CN115433761A - 内毒素的测定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明目的在于提供一种用于更高精度地测定透析液的内毒素浓度的方法，其使用由水制作的校准曲线，及用于该方法的试剂盒。本发明提供的内毒素的测定方法如下所述：将规定量的被测试样与含溶解物试剂的干燥粉末混合来制备第一反应溶液，然后将该第一反应溶液以规定时间进行温育后，在避光下，将所述第一反应溶液与含荧光素酶生物发光试剂的干燥粉末混合来制备第二反应溶液，并测定该第二反应溶液的发光量，根据所述发光量测定所述被测试样的内毒素浓度，所述被测试样为透析液或水，所述第二反应溶液的钠离子浓度为250～390mM，钙离子浓度为0.5～10mM，氯化物离子浓度为250～361.5mM，以及Tris浓度为20～30mM。

Description

内毒素的测定方法
技术领域
本发明涉及一种利用溶解物反应与生物发光测定水和透析液中内毒素的方法。
背景技术
内毒素是构成革兰氏阴性菌的细胞壁的脂多糖，是一种非常强的毒素。因此，检测水、药品、饮食品等中的内毒素污染非常重要。尤其是，由于对透析患者静脉给药的透析液通常是长期给药，因此即使是浓度非常低的内毒素，也可能带来严重的影响。因此，从安全性角度出发，透析液的内毒素污染控制非常重要。
内毒素的检测一般利用使用溶解物试剂的溶解物反应来进行，所述溶解物试剂是由鲎血细胞提取成分(变形细胞溶解物，amebocyte lysate)制备的。该溶解物试剂中含有来源于鲎的C因子、B因子和前凝固酶(pro-clotting enzyme)。如果在含内毒素的样品中混合溶解物试剂，则C因子被内毒素激活，B因子被该活性C因子激活，前凝固酶被该活性B因子激活而生成凝固酶(clotting enzyme)。以该凝固酶的活性作为指标，测定内毒素的量。
凝固酶的活性以往利用比浊法对通过凝固蛋白原(coagulogen)水解产生的凝固素(coagulin)的不溶性凝胶的量进行测定的方法；或者，在反应体系中预先添加由凝固酶的消化位点使显色色素与肽结合而成的合成基质，再利用比色法进行测定，所述比色法测定由凝固酶的消化而从合成基质游离的显色色素的显色量。近年来，作为更高灵敏度且快速测定凝固酶的活性的方法，开发出利用生物发光法进行测定的方法(非专利文献1)。该方法中，使用由作为凝固酶基质的肽修饰的发光基质、荧光素酶和三磷酸腺苷酸(ATP)。由凝固酶的消化而游离的发光基质通过ATP和荧光素酶发光。根据该发光量，可以测定凝固酶的活性，从而可以测定内毒素的量。
甲虫荧光素酶被广泛使用在荧光素-荧光素酶发光反应中。野生型甲虫荧光素酶受氯化钠的影响，在高浓度的氯化钠环境下酶反应被抑制，与不含氯化钠的水溶液中相比，发光强度下降至20～50％左右。因此，在非专利文献1中记载的方法中，在测定氯化钠浓度高达130～150mM左右的透析液的内毒素浓度时，使用抗盐性荧光素酶(专利文献1)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2017-225372号公报
非专利文献
非专利文献1：小田侑等人，内毒素与自然免疫研究，2019年，第22卷，第17～20页。
发明内容
发明所要解决的问题
通过使用抗盐性荧光素酶，虽然也能够测定氯化钠浓度较高的透析液中的内毒素浓度，但不能完全除去透析液成分引起的抑制的影响。因此，在利用生物发光的测定方法中，透析液中的内毒素浓度与相同内毒素浓度的水相比，发光量变小。因此，在使用由水制作的校准曲线时，透析液中的内毒素浓度会测定为比实际的内毒素浓度低的浓度。从而，为了更准确地测定透析液的内毒素浓度，需要使用由透析液而非水制作的校准曲线，但使用2种校准曲线较为繁琐。
因此，本发明的目的在于提供一种用于更高精度地测定透析液的内毒素浓度的方法，其使用由水制作的校准曲线，以及用于该方法的试剂盒。
解决问题的技术方案
为了达成上述目的，本发明人进行了深入研究，结果发现：在利用溶解物反应和生物发光法测定内毒素的方法中，通过将荧光素酶反应时反应溶液中的盐浓度调整在特定范围内，在充分保证内毒素的检测灵敏度的同时，能够减小被测试样为水时和被测试样为透析液时的发光量差异，从而完成了本发明。
即，本发明的发明为下述第1方案～第13方案。
本发明的第1方案为，一种内毒素的测定方法，其是测定内毒素的方法，具有以下步骤：溶解物反应步骤，其将规定量的被测试样与含溶解物试剂的干燥粉末混合来制备第一反应溶液，然后将该第一反应溶液以规定时间进行温育；荧光素酶反应步骤，其在所述溶解物反应步骤后，在避光下，将所述第一反应溶液与含荧光素酶生物发光试剂的干燥粉末混合来制备第二反应溶液，并测定该第二反应溶液的发光量；以及内毒素测定步骤，其根据所述荧光素酶反应步骤中得到的发光量，测定所述被测试样的内毒素浓度，所述被测试样为透析液或水，所述溶解物试剂含有C因子、B因子和前凝固酶，所述荧光素酶生物发光试剂含有发光合成基质、抗盐性荧光素酶和ATP，所述发光合成基质是通过被活性C因子、活性B因子或由所述前凝固酶的转化得到的凝固酶消化而使发光基质游离的物质，在所述荧光素酶反应步骤中，所述第二反应溶液的钠离子浓度为250～390mM，钙离子浓度为0.5～10mM，氯化物离子浓度为250～361.5mM，以及Tris浓度为20～30mM。
本发明的第2方案为，根据第1方案所述的内毒素的测定方法，其中，在所述荧光素酶反应步骤中，所述第二反应溶液的pH为7.7～8.5。
本发明的第3方案为，根据第1方案或第2方案所述的内毒素的测定方法，其中，在所述荧光素酶反应步骤中，所述第二反应溶液的镁离子浓度为10～20mM，碳酸离子浓度为1～5mM。
本发明的第4方案为，一种内毒素的测定方法，其是测定内毒素的方法，其中，将规定量的被测试样与溶解物试剂和含荧光素酶生物发光试剂的干燥粉末混合来制备反应溶液，将该反应溶液在避光下以规定时间进行温育，然后根据该反应溶液的发光量，测定所述被测试样的内毒素浓度，所述被测试样为透析液或水，所述溶解物试剂含有C因子、B因子和前凝固酶，所述荧光素酶生物发光试剂含有发光合成基质、抗盐性荧光素酶和ATP，所述发光合成基质是通过被活性C因子、活性B因子或由所述前凝固酶的转化得到的凝固酶消化而使发光基质游离的物质，所述反应溶液的钠离子浓度为250～390mM，钙离子浓度为0.5～10mM，氯化物离子浓度为250～361.5mM，以及Tris浓度为20～30mM。
本发明的第5方案为，根据第4方案所述的内毒素的测定方法，其中，所述反应溶液的pH为7.7～8.5。
本发明的第6方案为，根据第4方案或第5方案所述的内毒素的测定方法，其中，所述反应溶液的镁离子浓度为10～20mM，碳酸离子浓度为1～5mM。
本发明的第7方案为，根据第1方案～第6方案中任一方案所述的内毒素的测定方法，其中，所述溶解物试剂是从鲎血细胞中提取的成分。
本发明的第8方案为，根据第1方案～第7方案中任一方案所述的内毒素的测定方法，其中，在所述内毒素测定步骤中，所述被测试样的内毒素浓度是根据使用水中含有浓度已知内毒素的稀释系列制作的校准曲线和所述荧光素酶反应步骤中得到的发光量测定的。
本发明的第9方案为，一种内毒素测定用试剂盒，其是用于测定透析液或水的内毒素浓度的试剂盒，含有：第一容器，其包含含溶解物试剂的干燥粉末；第二容器，其包含含荧光素酶生物发光试剂的干燥粉末，在所述第一容器中将规定量的透析液或水混合来制备第一反应溶液，然后将得到的第一反应溶液总量混合到所述第二容器中，得到的第二反应溶液的钠离子浓度为250～390mM，钙离子浓度为0.5～10mM，氯化物离子浓度为250～361.5mM，以及Tris浓度为20～30mM。
本发明的第10方案为，根据第9方案所述的内毒素测定用试剂盒，其中，所述第二反应溶液的pH为7.7～8.5，镁离子浓度为10～20mM，碳酸离子浓度为1～5mM。
本发明的第11方案为，一种内毒素测定用试剂盒，其是用于测定透析液或水的内毒素浓度的试剂盒，其中，所述试剂盒含有包含干燥粉末的容器，所述干燥粉末包含溶解物试剂和荧光素酶生物发光试剂，在所述容器中将规定量的透析液或水混合而制备的反应溶液的钠离子浓度为250～390mM，钙离子浓度为0.5～10mM，氯化物离子浓度为250～361.5mM，以及Tris浓度为20～30mM。
本发明的第12方案为，根据第11方案所述的内毒素测定用试剂盒，其中，所述反应溶液的pH为7.7～8.5，镁离子浓度为10～20mM，碳酸离子浓度为1～5mM。
本发明的第13方案为，根据第9方案～第12方案中任一方案所述的内毒素测定用试剂盒，其用于实施第1方案～第8方案中任一方案所述的内毒素的测定方法。
发明效果
根据本发明的内毒素的测定方法，即使在使用由水制作的校准曲线时，也能够更高精度地测定透析液中的内毒素浓度。
另外，通过使用本发明的内毒素测定用试剂盒，能够更简单且容易地实施该测定方法。
具体实施方式
本发明的内毒素的测定方法是测定水或透析液的内毒素浓度的方法，且利用溶解物反应和生物发光法。该生物发光中使用光合成基质、荧光素酶和ATP，所述光合成基质是通过被由溶解物反应产生的活性C因子、活性B因子或凝固酶的蛋白酶活性消化而使发光基质游离的发光合成基质。该方法中，被测试样中含有内毒素时，C因子被内毒素激活，B因子被活性C因子激活，由活性B因子使前凝固酶转化为凝固酶。由产生的活性C因子、活性B因子或凝固酶的蛋白酶活性使发光合成基质分解。由此，游离的发光基质(荧光素或其衍生物)通过荧光素酶和ATP进行生物发光。被测试样中的内毒素量越多，则产生的凝固酶的量会越多，作为结果，通过荧光素酶产生的发光量增多，因此与观察透过光量衰减的比浊法相比，S/N(信噪比，Signal/Noise)优异。
