제는 시험관내-전사된 mRNA이다. 트랜스포사제는 유전자 전달 작제물로부터 부위-특이적 또는 유전자좌-특이적 게놈 영역으로 유전자를 절제 및/또는 전위할 수 있다.
본 개시내용에 따른 유전자 전달 작제물을 포함하는 조성물은 하나 이상의 비-바이러스 벡터를 포함할 수 있다. 또한, 트랜스포사제는 이식유전자를 갖는 트랜스포존과 동일하거나 상이한 벡터 상에 배치될 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 트랜스포사제 및 이식유전자를 포함하는 트랜스포존은 이들이 동일한 벡터에 포함되도록 시스 배열에 있다. 일부 실시형태에서, 트랜스포사제 및 이식유전자를 포함하는 트랜스포존은 이들이 상이한 벡터에 포함되도록 트랜스 배열에 있다. 벡터는 본 개시내용에 따른 임의의 비-바이러스 벡터이다.
일부 실시형태에서, 트랜스포사제는 봄빅스 모리, 제노푸스 트로피칼리스, 트리코플루시아 니, 리놀로푸스 페룸에퀴눔, 로우세투스 아에집티아쿠스, 필로스토무스 디스콜로르, 마이오티스 마이오티스, 마이오티스 루시푸구스, 프테로푸스 밤피루스, 피피스트렐루스 쿠흘리, 판 트로글로다이테스, 몰로수스 몰로수스, 또는 호모 사피엔스로부터 유래되고/거나, 이의 조작된 형태이다. 일부 실시형태에서, 트랜스포사제는 ITR을 특이적으로 인식한다. 트랜스포사제는 봄빅스 모리, 제노푸스 트로피칼리스, 또는 트리코플루시아 니 단백질을 인코딩하는 DNA 또는 RNA 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제10,041,077호를 참조하며, 이는 본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용된다.
그러나, 일부 실시형태에서, 트랜스포사제는, 예를 들어 세포-투과성 펩타이드를 사용하여(예를 들어, 문헌[Ramsey and Flynn (2015). Cell-penetrating peptides transport therapeutics into cells. Pharmacol. Ther. 154: 78-86]에 기재된 바와 같음); 염 및 프로판베타인을 포함하는 소분자를 사용하여(예를 들어, 문헌[Astolfo et al. Cell 2015; 161:674-690]에 기재된 바와 같음); 또는 전기천공(예를 들어, 문헌[Morgan and Day. Methods in Molecular Biology 1995; 48: 63-71]에 기재된 바와 같음)을 사용하여 단백질로서 세포에 직접 도입될 수 있다.
일부 실시형태에서, 트랜스포존 시스템은, 예를 들어 미국 특허 제10,435,696호에 기재된 바와 같이 구현될 수 있으며, 이는 본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용된다.
일부 실시형태에서, 기재된 조성물은 이식유전자(예를 들어, VLDLR 단백질 또는 LDLR 단백질 또는 이의 기능적 단편을 인코딩하는 핵산) 및 트랜스포사제를 특정 비율로 포함한다. 일부 실시형태에서, 전위 활성의 효율을 개선시키는 이식유전자 대 트랜스포사제 비율이 선택된다. 이식유전자 대 트랜스포사제 비율은 형질감염된 유전자 전달 작제물의 농도에 따라 다르다. 일부 실시형태에서, 초저밀도 지단백질 수용체 단백질(VLDLR) 또는 저밀도 지단백질 수용체 단백질(LDLR), 또는 이의 기능적 단편을 인코딩하는 핵산 대 트랜스포사제를 인코딩하는 핵산 작제물의 비율은 약 5:1, 또는 약 4:1, 또는 약 3:1, 또는 약 2:1, 또는 약 1:1, 또는 약 1:2, 또는 약 1:3, 또는 약 1:4, 또는 약 1:5이다.
일부 실시형태에서, 초저밀도 지단백질 수용체 단백질(VLDLR) 또는 저밀도 지단백질 수용체 단백질(LDLR), 또는 이의 기능적 단편을 인코딩하는 핵산 대 트랜스포사제를 인코딩하는 핵산 작제물의 비율은 약 2:1이다.
일부 실시형태에서, 비-바이러스 벡터는, 예를 들어 지질 입자를 이용하는 방법과 같은 다양한 형질감염 방법에 의해 세포 내로 도입되는 접합된 폴리뉴클레오타이드 서열이다. 일부 실시형태에서, 유전자 전달 작제물을 포함하는 조성물은 전달 입자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 전달 입자는 지질-기반 입자(예를 들어, 지질 나노입자(LNP), 양이온성 지질, 또는 생분해성 중합체)를 포함한다. 유전자 전달 작제물의 지질 나노입자(LNP) 전달은 잠재적인 표적을 벗어난 사건 및 면역 반응을 제한하기 위한 일시적인 비-통합 발현, 및 대형 화물을 수송할 수 있는 능력에 의한 효율적인 전달을 포함하는 특정 이점을 제공한다. LNP는 작은 간섭 RNA(siRNA) 및 mRNA의 전달, 및 시험관내 및 생체내에서 CRISPR/Cas9 구성요소를 간세포 및 간에 전달하는 데 사용되었다. 예를 들어, 미국 특허 제10,195,291호는 RNA 간섭(RNAi) 치료제의 전달을 위한 LNP의 용도를 기재한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 실시형태에 따른 조성물은 LNP의 형태이다. 일부 실시형태에서, LNP는 1,2-다이올레오일-3-트라이메틸암모늄 프로판(DOTAP); N,N-다이올레일-N,N-다이메틸암모늄 클로라이드(DODAC); N-(2,3-다이올레일옥시)프로필)-N,N,N-트라이메틸암모늄 클로라이드(DOTMA); N,N-다이스테아릴-N,N-다이메틸암모늄 브로마이드(DDAB), 다이메틸아미노에탄-카바모일과 혼합된 양이온성 콜레스테롤 유도체(DC-Chol), 포스파티딜콜린(PC), 트라이올레인(글리세릴 트라이올레이트), 및 1,2-다이스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[카복시(폴리에틸렌 글라이콜)-2000](DSPE-PEG), 1,2-다이미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌글라이콜-2000(DMG-PEG 2K) 및 1,2-다이스테아롤-sn-글리세롤-3포스포콜린(DSPC)으로부터 선택되는 하나 이상의 지질을 포함한다.
일부 실시형태에서, LNP는 도 5에 나타낸 바와 같을 수 있으며, 이는 문헌[Patel et al., J Control Release 2019; 303:91-100]으로부터 변경된 것이다. 도 5에 나타낸 바와 같이, LNP는 하나 이상의 구조적 지질(예를 들어, DSPC), PEG-접합 지질(CDM-PEG), 양이온성 지질(MC3), 콜레스테롤, 및 표적화 리간드(예를 들어, GalNAc)를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 조성물은 지질 및 중합체를 다양한 비율로 가질 수 있으며, 여기서 지질은, 예를 들어 DOTAP, DC-Chol, PC, 트라이올레인, DSPE-PEG로부터 선택될 수 있고, 중합체는, 예를 들어 PEI 또는 폴리 락틱-코-글라이콜산(PLGA)일 수 있다. 임의의 다른 지질 및 중합체가 추가적으로 또는 대안적으로 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 지질 및 중합체의 비율은 약 0.5:1, 또는 약 1:1, 또는 약 1:1.5, 또는 약 1:2, 또는 약 1:2.5, 또는 약 1:3, 또는 약 3:1, 또는 약 2.5:1, 또는 약 2:1, 또는 약 1.5:1, 또는 약 1:1, 또는 약 1:0.5이다.
일부 실시형태에서, LNP는 양이온성 지질을 포함하며, 이의 비제한적인 예는 N,N-다이올레일-N,N-다이메틸암모늄 클로라이드(DODAC), N,N-다이스테아릴-N,N-다이메틸암모늄 브로마이드(DDAB), N-(I-(2,3-다이올레오일옥시)프로필)-N,N,N-트라이메틸암모늄 클로라이드(DOTAP), N-(I-(2,3-다이올레일옥시)프로필)-N,N,N-트라이메틸암모늄 클로라이드(DOTMA), N,N-다이메틸-2,3-다이올레일옥시)프로필아민(DODMA), 1,2-다이리놀레일옥시-N,N-다이메틸아미노프로판(DLinDMA), 1,2-다이리놀레닐옥시-N,N-다이메틸아미노프로판(DLenDMA), 1,2-다이리놀레일카바모일옥시-3-다이메틸아미노프로판(DLin-C-DAP), 1,2-다이리놀레이옥시-3-(다이메틸아미노)아세톡시프로판(DLin-DAC), 1,2-다이리놀레이옥시-3-몰폴리노프로판(DLin-MA), 1,2-다이리놀레오일-3-다이메틸아미노프로판(DLinDAP), 1,2-다이리놀레일티오-3-다이메틸아미노프로판(DLin-S-DMA), 1-리놀레오일-2-리놀레일옥시-3-다이메틸아미노프로판(DLin-2-DMAP), 1,2-다이리놀레일옥시-3-트라이메틸아미노프로판 클로라이드 염(DLin-TMA.Cl), 1,2-다이리놀레오일-3-트라이메틸아미노프로판 클로라이드 염(DLin-TAP.Cl), 1,2-다이리놀레일옥시-3-(N-메틸피페라지노)프로판(DLin-MPZ), 또는 3-(N,N-다이리놀레일아미노)-1,2-프로판다이올(DLinAP), 3-(N,N-다이올레일아미노)-1,2-프로판다이오(DOAP), 1,2-다이리놀레닐옥시-N,N-다이메틸아미노프로판(DLinDMA), 2,2-다이리놀레일-4-다이메틸아미노메틸-[1,3]-다이옥솔란(DLin-K-DMA) 또는 이들의 유사체, (3aR,5s,6aS)-N,N-다이메틸-2,2-다이((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이엔일)테트라하이드로-3aH-사이클로펜타[d][1,3]다이옥솔-5-아민(ALN100), (6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트라이아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일 4-(다이메틸아미노)뷰타노에이트(MC3), 1,1'-(2-(4-(2-((2-(비스(2-')아미노)에틸)(2 하이드록시도데실)아미노)에틸)피페라진-1-일)에틸아잔다이일)다이도데칸-2-올(Tech G1), 1,2-다이리놀레일옥소-3-(2-N,N-다이메틸아미노)에톡시프로판(DLin-EG-DMA), 또는 이들의 혼합물을 포함한다.
일부 실시형태에서, LNP는 간 전달에 적합한 폴리에틸렌이민(PEI) 및 폴리(락틱-코-글라이콜산)(PLGA), 및 N-아세틸갈락토사민(GalNAc)으로부터 선택되는 하나 이상의 분자를 포함한다. 일부 실시형태에서, LNP는, 예를 들어 미국 특허 제5,985,826호에 기재된 바와 같은 간-지향 화합물을 포함하며, 이는 본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용된다. GalNAc는 포유동물 간 세포에서 발현되는 아시알로당단백질 수용체(ASGPR)를 표적으로 하는 것으로 알려져 있다. 문헌[Hu et al. Protein Pept Lett. 2014;21(10):1025-30]을 참조한다.
일부 예에서, 본 개시내용의 유전자 전달 작제물은 PEI 또는 이의 유도체, 예컨대, 폴리에틸렌이민-폴리에틸렌글라이콜-N-아세틸갈락토사민(PEI-PEG-GAL) 또는 폴리에틸렌이민-폴리에틸렌글라이콜-트라이-N-아세틸갈락토사민(PEI-PEG-triGAL) 유도체와 함께 제형화되거나 복합체화될 수 있다.
일부 실시형태에서, LNP는 접합된 지질이며, 이의 비제한적인 예는 폴리에틸렌글라이콜(PEG)-다이아실글리세롤(DAG), PEG-다이알킬옥시프로필(DAA), PEG-인지질, PEG-세라마이드(Cer), 또는 이들의 혼합물을 포함하지만 이에 제한되지 않는 폴리에틸렌글라이콜(PEG)-지질을 포함한다. PEG-DAA 접합체는, 예를 들어 PEG-다이라우릴옥시프로필(C12), PEG-다이미리스틸옥시프로필(C14), PEG-다이팔미틸옥시프로필(C16) 또는 PEG-다이스테아릴옥시프로필(C18)일 수 있다.
실시형태에서, 나노입자는 직경이 약 1000 ㎚ 미만인 입자이다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 나노입자는 최대 치수(예를 들어, 직경)가 약 500 ㎚ 이하, 또는 약 400 ㎚ 이하, 또는 약 300 ㎚ 이하, 또는 약 200 ㎚ 이하, 또는 약 100 ㎚ 이하이다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 나노입자는 최대 치수가 약 50 ㎚ 내지 약 150 ㎚, 또는 약 70 ㎚ 내지 약 130 ㎚, 또는 약 80 ㎚ 내지 약 120 ㎚, 또는 약 90 ㎚ 내지 약 110 ㎚의 범위이다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 나노입자는 최대 치수(예를 들어, 직경)가 약 100 ㎚이다.
일부 양태에서, 본 개시내용에 따른 조성물은 생체내 유전자 변형 방법을 통해 전달될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 유전자 변형은 생체외 방법을 통해 수행될 수 있다.
따라서, 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 임의의 실시형태에 따른 조성물, 또는 실시형태의 조합에 따른 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 환자에서 총 콜레스테롤 및/또는 저밀도 지단백질 콜레스테롤(LDL-C)을 저하시키는 방법이 제공된다. 방법은 정맥내 또는 복강내 투여, 또는 간으로의, 선택적으로 문맥내 정맥 또는 간 실질로의 투여를 포함하는 적합한 경로를 통해 조성물을 전달하는 단계를 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명은 생체외 유전자 치료 접근법을 제공한다. 따라서, 일부 양태에서, (a) 환자로부터 수득한 세포를 본 개시내용의 실시형태에 따른 조성물과 접촉시키는 단계; 및 (b) 세포를 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 환자에서 총 콜레스테롤 및/또는 LDL-C를 저하시키는 방법이 제공된다.
실시형태에서, 방법은 세포를, 봄빅스 모리, 제노푸스 트로피칼리스, 트리코플루시아 니, 리놀로푸스 페룸에퀴눔, 로우세투스 아에집티아쿠스, 필로스토무스 디스콜로르, 마이오티스 마이오티스, 마이오티스 루시푸구스, 프테로푸스 밤피루스, 피피스트렐루스 쿠흘리, 판 트로글로다이테스, 몰로수스 몰로수스, 또는 호모 사피엔스로부터 유래된 트랜스포사제를 인코딩하는 핵산 작제물, 및/또는 이의 조작된 형태와, 및/또는 PCSK9를 표적으로 하는 마이크로RNA를 인코딩하는 핵산 작제물과 접촉시키는 단계를 더 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 생체내 및 생체외 방법은 가족성 고콜레스테롤혈증, 일반적인 고콜레스테롤혈증, 트라이글리세라이드 증가, 인슐린 저항성, 대사 증후군 및 콜레스테롤 수준 상승을 특징으로 하는 기타 질환을 치료할 수 있다.
일부 양태에서, (a) 환자로부터 수득한 세포를 본 개시내용의 실시형태에 따른 조성물과 접촉시키는 단계, 및 (b) 세포를 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 FH를 치료 및/또는 완화하는 생체외 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, FH는 동형접합 FH(HoFH)이다. 일부 실시형태에서, FH는 이형접합 FH(HeFH)이다. 일부 실시형태에서, FH는 APOB, LDLR 및 PCSK9 중 하나 이상에서 하나 이상의 돌연변이를 특징으로 한다. 이들 병원성 돌연변이는 혈청 내 높은 LDL-C 수준을 치료 및/또는 완화하기 위해 기재된 방법을 사용하여 교정될 수 있다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 실시형태에 따른 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 FH를 치료 및/또는 완화하는 방법이 제공된다. 이와 같은 생체내 방법에서, 조성물은 본 명세서에 기재된 임의의 기법을 사용하여 투여된다.
