CN115444810B - 一种载阿霉素纳米粒复合温敏凝胶的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种载阿霉素纳米粒复合温敏凝胶的制备方法，步骤如下：S1、DOX‑NPs的制备：称取PLGA、卵磷脂溶解于二氯甲烷作为油相，在油相中加入内水相，冰水浴条件下探头超声，即得初乳；将初乳转移至吐温‑80溶液中，超声即得复乳，减压蒸馏除去二氯甲烷即得DOX‑NPs混悬液；将DOX‑NPs混悬液离心后收集底部沉淀，再加入冻干保护剂蔗糖，冷冻干燥后得到DOX‑NPs冻干粉。本发明采用上述的一种载阿霉素纳米粒复合温敏凝胶的制备方法，方法简便，制备的温敏凝胶实现生物可降解性、良好的缓释性能和较高的生物利用度，有望成为TACE的载药栓塞材料。

Description

一种载阿霉素纳米粒复合温敏凝胶的制备方法
技术领域
本发明涉及温敏水凝胶技术领域，尤其是涉及一种载阿霉素纳米粒复合温敏凝胶的制备方法。
背景技术
肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）是全世界最常见的恶性肿瘤之一。由于其发病隐匿且发展迅速，很多患者发现时已进展至中晚期，从而失去了根治性治疗的机会。经肝动脉化疗栓塞术（transarterial chemoembolization, TACE）是治疗中晚期HCC的首选方法。通过栓塞实现局部缺血坏死，同时化疗药物杀伤肿瘤细胞。传统TACE是以碘油和化疗药物的乳剂为栓塞材料，在临床上最为常用，但存在稳定性较差、释药快和末梢栓塞不完全的问题，一定程度上影响了治疗效果。为解决传统TACE的这些问题，现已开发和应用载药微球。载药微球一般是由聚乙烯醇（Polyvinyl alcohol, PVA）等有机材料构成，稳定性较好、能够栓塞末梢小动脉且可以实现化疗药物的局部缓释，但载药微球材料不可降解，这往往会导致严重的炎症反应并阻碍后续治疗。HCC易复发，意味着患者可能需要多次TACE治疗，因此栓塞材料的生物可降解性就显得尤为重要。
温敏水凝胶是一类可响应外界环境温度的变化，由液态转变为固态的水凝胶，具有可注射、栓塞血管和长滞留特性，非常适用于TACE给药。其中以天然多糖聚合物，特别是以壳聚糖（Chitosan, CS）为基质的温敏水凝胶，因具有制备工艺简单、成本较低、生物相容性好、生物可降解及抗菌等诸多优点而受到广泛关注。
纳米粒通常是指直径在10～1000nm的粒子，其可通过增加药物半衰期、提高药物稳定性和延长药物释放时间来提高药物的生物利用度。乳酸-羟基乙酸共聚物（Poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA）是一种已通过FDA认证并广泛应用于制药领域的高分子材料，具有可降解性、良好的生物相容性和低毒性的特点。近年来，研究发现通过将纳米粒和温敏凝胶相结合的方式，可实现药物局部的缓慢释放。
发明内容
本发明的目的是提供一种载阿霉素纳米粒复合温敏凝胶的制备方法，方法简便，制备的温敏凝胶实现生物可降解性、良好的缓释性能和较高的生物利用度，有望成为TACE的载药栓塞材料。
为实现上述目的，本发明提供了一种载阿霉素纳米粒复合温敏凝胶的制备方法，步骤如下：
S1、DOX-NPs的制备
称取PLGA、卵磷脂溶解于二氯甲烷作为油相，在油相中加入内水相，冰水浴条件下探头超声，即得初乳；
将初乳转移至吐温-80溶液中，超声即得复乳，减压蒸馏除去二氯甲烷即得DOX-NPs混悬液；
将DOX-NPs混悬液离心后收集底部沉淀，再加入冻干保护剂蔗糖，冷冻干燥后得到DOX-NPs冻干粉；
S2、温敏凝胶负载DOX-NPs
精密称取适量DOX-NPs冻干粉于EP管中，并加入CS溶液，搅拌使其完全溶解，制得混合液a；称取β-GP溶于NaOH溶液中，混合均匀得澄清的β-GP溶液；
于玻璃小瓶中加入混合液a，随后置于冰浴中，继续搅拌，用注射器极缓慢的注入β-GP溶液，继续在冰浴条件下搅拌，即得。