具体地，将水或透析液作为被测试样，具有下述的溶解物反应步骤、荧光素酶反应步骤和内毒素测定步骤。
溶解物反应步骤，其将规定量的被测试样与含溶解物试剂的干燥粉末混合来制备第一反应溶液，然后将该第一反应溶液以规定时间进行温育。
荧光素酶反应步骤，其在上述溶解物反应步骤后，在避光下，将上述第一反应溶液与含荧光素酶生物发光试剂的干燥粉末混合来制备第二反应溶液，并测定该第二反应溶液的发光量。
内毒素测定步骤，其根据上述荧光素酶反应步骤中得到的发光量，测定上述被测试样的内毒素浓度。
本发明中使用的溶解物试剂含有C因子、B因子和前凝固酶。作为本发明中使用的溶解物试剂，只要是反应中通常使用的试剂，则没有特别限定。例如，可以将由从鲎血细胞中提取的成分形成的溶解物试剂的干燥粉末用作本发明中的含溶解物试剂的干燥粉末。溶解物试剂可以通过常规方法由鲎血细胞制备。
在本发明和本申请的说明书中，“鲎”是指例如可举出：属于中华鲎(Tachypleustridentatus)或南方鲎(Tachypleus gigas)等鲎(Tachypleus)属的鲎、属于美洲鲎(Limulus polyphemus)等鲎(Limulus)属的鲎、属于圆尾鲎(Carcinoscorpiusrotundicauda)等鲎(Carcinoscorpius)属的鲎。
本发明中使用的溶解物试剂所含有的C因子、B因子和前凝固酶也可以是重组蛋白。作为“由重组蛋白构成的C因子”，可以是由与从野生鲎血细胞提取物中纯化的C因子(野生型C因子)相同的氨基酸序列组成的重组蛋白，可以是野生型C因子中导入各种突变而成的突变型蛋白(突变体)，也可以是野生型C因子或突变体的N末端或C末端中融合其他的肽或蛋白而成的变体。同样地，作为“由重组蛋白构成的B因子”，可以是由与从野生鲎血细胞提取物中纯化的B因子(野生型B因子)相同的氨基酸序列组成的重组蛋白，可以是野生型B因子中导入各种突变而成的突变体，也可以是野生型B因子或突变体的N末端或C末端中融合其他的肽或蛋白而成的变体。作为“由重组蛋白构成的前凝固酶”，可以是由与从野生鲎血细胞提取物中纯化的前凝固酶(野生型前凝固酶)相同的氨基酸序列组成的重组蛋白，可以是野生型前凝固酶中导入各种突变而成的突变体，也可以是野生型前凝固酶或突变体的N末端或C末端中融合其他的肽或蛋白而成的变体。
作为突变体，只要是不损害各自活性的变体即可。例如，如果有公知的变体，则只要使用它即可，也可以使用重新改造野生型而得到的变体。在重新改造的情况下，例如，优选设计成表达的C因子、B因子或前凝固酶的活性中的酶活性高于野生型而得到的变体等。例如可举出：野生型的氨基酸序列中缺失、插入、置换或增添1个或数个的氨基酸而成的氨基酸序列等。这里，“缺失、插入、置换或增添1个或数个的氨基酸而成的”是指利用定点诱导突变法等公知的突变多肽制作法进行意图缺失、插入、置换或增添能够缺失、插入、置换或增添程度的数(优选为10个以下、更优选为7个以下，最优选为5个以下)的氨基酸。此外，野生型与突变体的氨基酸序列的序列一致性优选为70％以上，更优选为80％以上，进一步优选为90％以上，最优选为95％以上。
需要说明的是，氨基酸序列彼此间的序列一致性(同源性)通过以下方式求出：通过对两个氨基酸序列在插入和缺失对应的部分中加入空位(gap)的同时进行并列排置，以使对应的氨基酸达到最多一致，由此求出在得到的比对中一致的氨基酸相对于除空位之外的全部氨基酸序列的比例。氨基酸序列彼此间的序列一致性可使用本技术领域中公知的各种同源性检索软件求得。
作为野生型或突变体的C因子、B因子和前凝固酶中融合的肽或蛋白，只要不损害各活性，则没有特别限定。作为该肽等，例如可举出：广泛用于组氨酸标签、HA(hemagglutinin，血细胞凝集素)标签、Myc标签和Flag标签等重组蛋白的表达与纯化的标签等。
由重组蛋白构成的C因子、B因子和前凝固酶例如通过将编码各个蛋白的基因导入作为宿主的细胞，使其表达于所得到的转化体后进行纯化而得到。作为宿主的细胞，可以使用大肠杆菌、酵母、昆虫细胞、哺乳细胞，也可以使用利用了这些细胞提取物的无细胞表达系统。此外，利用基因导入的转化体的制作、得到的转化体的培养和重组蛋白的表达、以及从培养物纯化重组蛋白可以通过常规方法进行。
编码野生型的C因子、B因子和前凝固酶的基因根据文献和数据库(例如，EMBL核酸序列数据库(EMBL Nucleotide Sequence Database)(http://www.ebi.ac.uk/embl/))而公知。因此，例如，编码B因子的基因参照J.Biol.Chem.268，21384-21388(1993)、编码C因子的基因参照J.Biol.Chem.266，6554-6561(1991)、编码前凝固酶的基因参照国际公布第2008/004674号中记载的碱基序列信息等，可以利用PCR法等进行适当扩增并克隆。此外，编码突变体的C因子、B因子和前凝固酶的基因可以基于编码由目标氨基酸序列组成的蛋白的碱基序列，通过化学合成来制造，也可以通过适当改造各自的野生型基因来制造。此外，本发明所使用的转化体中导入的编码C因子、B因子和前凝固酶的基因优选为将简并密码子修改为宿主的密码子使用频率较高者的基因。
此外，本发明中，也可以使用市售的溶解物试剂的干燥粉末。
本发明中使用的溶解物试剂中所含的B因子相对于C因子的含有比例(B因子/C因子)以质量比计优选为10/1～0.1/1，更优选为2/1～0.5/1。此外，该溶解物试剂中所含的前凝固酶相对于C因子的含有比例(前凝固酶/C因子)以质量比计优选为10/1～0.1/1，更优选为2/1～0.5/1。
本发明中使用的溶解物试剂中可以适当含有盐、pH调节剂等非来源于鲎血细胞提取成分的其它成分。
本发明中使用的荧光素酶生物发光试剂含有发光合成基质、抗盐性荧光素酶和ATP。本发明中使用的荧光素酶生物发光试剂的干燥粉末如下得到：制备含发光合成基质、抗盐性荧光素酶和ATP的溶液，并通过冷冻干燥等使该溶液干燥。
本发明中使用的发光合成基质是通过被由溶解物反应生成的活性C因子、活性B因子或凝固酶消化而使发光基质游离的物质。作为发光基质，只要是通过荧光素酶和ATP进行生物发光的物质，则没有特别限定，例如可以使用萤火虫荧光素或其衍生物等。作为荧光素的衍生物，例如可举出：氨基荧光素。
作为本发明中使用的发光合成基质，例如可举出：发光基质(荧光素或其衍生物)与肽的连接物，且发光基质与肽的连接位点是由被活性C因子、活性B因子和凝固酶中的至少任一种的蛋白酶活性切断的氨基酸序列组成的。其中，优选氨基荧光素的氨基与肽的羧基形成酰胺键，该酰胺键被活性C因子、活性B因子和凝固酶中的至少任一种的蛋白酶活性切断的物质。该肽的氨基酸残基数和氨基酸序列没有限定，从特异性、合成成本、处理容易性等角度出发，氨基酸残基数优选为2个～10个。此外，该肽的种类可以单独，也可以是两种以上的组合。
具体地，作为具有凝固酶的识别序列的肽，可举出：Gly-Val-Ile-Gly-Arg-(SEQID NO:1)、Val-Leu-Gly-Arg-(SEQ ID NO:2)、Leu-Arg-Arg-(SEQ ID NO:3)、Ile-Glu-Gly-Arg-(SEQ ID NO:4)、Leu-Gly-Arg-(SEQ ID NO:5)、Val-Ser-Gly-Arg-(SEQ ID NO:6)、Val-Gly-Arg-(SEQ ID NO:7)等。该肽的N末端可以被保护基保护。作为保护基，只要是通常在该领域中使用的基团，就可以无限定地使用。具体地，例如可举出：N-琥珀酰基、叔丁氧基羰基、苯甲酰基、对甲苯磺酰基等。
本发明中使用的发光合成基质可以是市售的，也可以是合成的。作为市售的发光合成基质，例如可举出：由Promega公司市售的“Proteasome-GloTM Assay Systems”附带的发光合成基质(苯甲酰基-Leu-Arg-Arg-氨基荧光素)。作为合成的方法，例如可举出：日本特表2005-530485号公报(国际公布第2003/066611号)中记载的方法。
本发明中使用的荧光素酶生物发光试剂中所含的抗盐性荧光素酶与野生型荧光素酶相比，是不易受到因氯化钠导致的发光抑制影响的突变型荧光素酶。抗盐性荧光素酶是指野生型荧光素酶中导入突变后的突变型荧光素酶，且0.9质量％氯化钠溶液中的发光强度为不含氯化钠的溶液中的发光强度50％以上的突变型荧光素酶。作为本发明中使用的抗盐性荧光素酶，荧光素酶活性的残留活性为50％以上即可，优选为60％以上，更优选为70％以上，尤其优选为80％以上，最优选为90％以上。
需要说明的是，荧光素酶的“残留活性(％)”是指将不含氯化钠的溶液中的发光强度作为100％时，0.9质量％氯化钠溶液中的发光强度的相对值([0.9质量％氯化钠溶液中的发光强度]/[不含氯化钠的溶液中的发光强度]×100)(％)。需要说明的是，荧光素-荧光素酶发光反应的反应溶液为“不含氯化钠的溶液”是指不混配氯化钠而制备的反应溶液。为了计算残留活性而进行荧光素-荧光素酶发光反应时的“不含氯化钠的溶液”与“0.9质量％氯化钠溶液”，除了氯化钠之外的组成完全相同，反应温度及时间等反应条件也一致。
本发明中使用的抗盐性荧光素酶优选来源于甲虫的野生型荧光素酶的突变体，在编码野生型甲虫荧光素酶的氨基酸序列中，特别优选至少具有选自下述(a)、(b)、(c)和(d)中一种以上的突变的突变型甲虫荧光素酶(专利文献1)。
(a)与野生型北美萤火虫荧光素酶的氨基酸序列中的第288位缬氨酸相对应的氨基酸突变为异亮氨酸、亮氨酸或苯丙氨酸。