실시형태에서, FH를 치료 및/또는 완화하는 방법은 PCSK9를 표적으로 하는 miRNA를 투여하는 단계를 더 포함한다.
생체외 유전자 치료의 이점 중 하나는 환자 투여 전에 형질도입된 세포를 "샘플링"하는 능력이다. 이는 효능을 촉진하고 환자에게 세포(들)를 도입하기 전에 안전성 검사를 수행할 수 있게 한다. 예를 들어, 형질도입 효율 및/또는 통합 클론성은 제품 주입 전에 평가될 수 있다. 간은 독특한 재생 능력을 가지고 있으며, 실질 세포와 비실질 세포 둘 다 이 과정에 기여한다. 간 손상 시, 간 세포는 부분적으로 역분화된 전구 세포로 변경될 수 있으며, 이는 간세포와 담관 상피 세포를 생성하여 기관의 원래 크기와 정상적인 기능을 복원할 수 있다. 그럼에도 불구하고, 1차 인간 간세포(PHH)는 시험관내에서 자발적으로 분열하지 않는다. 이는 간을 향한 생체외 질환 모델링 및 세포-기반 치료에 대한 중요한 제한 사항이다. 유전자 변형 세포의 생체외 이식이 간 이식에 대한 매력적인 대안이지만, 이 기술을 이용하려는 시도는 지금까지 성공하지 못하였다. 외과적 간 이식은 여전히 다수의 유전 및 후천적 간 질환에 대한 치유/완화 방법이지만, 기증자의 부족으로 인해 어려이 있다. 예를 들어, 문헌[McDiarmid, Liver Transpl 2001; 7:48-50]을 참조한다.
일부 실시형태에서, 단리된 세포는 간세포이며, 이는 변형된 간세포일 수 있다. 일부 실시형태에서, 단리된 세포는 1차 인간 간세포(PHH)이다. 일부 실시형태에서, 단리된 세포는 유도 만능 줄기 세포이다.
유도 만능 줄기 세포(iPSC)는 줄기 세포 이식의 대리 역할을 할 가능성이 있다. 성체 세포의 iPSC로의 재프로그래밍은 섬유아세포의 간세포로의 전환분화를 유도하여, 다능성 상태를 우회한다. 예를 들어, 문헌[Yu et al. (2013). Cell Stem Cell 13:328-40; Takahashi & Yamanaka (2006). Cell 126:663-76; Zhu et al. (2014) Nature 508:93-7]을 참조한다. iPSC는 고유한 자가 재생 능력과 3개의 배엽 중 하나로 분화할 수 있는 잠재력을 부여받아, 선천적 간 질환 치료를 위해 유전자-교정 이식 가능한 간세포를 대량으로 생성할 수 있다. 그러나 이식을 위한 iPSC의 생성은 후성적 이상 및 염색체 재배열의 발생뿐만 아니라, 기형종(teratoma)의 형성에 의해 제한된다. 예를 들어, 문헌[Liang & Zhang (2013). Cell Stem Cell 13:149-59; Si-Tayeb et al. (2010) Hepatology 51:297-305; Ma et al. (2014) Nature 511:177-83]을 참조한다.
간세포는 일반적으로 간 손상의 부재 하에 활성이 없기 때문에 생체외 유형의 유전자 조작에 대한 좋은 후보로 간주되지 않았지만, 최근 연구는 인간 유전자 치료에 필요한 정도는 아니지만 시험관내에서 간세포 증식이 유도될 수 있음을 입증하였다. Levy et al. Nat Biotechnol 2015; 33:1264-71. 그러나 최근에 Unzu외 다수는 Wnt, EGF, 및 FGF 신호전달을 모방한 성장 인자 및 소분자의 칵테일에 인간 1차 간 세포를 생체외 노출시켜 증식성 인간 간 전구 세포(HPC)를 생성하는 방법을 개발하였으며, 이는 PHH를 전구체 세포로 효율적으로 재프로그래밍하였다. Unzu et al. Hepatology 2019;69:2214-31. 본 개시내용은 생체외 유전자 변형에 효과적으로 사용될 수 있는 조성물 및 방법을 제공한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 임의의 생체내 및 생체외 방법은 환자의 심혈관 건강을 개선시킨다. 일부 실시형태에서, 방법은 실질적으로 비-면역원성이다.
일부 실시형태에서, 방법은 단일 투여를 필요로 한다. 따라서, 본 발명은 종종 평생이고 다수의 약물 및/또는 절차(예를 들어, LDL 성분채집술)를 수반하는 현재의 치료 프로토콜을 상당히 개선시킬 수 있는 일회성 치료제를 제공할 수 있다.
일부 실시형태에서, 방법은 간세포에서 LDL 대사를 자극하고/하거나 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 총 콜레스테롤 및/또는 LDL-C의 저하는 영속성이 있다.
일부 실시형태에서, 방법은 관상 동맥 질환(CAD)의 치료 및/또는 완화를 가능하게 한다. 일부 실시형태에서, 방법은 죽상경화증의 치료 및/또는 완화를 가능하게 한다.
일부 실시형태에서, 방법은 투여가 없는 경우의 총 콜레스테롤 및/또는 LDL-C의 수준에 비해 총 콜레스테롤 및/또는 LDL-C의 약 40% 초과, 또는 약 50% 초과, 또는 약 60% 초과, 또는 약 70% 초과, 또는 약 80% 초과, 또는 약 90% 초과의 저하를 제공한다.
일부 실시형태에서, 방법은 혈청에서 LDL-C 수준을 약 500 ㎎/dL 미만(약 13 m㏖/L 미만)으로 저하시킨다. 일부 실시형태에서, 방법은 혈청 LDL-C 수준을 약 450 ㎎/dL 미만, 또는 약 400 ㎎/dL 미만, 또는 약 350 ㎎/dL 미만, 또는 약 300 ㎎/dL 미만, 또는 약 250 ㎎/dL 미만, 또는 약 200 ㎎/dL 미만, 또는 약 150 ㎎/dL 미만으로 저하시킨다. 일부 실시형태에서, 방법은 혈청 LDL-C 수준을 약 130 ㎎/dL 미만으로 저하시킨다.
일부 실시형태에서, 본 조성물 및 방법은 PCSK9를 저하시키는 것을 가능하게 하며, 이는 PCSK9-표적화 마이크로RNA(miRNA)를 사용함으로써 수행될 수 있다.
실시형태에서, 본 유전자-표적화 조성물은 PCSK9를 넉다운시킬 수 있다. 실시형태에서, 본 유전자-표적화 조성물은 LDLR 및 VLDLR 분해 및 전환을 방지할 수 있다.
실시형태에서, 본 유전자-표적화 조성물은 PCSK9를 표적으로 하는 마이크로RNA를 포함한다. 실시형태에서, PCSK9를 표적으로 하는 마이크로RNA 서열은 LDLR 또는 VLDLR 유전자와 상이한 프로모터의 제어 하에 있다. 실시형태에서, PCSK9를 표적으로 하는 마이크로RNA 서열은 CAG 프로모터의 제어 하에 있다(예를 들어, 문헌[Gene. 79 (2): 269-77] 참조). 실시형태에서, PCSK9를 표적으로 하는 마이크로RNA 서열은 miR-451 스캐폴드의 맥락에 있으며, 이는 이론에 얽매이고자 하지 않지만, 비정규 다이서(Dicer)-독립적 경로를 통해 miRNA 처리를 강제하고 패신저 가닥(passenger strand) 활성으로 인한 표적 외 효과를 회피한다. Herrera-Carrillo et al., Nucleic Acids Res 2017;45:10369-79.
실시형태에서, 본 유전자-표적화 조성물은 PCSK9를 표적화하는 마이크로RNA를 포함하는 유전자-표적화 조성물을 포함하는 추가적인 조성물을 포함하는 방법에서 사용된다. 실시형태에서, PCSK9를 표적으로 하는 마이크로RNA 서열은 LDLR 또는 VLDLR 유전자와 상이한 프로모터의 제어 하에 있다. 실시형태에서, PCSK9를 표적으로 하는 마이크로RNA 서열은 CAG 프로모터의 제어 하에 있다(예를 들어, 문헌[Gene. 79 (2): 269-77] 참조). 실시형태에서, PCSK9를 표적으로 하는 마이크로RNA 서열은 miR-451 스캐폴드의 맥락에 있다.
실시형태에서, PCSK9를 표적으로 하는 마이크로RNA는 miR-24, miR-191, miR-195, miR-222, 및 miR-224 중 하나이다.
PCSK9는 주로 간에서 수용체와 복합체를 형성함으로써 LDL 수용체의 분해를 촉진시킨다. 세포 표면에 국한된 LDL 수용체는 LDL과 결합하고, 그 후 복합체는 엔도사이토시스를 통해 엔도솜으로 운반되며 산성 조건 하에서 LDL을 방출한다. LDL은 아미노산과 콜레스테롤로 분해되는 한편, LDL 수용체는 세포 표면으로 운반되고 LDL과 결합하여 세포로 흡수된다. 세포 표면으로 LDL 수용체의 이러한 재순환은 대략 150회 발생한다. PCSK9는 간 세포의 소포체에서 분비되고, 세포막의 LDL 수용체와 결합하여 세포로 흡수된다. PCSK9가 결합한 LDL 수용체는 재순환되지 않고 리소좀에서 분해된다. PCSK9는 또한 LDLR 이원체(paralog)인 VLDLR을 조절하고, 지방 VLDLR 수준의 조절을 통해 지방 생성을 제한한다.
PCSK9는 LDL 수용체의 분해를 촉진시키기 때문에, PCSK9를 표적으로 하면 혈장의 LDL 콜레스테롤 수치에 영향을 미칠 수 있다. 인간의 기능 상실 돌연변이는 낮은 LDL-C 수준 및 더 낮은 심혈관 질환 발병률과 연관이 있다. 문헌[Cohen et al., N Engl J Med 2006;354:1264-72; Miyake et al. Atherosclerosis 2008;196:29-36]을 참조한다. PCSK9 기능의 완전한 상실은 인간이나 포유동물의 생존 가능성이나 건강에 영향을 미치는 것으로 간주되지 않는다. 문헌[Zhao et al., Am J Hum Genet 2006;79:514-23; Rashid et al., Proc Natl Acad Sci USA 2005;102:5374-9]을 참조한다. PCSK9 기능의 상실은 LDL-C의 저하로 이어지며, 15년 초과의 후향적 결과 연구에서, PCSK9의 1개 복사체의 상실은 LDL-C를 낮추고 심혈관 질환의 발병으로부터 위험:이익 보호 증가를 야기하는 것으로 나타났다. Cohen et al., N Engl J Med 2006;354:1264-72.
RNA 간섭 및 관련 RNA 침묵 경로는 유전자 발현을 조절하기 위한 매우 특이적인 내인성 메커니즘을 활용한다. 작은 간섭 RNA(siRNA)는 이펙터 RNA-유도 침묵 복합체의 형성을 통해 서열-특이적 방식으로 상보적 표적 메신저 RNA(mRNA)의 번역을 선택적이고 촉매적으로 침묵시킨다. 최근에, siRNA인 인클리시란은 LDL 콜레스테롤 수준이 상승한 심혈관 위험이 높은 환자에서 PCSK9 및 LDL 콜레스테롤 수준을 저하시키는 것으로 나타났다. Ray et al., N Engl J Med 2017;376:1430-40. PCSK9 서열-특이적 miRNA 작제물을 사용한 PCSK9 침묵은 높은 유전자 침묵 활성으로 설계될 수 있다. miRNA miR-451 스캐폴드를 사용하는 접근법은 비정규 다이서-독립적 경로를 통해 miRNA 처리를 강제하고 패신저 가닥 활성으로 인한 표적 외 효과를 회피한다. Herrera-Carrillo et al., Nucleic Acids Res 2017;45:10369-79.
일부 실시형태에서, 선택적으로 봄빅스 모리, 제노푸스 트로피칼리스, 또는 트리코플루시아 니로부터 유래된 트랜스포사제를 인코딩하는 핵산 작제물, 및/또는 이의 조작된 형태가 전달된다.
일부 실시형태에서, 세포는 선택적으로 봄빅스 모리, 제노푸스 트로피칼리스, 또는 트리코플루시아 니로부터 유래된 트랜스포사제를 인코딩하는 핵산 작제물 및/또는 이의 조작된 형태와 접촉된다.
일부 실시형태에서, 트랜스포사제는 봄빅스 모리, 제노푸스 트로피칼리스, 트리코플루시아 니, 리놀로푸스 페룸에퀴눔, 로우세투스 아에집티아쿠스, 필로스토무스 디스콜로르, 마이오티스 마이오티스, 마이오티스 루시푸구스, 프테로푸스 밤피루스, 피피스트렐루스 쿠흘리, 판 트로글로다이테스, 몰로수스 몰로수스, 또는 호모 사피엔스로부터 유래되고/거나 이의 조작된 형태이다.
일부 실시형태에서, FH를 치료 및/또는 완화하는 방법은 스테로이드 치료 없이 수행된다. 글루코코르티코이드 스테로이드(예를 들어, 프레드니손)와 같은 스테로이드는 면역 반응을 감소시킴으로써 AAV-기반 유전자 치료의 효과를 개선시키는 데 사용되었다. 그러나, 스테로이드 치료에 부작용이 없는 것은 아니다. 본 개시내용의 조성물 및 방법은 실질적으로 비-면역원성일 수 있고, 따라서 스테로이드 치료에 대한 필요성을 제거할 수 있다.
그러나, 일부 실시형태에서, 방법은 스테로이드 치료와 조합하여 수행된다.
일부 실시형태에서, 방법은 기재된 조성물을 하나 이상의 추가적인 치료제와 조합하여 투여하기 위해 사용될 수 있다. 추가적인 치료제의 비제한적인 예는 스타틴, 에제티미브, 담즙산 결합 수지, 에볼로쿠맙, 인클리시란, 로미타피드 및 미포머센 중 하나 이상을 포함한다. 따라서, 일부 실시형태에서, 방법은 스타틴, 에제티미브, 담즙산 결합 수지, 에볼로쿠맙, 인클리시란, 로미타피드 및 미포머센 중 하나 이상을 투여하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 스타틴은 아토르바스타틴(LIPITOR), 플루바스타틴(LESCOL), 로바스타틴(ALTOCOR; ALTOPREV; MEVACOR), 피타바스타틴(LIVALO), 프라바스타틴(PRAVACHOL), 로수바스타틴 칼슘(CRESTOR), 및 심바스타틴(ZOCOR) 중 하나 이상이다.
양태에서, 유전자 전달 작제물을 포함하는 조성물이 제공된다. 실시형태에서, 조성물은 (a) 초저밀도 지단백질 수용체 단백질(VLDLR) 또는 저밀도 지단백질 수용체 단백질(LDLR) 또는 이의 기능적 단편을 인코딩하는 핵산이되, VLDLR은 서열번호 4의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 약 90% 동일성의 변이체, 또는 서열번호 5의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 약 90% 동일성의 변이체를 포함하는 인간 VLDLR인, 핵산; (b) 서열번호 15의 핵산 서열, 또는 이와 적어도 약 90% 동일성을 갖는 변이체를 갖는 인간 LP1 프로모터인, 간-특이적 프로모터; 및 (c) 하나 이상의 트랜스포사제 인식 부위 및 하나 이상의 역 말단 반복부(ITR) 또는 말단 서열을 포함하는 비-바이러스 벡터를 포함한다.
일부 실시형태에서, 방법은 스타틴, 에제티미브, 담즙산 결합 수지, 에볼로쿠맙, 인클리시란, 로미타피드 및 미포머센 중 하나 이상을 이용하는 치료에 대한 필요성을 제거한다. 본 방법 및 조성물은 총 콜레스테롤 및/또는 LDL-C 수준의 영속성이 있는 감소를 제공할 수 있으므로, 추가적인 치료제에 대한 필요성이 감소되거나 제거될 수 있다.
