KR100454903B1 - 엠이케이케이3 단백질 인산화효소의 기질 펩티드 및 이를이용한 비방사성 엠이케이케이3 단백질 인산화효소활성측정법 - Google Patents

엠이케이케이3 단백질 인산화효소의 기질 펩티드 및 이를이용한 비방사성 엠이케이케이3 단백질 인산화효소활성측정법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 MEKK3 단백질 인산화효소의 기질 펩티드 및 이를 이용한 비방사성 MEKK3 단백질 인산화효소 활성측정법에 관한 것이다. 본 발명의 비방사성 MEKK3 단백질 인산화효소 활성측정법은 13개의 아미노산으로 구성된 기질 펩티드를 형광표지하는 단계; 전기 형광표지된 기질 펩티드를 MEKK3 단백질 인산화효소와 반응시키는 단계; 반응이 끝난 전기 형광표지된 기질 펩티드를 자신의 등전점에서 전기영동하여, 인산화된 펩티드와 인산화되지 않은 펩티드로 분리하는 단계; 및, 인산화된 펩티드의 양을 측정하는 단계를 포함한다. 본 발명에 의하면, 방사성 동위원소를 이용하지 않고, 부분정제된 것은 물론, 정제되지 않은 MEKK3 단백질 인산화효소의 활성을 간편, 신속 및 정확하게 측정할 수 있다.

Description

엠이케이케이3 단백질 인산화효소의 기질 펩티드 및 이를 이용한 비방사성 엠이케이케이3 단백질 인산화효소 활성측정법{MEKK3 Specific Oligo-Peptide and Non-Radioactive MEKK3 Protein Kinase Assay Using the Same}
본 발명은 엠이케이케이3(MEKK3, mitogen-activated protein kinase kinase kinase 3) 단백질 인산화효소의 기질 펩티드 및 이를 이용한 비방사성 MEKK3 단백질 인산화효소 활성측정법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 MEKK3 단백질 인산화효소의 기질 펩티드 및 형광표지된 기질 펩티드를 MEKK3 단백질 인산화효소와 반응시키고, 자신의 등전점에서 전기영동한 다음, 인산화된 펩티드의 양을 측정함으로써, MEKK3 단백질 인산화효소의 활성을 측정하는 방법에 관한 것이다.
스트레스와 관계되는 신호전달경로에서 세린/트레오닌 단백질 인산화효소의 작용경로는 MAP(mitogen-activated protein) 인산화효소 작용경로라고도 하며, 몇몇 호르몬, 성장인자, 사이토카인 및 주변인자에 의하여 활성화된다. 지금까지의 연구결과, 다섯 종류의 MAP 인산화효소의 작용경로가 존재한다는 사실과 많은 단백질 인산화효소가 그 작용경로에 존재하는 것이 밝혀졌으며, 상술한 인산화효소 작용경로가 서로 중첩되어 세포막으로부터 핵으로 신호가 전달되는 작용이 추측되고 있다. 세포막으로부터 다양한 MAP 인산화효소로 신호를 전달하는 과정을 매개하는 인산화효소 중 네 종류의 MEKK 단백질이 밝혀졌는데, 특히, 세포의 생존과 사멸에 관여하고, 세린/트레오닌 단백질 인산화효소 PI3/Akt에 의하여 그 작용이 조절되며, MKK3, MKK5 내지 MKK7 및 BMK를 인산화하는 MEKK3 단백질 인산화효소는 세포 신호전달 분야에서 최근에 많은 관심을 받고 있어, 그 활성을 측정하는 방법 또한 집중적인 연구의 대상이 되고 있다.
종래에는 방사성 동위원소32P가 인산화 반응에 따라 단백질 기질이나 펩티드에 전달되는 정도를 측정함으로써, MEKK3 단백질 인산화효소를 비롯한 여러 인산화효소의 활성을 측정하였으나, 여러 종류의 인산화효소가 공존하는 세포 내부에서 이들 효소의 활성측정을 위해서는 효소의 정제가 필수적이었으므로, 신속한 측정이 곤란하였고, 방사성 동위원소를 다루는 불편함과 방사선 피폭의 잠재적인 위험을 피할 수 없었다.