(b)与野生型北美萤火虫荧光素酶的氨基酸序列中的第376位亮氨酸相对应的氨基酸突变为脯氨酸。
(c)与野生型北美萤火虫荧光素酶的氨基酸序列中的第455位谷氨酸相对应的氨基酸突变为缬氨酸、丙氨酸、丝氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或苯丙氨酸。
(d)与野生型北美萤火虫荧光素酶的氨基酸序列中的第488位谷氨酸相对应的氨基酸突变为缬氨酸、丙氨酸、丝氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或苯丙氨酸。
在本发明和本申请的说明书中，“野生型甲虫荧光素酶”是指可举出：北美萤火虫(Photinus pyralis)荧光素酶(SEQ ID NO:8)、平家萤(Lucio lalateralis)荧光素酶(SEQID NO:9)、源氏萤(Luciola cruciata)荧光素酶(SEQ ID NO:10)、东欧萤火虫(Luciolamingrelica)荧光素酶、大萤火虫(Lampyrisnoctiluca)荧光素酶、发光叩甲虫(Pyrophorusplagiophthalamus)荧光素酶(SEQ ID NO:11)等。需要说明的是，各种野生型甲虫荧光素酶的氨基酸序列可以在数据库(例如，EMBL-EBI Database(http://www.ebi.ac.uk/queries/))中检索到。
当野生型甲虫荧光素酶不是北美萤火虫荧光素酶时，该野生型甲虫荧光素酶的氨基酸序列中“与北美萤火虫荧光素酶的氨基酸序列中的第X位氨基酸相对应的氨基酸”是指，使用氨基酸序列同源性分析软件(例如，“Micro Genie”，Beckman Coulter公司制)等，在以使同源性(序列一致性)达到最高的方式对该野生型甲虫荧光素酶和北美萤火虫荧光素酶的氨基酸序列进行比对时，位于与“北美萤火虫荧光素酶的氨基酸序列的第X位氨基酸”相对应的位置上的氨基酸。
具体地，与野生型北美萤火虫荧光素酶的氨基酸序列中的第288位缬氨酸相对应的氨基酸分别对应于野生型平家萤荧光素酶的氨基酸序列中的第290位缬氨酸、野生型源氏萤荧光素酶的氨基酸序列中的第290位缬氨酸、野生型发光叩甲虫荧光素酶的氨基酸序列中的第285位缬氨酸。野生型北美萤火虫荧光素酶的氨基酸序列中的第376位亮氨酸分别对应于野生型平家萤荧光素酶的氨基酸序列中的第378位亮氨酸、野生型源氏萤荧光素酶的氨基酸序列中的第378位亮氨酸。野生型北美萤火虫荧光素酶的氨基酸序列中的第455位谷氨酸分别对应于野生型平家萤荧光素酶的氨基酸序列中的第457位谷氨酸、野生型源氏萤荧光素酶的氨基酸序列中的第457位谷氨酸、野生型发光叩甲虫荧光素酶的氨基酸序列中的第452位谷氨酸。野生型北美萤火虫荧光素酶的氨基酸序列中的第488位谷氨酸分别对应于野生型平家萤荧光素酶的氨基酸序列中的第490位谷氨酸、野生型源氏萤荧光素酶的氨基酸序列中的第490位谷氨酸、野生型发光叩甲虫荧光素酶的氨基酸序列中的第489位谷氨酸。
当本发明中使用的抗盐性荧光素酶具有上述(a)的突变时，作为该突变，与野生型北美萤火虫荧光素酶的氨基酸序列中的第288位缬氨酸相对应的氨基酸优选突变为异亮氨酸或亮氨酸，更优选突变为异亮氨酸。
当本发明中使用的抗盐性荧光素酶具有上述(c)的突变时，作为该突变，与野生型北美萤火虫荧光素酶的氨基酸序列中的第455位谷氨酸相对应的氨基酸优选突变为缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或丙氨酸，更优选突变为缬氨酸。
当本发明中使用的抗盐性荧光素酶具有上述(d)的突变时，作为该突变，与野生型北美萤火虫荧光素酶的氨基酸序列中的第488位谷氨酸相对应的氨基酸优选突变为缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或丙氨酸，更优选突变为缬氨酸。
本发明中使用的抗盐性荧光素酶可以只具有上述(a)、(b)、(c)和(d)的突变中的一种，也可以具有两种以上的组合。其中，由于0.9质量％氯化钠溶液中由荧光素-荧光素酶发光反应产生的发光强度大于野生型甲虫荧光素酶的发光强度，因此在上述(a)、(b)、(c)和(d)的突变中，优选只具有上述(a)的突变的突变型甲虫荧光素酶、只具有上述(b)的突变的突变型甲虫荧光素酶、只具有上述(d)的突变的突变型甲虫荧光素酶、具有上述(a)和(b)的突变的突变型甲虫荧光素酶、具有上述(a)和(d)的突变的突变型甲虫荧光素酶、或者具有上述(a)和(b)和(d)的突变的突变型甲虫荧光素酶，进一步由于残留活性也较高，因此在上述(a)、(b)、(c)和(d)的突变中，更优选只具有上述(a)的突变的突变型甲虫荧光素酶、只具有上述(d)的突变的突变型甲虫荧光素酶、具有上述(a)和(b)的突变的突变型甲虫荧光素酶、具有上述(a)和(d)的突变的突变型甲虫荧光素酶、或者具有上述(a)和(b)和(d)的突变的突变型甲虫荧光素酶。
作为本发明中使用的抗盐性荧光素酶，例如可举出：与野生型北美萤火虫荧光素酶的氨基酸序列中的第288位缬氨酸相对应的氨基酸被置换为异亮氨酸的突变型甲虫荧光素酶、与野生型北美萤火虫荧光素酶的氨基酸序列中的第376位亮氨酸相对应的氨基酸被置换为脯氨酸的突变型甲虫荧光素酶、与野生型北美萤火虫荧光素酶的氨基酸序列中的第455位谷氨酸相对应的氨基酸被置换为缬氨酸的突变型甲虫荧光素酶、与野生型北美萤火虫荧光素酶的氨基酸序列中的第488位谷氨酸相对应的氨基酸被置换为缬氨酸的突变型甲虫荧光素酶、与野生型北美萤火虫荧光素酶的氨基酸序列中的第288位缬氨酸相对应的氨基酸被置换为异亮氨酸且与第376位亮氨酸相对应的氨基酸被置换为脯氨酸的突变型甲虫荧光素酶、与野生型北美萤火虫荧光素酶的氨基酸序列中的第288位缬氨酸相对应的氨基酸被置换为异亮氨酸且与第488位谷氨酸相对应的氨基酸被置换为缬氨酸的突变型甲虫荧光素酶、与野生型北美萤火虫荧光素酶的氨基酸序列中的第288位缬氨酸相对应的氨基酸被置换为异亮氨酸且与第376位亮氨酸相对应的氨基酸被置换为脯氨酸且与第488位谷氨酸相对应的氨基酸被置换为缬氨酸的突变型甲虫荧光素酶等。
需要说明的是，在编码野生型甲虫荧光素酶的氨基酸序列中，至少具有选自上述(a)、(b)、(c)和(d)中一种以上的突变的突变型甲虫荧光素酶可通过专利文献1中记载的方法合成。
本发明中使用的荧光素酶生物发光试剂的干燥粉末中的发光合成基质的量优选为在荧光素酶反应步骤中制备的第二反应溶液中的发光合成基质浓度为0.1～100μM的量，更优选为在荧光素酶反应步骤中制备的第二反应溶液中的发光合成基质浓度为1～20μM的量。如果发光合成基质的浓度为上述下限值以上，则可得到充分的检测灵敏度，另一方面，如果发光合成基质的浓度为上述上限值以下，则可抑制材料成本。
本发明中使用的荧光素酶生物发光试剂的干燥粉末中的抗盐性荧光素酶的量优选为在荧光素酶反应步骤中制备的第二反应溶液中的抗盐性荧光素酶浓度为1ng/μL～10μg/μL的量，更优选为在荧光素酶反应步骤中制备的第二反应溶液中的抗盐性荧光素酶浓度为10ng/μL～100ng/μL的量。如果抗盐性荧光素酶的浓度为上述下限值以上，则可得到充分的检测灵敏度，另一方面，如果抗盐性荧光素酶的浓度为上述上限值以下，则可抑制材料成本。
本发明中使用的荧光素酶生物发光试剂的干燥粉末中的ATP的量优选为在荧光素酶反应步骤中制备的第二反应溶液中的ATP浓度为10-7～10-3M的量，更优选为在荧光素酶反应步骤中制备的第二反应溶液中的ATP浓度为10-6～10-4M的量。如果ATP的浓度为上述下限值以上，则可防止在生物发光反应中ATP不足，另一方面，如果ATP的浓度为上述上限值以下，则可抑制材料成本，并可防止因过量ATP导致的生物发光反应的阻碍。
本发明中，首先，将规定量的被测试样(水或透析液)与含溶解物试剂的干燥粉末混合来制备第一反应溶液，然后将该第一反应溶液以规定时间进行温育(溶解物反应步骤)。在将被测试样和含溶解物试剂的干燥粉末混合后，优选对得到的第一反应溶液进行搅拌。与含溶解物试剂的干燥粉末混合的被测试样的量没有特别限定，例如可以为10μL～1mL，优选为100～800μL，更优选为100～500μL。对第一反应溶液进行温育的温度和时间，只要是可以进行溶解物反应的温度和时间，则没有特别限定，例如，可以在20～40℃温育5～40分钟，优选为在37℃温育10～30分钟。
接着，在避光下，将第一反应溶液与含荧光素酶生物发光试剂的干燥粉末混合来制备第二反应溶液，并测定该第二反应溶液的发光量(荧光素酶反应步骤)。在将第一反应溶液与含荧光素酶生物发光试剂的干燥粉末混合后，优选对得到的第二反应溶液进行搅拌。生物发光反应的反应温度即对制备的第二反应溶液的发光量进行测定前的温度，只要是可以进行生物发光反应的温度即可，例如可以为室温～40℃，优选为20～40℃。此外，生物发光反应的反应时间即从制备了第二反应溶液后直至对该反应溶液的发光量进行测定前的时间没有特别限定，例如可以为0秒～2分钟，优选为0～30秒。需要说明的是，反应时间为0秒是指将第一反应溶液与含荧光素酶生物发光试剂的干燥粉末混合后立即测定发光量。
第二反应溶液的发光量例如可以通过光电倍增管(photomultiplier,PMT)进行检测。发光量的测定时间没有特别限定，例如可以为10～60秒。除此之外，也可以使用市售的生物发光测定装置对第二反应溶液的发光量进行测定。作为生物发光测定装置，例如可举出：“Lumitester(注册商标)C1000”(龟甲万株式会社制)等。