또한, 일부 실시형태에서, 방법은 LDL 성분채집술에 대한 필요성을 제거한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 비-바이러스 유전자 치료를 위한 조성물은 정맥내, 문맥내, 유체역학적 전달, 및 직접 주사를 포함한 다양한 전달 경로를 통해 투여된다. 일부 실시형태에서, 투여는 정맥내이다. 일부 실시형태에서, 투여는 문맥내, 또는 간 실질 내로의 직접 주사이다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 투여는 대류-강화 전달(convection-enhanced delivery; CED)을 사용하는 실질내 간 주사이다. CED는 중추신경계의 간질 공간을 통해 치료제를 직접 전달하기 위해 마이크로스텝 주입 캐뉼러의 팁에서 압력 구배를 생성하는 기법이다. Mehta et al. (2017). Neurotherapeutics: the Journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics, 14(2), 358-371.
일부 실시형태에서, 환자에게 세포를 투여하는 것은 정맥내이다. 정맥내 투여는 일반적인 접근법이지만, 일부 경우에는 총 용량의 증가를 필요로 할 수 있고 비-표적 기관의 형질도입을 야기할 수 있다. 일부 경우에는 또한 정맥내 투여가 난소 및 고환에서 생식 세포를 형질도입할 가능성을 증가시킬 수 있다. 이는 트랜스포사제를 사용한 통합 유전자 요법에서 바람직하지 않다.
일부 실시형태에서, 세포에 투여하는 것은 동맥내, 문맥내, 및/또는 역행성 정맥내 경로이다.
일부 실시형태에서, 환자에게 세포를 투여하는 것은 문맥내이다.
일부 실시형태에서, 환자에게 세포를 투여하는 것은 직접적인 실질내 간 투여이다. 인간에서, 경피적 간 생검은 긴 바늘을 피부, 피하 조직, 늑간근, 및 복막을 통해 간에 도입하여 간 조직의 표본을 수득하는 절차이다. 이 절차는 보통 외래 환자를 대상으로 수행된다. 일부 실시형태에서, 직접 주사는 유사한 절차를 따를 수 있고, 마이크로캐뉼러를 사용하여 대류-강화 전달(CED)에 의해 조성물을 주사할 수 있다. CED는 압력-구동 벌크 유동(bulk flow)에 의존하는 직접 주입 기법이다. 현재 중추신경계(CNS)에 유전자 치료를 전달하는 데 사용된다. 벌크 유동은 확산을 통해 달성할 수 있는 것보다 훨씬 더 많은 부피의 약물 분포를 제공하는, CNS 내에서 표적화된 카테터를 통해 용질을 밀어내는 펌프로부터의 작은 압력 구배에 의해 생성된다. 전통적인 대류 전달과 비교하여, CED는 더 높은 농도의 치료제, 더 긴 주입 시간, 및 주입 부위에서 더 큰 분포 부피를 생성하여, 조직 손상을 최소화한다. CNS의 주입 속도는 3 내지 15마이크로리터/분의 범위이다. 일부 실시형태에서, 주입 속도는 15마이크로리터/분보다 높을 수 있다.
일부 실시형태에서, 간 생검은 영상화 유도와 함께 수행된다. 일부 실시형태에서, 간 생검은 초음파 유도, 경정맥, 컴퓨터 단층촬영(CT), 자기 공명 영상(MRI), 복강경, 및 내시경 초음파를 포함하는 영상화 기법을 사용하여 유도된다. 일부 실시형태에서는 간 우엽(간 부피의 5/6)의 경피적 CED 주입이 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함한다.
적합한 약제학적 조성물을 제형화하는 방법은 당업계에 알려져 있으며, 예를 들어 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st ed., 2005]; 및 서적[Drugs and the Pharmaceutical Sciences 시리즈: a Series of Textbooks and Monographs (Dekker, N.Y.)]을 참조한다. 예를 들어, 주사 용도에 적합한 약제학적 조성물은 멸균 주사용 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 수용액(수용성인 경우) 또는 분산액 및 멸균 분말을 포함할 수 있다. 정맥내 투여의 경우, 적합한 담체는 생리 식염수, 정균수, Cremophor EL™(BASF, 미국 뉴저지주 파시패니 소재) 또는 인산염 완충 식염수(PBS)를 포함한다. 모든 경우에, 조성물은 멸균 상태이어야 하고 용이한 주사 가능성이 존재하는 정도로 유동적이어야 한다. 제조 및 저장 조건에서 안정적이어야 하며 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 담체는, 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글라이콜, 및 액체 폴리에틸렌 글라이콜 등), 및 이들의 적합한 혼합물을 포함하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어 레시틴과 같은 코팅제의 사용, 분산의 경우 필요한 입자 크기의 유지 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 방지는 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로뷰탄올, 페놀, 아스코브산, 티메로살 등에 의해 달성될 수 있다. 많은 경우에, 등장화제, 예를 들어 당, 폴리알코올, 예컨대, 만니톨, 소르비톨, 염화나트륨을 조성물에 포함시키는 것이 바람직할 것이다. 주사 가능한 조성물의 연장된 흡수는 조성물에 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 포함함으로써 야기될 수 있다.
멸균 주사 용액은 필요에 따라 상기 열거한 성분 중 하나 또는 조합과 함께 적절한 용매에 필요한 양의 활성 화합물을 혼입한 후 여과 멸균함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 활성 화합물을 멸균 비히클에 혼입함으로써 제조되며, 이 비히클은 기본 분산 매질 및 상기 열거한 것들로부터의 필요한 기타 성분을 포함한다. 멸균 주사 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 진공 건조 및 동결 건조이며, 이는 사전에 멸균-여과된 용액으로부터 활성 성분과 임의의 추가적인 원하는 성분의 분말을 산출한다.
치료 화합물은 임플란트 및 마이크로캡슐화된 전달 시스템을 포함하여 제어 방출 제형과 같이 신체로부터의 신속한 제거로부터 치료 화합물을 보호할 담체와 함께 제조될 수 있다. 생분해성, 생체적합성 중합체, 예컨대, 콜라겐, 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물(예를 들어, 폴리[1,3-비스(카복시페녹시)프로판-코-세바스산](PCPP-SA) 매트릭스, 지방산 이량체-세바스산(FAD-SA) 공중합체, 폴리(락타이드-코-글라이콜라이드)), 폴리글라이콜산, 콜라겐, 폴리오쏘에스터, 폴리에틸렌글라이콜-코팅 리포솜, 및 폴리락트산이 사용될 수 있다. 이와 같은 제형은 표준 기법을 사용하여 제조되거나, 예를 들어 Alza Corporation 및 Nova Pharmaceuticals, Inc.로부터 상업적으로 입수할 수 있다. 리포솜 현탁액은 또한 약제학적으로 허용 가능한 담체로서 사용될 수 있다. 이는, 예를 들어 미국 특허 제4,522,811호에 기재된 바와 같이 당업자에게 알려진 방법에 따라 제조될 수 있다. 예를 들어 수술 부위에의 투여가 요구되는 경우, 반고체, 겔화, 연질-겔, 또는 기타 제형(제어 방출을 포함함)이 사용될 수 있다. 이와 같은 제형의 제조 방법은 당업계에 알려져 있으며 생분해성, 생체적합성 중합체의 사용을 포함할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Sawyer et al., Yale J Biol Med. 2006; 79(3-4): 141-152]을 참조한다.
실시형태에서, 관심이 있는 유전자의 세포 내로의 안정적인 통합에 기인한 안정적으로 형질감염된 세포를 생성하기 위해 트랜스포사제의 존재 하에 본 명세서에 기재된 유전자 전달 작제물을 사용하여 세포를 형질전환시키는 방법이 제공된다. 실시형태에서, 안정적인 통합은 폴리뉴클레오타이드를 세포의 염색체 또는 미니염색체로 도입하는 것을 포함하며, 따라서 세포 게놈의 비교적 영구적인 부분이 된다.
실시형태에서, 본 발명은 관심이 있는 유전자, 예를 들어, VLDLR 또는 LDLR이 성공적으로 숙주의 게놈으로 전달되었는지 여부를 결정하는 것에 관한 것이다. 일 실시형태에서, 방법은 관심이 있는 유전자에 측접하는 프라이머로 중합효소 연쇄 반응을 수행하는 단계; 수득된 증폭된 중합효소 연쇄 반응 생성물의 크기를 결정하는 단계; 및 수득된 생성물의 크기를 참조 크기와 비교하는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 수득된 생성물의 크기가 예상 크기와 일치하는 경우, 관심이 있는 유전자가 성공적으로 전달된 것이다.
실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 조성물(예를 들어, 제한 없이, 유전자 전달 작제물 및/또는 트랜스포사제를 포함하는 조성물)을 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 실시형태에서, 숙주 세포는 원핵 또는 진핵 세포, 예를 들어 포유동물 세포이다.
실시형태에서, 본 개시내용의 방법에 의해 형질전환된 세포를 포함할 수 있는 유전자이식 유기체가 제공된다. 일 예에서, 유기체는 포유동물 또는 곤충일 수 있다. 유기체가 포유동물인 경우, 유기체는 마우스, 래트, 원숭이, 개, 토끼 등을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 유기체가 곤충인 경우, 유기체는 초파리, 모기, 목화다래벌레(bollworm) 등을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다.
조성물은 투여에 대한 지침과 함께 용기, 키트, 팩 또는 디스펜서에 포함될 수 있다.
또한 i) 본 발명의 상기 언급한 유전자 전달 작제물 중 임의의 것, 및/또는 본 발명의 상기 언급한 세포 중 임의의 것 및 ii) 용기를 포함하는 키트가 본 명세서에서 제공된다. 특정 실시형태에서, 키트는 이의 사용에 대한 지침을 더 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 언급한 키트 중 임의의 것은 트랜스포사제를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 작제물을 더 포함할 수 있다.
본 발명은 하기 비제한적인 실시예에 의해 추가로 설명된다.
실시예
실시예 1: 트랜스포존 발현 벡터의 설계
LEAPIN 트랜스포사제 기술(ATUM, 미국 캘리포니아주 뉴어크 소재)을 사용하여 비-바이러스 트랜스포존 발현 벡터를 설계하고 클로닝한다. 트랜스포존 발현 벡터는 LP1 프로모터에 작동 가능하게 연결되고 이에 의해 구동되는 인간 VLDLR을 포함한다. 마우스 LP1-vldlr을 포함하는 트랜스포존 발현 벡터도 또한 생성한다. 인간 LDRL-/- 개별 만능 줄기 세포(iPSC) 질환 세포주 또는 형질전환된 인간 또는 배아 줄기 세포(ESC)를 사용한다. 다른 테스트한 세포주는 인간 간(HepG2, Huh7), 및 비-간(CHO, HT1080, 및 HEK293) 세포주를 포함한다. B6.129S7-Ldlrtm1Her/J(JAX) 마우스 모델(ldlr -/-)을 사용한다.
도 4A, 4B, 4C, 4D, 4E, 4F, 4G, 및 4H는 시험관내 형질감염과 전위 효능 평가, 및 인간 줄기 세포 및 ldlr -/- 마우스에서의 LP1-루시페라제 생체분포의 발현 연구에서 사용된 작제물의 개략도를 나타낸다. 도 4A는 포스포글리세레이트 키나제(PGK) 프로모터를 갖는 트랜스포존 작제물을 나타낸다. 도 4B 및 4C는 설계된 발현 벡터의 전위 효능을 결정하는 데 사용되는 LP1-GFP 트랜스포존 작제물을 나타낸다. 도 4D는 간세포로의 분화 후 VLDLR을 이용한 줄기 세포의 형질감염의 표현형 결과를 평가하는 데 사용되는 LP1-VLDRL 작제물을 나타낸다. 마우스, 돼지, 필리핀 원숭이(cynomolgus monkey), 및 인간 서열을 포함하는 LP1-VLDRL 작제물을 제조한다. 도 4E는 상이한 경로를 사용하여 생체분포를 평가하기 위해 정맥내, 문맥내 및 실질내 경로에 의해 간에 투여되는 LP1-강화된 인간 VLDLR(e-LDLR) 작제물을 나타낸다.
또한, LDLR 및 VLDLR 분해 및 전환을 방지하기 위해 PCSK9를 넉다운시키는 miRNA를 포함하도록 작제물을 설계한다. 도 4F는 LP1과 상이한 프로모터의 제어 하에 PCSK9-표적화 miRNA를 갖는 작제물을 나타내며, 여기서 작제물은 정맥내, 문맥내 또는 실질내 경로에 의해 간에 투여되어 상이한 경로를 사용하여 생체분포 및 용량 범위를 평가할 수 있다. 도 4G는 LP1과 상이한 프로모터의 제어 하에 LP1-VLDRL 트랜스포존 및 PCSK9-표적화 miRNA를 포함하는 트랜스포존을 포함하는 작제물을 나타낸다. 도 4H는 LP1- e-LDLR 트랜스포존 및 LP1과 상이한 프로모터의 제어 하에 PCSK9-표적화 miRNA를 포함하는 트랜스포존을 포함하는 작재물을 나타낸다.
실시예 2: 형질전환 마우스를 사용한 생체내 실험
이 실시예의 실험은 투약, 내약성, 생체분포, 안전성, 및 효능을 결정하기 위해 ldlr-/- 마우스에 LP1-vldlr 및 LP1-루시페라제 작제물의 정맥내, 문맥내, 및 실질내 간 주사를 포함한다. 유카탄(Yucatan) Ldlr -/- 형질전환 미니 돼지에서의 유사한 실험은 적절한 작제물 및 투여 절차의 안전성, 내약성 및 효능을 나타내도록 설계되어야 한다. GLP 환경에서 유카탄 돼지 또는 필리핀 원숭이에서의 생체분포, 용량-반응, 약동학, 약력학, 안전성 및 병리학적 연구를 수행할 수 있다.
실시예 3: 간 및 비-간 세포주에서 전위 효능 및 트랜스포사제(Ts):트랜스포존(Tn) 비율의 결정
구성적 포스포글리세레이트 키나제(PGK) 프로모터의 제어 하에 GFP를 발현하는 트랜스포존의 전위 효능을 PGK1-GFP Tn으로의 형질감염 후 간 및 비-간 세포주(즉, Huh7, HepG2, HT1801)의 형광-활성화 세포 분류(FACS)에 의해 결정한다. 작제물은 LEAPIN 트랜스포사제를 포함한다. 도 4A는 이 실시예에서 사용될 수 있는 벡터의 예를 나타낸다. 상기 표 1에 열거된 것을 포함하여, 다양한 간-특이적 프로모터가 사용된다.
실시예 4: 간-특이적 프로모터(LSP)의 선택
상기 실시예 3에서 결정한 바와 같이 전위 효능 및 Ts:Tn 비율에 기초하여 간 세포주 및 비-간 세포주를 선택한다. 상이한 간-특이적 프로모터(표 1)를 사용한 녹색 형광 단백질(GFP) 발현 수준을 트랜스포존(도 4A 및 4B) 및 트랜스포사제로 세포주를 공동 형질감염시킴으로써 결정한다. 간-특이적 프로모터를 문헌[Kramer et al. Mol Ther 2003; 7:375-85]에 기재된 바와 같이 평가한다. GFP 발현을 형질감염 후 1일, 1주, 2주, 및 4주 후에 FACS 분석에 의해 결정한다.
실시예 5: 인간 VLDLR, 강화된 LDLR(L339D, K830R, C839A), 및 PCSK9의 넉다운을 포함하는 트랜스포존 작제물의 평가
LDLR 돌연변이에 의해 유발된 FH를 개선하도록 설계된 작제물의 발현을 평가하기 위해 간 및 비-간 세포주에서 형질감염 실험을 수행한다. 2개의 트랜스포존(Tn) 작제물 설계는 인간 VLDLR이 있는 작제물, 및 인간 LDLR cDNA의 코딩 서열에 도입된 아미노산 치환(L339D, K830R, 및 C839A)이 있어 전단백질 전환효소 서브틸리신/켁신 유형 9(PCSK9) 및 LDLR의 유도성 분해제(IDOL)와의 상호작용을 감소시킨 강화된 인간 VLDLR(e-LDLR)이 있는 작제물을 포함한다. 추가적으로, LDLR 및 VLDLR 분해 및 전환을 방지하기 위해 PCSK9를 넉다운시키는 miRNA를 포함하도록 작제물을 설계한다. 도 4F 내지 4H를 참조한다.
