CN115418338B - 副干酪乳杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及副干酪乳杆菌及其应用。本发明从八岁女孩粪便中分离鉴定的副干酪乳杆菌SEUNEU‑115可以调节阴道菌群平衡，包括抑制阴道病原菌生长和促进阴道乳酸杆菌增殖，从根本上减少女性妇科疾病的发生；同时，所述副干酪乳杆菌SEUNEU‑115还可以促进宫颈癌细胞凋亡，保护女性健康。本发明提供的副干酪乳杆菌SEUNEU‑115在制备维持阴道健康的产品中具有相当的应用前景。

Description

副干酪乳杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及副干酪乳杆菌及其应用。

背景技术

阴道是女性生殖系统直接与外界环境相连的结构，是人体微生物的重要栖息地。与其它黏膜组织相同，阴道菌群由特定微生物组成，其中包括大肠埃希菌等需氧菌及其它厌氧及兼性厌氧菌等致病菌，同时阴道自身也可以分离出乳杆菌、双歧杆菌等益生菌，使得致病菌与益生菌二者处于动态平衡状态。

正常状态下，乳杆菌是阴道菌群的优势菌，其中主要包括詹氏乳杆菌（Lactobacillus jensenii）、加氏乳杆菌（ Lactobacillus gasseri ）和卷曲乳杆菌（Lactobacillus crispatus）等，乳杆菌通过竞争性黏附阴道上皮细胞，代谢分泌乳酸、过氧化氢（H₂O₂）、细菌素等物质，可有效抑制病原菌的生长，维持阴道酸性、健康的环境。其代谢物还可作为阴道内免疫调节剂，在病原微生物刺激后，调节固有和适应性免疫，从而抑制病原微生物导致的炎症反应。这些代谢物还可通过抑制环磷酸腺苷的产生上调细胞的自噬，促进阴道上皮细胞胞内细菌的清理。研究还发现乳杆菌分泌的乳酸可作为肿瘤细胞营养物质和代谢产物，影响肿瘤代谢，抑制抗肿瘤的免疫应答。

在宫颈阴道微环境中，乳酸菌的优势与最佳生殖健康有关。乳酸是乳酸菌发酵的副产物，是维持宿主防御和保护宫颈阴道粘膜上皮免受性传播病原体和机会性共生菌感染的重要代谢物。而多种厌氧菌的过度生长和乳酸杆菌耗竭是细菌性阴道病的特征。其中Veillonellaceae细菌家族等厌氧病原菌的过度生长使乳酸减少，改变了宫颈微环境的酸度，同时促进炎症和细胞死亡，这些变化为细菌性阴道病，以及随后的妇科疾病创造有利条件。此外，长期的炎症刺激可能会导致HPV感染，进一步诱发宫颈癌前病变。

目前研究发现三种细菌对宫颈微环境产生有害影响，分别是非典型韦荣菌（Veillonella atypica）、蒙彼利埃脉菌（Veillonella montpellierensis）和巨球形菌（Megasphaera micronuciformis）。非典型韦荣菌和蒙彼利埃脉菌减少了阴道中的乳酸，为病原体感染提供了条件。球形菌通过增加炎症和通过产生某些脂肪分子促进细胞死亡，从而进一步推动疾病进展。

个体的外环境变化及平常的生活及卫生习惯与阴道菌群失衡的发生是密切相关的。单独应用或者滥用抗生素治疗妇科疾病容易导致病菌产生抗药性、降低治疗效果，进而导致病情反复，治疗失败等问题，而用益生菌进行辅助治疗则能有效减少炎症反复发作，从根本上保护阴道菌群免受环境因素的干扰，抵御致病菌的侵袭，保护女性健康。因此，维持阴道微生态平衡是我们当今亟待解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了副干酪乳杆菌及其在女性阴道微环境中的应用。

本发明提供了保藏编号为CCTCC NO: M 2022928的副干酪乳杆菌SEUNEU-115（Lactobacillus paracasei SEUNEU-115），于2022年6月20日保藏在中国典型培养物保藏中心，地址为:中国.武汉.武汉大学。