本发明中的溶解物反应步骤和荧光素酶反应步骤，例如可以通过使用日本专利第5979318号公报中记载的试样液分析系统、市售的内毒素仪“Luminutes(注册商标)-ET”(东亚DKK株式会社制)进行测定。
最后，根据荧光素酶反应步骤中得到的发光量，测定被测试样的内毒素浓度(内毒素测定步骤)。具体地，对于浓度已知的内毒素标准品的稀释系列，同样地测定发光量，制作表示内毒素浓度与发光量关系的校准曲线。根据该校准曲线和对于被测试样在荧光素酶反应步骤中得到的发光量，计算该被测试样的内毒素浓度。荧光素酶反应中得到的发光量依赖于由溶解物反应产生的活性C因子、活性B因子或凝固酶的量和荧光素酶反应中产生的发光基质(荧光素或其衍生物)的量。因此，对于校准曲线制作中使用的内毒素标准品的稀释系列和使用制作的校准曲线计算内毒素浓度的被测试样，优选在相同条件下测定用于反应的被测试样的量、对第一反应溶液进行温育的温度和时间、对第二反应溶液进行温育的温度和时间。
即使是抗盐性荧光素酶，也会受到反应溶液中的氯化钠浓度的影响。即，第二反应溶液的氯化钠浓度越高，则荧光素酶反应中产生的发光量越降低。由于第二反应溶液中含有来自被测试样的氯化钠，因此在被测试样为水时和被测试样为透析液时，第二反应溶液的氯化钠浓度不同。因此，即使是相同内毒素浓度，将透析液作为被测试样得到的发光量也会少于将水作为被测试样得到的发光量。
本发明中，在被测试样为水和被测试样为透析液的任一情况下，均可通过使第二反应溶液的各离子浓度和Tris浓度在一定的范围内，从而抑制被测试样为水时和被测试样为透析液时的第二反应溶液的发光量差异。因此，本发明中，可以使用如下校准曲线来高精度地测定透析液的内毒素浓度，所述校准曲线是使用将浓度已知的内毒素标准品溶解于水中而制作的稀释系列来制作的。
本发明中，在被测试样为水和被测试样为透析液的任一情况下，均调整第二反应溶液的钠离子浓度为250～390mM，钙离子浓度为0.5～10mM，氯化物离子浓度为250～361.5mM，以及Tris浓度为20～30mM。例如，氯化钠浓度为250～390mM时，因氯化钠的浓度差导致的发光量差异较小。因此，如果在被测试样为水时制备的第二反应溶液的氯化钠浓度和在被测试样为透析液时制备的第二反应溶液的氯化钠浓度均在250～390mM的范围内，则即使使用由水制作的校准曲线，也能够高精度地测定透析液中的内毒素浓度。氯化钙和Tris也同样。
本发明中，在被测试样为水和被测试样为透析液的任一情况下，均优选调整第二反应溶液的镁离子浓度为10～20mM，碳酸离子浓度为1～5mM。如果在被测试样为水时制备的第二反应溶液的镁离子浓度和在被测试样为透析液时制备的第二反应溶液的镁离子浓度均在10～20mM的范围内，则能够进一步减小因镁离子的浓度差导致的发光量差异。碳酸离子也同样，如果在被测试样为水时制备的第二反应溶液的碳酸离子浓度和在被测试样为透析液时制备的第二反应溶液的碳酸离子浓度均在1～5mM的范围内，则能够进一步减小因碳酸离子的浓度差导致的发光量差异。
本发明中，在被测试样为水和被测试样为透析液的任一情况下，均优选调整第二反应溶液的pH为7.7～8.5。如果pH为7.7～8.5，则即使是相同内毒素浓度，发光量也会更大，能够进一步提高内毒素的检测灵敏度。
第二反应溶液的各离子浓度和Tris浓度、pH，可以通过调节溶解物反应步骤中使用的含溶解物试剂的干燥粉末和荧光素酶反应步骤中使用的含荧光素酶生物发光试剂的干燥粉末中的各离子浓度和Tris浓度来进行调整。例如，测定溶解物试剂的干燥粉末和荧光素酶生物发光试剂的干燥粉末中所含的钠盐、钙盐、镁盐、氯化物盐、碳酸盐和Tris的浓度，并使用规定量的水制备了第一反应溶液和第二反应溶液的情况下，调查为了使第二反应溶液的各离子浓度和Tris浓度达到规定浓度范围的下限值以上而不足的量。在溶解物试剂的干燥粉末和荧光素酶生物发光试剂的干燥粉末中的任一种里添加该不足的量。也可以分成含溶解物试剂的干燥粉末和含荧光素酶生物发光试剂的干燥粉末这两者进行添加。这时，在使用规定量的透析液来制备了第一反应溶液和第二反应溶液的情况下，注意第二反应溶液的各离子浓度和Tris浓度不要超过规定浓度范围的上限值。例如，通过预先调查作为被测试样的透析液的各离子浓度，能够容易地调整溶解物试剂的干燥粉末和荧光素酶生物发光试剂的干燥粉末中所含的各盐的量，以使第二反应溶液的各离子浓度无论是在使用水还是使用透析液时均能处于规定的范围内。
例如，透析液的钠离子浓度通常为100～140mM。于是，调整含溶解物试剂的干燥粉末和含荧光素酶生物发光试剂的干燥粉末中所含的钠盐的含量，以使第二反应溶液中的来自被测试样之外的钠离子浓度为250～390mM。同样地，由于透析液的氯化物离子浓度通常为100～140mM，因此调整含溶解物试剂的干燥粉末和含荧光素酶生物发光试剂的干燥粉末中所含的氯化物盐的含量，以使第二反应溶液中的来自被测试样之外的氯化物离子浓度为250～361.5mM。
另外，也可以将上述溶解物反应步骤中使用的含溶解物试剂的干燥粉末与上述荧光素酶反应步骤中使用的含荧光素酶生物发光试剂的干燥粉末预先混合形成单剂，在避光下进行溶解物反应步骤和荧光素酶反应步骤的一系列步骤。具体地，首先，在避光下，将规定量的被测试样与溶解物试剂和含荧光素酶生物发光试剂的干燥粉末(以下称为“单剂化干燥粉末”)混合来制备反应溶液。接着，将得到的反应溶液在避光下以规定时间进行温育，同时进行溶解物反应和荧光素酶反应。然后，根据该反应溶液的发光量，测定被测试样的内毒素浓度。
使用的溶解物试剂或荧光素酶生物发光试剂可以使用与上述同样的试剂。此外，单剂化干燥粉末中的溶解物试剂的各成分含量优选调整为使与规定量的被测试样混合而得到的反应溶液中的浓度等同于上述第一反应溶液中的浓度。同样地，单剂化干燥粉末中的荧光素酶生物发光试剂的各成分含量优选调整为使与规定量的被测试样混合而得到的反应溶液中的浓度等同于上述第二反应溶液中的浓度。具体地，优选混合有规定量的被测试样和单剂化干燥粉末的反应溶液的钠离子浓度为250～390mM，钙离子浓度为0.5～10mM，氯化物离子浓度为250～361.5mM，以及Tris浓度为20～30mM，而且，更优选pH为7.7～8.5，镁离子浓度为10～20mM，碳酸离子浓度为1～5mM。
通过将本发明的内毒素的测定方法中使用的各种试剂制成试剂盒，可以更简单地实施该方法。作为用于测定透析液或水的内毒素浓度的试剂盒，例如优选含有：第一容器，其包含含溶解物试剂的干燥粉末；第二容器，其包含含荧光素酶生物发光试剂的干燥粉末。此外，代替第一容器和第二容器，优选含有：含单剂化干燥粉末的容器。而且，优选含有记载有使用该试剂盒以实施本发明的内毒素测定方法的操作说明的书面材料等。
该试剂盒中，含溶解物试剂的干燥粉末和含荧光素酶生物发光试剂的干燥粉末中所含的盐和Tris的浓度，优选调整为在第一容器中将规定量的透析液或水混合来制备第一反应溶液，然后将得到的第一反应溶液总量混合到上述第二容器中而得到的第二反应溶液的钠离子浓度为250～390mM，钙离子浓度为0.5～10mM，氯化物离子浓度为250～361.5mM，以及Tris浓度为20～30mM，更优选调整为第二反应溶液的pH为7.7～8.5，镁离子浓度为10～20mM，碳酸离子浓度为1～5mM。同样地，单剂化干燥粉末中所含的盐和Tris的浓度，优选调整为在含单剂化干燥粉末的容器中将规定量的透析液或水混合而制备的反应溶液的钠离子浓度为250～390mM，钙离子浓度为0.5～10mM，氯化物离子浓度为250～361.5mM，以及Tris浓度为20～30mM，更优选调整为第二反应溶液的pH为7.7～8.5、镁离子浓度为10～20mM，碳酸离子浓度为1～5mM。
实施例
下面，示出实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明不限于以下实施例。
[实施例1]
使用溶解物反应与生物发光反应测定水中的内毒素，调查反应溶液中的钠浓度的影响。
内毒素使用来源于大肠杆菌O113：H10的内毒素(富士胶片和光纯药株式会社制)。此外，除非另有记载，水使用不含内毒素的无致热源的水。本实施例中，作为被测试样，使用以使内毒素活性值达到0.01EU/mL的方式将内毒素溶解在无致热源的水中而成的内毒素水溶液，作为空白(对照被测试样)，使用无致热源的水。
内毒素的测定使用内毒素仪“Luminutes(注册商标)-ET”(东亚DKK株式会社制)。将200μL的被测试样添加到包含溶解物试剂的干燥粉末的容器中并搅拌，然后将该容器固定在内毒素仪的规定位置上，通过在37℃温育20分钟进行溶解物反应。在反应结束后的反应物中加入含荧光素酶生物发光试剂的干燥粉末，引发生物发光反应。生物发光与溶解物反应同样地在37℃下进行。通过PMT检测并测定从引发生物发光反应开始直至经过40秒期间所产生的发光量。
作为溶解物试剂，使用鲎血细胞的提取成分(溶解物试剂)的干燥粉末，其为该内毒素仪的专用试剂盒附带的溶解物试剂的干燥粉末(东亚DKK株式会社制)。
荧光素酶生物发光试剂中，作为抗盐性荧光素酶，使用北美萤火虫荧光素酶的突变体(V288I+E488V)(专利文献1)。此外，作为发光合成基质，使用苯甲酰基-Leu-Gly-Arg-氨基荧光素(AAT Bioquest公司制)。
作为含荧光素酶生物发光试剂的干燥粉末，使用制备了含有0.25μg/μL的抗盐性荧光素酶、5mM的ATP、93mM的乙酸镁和0.1M的发光合成基质的溶液(pH8.0)并将该溶液30μL冷冻干燥而得到的干燥粉末。作为含溶解物试剂的干燥粉末，使用制备了含有167mM的Tris-Cl和0、233、466、1000、1333或1666mM的氯化钠的溶液(pH8.0)并将该溶液30μL冷冻干燥而得到的干燥粉末。由于荧光素酶生物发光试剂中基本不含盐或Tris，因此在被测试样为水时，生物发光反应的反应溶液的钠离子浓度、钙离子浓度、镁离子浓度、氯化物离子浓度、碳酸离子浓度和Tris浓度来自含溶解物试剂的干燥粉末。