특이적 세포주, Ts:Tn 비율, 강력한 구성적 LSP, 및 가장 안전한 Ts 작제물(즉, 정의된 부위 특이적 통합)을 상기 실시예 3 및 4에 기재한 바와 같이 선택한다. 이전에 설명된 방법에 의해 LDLR 및 VLDLR을 평가하기 위해 형질감염되지 않은 세포 및 형질감염된 세포에서 FACS 분석을 수행한다. 문헌[Somanathan et al. Circ Res 2014; 115:591-9; Kozarsky et al. (1996). Nat Genet 3:54-62; Turunen et al. (2016). Mol Ther 2016; 24:620-35.]을 참조한다.
실시예 6: FH 환자 iPSC 및 유전자이식 ldlr-/- 마우스, 및 대형 동물 모델에서 생체내 연구를 위한 트랜스포존(Tn) 및 트랜스포사제(Ts) 작제물의 생성
환자의 LDRL -/- 줄기 세포(iPSC 또는 ESC)에서의 시험관내 테스트 및 유전자이식 ldlr -/- 마우스에서의 생체내 테스트(루시페라제 생체분포를 포함함)를 위해 트랜스포존(Tn) 및 트랜스포사제(Ts) 작제물을 식별한다. 사용한 작제물은 도 4B, 4C, 4D, 및 4F에 개략적으로 나타나 있다. 대형 동물, 예컨대, 유카탄 미니 돼지 LDRL -/-(수스 스크로파(Sus scrofa)), 및 비-인간 영장류(필리핀 원숭이; 마카카 파시큘라리스(macaca fascicularis))에서 일부 연구를 수행한다.
실시예 7: LP1-VLDLR (Hs)/MLT 트랜스포사제로 형질감염된 Huh-7 세포에서의 mRNA 발현
이 연구의 목적은 HUH7 세포에서 2개의 유전자이식 세포주인 LP1-VLDLR/PGK-GFP 및 LP1-VLDLR의 생성에 의한 MLT 트랜스포사제 1 및 MLT 트랜스포사제 2의 통합 효율성을 입증하는 것이었다.
세포주 생성
2개의 상이한 플라스미드(LP1-VLDLR/PGK-GFP 및 LP1-VLDLR 단독)를 본 개시내용의 MLT 트랜스포사제(서열번호 9)와 함께 사용하여, 특정 뉴클레오펙션 조건(15개의 상이한 Nucleofector™ 프로그램 및 1개의 대조군(뉴클레오펙션 없음)과 조합된 3개의 상이한 4D-Nucleofector™ 용액)을 사용하여 HUH7 세포를 형질감염시켰다. 72시간 후, 항생제 처리(Kan+)를 적용하여 양성으로 형질감염된 클론을 선택하였다. 선별 항생제를 포함한 세포 배지를 2 내지 3일마다 교체하고 14일 동안 매일 세포독성에 대해 세포를 시각적으로 검사하였다. 14일 후 GFP 신호의 면역형광 검출을 사용하여 MLT 트랜스포사제의 게놈-편집 능력을 정량화하였다.
세포주 검증
세포주의 생성 및 확장 동안, 양성(HEK293) 및 음성 대조군(HUH7) 세포주를 사용하였다. Droplet Digital™ PCT(ddPCR)를 수행하여 세포당 LP1-VLDLR 이식유전자 복제물의 수를 정량화하였다. 2개의 양성 대조군은 (1) LP1-VLDLR 플라스미드 단독; 및 (2) 인간 게놈 DNA(이중-가닥 DNA에 대한 산업 표준인 125 내지 3000 bp 길이의 gBlocks™ 유전자 단편 이중-가닥 DNA 단편)이었다. 음성 대조군은 (1) HEK293 세포; (2) 미처리 HUH7 세포; (3) HUH7 세포 + MLT 트랜스포사제; 및 (4) H2O 대조군이었다.
qPCR을 수행하여 모든 세포주에서 이식유전자의 발현 수준을 정량화하였다. 3개의 양성 대조군, 즉, (1) HEK293 세포; (2) 플라스미드 단독; 및 (3) gBlocks™ 유전자 단편을 사용하였다. 3개의 음성 대조군, 즉, (1) HUH7 세포; (2) HUH7 세포 + MLT 트랜스포사제; (3) H2O 대조군을 사용하였다. LP1-VLDLR 단독을 무작위 통합을 위한 대조군으로 사용하였다.
LDL-C 흡수 프로토콜
Abcam LDL 흡수 키트(카탈로그 번호 ab133127)를 공급업체 지침에 따라 사용하였다. 뉴클레오펙션된 HUH7 세포를 70 내지 80%의 컨플루언시에서 사용하였다. HUH7 세포를 뉴클레오펙션된 세포로의 LDL 흡수의 검출을 위해 LDL-Dylight™ 549로 염색하였다. 핵 수의 정량화를 위해 회흐스트(Hoechst) 염색을 사용하여 수행된 고 콘텐츠 영상화(High content imaging)로 판독을 수행하였다.
사용된 시약
표 2는 본 실험에 사용된 시약을 나타낸다.
Figure pct00022
결과
도 6은 뉴클레오펙션 24시간 후 Huh7 세포의 GFP 발현을 예시하며; 4개의 패널(좌측에서 우측으로)은 Nucleofector™ 용액 키트(Lonza, 스위스 바젤 소재), 프로그램 CA-137, CM-150, CM-138 및 EO-100으로 얻은 데이터를 예시한다. 각각의 패널의 상단 행은 GFP 형광을 나타내고, 하단 행은 명시야 현미경 데이터를 나타낸다. 도 7은 뉴클레오펙션 4일 후 Huh7 세포의 GFP 발현 결과를 예시하고; 4개의 패널(좌측에서 우측으로)은 Nucleofector™ 용액 키트, 프로그램 CA-137, CM-150, CM-138 및 EO-100으로 얻은 데이터를 예시한다. 각각의 패널의 상단 행은 GFP 형광을 나타내고, 하단 행은 명시야 현미경 데이터를 나타낸다. 도 8A, 도 8B, 도 8D 및 도 8D는 뉴클레오펙션 24시간 후 뉴클레오펙션 효율의 정량화 결과를 예시한다: 데이터는 Nucleofector™ 용액 키트, 프로그램 CA-137(도 8A), CM-150(도 8B), CM-138(10,700개의 살아있는 세포, Q2 % GFP: 51%)(도 8C) 및 EO-100(도 8D)으로 얻은 것이다. 각각의 도면의 상단 행은 GFP 형광을 나타내고, 하단 행은 FACS 플롯을 나타낸다: (1) 10,700개의 살아있는 세포, Q2 % GFP: 51%; (2) 13,300개의 살아있는 세포, Q2 % GFP: 39%; (3) 13,800개의 살아있는 세포, Q2 % GFP: 45%; 및 (4) 10,800개의 살아있는 세포, Q2 % GFP: 71%.
도 9A, 도 9B, 도 9C, 도 9D, 도 9E, 도 9F 및 도 9G는 다음과 같이 형질감염 7일 후 상이한 조건 하에서 형질감염된 Huh7 세포의 FACS 플롯을 나타낸다: (도 9A) 프로그램 없음 - 음성 분석 대조군; (도 9B) pmaxGFP - 양성 분석 대조군; (도 9C) LP1-VLDLR/PGK-GFP 플라스미드(즉, LP1 프로모터, 초저밀도 지단백질 수용체(VLDLR) 유전자, 및 향상된 (eGFP)의 PGK 프로모터-유도 발현을 포함하는 플라스미드); (도 9D) LP1-VLDLR/PGK-GFP + MLT 1; (도 9E) LP1-VLDLR/PGK-GFP + MLT 2; (도 9F) MLT 1; 및 (도 9G) MLT 2. 하기 표 3은 도 9A 내지 도 9G에 대한 각각의 형질감염에 대한 정보를 제공한다.
Figure pct00023
도 9A, 도 9B, 도 9C, 도 9D, 도 9E, 도 9F 및 도 9G의 FACS 플롯은 LP1-VLDLR/PGK-GFP + MLT 1 및 LP1-VLDLR/PGK-GFP + MLT 2(패널 4 및 5)가 둘 다 본 연구의 음성 대조군(패널 1, 6, 및 7)과 비교할 때 Huh7 세포를 효과적으로 형질감염시킬 수 있음을 나타낸다. 어떠한 트랜스포사제도 없는 LP1-VLDLR/PGK-GFP는 LP1-VLDLR/PGK-GFP와 트랜스포사제(MLT 1 또는 MLT 2)의 조합의 발현과 유사한 발현을 갖는 것으로 관찰되었다. 이는 트랜스포사제의 존재가 Huh7 세포의 생존력에 부정적인 영향을 미치지 않는다는 것을 나타낸다.
미처리 Huh7 세포 대 VLDLR 플라스미드 및 MLT 트랜스포사제 2로 처리된 Huh7 세포의 LDL-C 흡수를 설명하는 도 10은, Huh7 세포가 VLDLR 플라스미드 및 MLT 트랜스포사제 2로 처리될 때, Huh7 세포에 대한 LDL-C 흡수에서 약 30 내지 50%의 증가가 있음을 나타낸다.
다양한 조건 하에 VLDLR 발현의 qPCR 결과를 설명하는 도 11은, 샘플 1(LP1-hVLDLR) 및 샘플 2(LP1-hVLDLR + PGK-GFP)에서 MLT 트랜스포사제 2의 존재가 VLDLR 발현을 증가시킴을 나타낸다. 이는 대조군과 비교할 때 인간 간세포(Huh7 세포)에서 LP1-hVLDLR의 발현이 10배 초과로 극적으로 증가함을 입증한다.
결론적으로, 본 연구는 특히 Huh7 세포를 LP1-hVLDLR로 처리하였을 때 VLDLR mRNA 발현의 발현에서 증가를 입증하였다. 이 연구는 또한 LDL-C 흡수가 미처리 세포주와 비교하여 VLDLR 플라스미드 및 MLT 트랜스포사제 2로 처리될 때 약 30%에서 50%로 증가됨을 입증하였다(도 10).
실시예 8: 전위 활성을 결정하기 위해 사용된 유세포 분석
이 연구는 형질감염된 세포주의 시험관내 전위를 결정하기 위해 유세포 분석의 사용을 평가하였다. 이 연구에서, 다양한 간세포 및 비-간세포 세포주에서 GFP의 존재를 측정하기 위해 유세포 분석을 사용하였다.
샘플을 15 ㎽ 공랭식 488 아르곤-이온 레이저가 장착된 유세포 분석기(Becton Dickinson Immunocytometry Systems, BDIS)에서 분석하였다. 530/30 ㎚ 통과대역(BP) 필터 후에 녹색 GFP 형광을 수집하였다. 잔류 스펙트럼 중첩을 제거하기 위해 형광 채널 사이에 전자 보상을 사용하였다. GFP 형광 데이터를 40년 로그 스케일로 표시하였다. 히스토그램의 변동 계수를 개선시키기 위해 샘플 획득에 낮은 유속 설정(12 ㎕/분)을 사용하였다. 각각의 샘플에서, 싱글렛(singlet) 게이트 내에서 최소 10,000개의 사건을 수집하였다. CELL Questy 소프트웨어(BDIS)를 이용하여 다변량 데이터의 분석을 수행하였고, ModFit LTy 소프트웨어(Verity Software House, 미국 메인주 탑스햄 소재)를 이용하여 히스토그램의 세포 주기 분석을 수행하였다.
표 4는 본 실험에 사용된 시약을 나타낸다.
Figure pct00024
이 연구에서, 세포주에서 유세포 분석에 의한 GFP 발현에 의해 DNA 공여체(플라스미드) 후보(도 12)를 테스트 및 측정하였다.
이러한 시험관내 전임상 발견 연구의 결과는 인간 질환을 치료하기 위해 트랜스포존 작제물을 사용하는 개념의 증거를 제공한다. 또한, 이 연구에서 얻은 데이터는 공여체 GFP를 측정함으로써 전위된 세포의 수를 정량화하기 위한 유세포 분석의 사용을 뒷받침한다.
실시예 9: Huh-7 인간 간세포에서 PGK-GFP 및 LP1-VLDLR의 공동 형질감염
이 연구의 목적은 PGK-GFP 및 LP1-VLDLR로 공동 형질감염된, 본 개시내용에 따른 MLT 트랜스포사제 1 및 MLT 트랜스포사제 2를 이용하거나 이용하지 않은 VLDLR/PGK-GFP 및 VLDLR 이식유전자의 통합을 평가하는 것이었다.
HUH7 세포주 제조
15개의 상이한 Nucleofector™ 프로그램 및 1개의 대조군(뉴클레오펙션 없음)과 조합된 4D-Nucleofector™ Solutions V를 이용하여 HUH7 세포주를 테스트하였다. 모든 후속 실험을 위해 24시간 후에 가장 높은 효율과 가장 낮은 사망률을 갖는 Nucleofection™ 조건을 선택하였다.
2개의 상이한 플라스미드(LP1-VLDLR/PGK-GFP 및 LP1-VLDLR 단독)를 2개의 상이한 트랜스포사제, 즉, MLT 트랜스포사제 1 및 MLT 트랜스포사제 2와 함께 사용하여, 이전에 미리 결정한 뉴클레오펙션 조건을 사용하여 HUH7 세포를 형질감염시켰다. 72시간 후, 항생제 처리(Kan+)를 적용하여 양성으로 형질감염된 클론을 선택하였다. 선별 항생제를 포함한 세포 배지를 2 내지 3일마다 교체하고 14일 동안 매일 세포독성에 대해 세포를 시각적으로 검사하였다. 14일 후 GFP 신호의 면역형광 검출을 사용하여 2개의 트랜스포사제(MLT1 및 MLT 2)의 게놈 편집 능력을 정량화하고 비교하였다.
분석 최적화
세포주의 생성 및 확장 동안, 양성(HEK293) 및 음성 대조군(HUH7) 세포주를 최적화 목적으로 사용하였다. LP1 VLDLR 이식유전자 복제 수를 정량화하기 위해 VLDLR 이식유전자를 검출하도록 ddPCR 분석을 위한 특정 Taqman 프로브를 설계하였다. 복제 수 결정 분석을 위한 참조 유전자. Gblock(양성 대조군) 및 플라스미드-특이적 프로브(안정적인 통합을 위한 음성 대조군)를 이용한 VlDLR 발현 수준.
웨스턴 블롯팅 및 면역세포화학(ICC) 실험에서, 최대 2개의 항체를 2개의 희석액으로 테스트하였다. 동일한 2개의 항체를 사용하여 2개의 세포주에서 ICC를 수행하였다. 추가 실험을 위해 특정 희석액의 단일 항체를 선택하였다.
LDL 흡수 분석 키트(Abcam; 카탈로그 번호 ab133127)를 사용하여 LDL 흡수를 평가하였다. 제조업체가 제공한 프로토콜을 수정 없이 따랐다. 세포를 최대 4가지 상이한 밀도로 도말하였다. 기술적으로 3차례 실험을 수행하였다. 고 콘텐츠 영상화 및 이미지 분석을 수행하였다. 세포 내 형광 LDL의 강도를 계산하였다.
Amaxa Nucleofector™ Program CA-137(Lonza)을 사용하여 새로 생성된 VLDLR/PGK-GFP 및 VLDLR 세포주에서 VLDLR 발현 평가를 수행하였다. 양성 대조군으로 HEK293 세포를 사용하고, 음성 대조군으로 HUH7 세포를 사용하였다. ddPCR을 수행하여 세포당 LP1-VLDLR 이식유전자 복제물의 수를 정량화하고, 모든 세포주에서 이식유전자의 발현 수준을 정량화하였다. 웨스턴 블롯에 의해 단백질 수준에서 VLDLR의 정량화를 수행하였다.