优选的，步骤S1中，水相为4mg/mL的DOX溶液，蔗糖终浓度50mg/mL，超声条件为50W，工作3s，间歇3s。
优选的，步骤S2中，CS溶液的制备方法为称取1.0g CS溶于50mL浓度为0.1mol/L的冰乙酸溶液中，磁力搅拌至其完全溶解，得澄清透明的CS溶液。
优选的，DOX-NPs的制备步骤如下：
称取25mg PLGA、30mg卵磷脂溶解于3mL二氯甲烷作为油相，在油相中加入0.2mL内水相，冰水浴条件下探头超声1min得初乳；
将初乳转移至9mL 2mg/mL的吐温-80溶液中，超声3min即得复乳，减压蒸馏除去二氯甲烷即得DOX-NPs混悬液；
将DOX-NPs混悬液于31200rpm下离心1h，收集底部DOX-NPs加入冻干保护剂蔗糖(蔗糖终浓度50mg/mL)，冷冻干燥后得到DOX-NPs冻干粉。
优选的，负载DOX-NPs的温敏凝胶步骤如下：
精密称取适量DOX-NPs冻干粉于EP管中，并加入CS溶液，搅拌使其完全溶解，制得混合液a；
称取5.6gβ-GP溶于10mL浓度为0.02mol/L的NaOH溶液中，混合均匀得澄清的β-GP溶液；
于玻璃小瓶中加入2mL混合液a，随后置于冰浴中，继续搅拌，用注射器极缓慢的注入0.5mLβ-GP溶液，继续在冰浴条件下搅拌30min，即得。
因此，本发明采用上述一种载阿霉素纳米粒复合温敏凝胶的制备方法，以PLGA作为载体材料，以化疗药物阿霉素(doxorubicin, DOX)为对象，采用复乳法制备阿霉素纳米粒(DOX-NPs)，再将DOX-NPs分散于CS/β-甘油磷酸钠(β-sodium glycerophosphate, β-GP)温敏凝胶(Gel)中，制备出具有可生物降解、抗溶蚀、栓塞血管和缓慢释药特点的TACE栓塞载药材料，为肝癌的TACE治疗提供新思路。
下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
附图说明
图1是CS/β-GP温敏凝胶胶凝前后对比图；
图2是温敏凝胶溶蚀率(n＝3)；
图3是兔耳血管栓塞效果(n＝3)；
图4是小鼠皮下温敏凝胶吸收情况(n＝3)；
图5是小鼠皮下温敏凝胶吸收量；
图6是DOX-NPs扫描电镜和透射电镜图；
图7是DOX-碘油的配制；
图8是DOX累积释放度(n＝3)；
图9是DOX-NPs-Gel的体外释放(n＝3)；
图10是腹腔注射后DOX、DOX-碘油、DOX-Gel和DOX-NPs-Gel组平均血药质量浓度-时间曲线(n＝3)。
具体实施方式
以下通过附图和实施例对本发明的技术方案作进一步说明。
除非另外定义，本发明使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的主旨或基本特征的情况下，能够以其它的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内，不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其它实施方式。这些其它实施方式也涵盖在本发明的保护范围内。
还应当理解，以上所述的具体实施例仅用于解释本发明，本发明的保护范围并不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明/发明的保护范围之内。
本发明中使用的“包括”或者“包含”等类似的词语意指在该词前的要素涵盖在该词后列举的要素，并不排除也涵盖其它要素的可能。术语“内”、“外”、“上”、“下”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制，当被描述对象的绝对位置改变后，则该相对位置关系也可能相应地改变。在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“附着”等术语应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或成一体；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。本发明中使用的术语“约”具有本领域技术人员公知的含义，优选指该术语所修饰的数值在其±50％，±40％，±30％，±20％，±10％，±5％或±1％范围内。