将从各试验区的发光量的测定值中减去空白的发光量的测定值后的发光量作为各试验区的发光量。以使用了氯化钠浓度为0mM的荧光素酶生物发光试剂的试验区(生物发光反应的反应溶液中的氯化钠浓度为0mM的试验区)的发光量为100％，计算各试验区的相对发光量(％)。计算结果如表1所示。
表1
生物发光反应的反应溶液中的氯化钠浓度[mM] 相对发光量[％]
100 100.0
135 62.1
170 60.2
250 48.7
320 44.6
390 42.1
如表1所示，当生物发光反应的反应溶液中的氯化钠浓度变高时，相对发光量有下降的趋势，但当反应溶液中的氯化钠浓度为250～390mM时，相对发光量基本相等，可知如果在该浓度范围的话，就可充分减少因氯化钠浓度不同导致的发光量差异。例如，以使生物发光反应的反应溶液中的来自被测试样之外的氯化钠浓度达到150mM的方式制备了含溶解物试剂的干燥粉末和含荧光素酶生物发光试剂的干燥粉末的情况下，在被测试样为水时生物发光反应的反应溶液的氯化钠浓度为150mM，在被测试样为透析液(氯化钠浓度为100～140mM)时生物发光反应的反应溶液的氯化钠浓度为250～390mM。可知无论被测试样为水还是被测试样为透析液时，生物发光反应的反应溶液中的氯化钠浓度均在250～390mM的范围内，二者的发光量差异较小，即使在透析液为被测试样时，也可使用由水制作的校准曲线来测定内毒素浓度。
实施例2
作为含溶解物试剂的干燥粉末，使用制备了含有167mM的Tris-Cl、0或1000mM的氯化钠和0、3.3、6.6、13.3、33.3、66.6、133或200mM的氯化钙的溶液(pH8.0)并将该溶液30μL冷冻干燥而得到的干燥粉末，除此以外，与实施例1同样地，将含有0.01EU/mL的内毒素的水作为被测试样，使用溶解物反应与生物发光反应测定该被测试样的内毒素浓度。测定结果如表2所示。
表2
Figure BDA0003666339910000141
如表2所示，当生物发光反应的反应溶液中的氯化钙浓度变高时，相对发光量有下降的趋势，该趋势在生物发光反应的反应溶液中的氯化钠浓度越高时越显著。无论氯化钠浓度如何，生物发光反应的反应溶液中的氯化钙浓度为0.5～10mM时，因氯化钙浓度不同导致的发光量差异较小。基于此，以使生物发光反应的反应溶液中的来自被测试样之外的氯化钙浓度达到0.5～10mM的方式制备了含溶解物试剂的干燥粉末和含荧光素酶生物发光试剂的干燥粉末的情况下，可知无论被测试样为水还是被测试样为透析液时，生物发光反应的反应溶液的氯化钙浓度均在0.5～10mM的范围内，二者的发光量差异较小，即使在透析液为被测试样时，也可使用由水制作的校准曲线来更高精度地测定内毒素浓度。
实施例3
作为含溶解物试剂的干燥粉末，使用制备了含有167mM的Tris-Cl、150mM的氯化钠以及13.3mM的碳酸钙的溶液(pH为7.0、7.5、8.0、8.5或9.0)并将该溶液30μL冷冻干燥而得到的干燥粉末，除此以外，与实施例1同样地，将含有0.01EU/mL的内毒素的水作为被测试样，使用溶解物反应与生物发光反应测定该被测试样的内毒素浓度。测定结果如表3所示。
表3
生物发光反应的反应溶液的pH 相对发光量[％]
7.0 55
7.5 100
8.0 224
8.5 209
9.0 98
如表3所示，生物发光反应受到反应溶液的pH的影响。尤其是生物发光反应的反应溶液的pH为8.0～8.5的试验区，相对发光量非常高，内毒素的检测灵敏度较高。
实施例4
作为被测试样，使用实施例1中使用的含有0.01EU/mL的内毒素的水或透析液。作为含溶解物试剂的干燥粉末，使用制备了含有150mM的氯化钠和13.3mM的碳酸钙的溶液以及含有133、166、200、266、333或466mM的Tris-Cl的溶液(pH8.0)并将该溶液30μL冷冻干燥而得到的干燥粉末，除此以外，与实施例1同样地，使用溶解物反应与生物发光反应测定被测试样的内毒素浓度。
作为透析液，使用“Sublood(注册商标)血液过滤补充液BSG”(扶桑药品工业株式会社制)。该透析液的钠离子浓度为140.0mM(140.0mEq/L)、钾离子浓度为2.0mM(2.0mEq/L)、钙离子浓度为3.5mM(3.5mEq/L)、镁离子浓度为1.0mM(1.0mEq/L)、氯化物离子浓度为111.5mM(111.5mEq/L)、碳酸离子浓度为35mM(70mEq/L)。测定结果如表4所示。
表4
Figure BDA0003666339910000151
如表4所示，生物发光反应受到反应溶液的Tris浓度的影响。尤其是被测试样为水时，与以透析液为被测试样时相比，受Tris浓度的影响更强，被测试样为水时和被测试样为透析液时的发光量差异变大。如果生物发光反应的反应溶液的Tris浓度在20～30mM的范围内，则被测试样为水时和被测试样为透析液时的发光量差异较小，可知即使透析液是被测试样时，也可使用由水制作的校准曲线来测定内毒素浓度。
实施例5
使用将溶解物试剂和荧光素酶生物发光试剂单剂化的干燥粉末，测定水和透析液中的内毒素量。作为被测试样，使用将0、0.001、0.003、0.005或0.01EU/mL的内毒素溶解在水或透析液中而成的溶液。水和透析液使用实施例4中使用的水和透析液。
作为单剂化的干燥粉末，使用制备了将溶解物试剂(0.38μg/μL)、0.25μg/μL的抗盐性荧光素酶、5mM的ATP和0.1M的发光合成基质与适量的氯化钠、碳酸氢钠、氯化钙一起溶解在Tris缓冲液(25mM,pH8.0)中而成的溶液并将该溶液30μL冷冻干燥而得到的干燥粉末。溶解物试剂、抗盐性荧光素酶和发光合成基质与实施例1中使用的相同。
内毒素的测定，与实施例1同样地使用内毒素仪“Luminutes(注册商标)-ET”(东亚DKK株式会社制)。将200μL的被测试样添加到包含单剂化干燥粉末的容器中并搅拌，然后将该容器固定在内毒素仪的规定位置上，在避光下，通过在37℃温育20分钟进行溶解物反应。通过PMT检测并测定从反应结束后开始直至经过40秒期间所产生的发光量。
被测试样为水时和被测试样为透析液时在发光量测定时的反应溶液的各成分的浓度如表5所示。此外，各被测试样的反应溶液的发光量的测定结果如表6所示。以使被测试样为水时的内毒素浓度为0EU/mL时的样品发光量为0的方式进行校正，测定各反应溶液的发光量。
表5
Figure BDA0003666339910000161
表6
Figure BDA0003666339910000162
如表6所示，内毒素浓度相同的样品中，无论被测试样为水时还是被测试样为透析液时均具有同等的发光量。由这些结果可知，通过使用该单剂化干燥粉末，可使用由水制作的校准曲线来高精度地测定透析液中的内毒素浓度。
序列表
<110> 东亚DKK株式会社
<120> 内毒素的测定方法
<130> J32459A1
<160> 11
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 凝固酶识别序列
<400> 1
Gly Val Ile Gly Arg
1 5
<210> 2
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 凝固酶识别序列
<400> 2
Val Leu Gly Arg
1
<210> 3
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 凝固酶识别序列
<400> 3
Leu Arg Arg
1
<210> 4
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 凝固酶识别序列
<400> 4
Ile Glu Gly Arg
1
<210> 5
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 凝固酶识别序列
<400> 5
Leu Gly Arg
1
<210> 6
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 凝固酶识别序列
<400> 6
Val Ser Gly Arg
1
<210> 7
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 凝固酶识别序列
<400> 7
Val Gly Arg
1
<210> 8
<211> 550
<212> PRT
<213> 北美萤火虫
<220>
<223> 荧光素酶
<400> 1
Met Glu Asp Ala Lys Asn Ile Lys Lys Gly Pro Ala Pro Phe Tyr Pro
1 5 10 15
Leu Glu Asp Gly Thr Ala Gly Glu Gln Leu His Lys Ala Met Lys Arg
20 25 30
Tyr Ala Leu Val Pro Gly Thr Ile Ala Phe Thr Asp Ala His Ile Glu
35 40 45
Val Asn Ile Thr Tyr Ala Glu Tyr Phe Glu Met Ser Val Arg Leu Ala
50 55 60