따라서, 방사성 동위원소를 이용하지 않고, 정제된 것은 물론, 정제되지 않은 MEKK3 단백질 인산화효소의 활성을 간편, 신속 및 정확하게 측정하는 방법을 개발하여야 할 필요성이 끊임없이 대두되었다.
이에, 본 발명자는 방사성 동위원소를 이용하지 않고, 정제된 것은 물론, 정제되지 않은 MEKK3 단백질 인산화효소의 활성을 간편, 신속 및 정확하게 측정하는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 형광표지된 기질 펩티드를 이용하여 MEKK3 단백질 인산화효소의 활성을 측정함으로써, 방사성 동위원소를 이용하지 않고, 정제된 것은 물론, 정제되지 않은 MEKK3 단백질 인산화효소의 활성을 간편, 신속 및 정확하게 측정하는 것이 가능하다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
결국, 본 발명의 주된 목적은 MEKK3 단백질 인산화효소의 기질 펩티드를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 전기 기질 펩티드를 이용한 비방사성 MEKK3 단백질인산화효소의 활성측정법을 제공하는 것이다.
도 1은 야생형 MKK3과 돌연변이형 MKK3를 비교분석한 전기영동 사진이다.
도 2는 형광표지 기질 펩티드로 MEKK3 단백질 인산화효소의 활성을 측정한 전기영동 사진이다.
도 3은 MEKK3 단백질 인산화효소에 대한 기질 펩티드의 특이성을 보여주는 전기영동 사진이다.
도 4는 PI3/Akt 단백질 인산화효소 활성억제제를 처리한 다음, MEKK3 단백질 인산화효소의 활성을 측정한 전기영동 사진이다.
도 5는 단백질 인산화효소 활성촉진제를 처리한 다음, MEKK3 단백질 인산화효소의 활성을 측정한 전기영동 사진이다.
본 발명자들은 SGK1-MEKK3-MKK3으로 이어지는 신호전달경로에서 MEKK3이 SGK1(serum glucocorticoid kinase 1)에 의하여 인산화가 되면, MKK3에 대한 MEKK3의 인산화작용이 차단되는 사실을 확인하였다. 또한, MEKK3은 MKK3의 189번째 세린 또는 트레오닌을 인산화시켜 MKK3를 활성화시키며, 전기 세린 또는 트레오닌을 다른 종류의 아미노산으로 치환시키면, 전기 인산화가 일어나지 않아 MKK3이 활성화되지 않는 것을 확인하였다. 한편, MKK3의 단백질 데이터 베이스를 검색하여, 189번째 세린 또는 트레오닌을 중심으로 이로부터 N-말단방향으로 다섯개의 아미노산 및 C-말단방향으로 네개의 아미노산 서열이 여러 MKK3 간에 보존되어 있는 것을 확인하였고, 여기에 C-말단방향으로 세개의 아미노산을 추가한 전체 13개의 아미노산으로 구성되는 펩티드를 합성하여, 전기 펩티드가 MEKK3에 대하여 단독 기질로서 작용가능한 것을 확인하였다.
본 발명의 MEKK3 단백질 인산화효소의 기질 펩티드는 하기 13개의 아미노산 서열로 나타내어진다:
(Ser 또는 Thr)-Gly-Tyr-Leu-Asp-(Ser 또는 Thr)-Val-Ala-Lys-(Ser 또는 Thr)-Xaa-Xaa-Xaa
상기 식에서,
Xaa는 자연계에 존재하는 아미노산 20개 중 어느 하나를 나타낸 다.
MEKK3 단백질 인산화효소는 전기 기질 펩티드와 유사한 다른 기질 펩티드와는 반응하지 않고, 다른 단백질 인산화효소는 본 발명의 MEKK3 단백질 인산화효소의 기질 펩티드와 반응하지 않는다. 따라서, 이들 펩티드는 MEKK3 단백질 인산화효소에 대한 매우 선택적인 기질로 작용하여, 정제된 상태에서는 물론, 정제되지 않은 세포파쇄액 상태에서도 전기 인산화효소의 활성을 측정하는 것이 가능하다. 포유류의 MEKK3에 대한 활성을 측정할 경우, 전기 펩티드로 바람직하게는 서열번호 1 내지 서열번호 10의 펩티드를 들 수 있으며, 사람의 MEKK3에 대한 활성을 측정할 경우, 좀 더 바람직하게는 서열번호 7의 펩티드와 서열번호 10의 펩티드를 들 수 있다.