핵 수의 정량화를 위해 회흐스트 염색을 사용하여 고 콘텐츠 영상화 및 이미지 분석을 수행하고, 인간 VLDLR에 대해 선택된 항체를 이용하여 면역세포화학을 수행하였다.
시약
표 5는 본 실험에 사용된 시약을 요약한 것이다.
Figure pct00025
결과
도 13A, 도 13B 및 도 13C는 도 12의 유전자 전달 작제물을 사용한 트랜스포사제(MLT 1 및 MLT 2)를 이용한 분석("트랜스포사제+") 및 이용하지 않은 분석("트랜스포사제-")에 대한 Huh7 세포에서의 GFP 발현의 이미지 및 FACS 플롯이다. 도 13A, 도 13B 및 도 13C는 각각 24시간(도 13A), 72시간(도 13B) 및 7일(도 13C)에서의 트랜스포사제- 분석(상단) 및 트랜스포사제+ 분석(하단)에 대한 데이터를 나타낸다.
도 13A, 도 13B 및 도 13C에 나타낸 FACs 분석 결과는 도 12의 공여체 DNA 작제물을 사용하여 생성되었다. 24시간 후, 트랜스포사제를 이용한 분석(트랜스포사제+) 및 트랜스포사제를 이용하지 않은 분석(트랜스포사제-) 둘 다에서, 둘 다에 대해 약 2%로 정량화된 GFP 발현이 거의 내지 전혀 없었다(도 13A). 72시간째에, 트랜스포사제- 형질감염된 세포에서, 0%의 GFP 발현이 있었던 반면, 72시간째에 트랜스포사제+ 세포(트랜스포사제 + LP1-VLDLR 및 PGK-GFP)에서 23%의 GFP 발현이 관찰되었다(도 13B). 7일째에, 트랜스포사제- 세포에서 7%의 GFP 발현이 있었던 반면, 72시간째에 트랜스포사제+ 세포에서 21%의 발현이 있었다(도 13C). ddPCR 및 FACS 둘 다에 의해 이 데이터를 정량화하였다.
따라서, 이들 실험에서 얻은 데이터는 도 13A, 도 13B 및 도 13C에 나타낸 바와 같이, 트랜스포사제 + PGK-GFP 및 LP1-VLDLR이 Huh7 세포를 전위시킬 수 있음을 설명한다. 이들 형질감염된 세포의 비교는 트랜스포사제- 세포 및 트랜스포사제-+ 세포에서 상당한 차이를 입증한다. 72시간째에 트랜스포사제 + LP1-VLDLR 및 PGK-GFP로 형질감염된 Huh7 세포는 23%의 GFP 발현을 나타내었다. 이는, 72시간째에 트랜스포사제 + LP1-VLDLR 및 PGK-GFP가 유해한 세포 사멸을 유발하지 않으면서 Huh7 세포를 형질감염시킬 수 있음을 나타낸다. 7일째에, 트랜스포사제+ 형질감염 세포는 여전히 21%의 GFP 발현을 나타낸 반면, 트랜스포사제- 형질감염 세포(즉, 형질감염에 트랜스포사제가 사용되지 않음)는 7일째에 7%의 GFP 발현을 나타내었다. 이 데이터를 비교할 때, 실험 결과로부터 대조군 GFP% 양성 세포를 고려할 때, 7일 후에도 상당한 14%의 GFP 발현을 여전히 나타낸다는 것을 알 수 있다.
실시예 10: LP1-VLDLR로 전위된 Huh-7 세포에서의 LDL 흡수
이 연구의 목적은 본 개시내용의 MLT 트랜스포사제(헬퍼 RNA) 및 간 특이적 프로모터인 LP1에 의해 구동되는 (코돈 최적화된) 인간 VLDLR로 세포를 형질감염시키는 공여체 DNA 작제물을 사용하여 전위된 Huh7 세포에서 LDL 흡수 및 조절을 세포 수준에서 평가하는 것이었다. 목표는 성장 2주 후에 Huh7 세포에서 VLDLR 이식유전자의 성공적인 통합을 보여주는 것이었다. 키트는 인간 LDL을 이용한다. Huh7 세포는 일반적으로 인간 VLDLR을 발현하지 않지만 LDLR은 발현한다. LDLR에 추가적으로 VLDLR을 발현하는 전위된 Huh7 세포에서 LDL 흡수의 증가가 보일 것으로 예상되었다. 배양된 Hu-7 세포로의 LDL 흡수를 검출하기 위한 형광 프로브로서 DyLight™ 550을 사용하였다.
방법론
96-웰 플레이트용으로 본 연구에 사용된 프로토콜을 설계하였다(다른 크기의 플레이트의 경우, 각각의 웰에 적용할 배지/용액의 부피를 그에 따라 조정하였음):
1. 96-웰 플레이트에 3×104개 세포/를 파종하고, 밤새 세포를 성장시킨다. HepG2 세포의 경우, 치료 전 2일 동안 세포를 성장시킨다;
2. 다음날 또는 3일째에, 세포를 실험 화합물 또는 비히클로 24시간 동안 처리한다;
3. 처리 기간이 끝나면, 배양 배지를 75 내지 100 ㎕/웰 LDL-DyLight™ 550 작업 용액으로 대체한다;
4. 추가로 3 내지 4시간 동안, 또는 실험 프로토콜에 사용된 시간 동안 37℃ 인큐베이터에서 세포를 인큐베이션한다;
5. LDL 흡수 인큐베이션이 끝나면, 배양 배지를 흡인하고 새로운 배양 배지 또는 PBS로 대체한다;
6. 여기 및 방출 파장 540 ㎚ 및 570 ㎚를 각각 측정할 수 있는 필터를 이용하여 현미경으로 LDL 흡수 정도를 검사한다.
시약
표 6은 본 실험에 사용된 시약을 요약한 것이다.
Figure pct00026
결과
Abcam LDL 흡수 분석 키트(카탈로그 번호 ab133127)를 공급업체 지침에 따라 사용하여 본 개시내용의 트랜스포사제(RNA 헬퍼) 및 LPI-VLDLR 공여체로 전위되고 14일 동안 배양물에서 유지된 Huh7 세포에서 LDL 흡수를 결정하였다. LP1-VLDLR로 뉴클레오펙션시킨 뉴클레오펙션된 HUH7 세포를 14일 동안 70% 내지 80%의 컨플루언시로 성장시켰다. 뉴클레오펙션된 세포를 LDL 흡수의 검출을 위해 LDL-Dylight™ 549로 염색하였다. 고 콘텐츠 영상화로 판독을 수행하였다.
도 14A, 도 14B, 도 14C 및 도 14D는 뉴클레오펙션되지 않은(미처리) HEK293 및 Huh7 세포에서 기준선 LDL 흡수를 설명하며: 도 14A는 미처리 HEK293 세포, LDL 흡수 단독을 나타내고; 도 14B는 미처리 Huh7 세포, LDL 흡수 단독을 나타내며; 도 14C는 염색되지 않은 미처리 HEK293 세포를 나타내고; 도 14D는 염색되지 않은 미처리 Huh7 세포를 나타낸다. 도 14A, 도 14B, 도 14C 및 도 14D에 나타낸 바와 같이, LDL 흡수 신호는 염색되지 않은 미처리 세포(0%)와 비교하여, LDL-Dylight™ 549로 염색된 뉴클레오펙션되지 않은(미처리) HEK293 및 Huh7 세포 둘 다에서 검출되었다(30% 내지 50%). HEK293 및 Huh7 세포 유형은 둘 다 저밀도 지단백빌 수용체(LDLR)를 갖는다. 정상산소 조건에서 Huh7 세포는 초저밀도 지단백질 수용체(VLDLR)를 발현하지 않는 반면, HEK293은 LDLR 및 VLDLR을 둘 다 발현한다.
도 15A, 도 15B, 도 15C, 도 15D 및 도 15E는 전위된 대 전위되지 않은 Huh7 세포에서 LDL 흡수를 설명하며: 도 15A는 비교를 위해 전위되지 않은(트랜스포사제 -) HEK293 세포를 나타내고; 도 15B는 전위되지 않은(트랜스포사제 -) Huh7 세포를 나타내며; 도 15C는 인간 LP1-VLDLR 플라스미드(pVLDLR)로 뉴클레오펙션된 전위되지 않은(트랜스포사제 -) Huh7 세포를 나타내고; 도 15D는 인간 LP1-VLDLR 플라스미드(pVLDLR)로 뉴클레오펙션된 MLT 1로 전위된 Huh7 세포를 나타내며; 도 15E는 인간 LP1-VLDLR 플라스미드(pVLDLR)로 뉴클레오펙션된 MLT 트랜스포사제 2로 전위된 Huh7 세포를 나타낸다. 나타낸 바와 같이, LDL 흡수 신호는 MLT 1 또는 MLT 트랜스포사제 2로 전위된 Huh7 세포(70% 내지 90%)와 비교하여, LDL-Dylight™ 549로 염색된 뉴클레오펙션되지 않은 HEK293 및 Huh7 세포, 및 전위되지 않은 Huh7 세포(30% 내지 50%)에서 더 작았다.
결과는 전위된 Huh7 세포의 표면에서 VLDLR의 증가가 LDL 흡수의 증가를 유발하였음을 시사한다.
실시예 11: ldlr-/- 마우스에서 LNP LP1-루시페라제/트랜스포사제 BLI의 약력학적 용량 범위
이 연구의 목적은 동일한 배경 균주의 야생형(ldlr+/+ 및 ldlr-/-) C57BL/6 마우스에서 생체내 형광 표지된 지질 나노입자의 간 흡수를 비교하는 것이었다. 테스트 물품의 간내 주사 후 2개의 시점(제3일 및 제5일)에서 전신 생물발광 영상화(BLI)에 의해 루시페라제의 발현을 기록하였다.
이 연구는 이온화 가능한 리피도이드, 콜레스테롤, 인지질 및 PEG-지질과 같은 지질 나노입자(LNP) 제형을 사용하였다.
동물 그룹
본 연구는 목적 사육된 미경험 마우스인, 계통 ldlr-/- 및 야생형(ldlr+/+) C57BL/6J(Jackson Laboratories, 미국 메인주 바하버 소재)를 사용하였다. 수컷 수: C57BL/6J 야생형(ldlr+/+) 16마리(교체 2마리 추가) / ldlr-/- 넉아웃 16마리(교체 2마리 추가). 투약 개시 시점의 목표 연령: 약 10주령; 도달 시 목표 무게: 26.9 + 1.7g.
이 연구에 사용된 3개의 마우스 코호트가 표 7, 표 8 및 표 9에 기재되어 있다.
Figure pct00027
Figure pct00028
Figure pct00029
시약 및 테스트 물품
표 10은 본 실험에 사용된 시약을 요약한 것이다.
Figure pct00030
본 연구에 사용된 비히클은 인산염-완충 식염수(PBS), pH 7.4, Ca2+ 또는 Mg2+ 없음(약 4℃에서 저장함)이었다.
본 연구에 사용된 테스트 물품은 다음과 같았다:
Figure pct00031
PBS: Ca 또는 Mg가 없는 1× PBS 완충액, 주사용 멸균 용액(27G-31G 주사 바늘을 사용함).
Figure pct00032
테스트 물품 1: 빈 LNP.
Figure pct00033
테스트 물품 2: LNP LP1- 루시페라제 2/MLT 트랜스포사제 2(750ug 핵산/㎖)(스톡).
표 11은 본 실험에 사용된 테스트 물품의 용량을 요약한 것이다.
Figure pct00034
결과
총 8개 그룹의 마우스에 상이한 용량의 테스트 물품(LP1-vldlr+ MLT 트랜스포사제) 또는 빈 LNP(허위 수술)를 주사하였다. 도 16A 및 도 16B는 제3일(도 16A) 및 제5일(도 16B)의 코호트 1에 대한 BLI를 나타낸다. 도 17A 및 도 17B는 제3일(도 17A) 및 제5일(도 17B)의 코호트 2에 대한 BLI를 나타낸다. 도 18A 및 도 18B는 제3일(도 18A) 및 제5일(도 18B)의 코호트 3에 대한 BLI를 나타낸다. 도 19는 장기간 유지(각각 26일 및 33일) 후 그룹 6 및 그룹 8에 속하는 동물의 BLI를 나타낸다.
흥미롭게도, 야생형 마우스뿐만 아니라, ldlr-/- 마우스(그룹 5, 6, 7, 8)도 도 16A, 도 16B, 도 17A, 도 17B, 도 18A, 도 18B 및 도 19에 나타낸 바와 같이 공여체 DNA의 상당한 흡수를 나타내었다. 빈 LNP는 wt 또는 ldlr-/- 마우스에 치명적인 영향을 미치지 않았다(도 16A, 도 16B, 도 17A, 도 17B).
고용량의 LNP는 제3일 및 제5일 둘 다에서 wt 마우스에서 공여체 DNA의 성공적인 전위를 나타내었지만, ldlr-/- 마우스에서는 어떠한 유망한 효과도 나타내지 않았다(도 17A 및 도 17B). 그러나, 고용량의 LNP는 심지어 wt 마우스(그룹 2)에서도 제5일에 감소하는 발광 패턴을 나타내었다(도 17B). 반면, 중간 용량은 두 날 모두 야생형(그룹 3)에서 여전히 효과적이었지만 제5일에 ldlr-/-(그룹 6) 마우스에서는 효능을 나타내지 않았다(도 17B). 흥미롭게도, 저용량은 wt 및 ldlr-/- 마우스 둘 다에 대해 상당한 효과를 나타내었다(도 18A 및 도 18B). 중간 및 저용량의 테스트 물품을 받은 두 그룹의 동물(그룹 6 및 8)을 26일 및 33일 동안 더 오래 머물게 했을 때, 저용량을 받은 동물(그룹 8)은 안정적으로 통합된 루시페라제 DNA로부터 나오는 계속된 발광 발현을 나타내었다(도 20). 그룹 2에서 1마리 동물, 그룹 5에서 2마리 동물, 및 그룹 6에서 1마리 동물이 수술 절차로 인해 사망하였다.
결론적으로, 저용량의 테스트 물품(0.35 ㎎/㎏)이 가장 우수한 발광 결과를 나타내었다. 낮은 투약은 상대적으로 더 긴 기간 동안 가장 우수한 통합 또는 전위 효율을 나타내었다.
실시예 11: 안정적인 국소 간 통합
도 20의 좌측 패널은 6.25 ug의 DNA의 총 간 용량으로 간의 좌측엽에 주사된 공여체 DNA를 단독으로 포함하는 50uL의 LNP를 투여하고 주사 후 제26일에 영상화한 ldlr-/- 동물을 나타낸다. 도 20의 우측 패널은 9.375 ug의 핵산(DNA 6.25 ug, 3.125 ug RNA)의 총 간 용량으로 간의 좌측엽에 주사된 공여체 DNA 및 헬퍼 RNA를 둘 다 포함하는 50uL의 LNP를 투여하고 주사 후 제26일에 영상화한 ldlr-/- 동물을 나타낸다. 도 20의 결과는 LP1-루시페라제 2/MLT 트랜스포사제를 포함하는 간-특이적 LNP 제형이 ldlr-/- 동물에서 간의 좌측엽에 국소 및 표적 주사에 의해 투여될 때, 공여체 DNA의 안정적인 국소 간 통합이 테스트 물품의 단일 용량 후에 발생함을 설명한다. 추가적으로, 간외 통합의 증가는 없으며, 이는 본 접근법에 의해 전달되는 표적 요법을 입증한다.