Glu Ala Met Lys Arg Tyr Gly Leu Asn Thr Asn His Arg Ile Val Val
65 70 75 80
Cys Ser Glu Asn Ser Leu Gln Phe Phe Met Pro Val Leu Gly Ala Leu
85 90 95
Phe Ile Gly Val Ala Val Ala Pro Ala Asn Asp Ile Tyr Asn Glu Arg
100 105 110
Glu Leu Leu Asn Ser Met Asn Ile Ser Gln Pro Thr Val Val Phe Val
115 120 125
Ser Lys Lys Gly Leu Gln Lys Ile Leu Asn Val Gln Lys Lys Leu Pro
130 135 140
Ile Ile Gln Lys Ile Ile Ile Met Asp Ser Lys Thr Asp Tyr Gln Gly
145 150 155 160
Phe Gln Ser Met Tyr Thr Phe Val Thr Ser His Leu Pro Pro Gly Phe
165 170 175
Asn Glu Tyr Asp Phe Val Pro Glu Ser Phe Asp Arg Asp Lys Thr Ile
180 185 190
Ala Leu Ile Met Asn Ser Ser Gly Ser Thr Gly Leu Pro Lys Gly Val
195 200 205
Ala Leu Pro His Arg Thr Ala Cys Val Arg Phe Ser His Ala Arg Asp
210 215 220
Pro Ile Phe Gly Asn Gln Ile Ile Pro Asp Thr Ala Ile Leu Ser Val
225 230 235 240
Val Pro Phe His His Gly Phe Gly Met Phe Thr Thr Leu Gly Tyr Leu
245 250 255
Ile Cys Gly Phe Arg Val Val Leu Met Tyr Arg Phe Glu Glu Glu Leu
260 265 270
Phe Leu Arg Ser Leu Gln Asp Tyr Lys Ile Gln Ser Ala Leu Leu Val
275 280 285
Pro Thr Leu Phe Ser Phe Phe Ala Lys Ser Thr Leu Ile Asp Lys Tyr
290 295 300
Asp Leu Ser Asn Leu His Glu Ile Ala Ser Gly Gly Ala Pro Leu Ser
305 310 315 320
Lys Glu Val Gly Glu Ala Val Ala Lys Arg Phe His Leu Pro Gly Ile
325 330 335
Arg Gln Gly Tyr Gly Leu Thr Glu Thr Thr Ser Ala Ile Leu Ile Thr
340 345 350
Pro Glu Gly Asp Asp Lys Pro Gly Ala Val Gly Lys Val Val Pro Phe
355 360 365
Phe Glu Ala Lys Val Val Asp Leu Asp Thr Gly Lys Thr Leu Gly Val
370 375 380
Asn Gln Arg Gly Glu Leu Cys Val Arg Gly Pro Met Ile Met Ser Gly
385 390 395 400
Tyr Val Asn Asn Pro Glu Ala Thr Asn Ala Leu Ile Asp Lys Asp Gly
405 410 415
Trp Leu His Ser Gly Asp Ile Ala Tyr Trp Asp Glu Asp Glu His Phe
420 425 430
Phe Ile Val Asp Arg Leu Lys Ser Leu Ile Lys Tyr Lys Gly Tyr Gln
435 440 445
Val Ala Pro Ala Glu Leu Glu Ser Ile Leu Leu Gln His Pro Asn Ile
450 455 460
Phe Asp Ala Gly Val Ala Gly Leu Pro Asp Asp Asp Ala Gly Glu Leu
465 470 475 480
Pro Ala Ala Val Val Val Leu Glu His Gly Lys Thr Met Thr Glu Lys
485 490 495
Glu Ile Val Asp Tyr Val Ala Ser Gln Val Thr Thr Ala Lys Lys Leu
500 505 510
Arg Gly Gly Val Val Phe Val Asp Glu Val Pro Lys Gly Leu Thr Gly
515 520 525
Lys Leu Asp Ala Arg Lys Ile Arg Glu Ile Leu Ile Lys Ala Lys Lys
530 535 540
Gly Gly Lys Ser Lys Leu
545 550
<210> 9
<211> 548
<212> PRT
<213> 平家萤
<220>
<223> 荧光素酶
<400> 2
Met Glu Asn Met Glu Asn Asp Glu Asn Ile Val Tyr Gly Pro Glu Pro
1 5 10 15
Phe Tyr Pro Ile Glu Glu Gly Ser Ala Gly Ala Gln Leu Arg Lys Tyr
20 25 30
Met Asp Arg Tyr Ala Lys Leu Gly Ala Ile Ala Phe Thr Asn Ala Leu
35 40 45
Thr Gly Val Asp Tyr Thr Tyr Ala Glu Tyr Leu Glu Lys Ser Cys Cys
50 55 60
Leu Gly Glu Ala Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Val Val Asp Gly Arg Ile
65 70 75 80
Ala Leu Cys Ser Glu Asn Cys Glu Glu Phe Phe Ile Pro Val Leu Ala
85 90 95
Gly Leu Phe Ile Gly Val Gly Val Ala Pro Thr Asn Glu Ile Tyr Thr
100 105 110
Leu Arg Glu Leu Val His Ser Leu Gly Ile Ser Lys Pro Thr Ile Val
115 120 125
Phe Ser Ser Lys Lys Gly Leu Asp Lys Val Ile Thr Val Gln Lys Thr
130 135 140
Val Thr Ala Ile Lys Thr Ile Val Ile Leu Asp Ser Lys Val Asp Tyr
145 150 155 160
Arg Gly Tyr Gln Ser Met Asp Asn Phe Ile Lys Lys Asn Thr Pro Pro
165 170 175
Gly Phe Lys Gly Ser Ser Phe Lys Thr Val Glu Val Asn Arg Lys Glu
180 185 190
Gln Val Ala Leu Ile Met Asn Ser Ser Gly Ser Thr Gly Leu Pro Lys
195 200 205
Gly Val Gln Leu Thr His Glu Asn Ala Val Thr Arg Phe Ser His Ala
210 215 220
Arg Asp Pro Ile Tyr Gly Asn Gln Val Ser Pro Gly Thr Ala Ile Leu
225 230 235 240
Thr Val Val Pro Phe His His Gly Phe Gly Met Phe Thr Thr Leu Gly
245 250 255
Tyr Leu Thr Cys Gly Phe Arg Ile Val Met Leu Thr Lys Phe Asp Glu
260 265 270
Glu Thr Phe Leu Lys Thr Leu Gln Asp Tyr Lys Cys Ser Ser Val Ile
275 280 285
Leu Val Pro Thr Leu Phe Ala Ile Leu Asn Arg Ser Glu Leu Leu Asp
290 295 300
Lys Tyr Asp Leu Ser Asn Leu Val Glu Ile Ala Ser Gly Gly Ala Pro
305 310 315 320
Leu Ser Lys Glu Ile Gly Glu Ala Val Ala Arg Arg Phe Asn Leu Pro
325 330 335
Gly Val Arg Gln Gly Tyr Gly Leu Thr Glu Thr Thr Ser Ala Ile Ile
340 345 350