本公开使用的所有术语（包括技术术语或者科学术语）与本公开所属领域的普通技术人员理解的含义相同，除非另外特别定义。还应当理解，在诸如通用词典中定义的术语应当被理解为具有与它们在相关技术的上下文中的含义相一致的含义，而不应用理想化或极度形式化的意义来解释，除非本文有明确地这样定义。
对于相关领域普通技术人员已知的技术、方法和设备可能不作为详细讨论，但在适当情况下，所述技术、方法和设备应当被视为说明书的一部分。
本发明说明书中引用的现有技术文献所公开的内容整体均通过引用并入本发明中，并且因此是本发明公开内容的一部分。
本发明中使用的各种试剂如无特殊说明，均为本领域技术人员的常规选择，以下为涉及到的特殊试剂或设备的说明。
ICR小鼠，雄性，20±2g，购于斯贝福（北京）生物技术有限公司，生产许可号：SCXK（京）2019-0010。新西兰大白兔，雌雄随机，2.8±0.2kg，购于贵州医科大学实验动物中心，生产许可证号：SCXK（黔）2018-0001。SD大鼠，雄性，250±20g购于辽宁长生生物技术股份有限公司，生产许可号：SCXK（辽）2020-0001。
盐酸阿霉素（Doxorubicin，DOX含量＞98.0％，批号：N1111A，大连美伦生物技术有限公司）、壳聚糖（Chitosan，CS脱乙酰度≥95％，批号：RH209117，上海罗恩试剂有限公司）、β-甘油磷酸钠（β-sodium glycerophosphate，β-GP含量≥98.0％，批号：BCCC6949，美国西格玛奥德里奇公司）、罂粟乙碘油注射液（Ethiodized poppyseed oil injection，批号：200606CA，碘浓度：480mg/mL，江苏恒瑞医药股份有限公司）、PLGA（批号：RJ0202007，相对分子量：10kD，型号：50:50，西安瑞禧生物科技有限公司）、卵磷脂（批号：180701，供口服用药用辅料，江苏曼氏生物科技股份有限公司）、吐温-80（批号：301C053，北京索莱宝科技有限公司）、透析袋（截留分子量：8～14kD，批号：1123E0222，北京索莱宝科技有限公司）、超滤管（截留分子量：30kD，默克密理博公司）、阿奇霉素（含量＞98.0％，批号：N0615A，大连美伦生物技术有限公司），其余试剂为分析纯。
UPLC-TQS三重四级杆质谱串联仪（美国Waters公司）、Forma905-ULTS1490医用低温冰箱（美国Thermo Fisher公司）、FDU-1100真空冷冻干燥机（日本东京理化器械株式会社）、JY88-IIN细胞破碎机（宁波新芝生物科技股份有限公司）、90Plus激光粒度仪（美国布鲁克海文仪器公司）、R100旋蒸仪（瑞士步琦公司）、Optima XPN-100超速离心机（美国贝克曼库尔特公司）、Allegra X-30R低温高速离心机（美国贝克曼库尔特公司）、JEM1200EX透射电镜（日本电子株式会社）、Merlin Compact扫描电镜（德国蔡司公司）、CS501A恒温水浴槽（中国重庆银河试验仪器有限公司）、MSC5R磁力搅拌器（群安实验仪器有限公司）、UV-2700紫外可见分光光度仪（岛津仪器（苏州）有限公司）、IMS-20制冰机（常熟市雪科电器有限公司）、XYN-15LP氮吹仪氮气发生器（上海析友分析仪器有限公司）、EL204电子天平（上海梅特勒-托利多仪器有限公司）。
实施例一
CS/β-GP温敏凝胶的制备与测试
一、CS/β-GP温敏凝胶的制备