本发明提供的副干酪乳杆菌SEUNEU-115从8岁女童粪便中分离出来，为革兰氏染色阳性，显微镜下呈杆状；在固体培养基中生长，可形成边缘整齐、表面光滑圆润不透明的圆形白色小菌落；在液体培养基中呈均匀浑浊生长，久置菌体呈白色沉淀。

本发明提供了所述副干酪乳杆菌在制备抑制阴道病原菌生长和/或促进阴道乳酸杆菌增殖的产品中的应用。

所述阴道病原菌包括非典型韦荣菌、蒙彼利埃脉菌和/或巨球形菌中的一种或多种，所述阴道乳酸杆菌包括詹氏乳杆菌、加氏乳杆菌和/或卷曲乳杆菌中的一种或多种。

具体的，在一些实施例中，SEUNEU-115抑制阴道病原菌非典型韦荣菌和蒙彼利埃脉菌增殖，抑制率为28.57%~75.00%；SEUNEU-115抑制阴道病原菌巨球形菌增殖，抑菌活性为15~20 Au/ml；SEUNEU-115促进阴道乳酸菌詹氏乳杆菌、加氏乳杆菌和卷曲乳杆菌增殖，促增殖率11.83%~44.60%。

本发明提供了所述副干酪乳杆菌在制备促进宫颈癌细胞凋亡的产品中的应用。

所述增加宫颈癌细胞凋亡包括上调宫颈癌细胞凋亡相关基因和/或下调宫颈癌细胞抗氧化相关基因。

所述宫颈癌细胞凋亡相关基因包括BCL2-Associated X蛋白家族的BAX基因，所述宫颈癌细胞抗氧化相关基因包括Sirtuins蛋白家族SIRT-1基因、SIRT-2基因、 SIRT-3基因和/或核因子E2相关因子NRF2基因中的一种或多种。

具体的，在一些实施例中，SEUNEU-115上调宫颈癌Hela细胞凋亡相关基因BCL2-Associated X蛋白 BAX基因的表达，上调后基因相对表达量为1.39~1.66；SEUNEU-115下调宫颈癌Hela细胞抗氧化相关基因核因子E2相关因子2 NRF2、Sirtuins蛋白家族1 SIRT-1、Sirtuins蛋白家族2 SIRT-2和Sirtuins蛋白家族3 SIRT-3基因的表达，下调后基因相对表达量为0.45~0.83。

本发明提供了一种维持阴道健康的产品，其原料包括所述SEUNEU-115菌株或所述SEUNEU-115菌株的上清液中至少一种。

本发明还提供了一种促进宫颈癌细胞凋亡的产品，其原料包括所述SEUNEU-115菌株、所述SEUNEU-115菌株的上清液或所述SEUNEU-115菌株的灭活菌体中至少一种。

优选地，本发明所述的产品原料包括为所述副干酪乳杆菌SEUNEU-115菌株的上清液或灭活菌体。

本发明提供的所述产品，其剂型包括口服制剂、注射剂、滴剂或皮肤外用剂中的一种或多种。

本发明提供了保藏编号为CCTCC NO: M 2022928的副干酪乳杆菌。本发明提供的副干酪乳杆菌SEUNEU-115可以调节阴道菌群平衡，改善细菌性阴道疾病，维持阴道健康，同时还可以诱导宫颈癌细胞凋亡。还提供了副干酪乳杆菌SEUNEU-115在制备食品、医药品、消毒用品中的应用。

生物保藏说明

副干酪乳杆菌SEUNEU-115（Lactobacillus paracasei SEUNEU-115），于2022年6月20日保藏在中国典型培养物保藏中心，地址为:中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCCNO: M 2022928。

具体实施方式

本发明提供了副干酪乳杆菌及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1 SEUNEU-115的分离

于8岁女童粪便中采样。将样品适当处理后于生理盐水中震荡混匀，取上清划线于MRS固体平板，37℃恒温培养48h后，挑取白色菌落反复接种筛选，直至得到均匀的单个菌落，命名为SEUNEU-115。