실시예 12: ldlr -/- 마우스에서 간-특이적 LNP 제형의 안전성 및 효능 평가
본 연구에서, ldlr-/- 마우스에 LP1-vldlr/MLT 트랜스포사제를 사용하는 간-특이적 LNP 제형을 간의 좌측엽에 직접 주사함으로써 투여하였다. 도 21A는 미처리(공여체 단독) 마우스와 비교하여 처리된 ldlr-/- 마우스에서, 제7일(D7) 및 제15일(D15)에 기준 범위와 비교하여 트라이글리세라이드(㎎/dL)의 저하를 설명하는 효능 평가 결과를 나타낸다. 도 21B는 간 기능을 나타내는 테스트 동물의 혈액 중 간 효소인 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT)(단위: u/L)를 측정한 안전성 평가 결과를 나타낸다. 도 21B에서, 데이터는 미처리, 처리, 및 PBS 그룹에 대해 나타나 있으며, 각각은 참조("1") 범위, 및 D7("2")과 D15("3")에 대한 데이터를 포함한다.
이러한 결과는 트라이글리세라이드가 정상 기준 범위와 비교하여 약 40% 저하를 나타냄을 입증한다. 어떠한 LDL-C의 단기적인 변화도 관찰되지 않았다. 또한, 직접 간 주사로 인한 ALT의 초기 상승(도 21A, 제7일)은 이후에 정상 기준 범위(도 21A, 제15일)로 되돌아간다.
정의
하기 정의는 본 명세서에 개시된 발명과 관련하여 사용된다. 달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다.
용어 "생체내"는 대상체의 신체에서 일어나는 사건을 지칭한다.
용어 "생체외"는 대상체의 신체에서 제거된 세포, 조직 및/또는 기관에 대해 절차를 수행하거나 치료하는 것을 수반하는 사건을 지칭한다. 적절하게는, 세포, 조직 및/또는 기관은 치료 또는 수술 방법으로 대상체의 신체로 되돌아갈 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "변이체"는 특정 위치에서 하나 이상의 치환, 결실 및/또는 첨가를 통해 참조의 핵산 또는 아미노산 서열과 상이한 핵산 또는 아미노산 서열을 포함하는 핵산 또는 단백질을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 변이체는 하나 이상의 보존적 치환을 포함할 수 있다. 보존적 치환은, 예를 들어 유사하게 하전되거나 하전되지 않은 아미노산의 치환을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "담체" 또는 "비히클"은 약물 투여에 적합한 담체 물질을 지칭한다. 본 명세서에서 유용한 담체 및 비히클은 당업계에 알려진 임의의 이와 같은 물질, 예를 들어 임의의 액체, 겔, 용매, 액체 희석제, 가용화제, 계면활성제 등을 포함하며, 이는 무독성이고, 조성물의 다른 구성요소와 해로운 방식으로 상호작용하지 않는다.
어구 "약제학적으로 허용 가능한"은 적절한 의학적 판단의 범주 내에서 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 합리적인 이익/위험 비율에 상응하는 기타 문제 또는 합병증 없이 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합한 화합물, 물질, 조성물, 및/또는 투약 형태를 지칭한다.
용어 "약제학적으로 허용 가능한 담체" 또는 "약제학적으로 허용 가능한 부형제"는 임의의 그리고 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제, 및 불활성 성분을 포함하는 것으로 의도된다. 활성 약제학적 성분에 대한 이와 같은 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 약제학적으로 허용 가능한 부형제의 사용은 당업계에 잘 알려져 있다. 임의의 통상적인 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 약제학적으로 허용 가능한 부형제가 활성 약제학적 성분과 양립할 수 없는 경우를 제외하고, 본 발명의 치료 조성물에서의 이의 사용이 고려된다. 다른 약물과 같은 추가적인 활성 약제학적 성분도 또한 기재된 조성물 및 방법에 포함될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 단수 표현은 하나 이상을 의미할 수 있다.
또한, 참조된 숫자 표시와 관련하여 사용될 때 용어 "약"은 참조된 숫자 표시에 해당 참조된 숫자 표시의 최대 10%를 더하거나 뺀 것을 의미한다. 예를 들어, "약 50"이라는 언어는 45 내지 55의 범위를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 단어 "포함하다", 및 이의 변형어는, 목록에 있는 항목의 언급이 또한 이 기술의 조성물 및 방법에 유용할 수 있는 다른 유사 항목을 배제하는 것이 아니도록, 비제한적인 것으로 의도된다. 유사하게, 용어 "할 수 있다" 및 "가능할 수 있다" 및 이의 변형어는, 실시형태가 특정 요소 또는 특징을 포함할 수 있다는 언급이 해당 요소 또는 특징을 포함하지 않는 본 기술의 다른 실시형태를 배제하는 것이 아니도록, 비제한적인 것으로 의도된다.
"비롯하는", "함유하는", 또는 "갖는"과 같은 용어의 동의어인 개방형 용어 "포함하는"이 본 명세서에서 발명을 기재하고 청구하는 데 사용되지만, 본 발명, 또는 이의 실시형태는 대안적으로 "~로 이루어진" 또는 "본질적으로 ~로 이루어진"과 같은 대체 용어를 사용하여 기재될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 단어 "바람직한" 및 "바람직하게는"은 특정 상황 하에서 특정 이점을 제공하는 기술의 실시형태를 지칭한다. 그러나, 동일하거나 다른 상황 하에서 다른 실시형태가 또한 바람직할 수 있다. 또한, 하나 이상의 바람직한 실시형태의 언급은 다른 실시형태가 유용하지 않다는 것을 의미하지 않으며, 기술의 범주로부터 다른 실시형태를 배제하는 것으로 의도되지 않는다.
균등물
본 발명이 이의 특정 실시형태와 관련하여 기재되었지만, 추가 변형이 가능하고 본 출원은 일반적으로 본 발명의 원리를 따르고 본 발명이 속하는 기술 분야에서 알려지거나 관례적인 실무 내에 있는 그리고 본 명세서에 제시되고 하기와 같이 첨부된 청구범위의 범주에서 필수적인 특징에 적용될 수 있는 본 개시내용으로부터의 이러한 이탈을 포함하는 본 발명의 임의의 변형, 사용, 또는 각색을 포함하는 것으로 의도됨이 이해될 것이다.
당업자는 단지 일상적인 실험을 사용하여 본 명세서에 구체적으로 기재된 특정 실시형태에 대한 다수의 등가물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이와 같은 등가물은 하기 청구범위의 범주에 포함되는 것으로 의도된다.
참조에 의한 원용
본 명세서에 참조된 모든 특허 및 간행물은 본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용된다.
본 명세서에 논의된 간행물은 본 출원의 출원일 이전의 개시내용을 위해서만 제공된다. 본 명세서의 어떠한 내용도 본 발명이 선행 발명으로 인해 이와 같은 간행물보다 선행할 자격이 없음을 인정하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 모든 제목은 단순히 구성을 위한 것이며 어떤 방식으로든 개시내용을 제한하려는 것으로 의도되지 않는다. 임의의 개별 섹션의 내용은 모든 섹션에 동일하게 적용될 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> Saliogen Therapeutics, Inc. <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATMENT OF FAMILIAL HYPERCHOLESTEROLEMIA AND ELEVATED LOW-DENSITY LIPOPROTEIN CHOLESTEROL <130> SAL-001PC/126933-5001 <140> PCT/US2021/030006 <141> 2021-04-29 <150> US 63/017,424 <151> 2020-04-29 <160> 15 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5173 <212> DNA <213> human LDLR transcript variant 1 mRNA <400> 1 gtgcaatcgc gggaagccag ggtttccagc taggacacag caggtcgtga tccgggtcgg 60 gacactgcct ggcagaggct gcgagcatgg ggccctgggg ctggaaattg cgctggaccg 120 tcgccttgct cctcgccgcg gcggggactg cagtgggcga cagatgcgaa agaaacgagt 180 tccagtgcca agacgggaaa tgcatctcct acaagtgggt ctgcgatggc agcgctgagt 240 gccaggatgg ctctgatgag tcccaggaga cgtgcttgtc tgtcacctgc aaatccgggg 300 acttcagctg tgggggccgt gtcaaccgct gcattcctca gttctggagg tgcgatggcc 360 aagtggactg cgacaacggc tcagacgagc aaggctgtcc ccccaagacg tgctcccagg 420 acgagtttcg ctgccacgat gggaagtgca tctctcggca gttcgtctgt gactcagacc 480 gggactgctt ggacggctca gacgaggcct 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Glu Leu Val Gln Pro Ser Gly Lys Asn 690 695 700 Trp Cys Glu Asp Asp Met Glu Asn Gly Gly Cys Glu Tyr Leu Cys Leu 705 710 715 720 Pro Ala Pro Gln Ile Asn Asp His Ser Pro Lys Tyr Thr Cys Ser Cys 725 730 735 Pro Asn Gly Tyr Asn Leu Glu Glu Asn Gly Arg Glu Cys Gln Ser Thr 740 745 750 Ser Thr Pro Val Thr Tyr Ser Glu Thr Lys Asp Ile Asn Thr Thr Asp 755 760 765 Ile Leu Arg Thr Ser Gly Leu Val Pro Gly Gly Ile Asn Val Thr Thr 770 775 780 Ala Val Ser Glu Val Ser Val Pro Pro Lys Gly Thr Ser Ala Ala Trp 785 790 795 800 Ala Ile Leu Pro Leu Leu Leu Leu Val Met Ala Ala Val Gly Gly Tyr 805 810 815 Leu Met Trp Arg Asn Trp Gln His Lys Asn Met Lys Ser Met Asn Phe 820 825 830 Asp Asn Pro Val Tyr Leu Lys Thr Thr Glu Glu Asp Leu Ser Ile Asp 835 840 845 Ile Gly Arg His Ser Ala Ser Val Gly His Thr Tyr Pro Ala Ile Ser 850 855 860 Val Val Ser Thr Asp Asp Asp Leu Ala 865 870 <210> 9 <211> 572 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 9 Met Ala Gln His Ser Asp Tyr Ser Asp Asp Glu Phe 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215 220 Ile Asn Ile Tyr Lys Pro His Gln Gln Leu Ser Leu Asp Glu Gly Ile 225 230 235 240 Val Pro Trp Arg Gly Arg Leu Phe Phe Arg Val Tyr Asn Ala Gly Lys 245 250 255 Ile Val Lys Tyr Gly Ile Leu Val Arg Leu Leu Cys Glu Ser Asp Thr 260 265 270 Gly Tyr Ile Cys Asn Met Glu Ile Tyr Cys Gly Glu Gly Lys Arg Leu 275 280 285 Leu Glu Thr Ile Gln Thr Val Val Ser Pro Tyr Thr Asp Ser Trp Tyr 290 295 300 His Ile Tyr Met Asp Asn Tyr Tyr Asn Ser Val Ala Asn Cys Glu Ala 305 310 315 320 Leu Met Lys Asn Lys Phe Arg Ile Cys Gly Thr Ile Arg Lys Asn Arg 325 330 335 Gly Ile Pro Lys Asp Phe Gln Thr Ile Ser Leu Lys Lys Gly Glu Thr 340 345 350 Lys Phe Ile Arg Lys Asn Asp Ile Leu Leu Gln Val Trp Gln Ser Lys 355 360 365 Lys Pro Val Tyr Leu Ile Ser Ser Ile His Ser Ala Glu Met Glu Glu 370 375 380 Ser Gln Asn Ile Asp Arg Thr Ser Lys Lys Lys Ile Val Lys Pro Asn 385 390 395 400 Ala Leu Ile Asp Tyr Asn Lys His Met Lys Gly Val Asp Arg Ala Asp 405 410 415 Gln Tyr Leu Ser Tyr Tyr Ser Ile Leu Arg Arg Thr Val Lys Trp Thr 420 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tcgagggcgg ccgggaagag tggagccacg tggacaaccc tcctgttctg 240 gaagattttc tgggccatca gggcctgaac accgacgccg tgatcaacaa catcgaggat 300 gccgtgaagc tgttcatagg agatgatttc tttgagttcc tggtcgagga atccaaccgc 360 tattacaacc agaatagaaa caacttcaag ctgagcaaga aaagcctgaa gtggaaggac 420 atcacccctc aggagatgaa aaagttcctg ggactgatcg ttctgatggg acaggtgcgg 480 aaggacagaa gggatgatta ctggacaacc gaaccttgga ccgagacccc ttactttggc 540 aagaccatga ccagagacag attcagacag atctggaaag cctggcactt caacaacaat 600 gctgatatcg tgaacgagtc tgatagactg tgtaaagtgc ggccagtgtt ggattacttc 660 gtgcctaagt tcatcaacat ctataagcct caccagcagc tgagcctgga tgaaggcatc 720 gtgccctggc ggggcagact gttcttcaga gtgtacaatg ctggcaagat cgtcaaatac 780 ggcatcctgg tgcgccttct gtgcgagagc gatacaggct acatctgtaa tatggaaatc 840 tactgcggcg agggcaaaag actgctggaa accatccaga ccgtcgtttc cccttatacc 900 gacagctggt accacatcta catggacaac tactacaatt ctgtggccaa ctgcgaggcc 960 ctgatgaaga acaagtttag aatctgcggc acaatcagaa aaaacagagg catccctaag 1020 gacttccaga ccatctctct gaagaagggc gaaaccaagt tcatcagaaa gaacgacatc 1080 ctgctccaag tgtggcagtc caagaaaccc gtgtacctga tcagcagcat ccatagcgcc 1140 gagatggaag aaagccagaa catcgacaga acaagcaaga agaagatcgt gaagcccaat 1200 gctctgatcg actacaacaa gcacatgaaa ggcgtggacc gggccgacca gtacctgtct 1260 tattactcta tcctgagaag aacagtgaaa tggaccaaga gactggccat gtacatgatc 1320 aattgcgccc tgttcaacag ctacgccgtg tacaagtccg tgcgacaaag aaaaatggga 1380 ttcaagatgt tcctgaagca gacagccatc cactggctga cagacgacat tcctgaggac 1440 atggacattg tgccagatct gcaacctgtg cccagcacct ctggtatgag agctaagcct 1500 cccaccagcg atcctccatg tagactgagc atggacatgc ggaagcacac cctgcaggcc 1560 atcgtcggca gcggcaagaa gaagaacatc cttagacggt gcagggtgtg cagcgtgcac 1620 aagctgcgga gcgagactcg gtacatgtgc aagttttgca acattcccct gcacaaggga 1680 gcctgcttcg agaagtacca caccctgaag aattactag 1719 <210> 11 <211> 1719 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 11 atggcccagc acagcgacta cagcgacgac gagttctgtg ccgataagct gagtaactac 60 agctgcgaca gcgacctgga aaacgccagc acatccgacg aggacagctc tgacgacgag 120 gtgatggtgc ggcccagaac cctgagacgg agaagaatca gcagctctag cagcgactct 180 gaatccgaca tcgagggcgg ccgggaagag tggagccacg tggacaaccc tcctgttctg 240 gaagattttc tgggccatca gggcctgaac accgacgccg tgatcaacaa catcgaggat 300 gccgtgaagc tgttcatagg agatgatttc tttgagttcc tggtcgagga atccaaccgc 360 tattacaacc agaagagaaa caacttcaag ctgagcaaga aaagcctgaa gtggaaggac 420 atcacccctc aggagatgaa aaagttcctg ggactgatcg ttctgatggg acaggtgcgg 480 aaggacagaa gggatgatta ctggacaacc gaaccttgga ccgagacccc ttactttggc 540 aagaccatga ccagagacag attcagacag atctggaaag cctggcactt caacaacaat 600 gctgatatcg tgaacgagtc tgatagactg tgtaaagtgc ggccagtgtt ggattacttc 660 gtgcctaagt tcatcaacat ctataagcct caccagcagc tgagcctgga tgaaggcatc 720 gtgccctggc ggggcagact gttcttcaga gtgtacaatg ctggcaagat cgtcaaatac 780 ggcatcctgg tgcgccttct gtgcgagagc gatacaggct acatctgtaa tatggaaatc 840 tactgcggcg agggcaaaag actgctggaa accatccaga ccgtcgtttc cccttatacc 900 gacagctggt accacatcta catggacaac tactacaatt ctgtggccaa ctgcgaggcc 960 ctgatgaaga acaagtttag aatctgcggc acaatcagaa aaaacagagg catccctaag 1020 gacttccaga ccatctctct gaagaagggc gaaaccaagt tcatcagaaa gaacgacatc 1080 ctgctccaag tgtggcagtc caagaaaccc gtgtacctga tcagcagcat ccatagcgcc 1140 gagatggaag aaagccagaa catcgacaga acaagcaaga agaagatcgt gaagcccaat 1200 gctctgatcg actacaacaa gcacatgaaa ggcgtggacc gggccgacca gtacctgtct 