称取1.0g CS溶于50mL浓度为0.1mol/L的冰乙酸溶液中，磁力搅拌至其完全溶解，得澄清透明的CS溶液；称取5.6gβ-GP溶于10mL浓度为0.02mol/L的NaOH溶液中，混合均匀得澄清的β-GP溶液；于玻璃小瓶中加入2mL上述CS溶液，随后置于冰浴中，继续搅拌，用注射器将0.5mL上述β-GP溶液极缓慢注入CS溶液中，继续在冰浴条件下搅拌30min，即得CS/β-GP温敏凝胶溶液。
制备CS/β-GP温敏水凝胶时，CS在0.1mol/L的冰乙酸溶液中溶解较慢，短时间内难以完全溶解均匀，需要静置搅拌过夜。当逐滴加入β-GP溶液时局部容易出现白色絮状物，β-GP溶液液滴过大，无法迅速溶解于CS溶液中，局部浓度过大，导致白色絮状物。
二、CS/β-GP温敏凝胶的胶凝时间考察
采用倒瓶法目视考察CS/β-GP温敏凝胶溶液的胶凝时间，取出2mL温敏凝胶溶液，室温下放置10min后置于37℃的恒温水浴槽中，每隔5s倾斜瓶子，观察液态溶胶是否变为固态。如此反复直至固态，记录时间，即为37℃条件下CS/β-GP温敏凝胶溶液的胶凝时间。平行测定3次，取平均值。
如图1所示，CS/β-GP温敏凝胶溶液在室温下呈无色透明状液体（图A部分），当温度为37℃时转变为半透明固体凝胶（图B部分），平均凝胶化时间为65s，表明温敏凝胶在生理温度下会快速完成胶凝。
三、体外溶蚀
称量玻璃小瓶原始重量，取2mL CS/β-GP温敏凝胶溶液于玻璃小瓶中，浸入37℃恒温水浴中，胶凝后称量总重。然后缓慢加入2mL PBS（pH 7.2）至凝胶表面，置于37℃恒温振荡仪（50rpm），在预先设置的时间点（0.5、1、2、4、6、12、24h之后每隔12h取一次，直至30d），用移液枪轻吸出凝胶表面的液体，然后迅速称量并记录此时玻璃小瓶的重量，前后两次重量之差即为溶蚀量，同时补充相同体积和温度的释放介质，继续恒温振荡，如此循环往复。计算各时间点凝胶累积溶蚀率。
如图2所示，开始温敏凝胶溶蚀速度较快，随后变化缓慢，30d溶蚀量为51.93±1.77％，表明CS/β-GP温敏凝胶抗溶蚀性能较好。
四、栓塞性能考察
取3只新西兰大白兔进行兔耳中动脉血管栓塞实验，从兔耳中动脉远心端向近心端缓慢注入0.2mL CS/β-GP温敏凝胶溶液。分别在注射后10min、1、5、8d仔细观察兔耳的缺血情况。
如图3所示，CS/β-GP温敏凝胶溶液室温下呈液态，黏度合适，易于注射（图A部分）；兔耳中动脉栓塞前，血管呈紫红色，触摸感软有弹性（图B部分）；注射空白CS/β-GP温敏水凝胶后10min，兔耳中动脉血管发白，触摸感硬，说明温敏凝胶可以迅速凝固，能堵塞血管（图C部分）；栓塞后1d，兔耳呈现缺血紫红色状态，兔耳中动脉血管触摸感硬（图D部分）；栓塞后第5d，兔耳中动脉出现轻微坏死现象（图E部分）；栓塞后第8d，兔耳明显发黑坏死，说明温敏凝胶的血管栓塞性能良好（图F部分）。
五、皮下吸收特性考察
在8只ICR小鼠的右后腿部皮下分别注射0.3mL CS/β-GP温敏凝胶溶液，分别于1、3、5、10、15、20、25、30d脱颈死小鼠，观察皮下层凝胶的吸收情况并拍照记录，随后小心取下凝胶称重，计算其吸收量。
皮下注射CS/β-GP温敏凝胶后小鼠精神状况良好，1、3、5、10、15、20、25、30d时注射部位未见任何异常。温敏凝胶的外观和质量的变化见图4和图5所示。第1、3d温敏凝胶外观为直径约1.3cm的圆饼状，到第5d直径缩小（不足1cm），后续变化缓慢，第30d时直径约0.7cm。第1和5d时温敏凝胶分别被吸收43.13％和58.27％，后续变化缓慢，直到30d时剩余38.27％，这说明CS/β-GP温敏凝胶可被吸收。
实施例二
DOX-NPs的制备与检测
一、DOX-NPs的制备