아울러, 본 발명의 기질 펩티드를 이용한 비방사성 MEKK3 단백질 인산화효소 활성측정법은 전기 기질 펩티드를 형광표지하는 단계; 전기 형광표지된 기질 펩티드를 MEKK3 단백질 인산화효소와 반응시키는 단계; 반응이 끝난 전기 형광표지된 기질 펩티드를 등전점에서 전기영동하여, 인산화된 펩티드와 인산화되지 않은 펩티드로 분리하는 단계; 및, 인산화된 펩티드의 양을 측정하는 단계를 포함한다.
전기 기질 펩티드를 이용한 비방사성 MEKK3 단백질 인산화효소 활성측정법은 방사선동위원소를 이용하지 않고, 정제된 것은 물론, 정제되지 않은 MEKK3 단백질 인산화효소의 활성을 간편, 신속 및 정확하게 측정하는 것이 가능하다.
이하에서는, 전술한 비방사성 MEKK3 단백질 인산화효소 활성측정법을 좀 더 상세히 설명하고자 한다.
우선 펩티드에 이소티오시아네이트 플루오레스세인(FITC)과 같은 형광물질을 접합(conjugation)하여 형광을 띠게 한 다음, MEKK3 단백질 인산화효소를 ATP 존재 하에서 형광표지된 기질 펩티드와 반응시키면 전기 형광표지된 기질 펩티드에 인산화가 일어난다. 인산화되지 않은 펩티드는 자신의 중성 pH(등전점)에서 전하를 띠지 않기 때문에, 전기장에서 이동하지 않으며, 인산화된 펩티드는 -2가의 전하를 띠게 되어 전기장을 걸어주면 양극으로 이동한다. 이러한 차이를 이용하여 아가로스 겔 전기영동을 실시해서 양 펩티드를 분리한다. 인산화된 펩티드의 정량은 아가로스 겔을 덴시토메트리(densitometry)를 이용하여 분석하거나, 아가로스 겔에서 인산화된 펩티드를 분리한 다음 형광을 측정하여 할 수 있는데, 10ng 정도의 MEKK3 단백질 인산화효소의 활성을 2시간 이내에 검출할 수 있다. 한편, 본 발명의 기질 펩티드는 하기 실시예에서 기술한 바와 같이 시료에 존재하는 다른 인산화효소와는 반응하지 않는 기질특이성을 나타내므로, 정제된 상태에서는 물론, 정제하지 않은 세포파쇄액 상태에서도 MEKK3 단백질 인산화효소의 활성을 측정하는 것이 가능하고, 동위원소를 사용하는 방법에 비하여 노이즈(noise)나 배경(background)이 거의 없고, 그 사용에 따르는 잠재적인 위험도 피할 수 있다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
비교 실시예 1: 야생형 MKK3과 돌연변이형 MKK3의 비교분석
32P의 존재하에서 MEKK3 단백질 인산화효소를 기질 단백질인 야생형 MKK3(MKK3 WT) 및189세린이 알라닌으로 치환된 돌연변이형 MKK3 S189A와 반응시킨 다음, 알칼라인 탈인산화효소를 처리하거나 처리하지 않고 전기영동한 후 X선 사진을 촬영하였다(참조: 도 1). 도 1의 상단부에는 이용된 기질 단백질(MKK3 WT, MKK3 S189A)을 표시하고, 알카라인 탈인산화효소를 처리한 경우(＋)와 처리하지 않은 경우(－)를 표시하며, 음성대조군(negative control)은 각각 MEKK3를 첨가하지 않거나,32P를 포함하는 ATP를 첨가하지 않고 반응시킨 기질 단백질을 나타낸다. 