1260 tattactcta tcctgagaag aacagtgaaa tggaccaaga gactggccat gtacatgatc 1320 aattgcgccc tgttcaacag ctacgccgtg tacaagtccg tgcgacaaag aaaaatggga 1380 ttcaagatgt tcctgaagca gacagccatc cactggctga cagacgacat tcctgaggac 1440 atggacattg tgccagatct gcaacctgtg cccagcacct ctggtatgag agctaagcct 1500 cccaccagcg atcctccatg tagactgagc atggacatgc ggaagcacac cctgcaggcc 1560 atcgtcggca gcggcaagaa gaagaacatc cttagacggt gcagggtgtg cagcgtgcac 1620 aagctgcgga gcgagactcg gtacatgtgc aagttttgca acattcccct gcacaaggga 1680 gcctgcttcg agaagtacca caccctgaag aattactag 1719 <210> 12 <211> 572 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> 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195 200 205 Arg Leu Cys Lys Val Arg Pro Val Leu Asp Tyr Phe Val Pro Lys Phe 210 215 220 Ile Asn Ile Tyr Lys Pro His Gln Gln Leu Ser Leu Asp Glu Gly Ile 225 230 235 240 Val Pro Trp Arg Gly Arg Leu Phe Phe Arg Val Tyr Asn Ala Gly Lys 245 250 255 Ile Val Lys Tyr Gly Ile Leu Val Arg Leu Leu Cys Glu Ser Asp Thr 260 265 270 Gly Tyr Ile Cys Asn Met Glu Ile Tyr Cys Gly Glu Gly Lys Arg Leu 275 280 285 Leu Glu Thr Ile Gln Thr Val Val Ser Pro Tyr Thr Asp Ser Trp Tyr 290 295 300 His Ile Tyr Met Asp Asn Tyr Tyr Asn Ser Val Ala Asn Cys Glu Ala 305 310 315 320 Leu Met Lys Asn Lys Phe Arg Ile Cys Gly Thr Ile Arg Lys Asn Arg 325 330 335 Gly Ile Pro Lys Asp Phe Gln Thr Ile Ser Leu Lys Lys Gly Glu Thr 340 345 350 Lys Phe Ile Arg Lys Asn Asp Ile Leu Leu Gln Val Trp Gln Ser Lys 355 360 365 Lys Pro Val Tyr Leu Ile Ser Ser Ile His Ser Ala Glu Met Glu Glu 370 375 380 Ser Gln Asn Ile Asp Arg Thr Ser Lys Lys Lys Ile Val Lys Pro Asn 385 390 395 400 Ala Leu Ile Asp Tyr Asn Lys His Met Lys Gly Val Asp Arg Ala Asp 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gtgatggtgc ggcccagaac cctgagacgg agaagaatca gcagctctag cagcgactct 180 gaatccgaca tcgagggcgg ccgggaagag tggagccacg tggacaaccc tcctgttctg 240 gaagattttc tgggccatca gggcctgaac accgacgccg tgatcaacaa catcgaggat 300 gccgtgaagc tgttcatagg agatgatttc tttgagttcc tggtcgagga atccaaccgc 360 tattacaacc agaatagaaa caacttcaag ctgagcaaga aaagcctgaa gtggaaggac 420 atcacccctc aggagatgaa aaagttcctg ggactgatcg ttctgatggg acaggtgcgg 480 aaggacagaa gggatgatta ctggacaacc gaaccttgga ccgagacccc ttactttggc 540 aagaccatga ccagagacag attcagacag atctggaaag cctggcactt caacaacaat 600 gctgatatcg tgaacgagtc tgatagactg tgtaaagtgc ggccagtgtt ggattacttc 660 gtgcctaagt tcatcaacat ctataagcct caccagcagc tgagcctgga tgaaggcatc 720 gtgccctggc ggggcagact gttcttcaga gtgtacaatg ctggcaagat cgtcaaatac 780 ggcatcctgg tgcgccttct gtgcgagagc gatacaggct acatctgtaa tatggaaatc 840 tactgcggcg agggcaaaag actgctggaa accatccaga ccgtcgtttc cccttatacc 900 gacagctggt accacatcta catggacaac tactacaatt ctgtggccaa ctgcgaggcc 960 ctgatgaaga acaagtttag aatctgcggc acaatcagaa aaaacagagg catccctaag 1020 gacttccaga ccatctctct gaagaagggc gaaaccaagt tcatcagaaa gaacgacatc 1080 ctgctccaag tgtggcagtc caagaaaccc gtgtacctga tcagcagcat ccatagcgcc 1140 gagatggaag aaagccagaa catcgacaga acaagcaaga agaagatcgt gaagcccaat 1200 gctctgatcg actacaacaa gcacatgaaa ggcgtggacc gggccgacca gtacctgtct 1260 tattactcta tcctgagaag aacagtgaaa tggaccaaga gactggccat gtacatgatc 1320 aattgcgccc tgttcaacag ctacgccgtg tacaagtccg tgcgacaaag aaaaatggga 1380 ttcaagatgt tcctgaagca gacagccatc cactggctga cagacgacat tcctgaggac 1440 atggacattg tgccagatct gcaacctgtg cccagcacct ctggtatgag agctaagcct 1500 cccaccagcg atcctccatg tagactgagc atggacatgc ggaagcacac cctgcaggcc 1560 atcgtcggca gcggcaagaa gaagaacatc cttagacggt gcagggtgtg cagcgtgcac 1620 aagctgcgga gcgagactcg gtacatgtgc aagttttgca acattcccct gcacaaggga 1680 gcctgcttcg agaagtacca caccctgaag aattactag 1719 <210> 14 <211> 572 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 14 Met Ala Gln His Ser Asp Tyr Pro Asp Asp Glu Phe Arg Ala Asp Lys 1 5 10 15 Leu Ser Asn Tyr Ser Cys Asp Ser Asp Leu Glu Asn Ala Ser Thr Ser 20 25 30 Asp Glu Asp Ser Ser Asp Asp Glu Val Met Val Arg Pro Arg Thr Leu 35 40 45 Arg Arg Arg Arg Ile Ser Ser Ser Ser Ser Asp Ser Glu Ser Asp Ile 50 55 60 Glu Gly Gly Arg Glu Glu Trp Ser His Val Asp Asn Pro Pro Val Leu 65 70 75 80 Glu Asp Phe Leu Gly His Gln Gly Leu Asn Thr Asp Ala Val Ile Asn 85 90 95 Asn Ile Glu Asp Ala Val Lys Leu Phe Ile Gly Asp Asp Phe Phe Glu 100 105 110 Phe Leu Val Glu Glu Ser Asn Arg Tyr Tyr Asn Gln Asn Arg Asn Asn 115 120 125 Phe Lys Leu Ser Lys Lys Ser Leu Lys Trp Lys Asp Ile Thr Pro Gln 130 135 140 Glu Met Lys Lys Phe Leu Gly Leu Ile Val Leu Met Gly Gln Val Arg 145 150 155 160 Lys Asp Arg Arg Asp Asp Tyr Trp Thr Thr Glu Pro Trp Thr Glu Thr 165 170 175 Pro Tyr Phe Gly Lys Thr Met Thr Arg Asp Arg Phe Arg Gln Ile Trp 180 185 190 Lys Ala Trp His Phe Asn Asn Asn Ala Asp Ile Val Asn Glu Ser Asp 195 200 205 Arg Leu Cys Lys Val Arg Pro Val Leu Asp Tyr Phe Val Pro Lys Phe 210 215 220 Ile Asn Ile Tyr Lys Pro His Gln Gln Leu Ser Leu Asp Glu Gly Ile 225 230 235 240 Val Pro Trp Arg Gly Arg Leu Phe Phe Arg Val Tyr Asn Ala Gly Lys 245 250 255 Ile Val Lys Tyr Gly Ile Leu Val Arg Leu Leu Cys Glu Ser Asp Thr 260 265 270 Gly Tyr Ile Cys Asn Met Glu Ile Tyr Cys Gly Glu Gly Lys Arg Leu 275 280 285 Leu Glu Thr Ile Gln Thr Val Val Ser Pro Tyr Thr Asp Ser Trp Tyr 290 295 300 His Ile Tyr Met Asp Asn Tyr Tyr Asn Ser Val Ala Asn Cys Glu Ala 305 310 315 320 Leu Met Lys Asn Lys Phe Arg Ile Cys Gly Thr Ile Arg Lys Asn Arg 325 330 335 Gly Ile Pro Lys Asp Phe Gln Thr Ile Ser Leu Lys Lys Gly Glu Thr 340 345 350 Lys Phe Ile Arg Lys Asn Asp Ile Leu Leu Gln Val Trp Gln Ser Lys 355 360 365 Lys Pro Val Tyr Leu Ile Ser Ser Ile His Ser Ala Glu Met Glu Glu 370 375 380 Ser Gln Asn Ile Asp Arg Thr Ser Lys Lys Lys Ile Val Lys Pro Asn 385 390 395 400 Ala Leu Ile Asp Tyr Asn Lys His Met Lys Gly Val Asp Arg Ala Asp 405 410 415 Gln Tyr Leu Ser Tyr Tyr Ser Ile Leu Arg Arg Thr Val Lys Trp Thr 420 425 430 Lys Arg Leu Ala Met Tyr Met Ile Asn Cys Ala Leu Phe Asn Ser Tyr 435 440 445 Ala Val Tyr Lys Ser Val Arg Gln Arg Lys Met Gly Phe Lys Met Phe 450 455 460 Leu Lys Gln Thr Ala Ile His Trp Leu Thr Asp Asp Ile Pro Glu Asp 465 470 475 480 Met Asp Ile Val Pro Asp Leu Gln Pro Val Pro Ser Thr Ser Gly Met 485 490 495 Arg Ala Lys Pro Pro Thr Ser Asp Pro Pro Cys Arg Leu Ser Met Asp 500 505 510 Met Arg Lys His Thr Leu Gln Ala Ile Val Gly Ser Gly Lys Lys Lys 515 520 525 Asn Ile Leu Arg Arg Cys Arg Val Cys Ser Val His Lys Leu Arg Ser 530 535 540 Glu Thr Arg Tyr Met Cys Lys Phe Cys Asn Ile Pro Leu His Lys Gly 545 550 555 560 Ala Cys Phe Glu Lys Tyr His Thr Leu Lys Asn Tyr 565 570 <210> 15 <211> 545 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 15 ccctaaaatg ggcaaacatt gcaagcagca aacagcaaac acacagccct ccctgcctgc 60 tgaccttgga gctggggcag aggtcagaga cctctctggg cccatgccac ctccaacatc 120 cactcgaccc cttggaattt cggtggagag gagcagaggt tgtcctggcg tggtttaggt 180 agtgtgagag gggaatgact cctttcggta agtgcagtgg aagctgtaca ctgcccaggc 240 aaagcgtccg ggcagcgtag gcgggcgact cagatcccag ccagtggact tagcccctgt 300 ttgctcctcc gataactggg gtgaccttgg ttaatattca ccagcagcct cccccgttgc 360 ccctctggat ccactgctta aatacggacg aggacagggc cctgtctcct cagcttcagg 420 caccaccact gacctgggac agtgaatccg gactctaagg taaatataaa atttttaagt 480 gtataatgtg ttaaactact gattctaatt gtttgtgtat tttagattcc aacctatgga 540 actga 545

Claims (67)

  1. 하기를 포함하는, 유전자 전달 작제물을 포함하는 조성물:
    (a) 초저밀도 지단백질 수용체(VLDLR) 단백질 또는 저밀도 지단백질 수용체(LDLR) 단백질 또는 이의 기능적 단편을 인코딩하는 핵산;
    (b) 간-특이적 프로모터; 및
    (c) 하나 이상의 트랜스포사제 인식 부위 및 하나 이상의 역 말단 반복부(inverted terminal repeat: ITR) 또는 말단 서열을 포함하는 비-바이러스 벡터.
  2. 제1항에 있어서, 상기 유전자 전달 작제물은 DNA를 포함하는, 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 유전자 전달 작제물은 코돈 최적화된 것인, 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VLDLR 단백질은 인간 VLDLR 단백질 또는 이의 기능적 단편인, 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 인간 VLDLR 단백질 또는 이의 기능적 단편을 인코딩하는 핵산은 서열번호 6의 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 93%, 또는 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 97%, 또는 적어도 약 98% 동일성을 갖는 변이체를 포함하는, 조성물.
  6. 제4항에 있어서, 상기 인간 VLDLR 단백질 또는 이의 기능적 단편을 인코딩하는 핵산은 서열번호 4의 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 5의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 93%, 또는 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 97%, 또는 적어도 약 98% 동일성을 갖는 변이체를 포함하는, 조성물.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LDLR 단백질은 인간 LDLR 단백질 또는 이의 기능적 단편인, 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 인간 LDLR 단백질 또는 이의 기능적 단편을 인코딩하는 핵산은 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 단백질, 또는 이와 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 93%, 또는 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 97%, 또는 적어도 약 98% 동일성을 갖는 변이체를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 인간 LDLR 단백질 또는 이의 기능적 단편을 인코딩하는 핵산은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 93%, 또는 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 97%, 또는 적어도 약 98% 동일성을 갖는 변이체를 포함하는, 조성물.
  10. 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 인간 LDLR 단백질 또는 이의 기능적 단편은 서열번호 3의 아미노산 서열을 참조하여 L18F, K830R, 및 C839A로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는, 조성물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 간-특이적 프로모터는 LP1 프로모터, 선택적으로 인간 LP1 프로모터이거나, 또는 간-특이적 프로모터는 표 1의 프로모터인, 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 LP1 프로모터는,
    (a) 인간 항트립신 프로모터, 인간 ApoE/HCR1 인핸서 및/또는 SV40 인트론; 및/또는
    (b) 서열번호 15의 핵산 서열, 또는 이와 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 93%, 또는 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 97%, 또는 적어도 약 98% 동일성을 갖는 변이체
    를 포함하는, 조성물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비-바이러스 벡터는 DNA 플라스미드이고 선택적으로
    상기 DNA 플라스미드는 인접 유전자의 활성화 또는 불활성화를 방지하거나 완화하는 하나 이상의 절연체 서열을 포함하는, 조성물.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 ITR 또는 말단 서열은 선택적으로 TTAA 반복 서열을 포함하는, 피기백(piggyBac)-유사 트랜스포존의 것이고/이거나,
    상기 ITR 또는 말단 서열은 VLDLR 단백질 또는 LDLR 단백질 또는 이의 기능적 단편을 인코딩하는 핵산에 측접하는, 조성물.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 전단백질 전환효소 서브틸리신 켁신 9(PCSK9)를 표적으로 하는 마이크로RNA를 인코딩하는 핵산 작제물을 더 포함하는, 조성물.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 트랜스포사제를 인코딩하는 핵산 작제물, 선택적으로 트랜스포사제를 인코딩하는 mRNA를 더 포함하는, 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 상기 트랜스포사제는 마이오티스 루시푸구스(Myotis lucifugus)로부터 유래된 것인, 조성물.
  18. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 트랜스포사제를 인코딩하는 핵산 작제물, 선택적으로 트랜스포사제를 인코딩하는 DNA를 더 포함하는, 조성물.