Ile Thr Pro Glu Gly Asp Asp Lys Pro Gly Ala Ser Gly Lys Val Val
355 360 365
Pro Leu Phe Lys Ala Lys Val Ile Asp Leu Asp Thr Lys Lys Thr Leu
370 375 380
Gly Pro Asn Arg Arg Gly Glu Val Cys Val Lys Gly Pro Met Leu Met
385 390 395 400
Lys Gly Tyr Val Asp Asn Pro Glu Ala Thr Arg Glu Ile Ile Asp Glu
405 410 415
Glu Gly Trp Leu His Thr Gly Asp Ile Gly Tyr Tyr Asp Glu Glu Lys
420 425 430
His Phe Phe Ile Val Asp Arg Leu Lys Ser Leu Ile Lys Tyr Lys Gly
435 440 445
Tyr Gln Val Pro Pro Ala Glu Leu Glu Ser Val Leu Leu Gln His Pro
450 455 460
Asn Ile Phe Asp Ala Gly Val Ala Gly Val Pro Asp Pro Ile Ala Gly
465 470 475 480
Glu Leu Pro Gly Ala Val Val Val Leu Glu Lys Gly Lys Ser Met Thr
485 490 495
Glu Lys Glu Val Met Asp Tyr Val Ala Ser Gln Val Ser Asn Ala Lys
500 505 510
Arg Leu Arg Gly Gly Val Arg Phe Val Asp Glu Val Pro Lys Gly Leu
515 520 525
Thr Gly Lys Ile Asp Gly Lys Ala Ile Arg Glu Ile Leu Lys Lys Pro
530 535 540
Val Ala Lys Met
545
<210> 10
<211> 548
<212> PRT
<213> 源氏萤
<220>
<223> 荧光素酶
<400> 3
Met Glu Asn Met Glu Asn Asp Glu Asn Ile Val Val Gly Pro Lys Pro
1 5 10 15
Phe Tyr Pro Ile Glu Glu Gly Ser Ala Gly Thr Gln Leu Arg Lys Tyr
20 25 30
Met Glu Arg Tyr Ala Lys Leu Gly Ala Ile Ala Phe Thr Asn Ala Val
35 40 45
Thr Gly Val Asp Tyr Ser Tyr Ala Glu Tyr Leu Glu Lys Ser Cys Cys
50 55 60
Leu Gly Lys Ala Leu Gln Asn Tyr Gly Leu Val Val Asp Gly Arg Ile
65 70 75 80
Ala Leu Cys Ser Glu Asn Cys Glu Glu Phe Phe Ile Pro Val Ile Ala
85 90 95
Gly Leu Phe Ile Gly Val Gly Val Ala Pro Thr Asn Glu Ile Tyr Thr
100 105 110
Leu Arg Glu Leu Val His Ser Leu Gly Ile Ser Lys Pro Thr Ile Val
115 120 125
Phe Ser Ser Lys Lys Gly Leu Asp Lys Val Ile Thr Val Gln Lys Thr
130 135 140
Val Thr Thr Ile Lys Thr Ile Val Ile Leu Asp Ser Lys Val Asp Tyr
145 150 155 160
Arg Gly Tyr Gln Cys Leu Asp Thr Phe Ile Lys Arg Asn Thr Pro Pro
165 170 175
Gly Phe Gln Ala Ser Ser Phe Lys Thr Val Glu Val Asp Arg Lys Glu
180 185 190
Gln Val Ala Leu Ile Met Asn Ser Ser Gly Ser Thr Gly Leu Pro Lys
195 200 205
Gly Val Gln Leu Thr His Glu Asn Thr Val Thr Arg Phe Ser His Ala
210 215 220
Arg Asp Pro Ile Tyr Gly Asn Gln Val Ser Pro Gly Thr Ala Val Leu
225 230 235 240
Thr Val Val Pro Phe His His Gly Phe Gly Met Phe Thr Thr Leu Gly
245 250 255
Tyr Leu Ile Cys Gly Phe Arg Val Val Met Leu Thr Lys Phe Asp Glu
260 265 270
Glu Thr Phe Leu Lys Thr Leu Gln Asp Tyr Lys Cys Thr Ser Val Ile
275 280 285
Leu Val Pro Thr Leu Phe Ala Ile Leu Asn Lys Ser Glu Leu Leu Asn
290 295 300
Lys Tyr Asp Leu Ser Asn Leu Val Glu Ile Ala Ser Gly Gly Ala Pro
305 310 315 320
Leu Ser Lys Glu Val Gly Glu Ala Val Ala Arg Arg Phe Asn Leu Pro
325 330 335
Gly Val Arg Gln Gly Tyr Gly Leu Thr Glu Thr Thr Ser Ala Ile Ile
340 345 350
Ile Thr Pro Glu Gly Asp Asp Lys Pro Gly Ala Ser Gly Lys Val Val
355 360 365
Pro Leu Phe Lys Ala Lys Val Ile Asp Leu Asp Thr Lys Lys Ser Leu
370 375 380
Gly Pro Asn Arg Arg Gly Glu Val Cys Val Lys Gly Pro Met Leu Met
385 390 395 400
Lys Gly Tyr Val Asn Asn Pro Glu Ala Thr Lys Glu Leu Ile Asp Glu
405 410 415
Glu Gly Trp Leu His Thr Gly Asp Ile Gly Tyr Tyr Asp Glu Glu Lys
420 425 430
His Phe Phe Ile Val Asp Arg Leu Lys Ser Leu Ile Lys Tyr Lys Gly
435 440 445
Tyr Gln Val Pro Pro Ala Glu Leu Glu Ser Val Leu Leu Gln His Pro
450 455 460
Ser Ile Phe Asp Ala Gly Val Ala Gly Val Pro Asp Pro Val Ala Gly
465 470 475 480
Glu Leu Pro Gly Ala Val Val Val Leu Glu Ser Gly Lys Asn Met Thr
485 490 495
Glu Lys Glu Val Met Asp Tyr Val Ala Ser Gln Val Ser Asn Ala Lys
500 505 510
Arg Leu Arg Gly Gly Val Arg Phe Val Asp Glu Val Pro Lys Gly Leu
515 520 525
Thr Gly Lys Ile Asp Gly Arg Ala Ile Arg Glu Ile Leu Lys Lys Pro
530 535 540
Val Ala Lys Met
545
<210> 11
<211> 543
<212> PRT
<213> 发光叩甲虫
<220>
<223> 荧光素酶
<400> 4
Met Met Lys Arg Glu Lys Asn Val Val Tyr Gly Pro Glu Pro Lys His
1 5 10 15
Pro Leu Gly Asn Phe Thr Ala Gly Glu Met Leu Tyr Asn Ala Leu His
20 25 30
Lys His Ser His Ile Pro Gln Ala Ile Leu Asp Val Met Gly Asn Glu
35 40 45
Ser Leu Ser Tyr Gln Glu Phe Phe Asp Thr Thr Val Lys Leu Gly Gln
50 55 60
Ser Leu Gln Asn Cys Gly Tyr Lys Met Asn Asp Val Val Ser Ile Cys
65 70 75 80
Ala Glu Asn Asn Lys Arg Phe Phe Ile Pro Ile Ile Ser Ala Trp Tyr