우측의 화살표에서, MEKK3 단백질 인산화효소는 MEKK3로 표시하고, MKK3 WT 또는 MKK3 S189는 MKK3로 표시한다. 도 1에서 보듯이, 방사성 동위원소를 이용한 종래의 MEKK3 단백질 인산화효소 활성측정법에 의한 전기영동의 결과, MEKK3 단백질 인산화효소에 의하여 야생형 MKK3(MKK3 WT)은 인산화되지만,189세린을 알라닌으로 치환한 돌연변이형 MKK3(MKK3 S189A)은 인산화되지 않으므로, MEKK3 단백질 인산화효소가 MKK3의 189번 위치의 세린과 자기 자신을 인산화한다는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 1: 형광표지 기질 펩티드를 이용한 MEKK3 단백질 인산화효소의 활성측정
형광표지된 기질 펩티드를 이용한 MEKK3 단백질 인산화효소의 활성측정이 가능한 것을 확인하기 위하여, MEKK3 단백질 인산화효소의 양 및 반응시간에 따른 활성을 다음과 같이 측정하였다(참조: 도 2): MEKK3 단백질 인산화효소의 기질로서 아미노 말단에 이소티오시아네이트 플루오레스세인(FITC)을 부착시켜 형광을 띠게 한 서열번호 1의 펩티드를 제작하였다. 전기 플루오레스세인이 접합된 형광펩티드 5㎍을 5㎕의 구분-처리된(differential-treated) 세포파쇄액이나, 5, 10 및 20ng의 활성화된 MEKK3 단백질 인산화효소와 함께 20㎕의 단백질 인산화효소 반응액(20mM HEPES, pH 7.2, 10mM MgCl2, 10mM MnCl2, 1mM 디티오트레이톨(dithiothreitol), 0.2mM EGTA, 20mM ATP, 1mg 포스파티딜세린(phosphatidylserine), MEKK3 단백질 인산화효소 활성촉진제)에 넣고, 30℃에서 30분간 반응시킨 다음, 95℃에서 10분간가열하여 반응을 중지시켰다. 전기 반응물을 0.8% 아가로스 겔, TBE 완충용액(pH 8.0)에서 100V 전압에 15분 동안 전기영동하여, 인산화된 펩티드를 인산화되지 않은 것과 분리하였다. 전기영동한 겔을 UV-분광기 위에 놓고 사진을 촬영하고, 인산화된 펩티드 밴드를 절단하여, 일정량(1㎖)의 증류수로 30분간 용출시킨 다음, 광학밀도 488mm에서 정량하여, 사용한 기질의 양에 대한 인산화 산물의 생성 비율(conversion ratio)을 도 2의 하단부에 표시하였다. 도 2에서, 인산화되지 않은 펩티드는 검은색 화살머리로, 인산화된 펩티드는 흰색 화살머리로 표시한다. 도 2에서 보듯이, MEKK3 단백질 인산화효소의 양의 증가 및 일정량의 MEKK3 단백질 인산화효소에 대한 반응시간 증가에 따른 MEKK3 단백질 인산화효소의 활성증가를 확인할 수 있고, 약 20ng 까지의 MEKK3 단백질 인산화효소의 활성을 검출할 수 있었다.