革兰氏染色镜检：菌株SEUNEU-115为革兰氏染色阳性，显微镜下呈杆状；在MRS平板上生长，可形成白色、表面光滑圆润不透明圆形小菌落，边缘整齐；在MRS液体培养基中呈均匀浑浊生长，久置菌体呈白色沉淀。

实施例2 SEUNEU-115的核酸鉴定

1、16S rDNA基因序列分析

挑取单菌落置MRS液体培养基中，37℃培养过夜后，12000转离心1min收集菌体，按照DNA提取试剂盒步骤进行操作。引物采用细菌通用引物27F,1492R，PCR扩增体系为50μL体系，95℃预变性5min；94℃ 15s，57℃15s，72℃ 40s，35个循环；72℃延伸10min。

2、结果

PCR产物测序结果与GenBank中已发表的标准序列进行同源性比较（BLASTN）后得出SEUNEU-115菌株为副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）。

实施例3 SEUNEU-115抑制阴道病原菌的作用

1、SEUNEU-115上清液制备

挑取副干酪乳杆菌SEUNEU-115单菌落于MRS液体培养基，37℃培养箱静置培养16~18h，酶标仪检测并以MRS稀释调整OD₆₀₀=0.2，121℃，30min高压灭活，12000转离心2min，经0.22μm滤膜过滤为上清液。

2、病原菌菌液制备

非典型韦荣菌液体培养基配方：5g/L胰蛋白胨，3g/L酵母浸粉，12.5g/L乳酸钠（60%），0.75g/L硫代硫酸钠，1mL/L吐温80，1g/L葡萄糖，3mg/L腐胺，1mg/L刃天青，用固体碳酸钾调pH为7.5。将非典型韦荣菌DSM 20739用培养基于37℃厌氧培养48h，检测并调整至OD₆₀₀=0.1。

将蒙彼利埃脉菌DSM 17217用PYG培养基（含30mg/L腐胺与20g/L乳酸钠，pH为7.2）于37℃厌氧培养72h，检测并调整至OD₆₀₀=0.1。

将巨球形菌DSM 17226用MRS（pH=6.2）培养基于37℃厌氧培养48h，检测并调整至OD₆₀₀=0.1。

3、抑制病原菌实验

将灭活上清液以5%（V/V）的比例加入非典型韦荣菌菌液中，以添加等体积MRS液体培养基为对照，37℃厌氧培养6h，检测菌液浓度（OD₆₀₀）并计算病原菌抑制率。

将灭活上清液以5%（V/V）的比例加入蒙彼利埃脉菌菌液中，以添加等体积MRS液体培养基为对照，37℃厌氧培养72h，检测菌液浓度（OD₆₀₀）并计算病原菌抑制率。

取100μL巨球形菌菌液滴于巧克力血琼脂培养基上，以经过95%酒精过火灭菌的玻璃涂布棒均匀涂抹于培养基上，待所有液体被培养基吸收表面呈现干燥状，静置10~15分钟。取孔径约9mm打孔器经过95%酒精过火灭菌后，平压于涂过病原菌液的培养基上形成一个孔洞，再以经过95%酒精过火灭菌的镊子将孔内培养基取出形成空洞。取200μL灭活上清液添加于空洞内，以添加等体积MRS液体培养基为对照，培养基正放小心移入37℃培养箱厌氧培养48h，使用电子式光标卡尺量测抑菌圈直径大小结果，以抑菌活性（Au/ml）为指标评价灭活上清液对巨球形菌生长影响，计算公式及结果如表1~2：