称取25mg PLGA、30mg卵磷脂溶解于3mL二氯甲烷作为油相，在油相中加入0.2mL内水相（4mg/mL的DOX溶液），冰水浴条件下探头超声（50W，工作3s，间歇3s）1min即得初乳，将初乳转移至9mL 2mg/mL的吐温-80溶液中，超声3min即得复乳，减压蒸馏除去二氯甲烷即得DOX-NPs混悬液。将DOX-NPs混悬液于31200rpm下离心1h，收集底部DOX-NPs加入冻干保护剂蔗糖（蔗糖终浓度50mg/mL），冷冻干燥后得到DOX-NPs冻干粉。
二、DOX-NPs的粒径及形态的表征
通过扫描电镜和透射电镜对DOX-NPs进行形貌特征考察。采用激光粒度仪对DOX-NPs的粒径和Zeta电位进行检测。
如图6所示，A部分为扫描电镜图，B部分为透射电镜图。制备的DOX-NPs的粒径在100～200nm范围内，且成均匀球形，形态规则无黏连，粒径分布均匀；通过激光粒度仪测定粒径为186.68±5.99nm，PDI为0.17±0.01，Zeta电位为-23.33±1.54mV；紫外分光光度法测得DOX的包封率和载药量分别为77.10±4.46％和2.64±0.19％。
三、包封率和载药量的测定
精密称取适量DOX-NPs冻干粉于EP管中，用DMSO溶解后，通过紫外分光光度计测定冻干粉中DOX的量，通过公式（1）和（2）计算样品的包封率和载药量。
（1）
（2）
DOX-NPs的重量＝冻干粉的重量-蔗糖的重量
四、体外释放考察
DOX溶液的配制：称取DOX 10mg于2.5mL容量瓶中，加入适量生理盐水溶解后，再定容至刻度。
传统TACE作为中晚期HCC的一线治疗方法，在临床中得到了广泛应用。通常化疗药物和碘油是临用前乳化，但乳化后的乳液稳定性较差。而DOX与碘油混匀后静置1min就会出现明显分层现象。
碘油乳化液（DOX-碘油）的配制：用两注射器分别吸取1mL上述DOX溶液与1mL碘油，通过三通管混匀。
DOX-碘油的配制过程中，通过三通管进行混合，混合后1min，即出现油水分层现象，说明临床实际使用的阿霉素碘油乳化液不稳定。DOX-Gel平均凝胶化时间和空白Gel一致，为65s。DOX-NPs-Gel平均凝胶化时间为120～130s。
DOX-Gel的配制：精密称取DOX 10mg于玻璃小瓶中，加入4mL CS溶液，搅拌溶解完全后，按照CS/β-GP温敏凝胶的制备方法进行操作。
DOX-NPs-Gel的配制：称取适量冻干后的DOX-NPs冻干粉（含DOX10mg）于玻璃小瓶中加入4mL CS溶液，搅拌使其完全溶解后，按照CS/β-GP温敏凝胶的制备方法进行操作。
DOX-NPs-Gel中所用材料CS、β-GP和PLGA均具有良好的生物相容性和生物可降解性。Gel可注射，胶凝时间为65s。DOX-NPs-Gel胶凝时间在120～150s，三者的推注时阻力无明显差异。DOX-NPs与冻干保护剂蔗糖对Gel胶凝时间影响，发现Gel的胶凝时间与蔗糖的含量呈正相关，与DOX-NPs含量呈负相关，即DOX-NPs-Gel胶凝时间的延长主要是由蔗糖导致。
（一）DOX、DOX-碘油、DOX-Gel、DOX-NPs进行体外释放考察
分别取1mL上述DOX、DOX-碘油、DOX-Gel、DOX-NPs溶液（均含DOX2mg）置于透析袋中。以15mL 1％DMSO溶液为释放介质，避光置于37℃恒温振荡仪（50rpm），分别在0.5、0.75、1、2、4、8、12、24、48、72、96、120、144和168h取样2mL，同时补充相同体积和温度的释放介质，紫外分光光度法测定DOX和计算各时间点DOX累积释放率。
如图8所示，A为0.5d释放曲线；B为7d释放曲线，其中，▼—DOX；■—DOX-碘油；●—DOX-Gel；▲—DOX-NPs。在0.5d时，DOX和DOX-碘油已经释放完全，DOX-Gel和DOX-NPs在7d时分别释放61.01±1.48％和14.15±3.27％。
(二)DOX-NPs-Gel的体外释放