85 90 95
Ile Gly Met Val Val Ala Pro Val Asn Glu Asp Tyr Ile Pro Asp Glu
100 105 110
Leu Cys Lys Val Thr Gly Ile Ser Lys Pro Ile Leu Val Phe Thr Thr
115 120 125
Arg Lys Ile Leu Pro Lys Val Leu Glu Val Lys Asp Arg Thr Asn Tyr
130 135 140
Ile Lys Arg Ile Ile Ile Leu Asp Ser Glu Glu Asn Leu Leu Gly Cys
145 150 155 160
Glu Ser Leu His Asn Phe Met Ser Arg Tyr Ser Asp Asn Asn Leu Gln
165 170 175
Thr Phe Lys Pro Leu His Tyr Asp Pro Val Asp Gln Val Ala Ala Ile
180 185 190
Leu Cys Ser Ser Gly Thr Thr Gly Leu Pro Lys Gly Val Met Gln Thr
195 200 205
His Arg Asn Ile Cys Val Arg Leu Thr His Ala Ser Asp Pro Arg Val
210 215 220
Gly Thr Gln Leu Ile Pro Gly Val Ser Val Leu Ala Tyr Leu Pro Phe
225 230 235 240
Phe His Ala Phe Gly Phe Ser Ile Asn Leu Gly Tyr Phe Met Val Gly
245 250 255
Leu Arg Val Val Met Leu Arg Arg Phe Asn Gln Glu Val Phe Leu Lys
260 265 270
Ala Ile Gln Asp Tyr Glu Val Arg Ser Val Ile Asn Val Pro Ser Thr
275 280 285
Ile Leu Phe Leu Ser Lys Ser Pro Leu Val Asp Lys Tyr Asp Leu Ser
290 295 300
Thr Leu Ala Glu Leu Cys Cys Gly Ala Ala Pro Leu Ala Lys Glu Val
305 310 315 320
Ala Glu Ile Ala Val Lys Arg Leu Asn Leu Pro Gly Ile Arg Cys Gly
325 330 335
Tyr Gly Leu Thr Glu Ser Thr Ser Ala Asn Ile His Thr Leu His Asn
340 345 350
Glu Phe Lys Ser Gly Ser Leu Gly Lys Val Thr Pro Tyr Met Ala Ala
355 360 365
Lys Ile Ile Asp Arg Asn Thr Gly Glu Ala Leu Gly Pro Asn Gln Val
370 375 380
Gly Glu Leu Cys Ile Trp Gly Pro Met Val Thr Lys Gly Tyr Val Asn
385 390 395 400
Asn Pro Gln Ala Thr Lys Glu Ala Ile Asp Asp Asp Gly Trp Leu His
405 410 415
Ser Gly Asp Phe Gly Tyr Tyr Asp Glu Asp Glu Tyr Phe Tyr Ile Val
420 425 430
Asp Arg Tyr Lys Glu Leu Ile Lys Tyr Lys Gly Tyr Gln Val Ala Pro
435 440 445
Val Glu Leu Glu Glu Ile Leu Leu Gln His Pro Gly Ile Arg Asp Val
450 455 460
Ala Val Val Gly Ile Pro Asp Ile Glu Ala Gly Glu Leu Pro Ala Gly
465 470 475 480
Phe Val Val Lys Gln Pro Gly Ala Gln Leu Thr Ala Lys Glu Val Tyr
485 490 495
Asp Phe Leu Ala Gln Arg Val Ser His Ser Lys Tyr Leu Arg Gly Gly
500 505 510
Val Arg Phe Val Asp Ser Ile Pro Arg Asn Val Thr Gly Lys Ile Ser
515 520 525
Arg Lys Glu Leu Arg Glu Ala Leu Met Glu Lys Ala Ser Lys Leu
530 535 540

Claims (13)

1.一种内毒素的测定方法，其是测定内毒素的方法，具有以下步骤：
溶解物反应步骤，其将规定量的被测试样与含溶解物试剂的干燥粉末混合来制备第一反应溶液，然后将该第一反应溶液以规定时间进行温育；
荧光素酶反应步骤，其在所述溶解物反应步骤后，在避光下，将所述第一反应溶液与含荧光素酶生物发光试剂的干燥粉末混合来制备第二反应溶液，并测定该第二反应溶液的发光量；以及
内毒素测定步骤，其根据所述荧光素酶反应步骤中得到的发光量，测定所述被测试样的内毒素浓度，
所述被测试样为透析液或水，
所述溶解物试剂含有C因子、B因子和前凝固酶，
所述荧光素酶生物发光试剂含有发光合成基质、抗盐性荧光素酶和ATP，
所述发光合成基质是通过被活性C因子、活性B因子或由所述前凝固酶的转化得到的凝固酶消化而使发光基质游离的物质，
在所述荧光素酶反应步骤中，所述第二反应溶液的钠离子浓度为250～390mM，钙离子浓度为0.5～10mM，氯化物离子浓度为250～361.5mM，以及Tris浓度为20～30mM。
2.根据权利要求1所述的内毒素的测定方法，其中，在所述荧光素酶反应步骤中，所述第二反应溶液的pH为7.7～8.5。
3.根据权利要求1或2所述的内毒素的测定方法，其中，在所述荧光素酶反应步骤中，所述第二反应溶液的镁离子浓度为10～20mM，碳酸离子浓度为1～5mM。
4.一种内毒素的测定方法，其是测定内毒素的方法，其中，
将规定量的被测试样与溶解物试剂和含荧光素酶生物发光试剂的干燥粉末混合来制备反应溶液，
将该反应溶液在避光下以规定时间进行温育，然后根据该反应溶液的发光量，测定所述被测试样的内毒素浓度，
所述被测试样为透析液或水，
所述溶解物试剂含有C因子、B因子和前凝固酶，
所述荧光素酶生物发光试剂含有发光合成基质、抗盐性荧光素酶和ATP，
所述发光合成基质是通过被活性C因子、活性B因子或由所述前凝固酶的转化得到的凝固酶消化而使发光基质游离的物质，
所述反应溶液的钠离子浓度为250～390mM，钙离子浓度为0.5～10mM，氯化物离子浓度为250～361.5mM，以及Tris浓度为20～30mM。
5.根据权利要求4所述的内毒素的测定方法，其中，所述反应溶液的pH为7.7～8.5。
6.根据权利要求4或5所述的内毒素的测定方法，其中，所述反应溶液的镁离子浓度为10～20mM，碳酸离子浓度为1～5mM。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的内毒素的测定方法，其中，所述溶解物试剂是从鲎血细胞中提取的成分。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的内毒素的测定方法，其中，在所述内毒素测定步骤中，所述被测试样的内毒素浓度是根据使用水中含有浓度已知内毒素的稀释系列制作的校准曲线和所述荧光素酶反应步骤中得到的发光量测定的。
9.一种内毒素测定用试剂盒，其是用于测定透析液或水的内毒素浓度的试剂盒，含有：
第一容器，其包含含溶解物试剂的干燥粉末；
第二容器，其包含含荧光素酶生物发光试剂的干燥粉末，
在所述第一容器中将规定量的透析液或水混合来制备第一反应溶液，然后将得到的第一反应溶液总量混合到所述第二容器中，得到的第二反应溶液的钠离子浓度为250～390mM，钙离子浓度为0.5～10mM，氯化物离子浓度为250～361.5mM，以及Tris浓度为20～30mM。
10.根据权利要求9所述的内毒素测定用试剂盒，其中，所述第二反应溶液的pH为7.7～8.5，镁离子浓度为10～20mM，碳酸离子浓度为1～5mM。
11.一种内毒素测定用试剂盒，其是用于测定透析液或水的内毒素浓度的试剂盒，其中，
所述试剂盒含有包含干燥粉末的容器，所述干燥粉末包含溶解物试剂和荧光素酶生物发光试剂，
在所述容器中将规定量的透析液或水混合而制备的反应溶液的钠离子浓度为250～390mM，钙离子浓度为0.5～10mM，氯化物离子浓度为250～361.5mM，以及Tris浓度为20～30mM。
12.根据权利要求11所述的内毒素测定用试剂盒，其中，所述反应溶液的pH为7.7～8.5，镁离子浓度为10～20mM，碳酸离子浓度为1～5mM。
13.根据权利要求9～12中任一项所述的内毒素测定用试剂盒，其用于实施权利要求1～8中任一项所述的内毒素的测定方法。
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