表1 ：SEUNEU-115 对非典型韦荣菌、蒙彼利埃脉菌的抑制作用

表2：SEUNEU-115 对巨球形菌的抑制作用

结果显示SEUNEU-115具有抑制非典型韦荣菌和蒙彼利埃脉菌增殖的作用，抑制率28.57%~75.00%，巨球形菌抑菌活性为15~20Au/ml。

实施例4 SEUNEU-115促进乳酸菌增殖的作用

1、SEUNEU-115上清液制备

制备方法参照实施例3。

2、乳酸菌菌液制备

将3种乳酸菌：詹氏乳杆菌ATCC 25258、加氏乳杆菌CGMCC 1.3396、卷曲乳杆菌CICC 24879分别用MRS培养基37℃培养18h，检测并调整詹氏乳杆菌菌液OD₆₀₀=0.1，加氏乳杆菌菌液与卷曲乳杆菌菌液OD₆₀₀=0.2。

3、促进乳酸菌增殖实验

将灭活上清液以10%（V/V）加入乳酸菌液中，以添加等体积MRS液体培养基为对照，詹氏乳杆菌、卷曲乳杆菌37℃培养4h，加氏乳杆菌37℃培养4h，以促增殖率（测量菌液浓度OD₆₀₀）为指标评价灭活上清液对乳酸菌生长的促进作用。计算公式及结果如表3：

表3：SEUNEU-115 对阴道乳酸菌的增殖作用

结果显示SEUNEU-115具有促进阴道有益乳酸菌增殖的作用，促增殖率11.83%~44.60%。

实施例5 SEUNEU-115调节Hela细胞凋亡、细胞自噬、抗氧化相关基因表达实验

1、SEUNEU-115上清液和灭活菌体制备

挑取加氏乳杆菌SEUNEU-115单菌落于MRS液体培养基，37℃培养箱静置培养16~18h，酶标仪检测并以PBS稀释调整OD₆₀₀=0.2，121℃，30min高压灭活，12000转离心2min，经0.22μm滤膜过滤为上清液。离心沉淀以适量PBS重悬，稀释调整OD₆₀₀=0.2，为灭活菌体。

2、Hela细胞制备及SEUNEU-115添加

接种人宫颈癌细胞Hela（2ml/孔，内含4×105细胞）至6孔板，5%二氧化碳培养箱37℃过夜培养至细胞贴壁。分别加入上清液10%(V/V)、灭活菌体10%(V/V)（对照组为等体积PBS），培养24h。

3、qPCR法检测Hela细胞凋亡和抗氧化相关基因相对表达倍数

加入裂解液，提取细胞总RNA，检测RNA浓度及纯度后反转录为cDNA，以GAPDH为内参基因，采用实时qPCR检测细胞凋亡相关基因BAX、抗氧化相关基因NRF2和 SIRT家族的表达。以等体积PBS处理组为对照（基因相对表达倍数F=1），利用2^-ΔΔCT法计算各样品F值。

公式：F=2^-ΔΔCT，其中：

△CT_实验=CT_实验-CT_{内参（实验）};

△CT_对照=CT_对照-CT_{内参（对照）};

△△CT=△CT_实验-△CT_对照。

结果见表4~ 5：

表4：SEUNEU-115 上清液下调抗氧化相关基因的表达

表5：SEUNEU-115 灭活菌体调节细胞凋亡/抗氧化相关基因的表达

结果显示加入SEUNEU-115可上调人宫颈癌细胞Hela细胞凋亡基因BAX，基因表达量为1.39~1.66，下调人宫颈癌细胞Hela抗氧化相关基因表达量为0.45~0.83，SEUNEU-115具有降低Hela细胞抗氧化能力以及诱导Hela细胞凋亡的作用。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (4)

1.保藏编号为CCTCC NO: M 2022928的副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）。

2.权利要求1所述的副干酪乳杆菌在制备抑制阴道病原菌生长和/或促进阴道乳酸杆菌增殖的产品中的应用；

所述阴道病原菌群包括非典型韦荣菌、蒙彼利埃脉菌和/或巨球形菌中的一种或多种，所述阴道乳酸杆菌包括詹氏乳杆菌和/或加氏乳杆菌中的一种或多种。

3.一种维持阴道健康的产品，其特征在于，其原料包括权利要求1所述的菌株和/或所述菌株的上清液中至少一种。

4.根据权利要求3所述的产品，其特征在于，其剂型包括滴剂或皮肤外用剂中的一种或多种。