吸取1mL上述DOX-NPs-Gel于5mL EP管中，置于37℃恒温水浴槽中待其完全胶凝后取出加入3mL 1％DMSO溶液作为释放介质，避光置于37℃恒温振荡仪（50rpm），分别在0.5、0.75、1、2、4、8、12、24、48、72、96、120、144和168h取样2mL，同时补充相同体积和温度的释放介质。取出的释放介质平均分成两份；一份1mL为样品A，包含DOX和DOX-NPs，用于计算DOX总释放率；另一份1mL置于超滤管中，5000rpm离心15min，下层滤液为样品B，为释放出的DOX，用于计算DOX释放率。样品A和B冻干后用2mL DMSO溶解，通过紫外分光光度法测定各样品DOX的浓度，计算DOX总释放率和DOX释放率。DOX总释放率减去DOX释放率为DOX-NPs释放率。
如图9所示，●—DOX总释放率；■—DOX-NPs释放率；▲—DOX释放率。7d时，DOX的总释放率（包含DOX和DOX-NPs）为53.41±7.45％，其中DOX释放率为6.15±0.19％，DOX-NPs释放率为47.24±5.11％。
在进行体外释放考察时，常规的PBS（pH7.2或5.6）作为释放介质，但释放1d后PBS溶液中出现红色絮状沉淀，由于DOX·HCl在PBS中发生脱盐反应导致析出。
采用以1％DMSO溶液为释放介质进行体外释放考察。体外释放结果显示DOX-NPs-Gel缓释性能明显优于DOX-Gel和DOX-NPs，这可能是因为药物从Gel的释放主要是通过孔洞缓慢扩散出来，而DOX-NPs镶嵌在Gel的孔洞中使得结构更加紧密，DOX-NPs不易从孔洞中释放出来，导致释放速率减慢，进而减缓了DOX的释放。
(三)体内药代动力学研究
12只雄性SD大鼠随机分成四组，分别腹腔注射给予DOX、DOX-碘油、DOX-Gel和DOX-NPs-Gel（DOX均为5mg/kg），给药后0.083、0.167、0.25、0.5、0.7、1.5、2.5、4、12、24、36、48、60、72、96、120、144、168h经眼底静脉丛穿刺取血约100μL置于肝素化的1.5mL离心管中，于6000rpm下离心10min，分离50μL血浆。根据课题组前期确定的样品处理方法和UPLC-MS/MS分析方法测定血浆中DOX浓度。
如图10所示，▲—DOX；■—DOX-碘油；●—DOX-Gel；▼—DOX-NPs-Gel。利用WinNonLin 8.1软件计算其主要药动学参数。采用SPSS 22.0统计软件进行独立样本t检验进行组间比较，P<0.05为具有统计学差异。
表1主要药动学参数
；
a—P<0.05,compare with DOX group；b—P<0.05,compare with DOX-碘油group；c—P<0.05,compare with DOX-Gel group
在48h时DOX组和DOX-碘油组大鼠血浆中DOX消失殆尽；在96h时DOX-Gel组DOX消失殆尽；在168h时DOX-NPs-Gel组DOX浓度仍为90.48ng/mL，表明DOX-NPs-Gel可在体内长时间释药。值得注意的是DOX-NPs-Gel组在48～168h内呈现出近乎恒速释放。与DOX组相比，DOX-碘油组的t1/2延长1.56倍，其他主要药动学参数均无明显差异，说明传统TACE能延缓DOX释放，但效果不明显。
与DOX-碘油相比，DOX-Gel组的AUC0-t和AUC0-∞分别提高4.79和3.28倍，CL降低80.17％，MRT0-t由15.07h延长至29.38h，说明凝胶较碘油具有更好的缓释效果；与DOX-碘油相比，DOX-NPs-Gel组的Cmax、AUC0-t和AUC0-∞分别提高1.07、12.08和40.21倍，t1/2和MRT0-t分别延长19.71和3.44倍；与DOX-Gel相比，DOX-NPs-Gel组的AUC0-t和AUC0-∞分别提高了1.61和7.16倍，t1/2和MRT0-t分别延长20.52和1.28倍，说明DOX-NPs-Gel能达到长时间缓控释释放DOX的目的。