실시예 2: MEKK3 단백질 인산화효소에 대한 기질 펩티드의 특이성
MEKK3 단백질 인산화효소에 대한 기질 펩티드의 특이성을 확인하기 위하여, 서열번호 11(IRS), 12(PDK1), 13(CDC42)의 펩티드를 합성한 다음, 플루오레스세인을 접합시켜 형광을 띠게 하고, MEKK3 단백질 인산화효소와 전기 실시예 1과 동일한 방법으로 반응을 수행하였다. 또한, 서열번호 1번의 펩티드를 기질로 하여 MEKK3 단백질 인산화효소 대신 10ng의 다른 단백질 인산화효소(PKC, GSK3)와 전기 실시예 1과 동일한 방법으로 반응을 수행하였다(참조: 도 3). 도 3에서, 인산화되지 않은 펩티드는 검은색 화살머리로, 인산화된 펩티드는 흰색 화살머리로 표시한다. 도 3에서 보듯이, 서열번호 11(IRS), 12(PDK1), 13(CDC42)의 펩티드는 MEKK3와 반응하지 않으며, 서열번호 1의 펩티드는 다른 단백질 인산화효소와 반응을 하지 않는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 3: PI3/Akt 단백질 인산화효소의 활성억제제의 처리농도에 따른 MEKK3 단백질 인산화효소의 활성변화
PI3/Akt 단백질 인산화효소의 활성억제제인 LY294002(Calbiochem, USA)가 MEKK3 단백질 인산화효소에 길항작용을 나타내는 것을 기질펩티드를 이용한 활성측정법으로 확인하기 위하여, 하기 실험을 수행하였다: PI3/Akt 단백질 인산화효소 억제제를 인간 흑색종 세포주에 처리한 다음, 세포 용해물에서 MEKK3 단백질 인산화효소의 활성을 측정하였다. 기질로는 서열번호 1의 펩티드를 이용하였으며, 효소활성은 정제하지 않은 5㎕의 구분-처리된 세포 파쇄액을 이용하여 실시예 1과 동일한 방법으로 반응을 수행하였다(참조: 도 4). 도 4에서, 인산화되지 않은 펩티드는 검은색 화살머리로, 인산화된 펩티드는 흰색 화살머리로 표시하였다. 도 4에 보듯이, PI3/Akt 단백질 인산화효소 억제제의 처리농도에 비례하여 MKK3 기질 펩티드의 인산화가 증가함을 확인할 수 있었다.
실시예 4: 단백질 인산화효소 활성촉진제의 처리농도에 따른 MEKK3 단백질인산화효소의 활성변화
단백질 인산화효소 활성촉진제인 오카다익산(Okadaic acid, Research Biochemicals, USA)의 처리농도에 따라 효소의 활성이 변화되는 것을 형광표지된 기질펩티드를 이용한 활성측정법으로 확인하기 위하여, 하기 실험을 수행하였다: 단백질 인산화효소 활성촉진제를 인간 흑색종 세포주에 처리한 다음, 세포용해물에 있는 MEKK3 단백질 인산화효소의 활성을 측정하였다. 기질로 이용한 펩티드는 서열번호 1의 펩티드를 이용하였으며, 효소활성은 정제하지 않은 5㎕의 구분-처리된 세포파쇄액을 이용하여 실시예 1과 동일한 방법으로 반응을 수행하였다(참조: 도 5). 도 5에서, 인산화되지 않은 펩티드는 검은색 화살머리로, 인산화된 펩티드는 흰색 화살머리로 표시하였다. 도 5에서 보듯이, 단백질 인산화효소 활성촉진제의 처리농도에 비례하여, 기질 펩티드의 인산화가 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
이상에서 상세히 설명하였듯이, 본 발명은 형광표지된 기질 펩티드를 이용하여, 간편, 신속, 정확하고도 안전하게, MEKK3 단백질 인산화효소의 활성을 측정하는 방법을 제공한다. 본 발명의 MEKK3 단백질 인산화효소의 활성을 측정하는 방법에 의하면, 방사성 동위원소를 이용하지 않고, 정제된 것은 물론, 정제되지 않은 MEKK3 단백질 인산화효소의 활성을 간편, 신속 및 정확하게 측정하는 것이 가능한 바, 세포 신호전달 분야에서 MEKK3 단백질 인산화효소의 역할에 관한 연구에 크게이바지할 수 있을 것이다.