  19. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 트랜스포사제는 봄빅스 모리(Bombyx mori), 제노푸스 트로피칼리스(Xenopus tropicalis), 트리코플루시아 니(Trichoplusia ni), 리놀로푸스 페룸에퀴눔(Rhinolophus ferrumequinum), 로우세투스 아에집티아쿠스(Rousettus aegyptiacus), 필로스토무스 디스콜로르(Phyllostomus discolor), 마이오티스 마이오티스(Myotis myotis), 마이오티스 루시푸구스, 프테로푸스 밤피루스(Pteropus vampyrus), 피피스트렐루스 쿠흘리(Pipistrellus kuhlii), 판 트로글로다이테스(Pan troglodytes), 몰로수스 몰로수스(Molossus molossus), 또는 호모 사피엔스(Homo sapiens)로부터 유래된 것, 및/또는 이의 조작된 형태이고/이거나, 트랜스포사제는 ITR 또는 말단 서열을 특이적으로 인식하는, 조성물.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 지질 나노입자(LNP)의 형태인, 조성물.
  21. 제20항에 있어서, 1,2-다이올레오일-3-트라이메틸암모늄 프로판(DOTAP), 다이메틸아미노에탄-카바모일과 혼합된 양이온성 콜레스테롤 유도체(DC-Chol), 포스파티딜콜린(PC), 트라이올레인(글리세릴 트라이올레이트), 및 1,2-다이스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[카복시(폴리에틸렌 글라이콜)-2000](DSPE-PEG), 1,2-다이미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌글라이콜-2000(DMG-PEG 2K), 및 1,2-다이스테아롤-sn-글리세롤-3포스포콜린(DSPC)으로부터 선택되는 하나 이상의 지질을 포함하고/하거나 폴리에틸렌이민(PEI) 및 폴리(락틱-코-글라이콜산)(PLGA), 및 N-아세틸갈락토사민(GalNAc)으로부터 선택되는 하나 이상의 분자를 포함하는, 조성물.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 추가적인 치료제를 포함하고, 추가적인 치료제는 선택적으로 스타틴, 에제티미브, 담즙산 결합 수지, 에볼로쿠맙, 인클리시란, 로미타피드 및 미포머센 중 하나 이상으로부터 선택되며, 스타틴은 선택적으로 아토르바스타틴(LIPITOR), 플루바스타틴(LESCOL), 로바스타틴(ALTOCOR; ALTOPREV; MEVACOR), 피타바스타틴(LIVALO), 프라바스타틴(PRAVACHOL), 로수바스타틴 칼슘(CRESTOR) 및 심바스타틴(ZOCOR) 중 하나 이상인, 조성물.
  23. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 단리된 세포.
  24. 환자의 총 콜레스테롤 및/또는 저밀도 지단백질 콜레스테롤(LDL-C)를 저하시키는 방법으로서,
    제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 환자의 총 콜레스테롤 및/또는 LDL-C를 저하시키는 방법.
  25. 환자의 총 콜레스테롤 및/또는 저밀도 지단백질 콜레스테롤(LDL-C)를 저하시키는 방법으로서,
    (a) 환자로부터 수득된 세포를 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 조성물과 접촉시키는 단계; 및
    (b) 상기 세포를 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계
    를 포함하는, 환자의 총 콜레스테롤 및/또는 LDL-C를 저하시키는 방법.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서, 상기 방법은 환자의 심혈관 건강을 개선시키는, 환자의 총 콜레스테롤 및/또는 LDL-C를 저하시키는 방법.
  27. 제24항 또는 제25항에 있어서, 상기 방법은 투여가 없는 경우의 총 콜레스테롤 및/또는 LDL-C의 수준에 비해 총 콜레스테롤 및/또는 LDL-C의 약 40% 초과, 또는 약 50% 초과, 또는 약 60% 초과, 또는 약 70% 초과, 또는 약 80% 초과, 또는 약 90% 초과의 저하를 제공하는, 환자의 총 콜레스테롤 및/또는 LDL-C를 저하시키는 방법.
  28. 제24항 또는 제25항에 있어서, 상기 방법은 혈청 LDL-C 수준을 약 500 ㎎/dL 미만(약 13 m㏖/ℓ 미만)으로 저하시키는, 환자의 총 콜레스테롤 및/또는 LDL-C를 저하시키는 방법.
  29. 제24항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 스테로이드 치료 없이 수행되는, 환자의 총 콜레스테롤 및/또는 LDL-C를 저하시키는 방법.
  30. 제24항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 실질적으로 비-면역원성인, 환자의 총 콜레스테롤 및/또는 LDL-C를 저하시키는 방법.
  31. 제24항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 총 콜레스테롤 및/또는 LDL-C의 저하는 영속성이 있는, 환자의 총 콜레스테롤 및/또는 LDL-C를 저하시키는 방법.
  32. 제24항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 단일 투여를 필요로 하는, 환자의 총 콜레스테롤 및/또는 LDL-C를 저하시키는 방법.
  33. 제24항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 간세포에서 LDL 대사를 자극하고/하거나 증가시키는, 환자의 총 콜레스테롤 및/또는 LDL-C를 저하시키는 방법.
  34. 제24항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서,
    선택적으로 봄빅스 모리, 제노푸스 트로피칼리스, 트리코플루시아 니, 리놀로푸스 페룸에퀴눔, 로우세투스 아에집티아쿠스, 필로스토무스 디스콜로르, 마이오티스 마이오티스, 마이오티스 루시푸구스, 프테로푸스 밤피루스, 피피스트렐루스 쿠흘리, 판 트로글로다이테스, 몰로수스 몰로수스, 또는 호모 사피엔스로부터 유래된 트랜스포사제를 인코딩하는 핵산 작제물, 및/또는 이의 조작된 형태; 및/또는
    PCSK9를 표적으로 하는 마이크로RNA를 인코딩하는 핵산 작제물
    을 투여하는 단계를 더 포함하는, 환자의 총 콜레스테롤 및/또는 LDL-C를 저하시키는 방법.
  35. 제24항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포를,
    선택적으로 봄빅스 모리, 제노푸스 트로피칼리스, 트리코플루시아 니, 리놀로푸스 페룸에퀴눔, 로우세투스 아에집티아쿠스, 필로스토무스 디스콜로르, 마이오티스 마이오티스, 마이오티스 루시푸구스, 프테로푸스 밤피루스, 피피스트렐루스 쿠흘리, 판 트로글로다이테스, 몰로수스 몰로수스, 또는 호모 사피엔스로부터 유래된 트랜스포사제를 인코딩하는 핵산 작제물, 및/또는 이의 조작된 형태, 및/또는
    PCSK9를 표적으로 하는 마이크로RNA를 인코딩하는 핵산 작제물
    과 접촉시키는 단계를 더 포함하는, 환자의 총 콜레스테롤 및/또는 LDL-C를 저하시키는 방법.
  36. 제24항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여는 정맥내인, 환자의 총 콜레스테롤 및/또는 LDL-C를 저하시키는 방법.
  37. 제24항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 가족성 고콜레스테롤혈증, 일반적인 고콜레스테롤혈증, 트리글리세라이드 증가, 인슐린 저항성 또는 대사 증후군을 치료하는, 환자의 총 콜레스테롤 및/또는 LDL-C를 저하시키는 방법.
  38. 제24항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여는 간으로, 선택적으로 문맥내 정맥 또는 간 실질로 이루어지는, 환자의 총 콜레스테롤 및/또는 LDL-C를 저하시키는 방법.
  39. 제34항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 초저밀도 지단백질 수용체 단백질(VLDLR) 또는 저밀도 지단백질 수용체 단백질(LDLR), 또는 이의 기능적 단편을 인코딩하는 핵산 대 트랜스포사제를 인코딩하는 핵산 작제물의 비율은 약 5:1, 또는 약 4:1, 또는 약 3:1, 또는 약 2:1, 또는 약 1:1, 또는 약 1:2, 또는 약 1:3, 또는 약 1:4, 또는 약 1:5인, 환자의 총 콜레스테롤 및/또는 LDL-C를 저하시키는 방법.
  40. 제34항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 초저밀도 지단백질 수용체 단백질(VLDLR) 또는 저밀도 지단백질 수용체 단백질(LDLR), 또는 이의 기능적 단편을 인코딩하는 핵산 대 트랜스포사제를 인코딩하는 핵산 작제물의 비율은 약 2:1인, 환자의 총 콜레스테롤 및/또는 LDL-C를 저하시키는 방법.
  41. 제24항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, PCSK9를 표적으로 하는 miRNA를 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 더 포함하는, 환자의 총 콜레스테롤 및/또는 LDL-C를 저하시키는 방법.
  42. 제24항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 추가적인 치료제를 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하되, 상기 추가적인 치료제는 선택적으로 스타틴, 에제티미브, 담즙산 결합 수지, 에볼로쿠맙, 인클리시란, 로미타피드 및 미포머센 중 하나 이상으로부터 선택되는, 환자의 총 콜레스테롤 및/또는 LDL-C를 저하시키는 방법.
  43. 제42항에 있어서, 상기 스타틴은 아토르바스타틴(LIPITOR), 플루바스타틴(LESCOL), 로바스타틴(ALTOCOR; ALTOPREV; MEVACOR), 피타바스타틴(LIVALO), 프라바스타틴(PRAVACHOL), 로수바스타틴 칼슘(CRESTOR), 및 심바스타틴(ZOCOR) 중 하나 이상인, 환자의 총 콜레스테롤 및/또는 LDL-C를 저하시키는 방법.
  44. 가족성 고콜레스테롤혈증(familial hypercholesterolemia: FH)을 치료 및/또는 완화하는 방법으로서,
    제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, FH를 치료 및/또는 완화하는 방법.
  45. 가족성 고콜레스테롤혈증(FH)을 치료 및/또는 완화하는 방법으로서,
    (a) 환자로부터 수득된 세포를 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 조성물과 접촉시키는 단계; 및
    (b) 상기 세포를 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계
    를 포함하는, FH를 치료 및/또는 완화하는 방법.
  46. 제44항 또는 제45항에 있어서, 상기 FH는 동형접합 FH(HoFH) 또는 이형접합 FH(HeFH)인, FH를 치료 및/또는 완화하는 방법.
  47. 제44항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FH는 APOB, LDLR 및 PCSK9 중 하나 이상에서 하나 이상의 돌연변이를 특징으로 하는, FH를 치료 및/또는 완화하는 방법.
  48. 제44항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 관상 동맥 질환(CAD)을 치료 및/또는 완화하는, FH를 치료 및/또는 완화하는 방법.
  49. 제44항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 스타틴, 에제티미브, 담즙산 결합 수지, 에볼로쿠맙, 인클리시란, 로미타피드 및 미포머센 중 하나 이상을 투여하는 단계를 더 포함하는, FH를 치료 및/또는 완화하는 방법.
  50. 제44항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 스타틴, 에제티미브, 담즙산 결합 수지, 에볼로쿠맙, 인클리시란, 로미타피드 및 미포머센 중 하나 이상을 이용하는 치료에 대한 필요성을 제거하는, FH를 치료 및/또는 완화하는 방법.
  51. 제44항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 LDL 성분채집술에 대한 필요성을 제거하는, FH를 치료 및/또는 완화하는 방법.
  52. 제44항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 스테로이드 치료에 대한 필요성을 제거하는, FH를 치료 및/또는 완화하는 방법.
  53. 제44항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 환자의 심혈관 건강을 개선시키는, FH를 치료 및/또는 완화하는 방법.
  54. 제44항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 실질적으로 비-면역원성인, FH를 치료 및/또는 완화하는 방법.
  55. 제44항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료 및/또는 완화는 영속성이 있는, FH를 치료 및/또는 완화하는 방법.
  56. 제44항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 단일 투여를 필요로 하는, FH를 치료 및/또는 완화하는 방법.
  57. 제44항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 간세포에서 LDL 대사를 자극하고/하거나 증가시키는, FH를 치료 및/또는 완화하는 방법.
  58. 제44항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서,
    선택적으로 봄빅스 모리 또는 제노푸스 트로피칼리스로부터 유래된 트랜스포사제를 인코딩하는 핵산 작제물 및/또는 이의 조작된 형태, 및/또는
    PCSK9를 표적으로 하는 마이크로RNA를 인코딩하는 핵산 작제물
    을 투여하는 단계를 더 포함하는, FH를 치료 및/또는 완화하는 방법.
  59. 제44항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여는 정맥내인, FH를 치료 및/또는 완화하는 방법.
  60. 제44항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여는 간으로, 선택적으로 문맥내 정맥 또는 간 실질로 이루어지는, FH를 치료 및/또는 완화하는 방법.
  61. 제44항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포를, 선택적으로 봄빅스 모리, 제노푸스 트로피칼리스, 트리코플루시아 니, 리놀로푸스 페룸에퀴눔, 로우세투스 아에집티아쿠스, 필로스토무스 디스콜로르, 마이오티스 마이오티스, 마이오티스 루시푸구스, 프테로푸스 밤피루스, 피피스트렐루스 쿠흘리, 판 트로글로다이테스, 몰로수스 몰로수스, 또는 호모 사피엔스로부터 유래된 트랜스포사제를 인코딩하는 핵산 작제물, 및/또는 이의 조작된 형태와 접촉시키는 단계를 더 포함하는, FH를 치료 및/또는 완화하는 방법.
  62. 제58항 또는 제61항에 있어서, 상기 초저밀도 지단백질 수용체 단백질(VLDLR) 또는 저밀도 지단백질 수용체 단백질(LDLR), 또는 이의 기능적 단편을 인코딩하는 핵산 대 트랜스포사제를 인코딩하는 핵산 작제물의 비율은 약 5:1, 또는 약 4:1, 또는 약 3:1, 또는 약 2:1, 또는 약 1:1, 또는 약 1:2, 또는 약 1:3, 또는 약 1:4, 또는 약 1:5인, FH를 치료 및/또는 완화하는 방법.
  63. 제58항 또는 제61항에 있어서, 상기 초저밀도 지단백질 수용체 단백질(VLDLR) 또는 저밀도 지단백질 수용체 단백질(LDLR), 또는 이의 기능적 단편을 인코딩하는 핵산 대 트랜스포사제를 인코딩하는 핵산 작제물의 비율은 약 2:1인, FH를 치료 및/또는 완화하는 방법.
  64. 제44항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, PCSK9를 표적으로 하는 miRNA를 투여하는 단계를 더 포함하는, FH를 치료 및/또는 완화하는 방법.
  65. 제44항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 추가적인 치료제를 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하되, 상기 추가적인 치료제는 선택적으로 스타틴, 에제티미브, 담즙산 결합 수지, 에볼로쿠맙, 인클리시란, 로미타피드 및 미포머센 중 하나 이상으로부터 선택되는, FH를 치료 및/또는 완화하는 방법.
  66. 제65항에 있어서, 상기 스타틴은 아토르바스타틴 (LIPITOR), 플루바스타틴(LESCOL), 로바스타틴(ALTOCOR; ALTOPREV; MEVACOR), 피타바스타틴(LIVALO), 프라바스타틴(PRAVACHOL), 로수바스타틴 칼슘(CRESTOR), 및 심바스타틴(ZOCOR) 중 하나 이상인, FH를 치료 및/또는 완화하는 방법.
  67. 하기를 포함하는, 유전자 전달 작제물을 포함하는 조성물:
    (a) 초저밀도 지단백질 수용체(VLDLR) 단백질 또는 저밀도 지단백질 수용체(LDLR) 단백질 또는 이의 기능적 단편을 인코딩하는 핵산이되, VLDLR은 서열번호 4의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 약 90% 동일상의 변이체, 또는 서열번호 5의 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 약 90% 동일성의 변이체를 포함하는 인간 VLDLR인, 핵산;
    (b) 서열번호 15의 핵산 서열, 또는 이와 적어도 약 90% 동일성을 갖는 변이체를 갖는 인간 LP1 프로모터인, 간-특이적 프로모터; 및
    (c) 하나 이상의 트랜스포사제 인식 부위 및 하나 이상의 역 말단 반복부(ITR) 또는 말단 서열을 포함하는 비-바이러스 벡터.
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