腹膜表面积很大且具有丰富血管，吸收能力强，可较好模拟肝动脉血管环境，因此，采用腹腔注射的给药方式考察四者在大鼠体内药代动力学过程。结果显示，DOX-碘油与DOX相比仅t1/2显著延长，说明传统TACE能延缓DOX释放，但效果不明显；DOX-Gel组与DOX-碘油组相比，CL显著降低，AUC0-t、AUC0-∞和MRT0-t显著增加，说明凝胶较碘油具有更好的缓释效果；DOX-NPs-Gel组与DOX-Gel组相比CL显著降低，t1/2、Cmax、AUC0-t、AUC0-∞和MRT0-t均显著增加，说明在凝胶中添加载DOX的NPs，可进一步达到缓控释目的。与DOX-碘油相比，DOX-NPs-Gel组的Cmax、AUC0-t和AUC0-∞分别提高2.07、13.08和41.21倍，t1/2和MRT0-t分别延长20.71和4.44倍，CL降低38.59倍，说明DOX-NPs-Gel这种载药栓塞材料与传统TACE的DOX-碘油乳剂相比，在体内能缓释释放，甚至在后期能控释释放DOX。由于DOX-NPs-Gel体内药代动力学研究只进行了7天，实际从药物的消除相来看，4d后DOX的释放速度和消除过程达到平衡，DOX血药浓度达到平衡。这种恒速释放对维持肿瘤内化疗药物高浓度，提高对肿瘤的治疗效果具有重要意义。
因此，本发明采用上述一种载阿霉素纳米粒复合温敏凝胶的制备方法，制备的温敏凝胶实现生物可降解性、良好的缓释性能和较高的生物利用度，有望成为TACE的载药栓塞材料。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其进行限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而这些修改或者等同替换亦不能使修改后的技术方案脱离本发明技术方案的精神和范围。

Claims (1)

1.一种载阿霉素纳米粒复合温敏凝胶的制备方法，其特征在于，步骤如下：
S1、DOX-NPs的制备
称取PLGA、卵磷脂溶解于二氯甲烷作为油相，在油相中加入内水相，冰水浴条件下探头超声，即得初乳；
将初乳转移至吐温-80溶液中，超声即得复乳，减压蒸馏除去二氯甲烷即得DOX-NPs混悬液；
将DOX-NPs混悬液离心后收集底部沉淀，再加入冻干保护剂蔗糖，冷冻干燥后得到DOX-NPs冻干粉；
所述水相为4mg/mL的DOX溶液，蔗糖终浓度50mg/mL，超声条件为50W，工作3s，间歇3s；
具体步骤如下：
称取25mg PLGA、30mg卵磷脂溶解于3mL二氯甲烷作为油相，在油相中加入0 .2mL内水相，冰水浴条件下探头超声1min得初乳；
将初乳转移至9mL 2mg/mL的吐温-80溶液中，超声3min即得复乳，减压蒸馏除去二氯甲烷即得DOX-NPs混悬液；
将DOX-NPs混悬液于31200rpm下离心1h，收集底部DOX-NPs加入冻干保护剂蔗糖，冷冻干燥后得到DOX-NPs冻干粉；
S2、温敏凝胶负载DOX-NPs
精密称取适量DOX-NPs冻干粉于EP管中，并加入CS溶液，搅拌使其完全溶解，制得混合液a；称取β-GP溶于NaOH溶液中，混合均匀得澄清的β-GP溶液；
于玻璃小瓶中加入混合液a，随后置于冰浴中，继续搅拌，用注射器极缓慢的注入β-GP溶液，继续在冰浴条件下搅拌，即得；
CS溶液的制备方法为称取1.0g CS溶于50mL浓度为0.1mol/L的冰乙酸溶液中，磁力搅拌至其完全溶解，得澄清透明的CS溶液；
具体步骤如下：
精密称取适量DOX-NPs冻干粉于EP管中，并加入CS溶液，搅拌使其完全溶解，制得混合液a；
称取5.6g β-GP溶于10mL浓度为0.02mol/L的NaOH溶液中，混合均匀得澄清的β-GP溶液；
于玻璃小瓶中加入2mL混合液a，随后置于冰浴中，继续搅拌，用注射器极缓慢的注入0.5mL β-GP溶液，继续在冰浴条件下搅拌30min，即得。
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