<110> CELLOGICS CORPORATION <120> MEKK3 Specific Oligo-Peptide and Non-Radioactive MEKK3 Protein Ki nase Assay Using the Same <160> 13 <170> KopatentIn 1.6 <210> 1 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 13-mer polypetide for non-radioactive MEKK3 protein kinase assay <400> 1 Ser Gly Tyr Leu Asp Ser Val Ala Lys Thr Met Asp Ala 1 5 10 <210> 2 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 13-mer polypetide for non-radioactive MEKK3 protein kinase assay <400> 2 Ser Gly Tyr Leu Asp Ser Val Ala Lys Thr Met Ala Asp 1 5 10 <210> 3 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 13-mer polypetide for non-radioactive MEKK3 protein kinase assay <400> 3 Ser Gly Tyr Leu Asp Ser Val Ala Lys Thr Met Asp Ala 1 5 10 <210> 4 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 13-mer polypetide for non-radioactive MEKK3 protein kinase assay <400> 4 Ser Gly Tyr Leu Asp Ser Val Ala Lys Thr Met Asp Ala 1 5 10 <210> 5 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 13-mer polypetide for non-radioactive MEKK3 protein kinase assay <400> 5 Ser Gly Tyr Leu Asp Ser Val Ala Lys Thr Ile Asp Ala 1 5 10 <210> 6 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 13-mer polypetide for non-radioactive MEKK3 protein kinase assay <400> 6 Ser Gly Tyr Leu Asp Ser Val Ala Lys Thr Met Asp Ala 1 5 10 <210> 7 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 13-mer polypetide for non-radioactive MEKK3 protein kinase assay <400> 7 Ser Gly Tyr Leu Asp Ser Val Ala Lys Thr Val Val Ala 1 5 10 <210> 8 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 13-mer polypetide for non-radioactive MEKK3 protein kinase assay <400> 8 Thr Gly Tyr Leu Asp Ser Val Ala Lys Thr Met Asp Ala 1 5 10 <210> 9 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 13-mer polypetide for non-radioactive MEKK3 protein kinase assay <400> 9 Ser Gly Tyr Leu Asp Thr Val Ala Lys Thr Met Asp Ala 1 5 10 <210> 10 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 13-mer polypetide for non-radioactive MEKK3 protein kinase assay <400> 10 Ser Gly Tyr Leu Asp Ser Val Ala Lys Ser Met Asp Ala 1 5 10 <210> 11 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 13-mer polypetide for non-radioactive MEKK3 protein kinase assay <400> 11 Gln Val Gly Leu Ser Arg Arg Ser Arg Thr Glu Ser Val Thr 1 5 10 <210> 12 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 13-mer polypetide for non-radioactive MEKK3 protein kinase assay <400> 12 Thr Ser Thr Phe Cys Gly Thr Pro Glu Tyr Leu Ala Pro Glu 1 5 10 <210> 13 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 13-mer polypetide for non-radioactive MEKK3 protein kinase assay <400> 13 Tyr Asp Arg Leu Arg Pro Leu Ser Tyr Pro Gln Thr 1 5 10

Claims (5)

  1. (Ser 또는 Thr)-Gly-Tyr-Leu-Asp-(Ser 또는 Thr)-Val-Ala-Lys-(Ser 또는 Thr)-Met-Asp-Ala의 아미노산 서열로 나타내어지는 MEKK3 단백질 인산화효소 기질 펩티드.
  2. 제 1항에 있어서,
    서열번호 1, 3, 4, 6, 8, 9 및 10의 펩티드로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1가지인 것을 특징으로 하는
    MEKK3 단백질 인산화효소 기질 펩티드.
  3. 제 1항에 있어서,
    형광표지되는 것을 특징으로 하는
    MEKK3 단백질 인산화효소 기질 펩티드.
  4. 제 1항의 MEKK3 단백질 인산화효소 기질 펩티드를 형광표지하는 단계; 전기 형광표지된 기질 펩티드를 MEKK3 단백질 인산화효소와 반응시키는 단계; 반응이 끝난 전기 형광표지된 기질 펩티드를 자신의 등전점에서 전기영동하여, 인산화된 펩티드와 인산화되지 않은 펩티드로 분리하는 단계; 및, 인산화된 펩티드의 양을 측정하는 단계를 포함하는 비방사성 MEKK3 단백질 인산화효소 활성측정법.
  5. 제 4항에 있어서,
    전기 기질 펩티드는 서열번호 1, 3, 4, 6, 8, 9 및 10의 펩티드로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1가지인 것을 특징으로 하는
    비방사성 MEKK3 단백질 인산화효소 활성측정법.
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